專利名稱：用于固定化酶乙醇熒光毛細分析法的乙醇毛細生物反應器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及用于固定化酶乙醇熒光毛細分析法(IE-EFCA)的乙醇毛細生物反應器(ECBR)及其制備方法，屬于生化分析領域。本發明適用于發酵食品、藥品、血液標本、工業用試劑等各類多組分液體樣品中乙醇的快速檢測和分析。
背景技術：
目前，需要測定乙醇含量的有蒸餾酒、配制酒、葡萄酒、果酒、米酒、啤酒、各種水果醬、水果泥、果汁、蔬菜汁、罐頭、血清、藥物、洗潔精，香水等。蒸餾酒及配制酒中的乙醇測定主要按照GB/T5009.48-2003方法，用比重計法或氣相色譜法進行；水果、蔬菜制品中乙醇的測定方法采用ISO2448-1973的重鉻酸鉀氧化滴定法；洗潔精，香水里酒精含量的測定方法是采用內標法的氣相色譜法；除此之外，乙醇測定方法還有液態乙醇氧化酶法(ALOD)、乙醇脫氫酶法(ADH)等。
重鉻酸鉀氧化滴定法是將樣品蒸餾分離得到的乙醇，在硫酸介質中，用重鉻酸鉀氧化，然后在指示劑-菲繞啉亞鐵鹽的存在下，用硫酸亞鐵銨滴定過量的重鉻酸鉀。
ALOD比色法是在ALOD(1000U/L)催化作用下，乙醇被氧化成乙醛和H2O2，繼續在過氧化物酶(POD，5000U/L)催化作用下，H2O2和4-氨基安替比林及苯酚反應，生成紅色的醌亞胺(500nm)，根據其吸光度定量樣品中乙醇含量。
ADH比色法是在ADH的催化作用下、乙醇和氧化型輔酶I(NAD+)反應，生成還原型輔酶I(NADH)；在340nm處測定NADH吸光度來定量樣品中乙醇濃度。
現有技術存在的主要問題是比重計法的準確度受蒸餾操作過程、水浴恒溫條件的影響很大，靈敏度低、重現性差、費時費力；比重計法和重鉻酸鉀氧化滴定法，在測定前都必須對樣品進行前處理，即先用蒸餾方法將樣品中的乙醇分離出來，操作復雜；重鉻酸鉀氧化滴定法使用試劑種類多；氣相色譜法的儀器預熱和操作耗時長，不適合不連續的批量樣品測定和生產現場的監測；ALOD比色法使用的試劑種類多、酶用量大，測定成本太高、特異性差，甲醇對測定干擾很大；中間產物易受被測液中其它共存物質影響；ADH比色法使用的液態酶用量大、測定成本高。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于固定化酶乙醇熒光毛細分析法(IE-EFCA)的乙醇毛細生物反應器(ECBR)及其制備方法。使用ECBR可以解決現有技術存在的問題，簡化操作過程、降低被測液用量、節約大量貴重的酶制劑，減少廢液，減少使用試劑種類，增強測定方法特異性，提高精度和靈敏度，實現微量樣品的微量分析，提高分析速度，實現固定化酶法和常規熒光分析法相結合，實現不連續的批量樣品快速測定，可用于生產現場的監測。
本發明的測定原理是在ADH的催化作用下，乙醇和NAD+反應，生成NADH；在352nm的激發波長下NADH被激發，產生熒光(456nm)；根據此熒光強度來定量樣品中乙醇濃度。
本發明用于IE-EFCA的乙醇毛細生物反應器如圖1所示，它包括毛細管、交聯劑、ADH和NAD+。使用時，用ECBR和一個固定座替代常規熒光分析中的試液槽，將其置于熒光分析儀光路中。
本發明的ECBR材質可以是石英玻璃、光學玻璃或透明塑料，其長度為3～5cm，容量為2～10μL，內徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；它的內孔可以是圓形、也可以是矩形，矩形時邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm；固定化ADH濃度為1～20IU/L；固定化NAD+濃度為1～7mmol/L。
