專利名稱：一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物TDE2CD1。此外，本發(fā)明還提供了該細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物的制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞膜蛋白在細(xì)胞多種生理功能，比如細(xì)胞分裂，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和凋亡過程中起非常重要的作用。膜蛋白可以作為細(xì)胞表面的受體或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與信號(hào)傳遞，物質(zhì)代謝，如果發(fā)生表達(dá)變異，可以促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。隨著人類功能基因組計(jì)劃的進(jìn)行，越來越多的新的細(xì)胞膜蛋白被克隆鑒定并提示在人類腫瘤組織和細(xì)胞株中有差異表達(dá)。TMS_TDE家族就是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類與腫瘤差異表達(dá)相關(guān)的跨膜蛋白家族。該類蛋白具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，均包含一個(gè)“Myc-type helix-loop-helix”功能結(jié)構(gòu)域。
MT-PVLT-10轉(zhuǎn)基因小鼠能夠表達(dá)多聚巨病毒的大T抗原，隨著年齡的增長，其雄性小鼠品系往往會(huì)伴有睪丸腫瘤的發(fā)生和精囊充血的現(xiàn)象，1994年Lebel等人在其雄鼠品系的肝、腦、睪丸的cDNA庫中克隆到一轉(zhuǎn)錄本為2.6kb的基因(over expressed in testicular tumor，Oett)，并發(fā)現(xiàn)其在睪丸瘤細(xì)胞株中的表達(dá)量是對(duì)照細(xì)胞株中的2-15倍，該小鼠基因編碼393個(gè)氨基酸，對(duì)其功能域分析發(fā)現(xiàn)其編碼的是含有若干疏水α-螺旋的跨膜蛋白。提示該基因很可能是一種潛在的癌基因。1999年該實(shí)驗(yàn)室根據(jù)同源篩選在人的胎盤cDNA文庫中克隆得到人的腫瘤差異表達(dá)基因(tumordifferentially expressed gene，TDE)，該基因位于20q13.1-13.3，氨基酸序列與小鼠比較有78％同源度，也含有若干個(gè)疏水α-螺旋，提示是一個(gè)跨膜蛋白。在多種組織和細(xì)胞株中均有表達(dá)，在肺癌中呈上調(diào)表達(dá)[9]。在結(jié)腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)錄水平低于正常表皮細(xì)胞。2002年Waston等人發(fā)現(xiàn)TDE的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到轉(zhuǎn)錄因子c-myc的調(diào)節(jié)，c-myc的表達(dá)可以使TDE表達(dá)下降。2003年JEN等人利用SAGE方法檢測非小細(xì)胞肺癌中基因表達(dá)差異時(shí)，克隆得到人的TDE2L基因，該基因位于1p35.1，氨基酸序列與人TDE基因有60％的同源度，同樣發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中TDE2的表達(dá)量比癌旁組織的高，呈上調(diào)趨勢。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述細(xì)胞膜質(zhì)標(biāo)記化合物的制備方法。
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物，它是一種蛋白多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物人TDE2CD1是一種蛋白。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人TDE2CD1蛋白”除了SEQ ID NO 2所示序列外，還包括集中表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上的SEQ ID NO 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。
本發(fā)明還提供了一種核苷酸分子，所述的核苷酸分子序列編碼一多肽，該多肽序列如SEQ ID NO.2所示。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種核苷酸分子，其核苷酸分子序列如SEQ ID NO.1所示。
本發(fā)明中，術(shù)語“TDE2CD1編碼序列還包括SEQ ID NO 1的各種變異體。如，核苷酸序列SEQ ID NO 1中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ IDNO.1中1-108位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ IDNO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸1-108位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，更佳地能在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸1-105位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸1-105位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有TDE2CD1編碼序列。
本發(fā)明還提供了一種上述的細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物的制備方法，該方法包括(a)將TDE2CD1編碼序列的可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成表達(dá)載體；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物TDE2CD1。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
