重組抗egfr單克隆抗體的制作方法

專利名稱：重組抗egfr單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種重組人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體。另外，本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的制備方法、含有該單克隆抗體的藥物組合物以及該單克隆抗體的用途。
背景技術(shù)：
癌癥是緊跟心臟病之后的人類第二大主要死亡因素，目前治療這種致命性疾病的新療法已取得了重大進(jìn)展。
正常細(xì)胞的增殖是通過各自的配體嚴(yán)格激活其生長因子受體來控制的，比如生長因子受體酪氨酸激酶。癌細(xì)胞也是在生長因子受體的激活下增殖的，但失去了正常增殖的嚴(yán)格控制。這種失控可能是由很多因素引起，比如生長因子的過度表達(dá)或生長因子受體的過度表達(dá)，以及由生長因子調(diào)控的生化途徑的自發(fā)性激活。參與致癌的受體包括表皮生長因子受體(EGFR)，來源于血小板的生長因子受體(PDGFR)，類胰島素生長因子受體(IGFR)，神經(jīng)生長因子受體(NGFR)和成纖維生長因子受體(FGF)等。
表皮生長因子受體(即EGFR)也稱作c-erbB1/Her1，其家族成員都是生長因子受體酪氨酸激酶，它們在細(xì)胞表面與特異的生長因子或天然配體相互作用，如與EGF或TGFα相互作用，由此活化受體酪氨酸激酶。已發(fā)現(xiàn)的該家族第一個成員是表觀分子量為165KD的糖蛋白。
EGFR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、修復(fù)和生存、新生血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，同時在相當(dāng)一部分的人類腫瘤中都有表達(dá)。在很多惡性腫瘤中，EGFR的表達(dá)往往與較差的預(yù)后和較低的生存率相關(guān)。因此可知，如果有藥物能阻斷EGFR的活性，那將會抑制其磷酸化和信號傳導(dǎo)，從而起到多重途徑的抗腫瘤作用，同時也能增加化療和放療的抗腫瘤療效。在一些研究中，EGFR抑制劑與多種化療藥物和放療藥物聯(lián)合作用于一些腫瘤細(xì)胞株時，表現(xiàn)出累加和協(xié)同作用。
EGFR抑制劑主要包括單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑、奎唑啉pyralo-/吡咯并-/吡啶并嘧啶、配體-毒素和免疫毒素聯(lián)結(jié)物，以及反義核苷酸和EGFR/配體主導(dǎo)的疫苗等。
一些體內(nèi)和體外實驗顯示抗EGFR抗體成功的抑制了表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞株的生長。在實體瘤的治療中，一些抗EGFR單克隆抗體單獨應(yīng)用或與傳統(tǒng)治療方法合并應(yīng)用的治療結(jié)果令人鼓舞。
以前的技術(shù)中已經(jīng)描述了多種小鼠的抗EGFR單克隆抗體，可與EGFR高特異的結(jié)合，這些抗體大致可分為兩類，一類是可與受體結(jié)合但不抑制EGF結(jié)合的抗體，另一類是可與受體結(jié)合并且還抑制EGF結(jié)合的抗體。但是患者對鼠源抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答限制了這些抗體在人類治療和體內(nèi)診斷中的應(yīng)用?；颊邥a(chǎn)生HAMA反應(yīng)(人抗小鼠抗體)，從而限制了抗體到達(dá)其抗原靶標(biāo)的能力，使抗體的效能降低。
一些研究人員為了減少HAMA反應(yīng)，研制出了人鼠嵌合的抗體，其中小鼠可變區(qū)(V)與人恒定區(qū)(C)連接。該抗體證明在臨床上好于鼠源抗體，但是嵌合抗體的小鼠V區(qū)中仍然含有使患者產(chǎn)生免疫原性的成分，限制了其應(yīng)用。
因此，需要尋找一種人源的EGFR抗體，使之在人體不產(chǎn)生免疫原性，并且具有高的親和力，本發(fā)明即是提供一種全人源的單克隆抗體，所述的抗體在體內(nèi)的親和力不會低于鼠源抗體，并且其在人體中不產(chǎn)生免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO3所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明還提供了編碼SEQ ID NO3以及SEQ ID NO4所示氨基酸序列的DNA分子。在一個較佳的實施方案中，所述DNA分子宜含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明第三方面提供了含有上述DNA分子序列以及與所述序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明第四方面還提供了經(jīng)上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選CHO細(xì)胞。
本發(fā)明第五方面提供了一種抑制有表皮生長因子受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長的藥物組合物，該藥物組合物含有藥學(xué)上有效量的上述人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明第六方面提供涉及上述人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明第七方面涉及一種制備上述人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體的方法，該方法包括a)提供一表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有上述DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
本發(fā)明的重組人源抗EGFR單克隆抗體是全人源的，其不會在人體產(chǎn)生免疫原性。而且，該抗體在體內(nèi)的親和力不低于鼠源抗體，其在宿主細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)中的表達(dá)量比現(xiàn)有的單克隆抗體也有顯著提高。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點可通過下面的詳細(xì)描述得知。
附圖簡述

圖1顯示了本發(fā)明所用的表達(dá)載體pMG18，并且標(biāo)明了其中的元件及酶切位點。其中，HCMV pro為人巨細(xì)胞病毒主要早期啟動子；Ck為人κ鏈恒定區(qū)基因；IgG1為人γ1鏈恒定區(qū)基因；pA為多聚腺苷化信號；DHFR為二氫葉酸還原酶基因；Amp為氨芐青霉素抗性基因。
具體實施方案如上所述，本發(fā)明首先提供了一種人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體(單克隆抗體)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。
本文所用的術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
本文所用的術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個片段中。可變區(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個FR區(qū)，它們大致上呈β-折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離獲得。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA分子。在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO1所示的編碼所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ IDNO2所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
