專利名稱：能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽及其制備方法
技術領域：
本發明屬于分子微生物學和感染免疫領域。涉及一種能抑制傷寒桿菌(Salmonella Typhi)侵入人體細胞的多肽，該多肽能與感染人的傷寒桿菌特有的病原性毒力島上IV型纖毛結構蛋白高親和，同時還涉及該多肽的制備方法。
背景技術：
近2300種相關的沙門氏菌中，傷寒桿菌是最重要的致病菌，它是唯一只對人致病并導致傷寒腸熱癥的細菌。傷寒桿菌可通過污染的食物和水流行和傳染。每年全世界感染傷寒桿菌的人數達16.6億，我國傷寒也長期流行。大多數沙門氏菌只引起腸炎，但傷寒桿菌可侵入人體血管導致高燒及更嚴重的腸熱癥和敗血癥，是臨床治療中頗為棘手的問題。遺憾的是至今為止全世界還沒有完善的傷寒疫苗；而近十幾年來，傷寒桿菌出現對多種抗菌素耐藥(如抗氯霉素抗性等)的趨勢，這也成為非常嚴重的問題。
近年克隆和發現傷寒桿菌IVB型纖毛操縱子，該操縱子含有11個基因，其中pilS基因是負責編碼傷寒桿菌IVB型纖毛的結構蛋白PilS，并已構建好了高水平表達谷胱甘肽硫轉移酶PilS融合蛋白(GST-PilS融合蛋白)的重組質粒菌株。傷寒桿菌IVB型纖毛缺失突變株(Typhi J341pilS-)只有表達IVB型纖毛的傷寒桿菌(Serovar Typhi A21-6)侵入小腸細胞的5％-25％，加入可溶性的prePilS蛋白(該蛋白為PilS蛋白的前體)可抑制傷寒桿菌對細胞的侵襲。見參考文獻Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，Fung A.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter humanintestinal epithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。
核糖體展示技術將編碼(NNM)12隨機12肽的DNA庫在體外轉錄、翻譯，轉錄產物mRNA由于缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結合，形成一個穩定的復合體結構。利用固相化抗原或受體的特異性的單克隆抗體親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的mRNA-核糖體-多肽復合物，通過降低Mg2+濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經過幾輪篩選，找到與靶蛋白結合的受體。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽。該多肽可特異性抵抗和抑制野生型傷寒桿菌對人體細胞的侵襲。
本發明的另一目的在于提供一種制備多肽的方法，該方法簡便，其對于篩選和進化抗體，從隨機寡核苷酸體外轉錄和翻譯編碼的短肽中篩選出能折疊、具有活性的抗體。除此之外，核糖體展示技術還可用于篩選配體和受體、確定抗原表位、新的蛋白酶抑制物和新的藥物開發等。該方法的整個過程都在細胞外進行，不需轉化細胞，即可以獲得大容量庫，從而提高了稀有克隆被分離出來的概率并增加了給定系統中被篩選序列的多樣性。其次，核糖體展示技術避免了細胞內、外操作的轉換，篩選過程簡單，可以在較短時間內進行多輪篩選。而且，核糖體展示技術還能通過逆轉錄PCR確定基因型。再者，核糖體展示技術能篩選具有細胞毒性的分子。此外，核糖體展示技術還可以通過易錯PCR(error-prone PCR)、DNA改組(DNA shuffling)和stEP(stagged extensionprocession)引入突變，從中篩選出編碼具有新功能或高活性的表達產物新基因。
本發明技術方案如下1、制備和純化PilS-GST-Sepharose 4B將谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白重組質粒菌株(見參考文獻Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，Fung A.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter human intestinalepithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。)，接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的2×YT液體培養基中，30℃振蕩培養至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其濃度為0.1mmol/L誘導，30℃振蕩培養4～6小時，濃縮菌株，超聲破碎，加入TritonX-100使其濃度為1％，輕混30分鐘，12000轉/分鐘離心10分鐘，取上清，加入谷胱甘肽瓊脂糖4B(Gluthathion-Sepharose 4B)，25℃混合30分鐘，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，即得到純化的PilS-GST-Sepharose 4B。