具體而言，可以用人TDE基因的cDNA序列為信息探針在人類EST數(shù)據(jù)庫中篩選，獲得若干與之有高度同源性的EST，利用GCG等軟件構(gòu)建EST-congtig圖，拼接出一條TDE2的全長cDNA的序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，以適當(dāng)?shù)脑蠟槟０?，即可得到TDE2CD1編碼序列(見SEQ ID NO 1)。
本發(fā)明中，適當(dāng)?shù)脑峡梢允呛蠺DE2CD1的各種生物材料，如人類的組織cDNA文庫、基因組、細(xì)胞提取物、質(zhì)粒、核苷酸序列等等。
通過與加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，enhanced green fluorescentprotein)耦聯(lián)，清楚的顯示本發(fā)明的TDE2CD1集中表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上。在生物發(fā)光的水母中，當(dāng)能量從Ca2+激活的水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移到綠色熒光蛋白GFP時(shí)，水母就能發(fā)光。因此，當(dāng)GFP在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如受到藍(lán)光或紫外光的照射，會(huì)產(chǎn)生一種明亮的綠色熒光。目前，GFP作為一種新的報(bào)告系統(tǒng)，在基因表達(dá)和蛋白定位的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。通常GFP蛋白是均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的，但如果將GFP蛋白接上特定的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，那么GFP將會(huì)被這些信號(hào)帶到特定的位置。EGFP作為一種加強(qiáng)型GFP，其綠色熒光更不容易淬滅。用加強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記人TDE2CD1基因，構(gòu)建TDE2CD1-EGFPN1重組子，將重組子和作為對(duì)照的未融合任何蛋白的EGFP分別轉(zhuǎn)染各類細(xì)胞株，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞貼壁在培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上。共聚焦顯微鏡下觀察(激發(fā)波長510nm)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TDE2CD1-EGFPN1質(zhì)粒的細(xì)胞中，綠色熒光集中分布在細(xì)胞質(zhì)膜，而轉(zhuǎn)染作為對(duì)照的未融合任何蛋白的EGFPN1質(zhì)粒的細(xì)胞中綠色熒光則呈全細(xì)胞均勻分布。這提示TDE2CD1可以作為一個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜的特異標(biāo)記加以使用。
本發(fā)明的TDE2CD1集中表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上，而且不影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，因此可以作為一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記物。首先，TDE2CD1重組質(zhì)粒標(biāo)記的蛋白不易丟失。比如在進(jìn)行細(xì)胞周期檢測時(shí)，轉(zhuǎn)染普通EGFP，一旦酒精固定就流失，從而失去了標(biāo)記的作用；而共同轉(zhuǎn)染的TDE2CD1-EGFP就可以標(biāo)記在膜上不被丟失。其次，如果發(fā)現(xiàn)有蛋白與本發(fā)明的TDE2CD1表達(dá)部位相同，那么這種蛋白也在細(xì)胞質(zhì)膜上有表達(dá)。這對(duì)于基因表達(dá)定位的研究與驗(yàn)證是非常簡便與高效的。另一方面，本發(fā)明的TDE2CD1可以作為細(xì)胞質(zhì)膜的形態(tài)標(biāo)記。將本發(fā)明的TDE2CD1與待檢的細(xì)胞組織樣品共同處理，可以顯現(xiàn)細(xì)胞輪廓，因此，本發(fā)明的TDE2CD1對(duì)診斷由細(xì)胞形狀異常引起或臨床癥狀表現(xiàn)為細(xì)胞形狀異常的疾病，將成為一種新的途徑和方法。
圖1為TDE2CD1-EGFP融合蛋白的示意圖。TDE2-EGFP融合蛋白由TDE2CD1和EGFP依次排列組成。
圖2為TDE2CD1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QGY細(xì)胞后共聚焦激光掃描顯微鏡視圖?？梢姡G色熒光集中分布在細(xì)胞質(zhì)膜。這說明TDE2CD1集中表達(dá)在細(xì)胞膜上。
圖3為陰性對(duì)照N1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QGY細(xì)胞后共聚焦激光掃描顯微鏡視圖?？梢姡G色熒光則呈全細(xì)胞均勻分布，這說明未與TDE2CD1連接的EGFP在細(xì)胞所有部位都有表達(dá)。從而驗(yàn)證了TDE2CD1-EGFP融合蛋白之所以集中表達(dá)在細(xì)胞膜上完全是由于TDE2CD1表達(dá)的緣故。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一TDE2CD1的制備通過EST同源篩選的方法，用人TDE基因的cDNA序列為信息探針在人類EST數(shù)據(jù)庫中篩選，獲得若干與之有高度同源性的EST，利用GCG軟件構(gòu)建EST-congtig圖，拼接出一條3108bp的cDNA的序列，并在預(yù)測可能的開放閱讀框(ORF)的5’和3’端設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物TDE2-A，TDE2-B(TDE2-A5`-TCTGTATCCGCTGCTCTTGTGACG-3`，TDE2-B5`-CATGCTAGAAGTCTCACTCAGTC-3`)分別從人的腦，胎盤，睪丸，肝等組織cDNA文庫中擴(kuò)增得到特異條帶，將獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T，經(jīng)測序與拼接cDNA序列一致。該cDNA序列全長3199bp，其中含有一個(gè)1359bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼453個(gè)氨基酸。序列比較分析表明，它與人類TDE1基因有較高的同源性，因此我們將其命名為TDE2。我們將該基因的cDNA序列以及其他相關(guān)信息登錄NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，得到的登錄序列號(hào)為(AF087902)。