在獲得上述編碼本發(fā)明的人源抗EGFR單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列后，通常可通過以下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。
首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也能預(yù)計到，將編碼本發(fā)明單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別插入不同的表達(dá)載體中進(jìn)行共表達(dá)也能獲得本發(fā)明的抗EGFR單克隆抗體。
本文所用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。
編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點將這些核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體中，使它們分別在表達(dá)載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們在同一讀框內(nèi)。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達(dá)載體，以及其它可獲得的表達(dá)載體，如pMG18(《根據(jù)INCP-9質(zhì)粒序列進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測的工具開發(fā)》“DEVELOPMENT OFTOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9 PLASMIDSSEQUENCES”.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas，1992年出版，具體載體圖見該書第143頁)。
隨后，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。“宿主細(xì)胞”一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。在本發(fā)明中，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。通常用哺乳動物細(xì)胞系來作為表達(dá)真核細(xì)胞衍生多肽的宿主細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞在培養(yǎng)物中的繁殖是本領(lǐng)域熟知的。見《組織培養(yǎng)》，Academic Press，Kruse and Patterson編輯(1973)，該文納入本文作為參考。較佳的哺乳動物細(xì)胞是許多可購得的無限增殖細(xì)胞系。這些無限增殖細(xì)胞系包括但不局限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Vero細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)和其它許多細(xì)胞系。它們?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子提供了翻譯后修飾，包括正確的折疊、正確的二硫鍵形成以及正確位點的糖基化。盡管在下文實施例中，本發(fā)明僅列舉了以CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的例子，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的詳細(xì)描述和具體實施例可以知道，本發(fā)明也能采用上述這些細(xì)胞系。
用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。例如可采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒來轉(zhuǎn)染諸如CHO細(xì)胞等宿主細(xì)胞。
然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的人源抗EGFR單克隆抗體。
所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))來測定。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析來測定。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種抑制有表皮生長因子受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長的藥物組合物，該藥物組合物含有藥學(xué)上有效量的本發(fā)明單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實施方案中，該藥物組合物中還可含有與本發(fā)明的單克隆抗體聯(lián)用的其它化療藥物和放療藥物。本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的單克隆抗體相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低單克隆抗體或藥物組合物的藥效。可作為藥學(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進(jìn)行施用。
下面將結(jié)合實施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
實施例1.人源抗體庫的構(gòu)建和篩選按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法構(gòu)建人源抗體庫。
起始材料為2028位健康人的外周血，按照上述文獻(xiàn)中提供的方法，制備mRNA，用PCR方法進(jìn)行體外擴增免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因，并將其克隆到噬菌體載體，利用抗體分子片段在噬菌體表面呈現(xiàn)的特點，以EGFR蛋白(購自晶美生物公司)為抗原，篩選到對EGFR蛋白特異性的抗體。
將復(fù)蘇的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，37℃培養(yǎng)18小時。
12000rpm高速離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一個無菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆?。其滴度?yīng)在2×1011以上。以EGFR蛋白為抗原，包被25毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在包被后的細(xì)胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體顆粒，37℃溫育1小時。
然后，倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。在培養(yǎng)瓶中加入1毫升對數(shù)期的TG1細(xì)胞，37℃溫育震蕩培養(yǎng)18小時。重復(fù)進(jìn)行4個循環(huán)。
將上述獲得的細(xì)胞稀釋至100000細(xì)胞/毫升，然后在加入0.1％氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得單克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，每孔一個克隆，共作960個克隆(10塊96孔板)。將上述深孔板在96孔板離心機上5000rpm離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4℃?zhèn)溆谩?br> 取96孔板10塊，每孔中加入EGFR(10微克/毫升)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37℃溫育1小時后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。加入1微升HRP標(biāo)記的羊抗M13單克隆抗體，37℃溫育30分鐘后用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃溫育顯色20分鐘后在讀板機上讀取595納米處的光吸收。根據(jù)光吸收讀數(shù)確定顯色反應(yīng)強的孔，這些孔相對應(yīng)的克隆即為親和力較強的抗體可變區(qū)克隆。