本發明ECBR中可單獨固定ADH，也可以同時固定ADH和NAD+。
本發明ECBR中ADH和NAD+可變成其它的酶制劑，形成不同用途的毛細生物反應器，也可制成各種專用的熒光毛細生物測試盒。
本發明ECBR可直接用于目前已商品化的各種熒光分析儀，實施乙醇的測定及研究。
本發明ECBR的制備方法包括以下步驟1)毛細管的化學修飾利用毛細現象將2.5％戊二醛試劑吸入毛細管內，在真空狀態下放置1h，使戊二醛共價結合在毛細管的內壁上；2)毛細管中酶及試劑的固定化再用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)洗掉未結合的戊二醛；然后，用毛細管吸入用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制的ADH或ADH和NAD+混合溶液，在4℃下旋轉固定6～12h，使ADH的氨基與戊二醛的醛基共價結合；3)毛細管化學修飾基團的封閉再將固定有ADH的毛細管浸泡在2％(m/v)的牛血清蛋白液中6-12h，封閉未結合的醛基，制成ECBR；最后，將ECBR保存在4℃的0.1mol/L磷酸緩沖液中(pH7.0)。
本發明的基本技術參數為乙醇的測定范圍在1.1～15.5g/L，檢出限為1.10g/L，相對標準偏差RSD＜2.0％，磷酸緩沖溶液濃度0.1mol/L，pH6.5～9.0，NAD+濃度3～6mmol/L，ADH固定化酶的濃度1～10U/L；酶催化反應時間10～20min，反應溫度20～40℃。
本發明的優點和積極效果是1)用ECBR代替常規的試液槽，實現IE-EFCA法；2)酶在ECBR中固定化后可以重復使用，能節約大量的貴重酶試劑，降低實驗成本；3)適用于試劑昂貴、樣品量少、濃度低、批量的樣品測定；便于攜帶、保存；4)無需對樣品進行前處理，可以直接測定，操作簡便；5)使用試劑種類少，操作耗時短，適合生產現場的監測；甲醇對測定不干擾；6)可用于食品、衛生、工業、環境、醫學、藥物、生物、等樣品中乙醇的測定，能產生巨大的經濟效益。
圖1本發明乙醇毛細生物反應器結構示意中S樣品、1毛細管、2毛細管壁、3交聯劑、4ADH、5NAD+。
圖2實施例1優選ECBR中固定化ADH濃度的曲線3實施例2是用本發明測定乙醇得到的標準曲線4實施例4是考察ECBR中固定化酶和液態酶效果的曲線圖具體實施例結合附圖對本發明的實施例作進一步描述實施例1本實施例是優選ECBR中固定化ADH的濃度。先將5、10、20、30、40、80U/L的ADH酶分別固定在毛細管中，制成六個ECBR；然后，用這些ECBR分別吸入一系列不同濃度的乙醇標準液，分別與NAD+混合后進行測定。實驗條件激發波長352nm，發射波長456nm，室溫25℃，樣品用量為10μL，結果如圖2所示；酶的固定量在10U/L時，熒光強度最高；因此，ADH的固定化濃度選定為10U/L。
實施例2本實施例是用本發明ECBR測定乙醇。實驗條件激發波長352nm，發射波長456nm，室溫40℃，被測液用量10μL。測定時，將固定座置于熒光儀的光路中；用ECBR分別吸入濃度為2、4、8、10、15g/L的乙醇標準液之后，將其插入固定座的插入孔內，測定其熒光強度，結果如圖3所示。乙醇濃度在2.0-15.0g/L范圍內和熒光強度有良好的線性關系。
實施例3本實施例是用ECBR測定樣品的回收率。四種酒樣中乙醇含量的測定結果如表1所示。測得的結果和樣品標示濃度相符。為了檢驗本發明的可靠性，用標準添加法進行了回收率測定，結果如表2所示。四種酒測得的回收率均在101～103％，結果令人滿意。
表1
表2