將TDE2基因編碼序列插入EGFP-N1載體，并以TDE2-EGFPN1重組質(zhì)粒為模板，以TDE2-EGFPN1-A/C1-B(EGFP-TDE2-A5`-TTCGAATTCTGATGGGGAGCGTCCTGG-3`；EGFP-TDE2-C1B5’-CCTGGATCCCGCAGTGGAGTTGTTTCCA-3’)為引物對(duì)同樣進(jìn)行PGR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用EcoR I和BamH I雙酶切，得到SEQ ID NO 1所示序列。
實(shí)施例二TDE2的亞細(xì)胞定位SEQ ID NO 1所示序列純化后連接轉(zhuǎn)化入類似雙酶切的pEGFP-N1質(zhì)粒，形成重組的TDE2CD1-EGFP質(zhì)粒，如圖1所示。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將作為陰性對(duì)照的EGFP-N1質(zhì)粒和重組的TDE2CD1-EGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)從培養(yǎng)皿中取出載有轉(zhuǎn)染好的貼壁細(xì)胞的蓋玻片，1×PBS輕洗，置于共聚焦激光掃描顯微鏡載物臺(tái)上觀察，并做斷層掃描，分析融合蛋白的分布。激發(fā)光波長488nm/510nm。具體結(jié)果見圖2和圖3。
圖2為TDE2CD1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QGY細(xì)胞后共聚焦激光掃描顯微鏡視圖?？梢姡G色熒光集中分布在細(xì)胞質(zhì)膜。這說明TDE2CD1集中表達(dá)在細(xì)胞膜上。
圖3為陰性對(duì)照N1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QGY細(xì)胞后共聚焦激光掃描顯微鏡視圖。可見，綠色熒光則呈全細(xì)胞均勻分布，這說明未與TDE2CD1連接的EGFP在細(xì)胞所有部位都有表達(dá)。從而驗(yàn)證了TDE2CD1-EGFP融合蛋白之所以集中表達(dá)在細(xì)胞膜上完全是由于TDE2CD1表達(dá)的緣故。
序列表<210>1<211>108<212>DNA<213>人類<220>
<221>CDS<222>(1)..(108)<223>
<400>1atg ggg agc gtc ctg ggg ctg tgc tcc atg gcg agc tgg ata cca tgt48Met Gly Ser Val Leu Gly Leu Cys Ser Met Ala Ser Trp Ile Pro Cys1 5 10 15ttg tgt gga agt gcc ccg tgt ttg cta tgc cga tgc tgt cct agt gga96Leu Cys Gly Ser Ala Pro Cys Leu Leu Cys Arg Cys Cys Pro Ser Gly20 25 30aac aac tcc act108Asn Asn Ser Thr35<210>2<211>36<212>PRT<213>人類<400>2Met Gly Ser Val Leu Gly Leu Cys Ser Met Ala Ser Trp Ile Pro Cys1 5 10 15Leu Cys Gly Ser Ala Pro Cys Leu Leu Cys Arg Cys Cys Pro Ser Gly20 25 30Asn Asn Ser Thr3權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物，其特征在于，它是一種蛋白多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一種核苷酸分子，其特征在于，所述的核苷酸分子序列編碼一多肽，該多肽序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸分子，其特征在于，所述的核苷酸分子序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一種質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒含有權(quán)利要求2所述核苷酸分子序列。
5.一種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物的制備方法，其特征在于，該方法包括(a)將權(quán)利要求2所述的核苷酸分子的序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成表達(dá)載體；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出權(quán)利要求1所述的細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物TDE2CD1。此外，本發(fā)明還提供了該細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記化合物的制備方法。本發(fā)明的TDE2CD1集中表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上，而且不影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，因此可以作為一種細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記物。首先，在研究細(xì)胞變化用酒精固定細(xì)胞時(shí)，將目的蛋白或染料與TDE2CD1耦聯(lián)，從而避免了目的蛋白或染料流失。其次，如果發(fā)現(xiàn)有蛋白與本發(fā)明的TDE2CD1表達(dá)部位相同，那么這種蛋白也在細(xì)胞質(zhì)膜上有表達(dá)。這對(duì)于基因表達(dá)定位的研究與驗(yàn)證是非常簡便與高效的。另一方面，本發(fā)明的TDE2CD1可以用于顯現(xiàn)細(xì)胞輪廓，因此，本發(fā)明的TDE2CD1對(duì)診斷由細(xì)胞形狀異常引起或臨床癥狀表現(xiàn)為細(xì)胞形狀異常的疾病，將成為一種新的途徑和方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1824673SQ20051002405
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日
發(fā)明者余龍, 楊晨怡, 唐麗莎 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)