通過上述過程篩選出了442個陽性克隆，最強的克隆的親和力測定結(jié)果見下表1。根據(jù)讀數(shù)確定其中親和力最強的克隆5D8和3F2，用于以后的研究。
表1 各克隆的親和力

實施例2.抗體可變區(qū)編碼序列的表達(dá)載體的克隆將實施例1得到的克隆的菌株，在100毫升LB培養(yǎng)基中擴增，用Promega公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。
用XbaI和NheI酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取360bp左右的帶進(jìn)行膠回收，所得片段即為重鏈可變區(qū)編碼序列。
用HindIII和Bsi WI酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取320bp左右的帶進(jìn)行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區(qū)編碼序列。
然后首先將上述重鏈可變區(qū)編碼序列插入到表達(dá)載體pMG18(參見書籍DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ONINCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas，1992年出版。具體載體圖見該書第143頁)的XbaI/NheI位點中，再用Hind III和Bsi WI將上述抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列插入到插入有重鏈可變區(qū)編碼序列的pMG18的HindIII/Bsi WI位點中，構(gòu)建成人源抗EGFR單克隆抗體基因的表達(dá)載體。
實施例3.CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選上述實施例2中構(gòu)建的帶有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入在大腸桿菌DH5α菌株，然后接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴增，用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提純化質(zhì)粒DNA。將上述純化的質(zhì)粒DNA采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，操作參照廠家的說明書進(jìn)行。
轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進(jìn)行極度稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3次，進(jìn)行單克隆化。
挑出的單克隆細(xì)胞系在RPM1641培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對上清進(jìn)行Western印跡實驗，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達(dá)強度，挑選出表達(dá)強的克隆作為候選細(xì)胞株，得到表達(dá)強度較高的候選克隆6個，即1D4、3C6、2B7、7A3、6H4、5E3。
實施例4.單克隆抗體的純化本實施例用硫酸銨沉淀法來純化單克隆抗體。將上述單克隆抗體的純化采用Protein A親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中直接分離純化。培養(yǎng)上清經(jīng)過簡單離心，除去細(xì)胞殘片后即可直接進(jìn)行protein A親和層析。
將protein A填料按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料后，在4℃慢速攪拌24小時。然后在100mM pH8.2的Tris-H2SO4緩沖液中漂洗4次后，用含250mM氯化鈉的同樣緩沖液洗脫后進(jìn)行硫酸銨分步沉淀，起始濃度為35％飽和度，終止?jié)舛?3％飽和度。4℃處理12小時后高速離心，取沉淀，重新溶于上述不含氯化鈉的緩沖液中，并于同樣緩沖液透析過夜后濃縮10倍，待用。
上述樣品經(jīng)HPLC檢定純度以及Follin酚法定量蛋白質(zhì)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過純化的重組蛋白，其純度可達(dá)90％以上，并具有顯著的生物活性。
以上親和層析的產(chǎn)物再次經(jīng)過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。這些樣品可以用于以下的進(jìn)一步分析與研究。
實施例5.抗體基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)強度和親和力測定(a)表達(dá)強度將上述篩選得到的高表達(dá)候選克隆培養(yǎng)于10cm的組織培養(yǎng)皿，采用ELISA法測量抗體的表達(dá)量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經(jīng)2％BSA于37℃封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(人IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測A450值。測得上述6個候選克隆的表達(dá)量如下表2所示表2 抗體基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)強度

從表2可以看出，編號為3C6的細(xì)胞株具有很高的表達(dá)水平，該細(xì)胞株的表達(dá)超過了150ug/ml，而目前國內(nèi)外一般的表達(dá)量是100ug/ml左右，因此本發(fā)明獲得的細(xì)胞株的表達(dá)已經(jīng)超出了國內(nèi)外單克隆抗體類的一般表達(dá)水平。
(b)親和力測定按以下方法對各克隆的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行純化。10000rpm離心除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片，100Kd截留分子量的濾膜超濾濃縮至1/10體積，超濾緩沖液是100mM Tris-HCl，pH7.5。過SPA-sepharose親和層析柱，上樣液為100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脫液為100mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl。分子篩(Sephadex G200)層析。洗脫液為100mM Tris-HCl，pH7.5，得純品。
親和力測定采用Scatchard分析法(Munson et al，1980，Anal.BioChem.，107220)進(jìn)行，結(jié)果表明，3C6單克隆抗體的親和力達(dá)到了1.36×10-8。
上述結(jié)果表明，3C6單克隆抗體的親和力已經(jīng)達(dá)到1nM的水平，其親和力已經(jīng)達(dá)到單克隆抗體藥物的要求。
實施例6.EGFR單克隆抗體基因的序列確定對上述細(xì)胞株3C6的抗EGFR單克隆抗體基因進(jìn)行DNA測序。即用人源抗體可變區(qū)通用引物，進(jìn)行PCR擴增，獲得的輕鏈和重鏈可變區(qū)委托上海生工公司進(jìn)行PCR測序。