實施例4本實施例是考察本發明ECBR的精密度。在測定乙醇的線性范圍內，分別選用較低和較高濃度兩種乙醇標準溶液進行了重現性實驗(n＝11)，結果如表3所示。可以看出，在較低和較高兩種濃度下，RSD都在2％左右，可見使用ECBR測定乙醇時其精密度能完全滿足要求。
表3
實施例5本實施例是用本發明ECBR考察了固定化酶和液態酶的效果。實驗條件激發波長352nm，發射波長456nm，實驗溫度40℃，被測液用量10μL，ECBR中固定化ADH的濃度10U/L，液態ADH濃度30U/L，NAD+液態濃度5mmol/L，乙醇作為樣品；測定結果如圖4所示。結果表明，ADH固定化后用于乙醇測定，其線性良好，靈敏度也遠高于液態ADH。
權利要求
1.用于固定化酶乙醇熒光毛細分析法(IE-EFCA)的乙醇毛細生物反應器(ECBR)(1)，其特征是它包括毛細管(2)、交聯劑(3)、乙醇脫氫酶(ADH)(4)及輔酶I(NAD+)(5)。
2.如權利要求1所述的ECBR，其特征是它(1)的材質可以是石英玻璃、光學玻璃或透明塑料，長度為3～5cm，容量為2～10μL，內徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；它(1)的內孔可以是圓形、也可以是矩形，矩形時邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm；固定化ADH濃度為1～20IU/L；固定化NAD+濃度為1～7mmol/L。
3.如權利要求1所述的ECBR，其特征是可以在ECBR(1)中單獨固定ADH，也可以同時固定ADH和NAD+，或同時固定兩種以上的酶或試劑。
4.如權利要求1所述的ECBR，其特征是可將ECBR(1)中的ADH(4)和NAD+(5)變成其它的酶或試劑，制成不同用途的毛細生物反應器和熒光毛細生物測試盒。
5.如權利要求1所述的ECBR，其特征在于可直接用于已商品化的各種熒光分析儀，實施乙醇的測定及研究。
6.如權利要求1所述的ECBR制備方法，其特征在于包括以下步驟1)毛細管的化學修飾利用毛細現象將2.5％戊二醛試劑吸入毛細管內，在真空狀態下放置1h，使戊二醛共價結合在毛細管的內壁上；2)毛細管中酶及試劑的固定化再用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)洗掉未結合的戊二醛；然后，用毛細管吸入用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制的ADH或ADH和NAD+混合溶液，在4℃下旋轉固定6～12h，使ADH的氨基與戊二醛的醛基共價結合；3)毛細管化學修飾基團的封閉再將固定有ADH的毛細管浸泡在2％(m/v)的牛血清蛋白液中6～12h，封閉未結合的醛基，制成ECBR；最后，將ECBR保存在4℃的0.1mol/L磷酸緩沖液中(pH 7.0)。
全文摘要
本發明公開了一種用于固定化酶乙醇熒光毛細分析法(IE－EFCA)的乙醇毛細生物反應器(ECBR)及其制備方法，屬于生化分析領域。它是用交聯劑將乙醇脫氫酶和輔酶I固定于毛細管內壁制成；它包括毛細管、交聯劑、輔酶I、乙醇脫氫酶及酶活性保持液；它可重復使用。用它實現IE－EFCA。測定乙醇時，用ECBR吸入乙醇樣品液后置于熒光分析儀中，檢測其熒光強度。本發明重現性好、操作簡便，能節約貴重的酶試劑，實現乙醇的微量化、快速化測定；可制成熒光毛細乙醇測試盒，用于醫藥、衛生、工業、食品和環境等含乙醇樣品的測定；改變毛細生物反應器中酶或試劑種類，可以達到不同的測定目的。
文檔編號C12Q1/00GK1766578SQ20051002183
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月9日 優先權日2005年10月9日
發明者李永生, 高秀峰 申請人:四川大學