結(jié)果顯示在下表3中。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別是本發(fā)明獲得的高活性高表達(dá)EGFR單克隆抗體3C6的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列；SEQID NO3和SEQ ID NO4分別是根據(jù)上述DNA編碼序列推測的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
表3


實施例7.3C6所產(chǎn)生的單克隆抗體的生物學(xué)活性檢測用常規(guī)方法分離人外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106細(xì)胞/毫升。將兩人PBMC(同種異體雙向MLR)等體積混合，以2×105細(xì)胞/孔的密度接種“U”型96孔培養(yǎng)板。加入不同體積的純化融合蛋白，設(shè)置等體積相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染上清或培養(yǎng)基作對照，每組3個孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)5天，終止培養(yǎng)前16小時加入3H-TdR(終濃度5μCi/ml)。收集細(xì)胞于0.45微米微孔濾膜上，烘干，用液體閃爍計數(shù)儀測DPM值。統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用Microsoft Excel統(tǒng)計程序進(jìn)行均數(shù)差異顯著性分析。
在MLR反應(yīng)體系中，分別加入1微升、5微升和10微升經(jīng)抗EGFR單克隆抗體表達(dá)載體或空載體轉(zhuǎn)染、Protein A純化的CHO細(xì)胞上清。結(jié)果表明，即使加入1微升Protein A純化的細(xì)胞上清也能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為66％～75％；而加入同樣體積的空載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清，則無此作用。經(jīng)單因素方差分析，其差異達(dá)到非常顯著的水平，結(jié)果見表3。
表3 純化EGFR單克隆抗體對人MLR中淋巴細(xì)胞增殖的影響(DPM，n＝3)

MLR實驗表明測試蛋白具有抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)的活性，并且3C6所產(chǎn)生的單克隆抗體具有很強的抑制作用。以上結(jié)果表明在CHO細(xì)胞中表達(dá)了有生物學(xué)活性的抗EGFR單克隆抗體。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
序列表<110>上海張江生物技術(shù)有限公司<120>重組抗EGFR單克隆抗體<130>051028<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>357<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1caggtgcagc tgaaggagtc cggccccggc ctggtggccc cctcccagtc cctgtccatc 60acctgcaccg tgtccggctt ctccctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgccagccc120cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggtccg gcggcaacac cgactacaac180acccccttca cctcccgcct gaacatctcc aaggacaact ccaagtccca ggtgttcctg240cgcatgtact ccctgcagac cgacgacacc gcccgctact actgcgcccg cgccctgacc300tactacgact acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtcctcc 357<210>2<211>321<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>2gacatcctgc tgacccagtc ccccgccatc ctgtccgtgt cccccggcga gcgcgtgtcc 60ttctcctgcc gcgcctccca gtccatcggc accaacatcc actggtacca gcagcgcacc120aacggccccc cccgcctgct gatcaagtac gcctccgagt ccatctccgg catcccctcc180cgcttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctgt ccatctcctc cgtggagtcc240gaggacatcg ccgactacta ctgccagcag aacaacaact ggcccaccac cttcggcggc300ggcaccaagc tggagatcaa g 321<210>3<211>119<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr50 55 60Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80Arg Met Tyr Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>4<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Pro Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Ser65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 10權(quán)利要求
1.一種人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
2.一種DNA分子，其特征在于，它編碼SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一種DNA分子，其特征在于，它編碼SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
6.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2和4所述的DNA分子序列以及與所述序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
8.一種抑制有表皮生長因子受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長的藥物組合物，其特征在于，它含有藥學(xué)上有效量的權(quán)利要求1所述的人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.權(quán)利要求1所述的人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
10.一種制備權(quán)利要求1所述的人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求2和4所述的DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人源抗表皮生長因子受體單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼上述氨基酸序列的DNA分子、含有該DNA分子的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞、抗體的制備方法、用途以及含有該抗體的藥物組合物。
文檔編號C12N15/12GK1827647SQ200510024158
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者王皓, 侯盛 申請人:上海張江生物技術(shù)有限公司