上述2×YT液體培養基為1升水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl5g。
2、隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫的構建和引物合成構建長度為90個堿基的隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫3’-CCT CTA TAT AGGTACCGA TCG(NNM)12AGGCCGGTA GTA GTA GTA GTA GTACCT AGGCCA-5’(N代表A、C、T、G，M代表A、C)，第一輪PCR的上游引物U15’-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGAAGGAGATATATCCATG-3’，下游引物D15’-GGCATACACTTGAAGGTGAGCCACTACCACTTCCACTACCGGATCCATGATG-3’.第二輪PCR的上游引物U25’-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’，下游引物為D1。隨機ssDNA文庫和引物由上海博亞生物有限公司合成。
3、雙鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴增以單鏈DNA文庫為模板，引物U1和D1擴增得到第一輪PCR產物。用2％瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳，用Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；已回收的DNA為模板，用引物U2和D1進行擴增，得到的產物純化回收，即為雙鏈DNA文庫。
4、核糖體文庫的構建將PCR擴增的隨機DNA文庫于體外轉錄—翻譯偶聯的E.coli S30 Extract System中表達。采用的E.coli S30 Extract System是適用于線性DNA模板的體外轉錄翻譯系統，將隨機DNA文庫8.5μL，氨基酸混合液(無甲硫氨酸)5μL，S30 Premix without Amino Acids 20μL，[35S]-甲硫氨酸(10.2mCi/mL) 1.5μL，S30 Extract 15μL加入到用0.1％DEPC處理過夜的EP管中，30℃溫育2小時30分鐘后，冰上放置5分鐘終止反應。
5、篩選在體外轉錄翻譯混合物中加入DNase去除DNA模板，將體外轉錄/翻譯混合物加入到經無RNase的洗液(PBS pH7.4，1％Tween-20，5mM醋酸鎂)洗滌過的PilS-GST-Sepharose 4B中，4℃搖動1小時，經洗液洗滌3次后收集沉淀，沉淀溶于無RNase的水中，加入無RNase的洗脫液(50mM Tris-醋酸pH7.5，150mM NaCl，10mM EDTA)，4℃溫育10分鐘使mRNA與核糖體解離，用RNaid Kit回收mRNA。以回收的mRNA為模板進行RT-PCR。
6、克隆和測序 經過一輪篩選，將獲得的RNA-核糖體-多肽庫經RT-PCR獲得DNA庫，用BamHI和PstI消化后連于質粒pUC19上，隨機挑取單個克隆測序，得到的核苷酸序列均為相同，均為AGG CAG GAG AGG TCT TCT CTTTCG AAG CCG GTG GTG，相應的氨基酸序列為RQERSSLSKPVV，命名為多肽R，在西安美聯公司合成多肽R和對照隨機多肽YYKLPGHHHHYRP。
上述制備的多肽的作用和功能A細菌侵襲試驗檢測多肽R(12肽)和隨機12肽Y對傷寒桿菌侵入人單核細胞THP-1細胞抑制能力將2、3、4、6μM的多肽R和Y分別與人傷寒桿菌Serovar Typhi J341(野生型人傷寒桿菌)、Typhi PilS-(IV型纖毛缺失的傷寒桿菌)室溫溫育15分鐘后，將傷寒桿菌加入至THP-1細胞(細胞/細菌1/10)，37℃，5％CO2，2小時反應后，用PBS反復洗滌5次以去除胞外菌，再加入慶大霉素(100μg/ml)37℃，5％CO2，1小時溫育以殺滅殘存的胞外菌，再用PBS反復洗滌5次后收獲細胞。將細胞重懸于1％TritonX-100的PBS溶液中，室溫下振蕩10分鐘裂解細胞后，取總體積的1/200涂于20mm的LB瓊脂平板上，37℃培養14-16小時后，計算平板上的菌落數。該侵襲實驗共重復3次，每次試驗每個試驗組均重復3次。
B等溫滴定量熱法檢測多肽和GST-PilS蛋白的親和力37℃時多肽R與PilS-GST或GST蛋白相互作用的熱力學性質的測定在美國MicroCal公司生產的VP型等溫滴定量熱儀上進行。滴定實驗中，將多肽溶液裝入250μL的滴定注射器，PilS-GST或GST蛋白溶液放入1.43mL的樣品池，攪拌器以300r/min的速度攪拌，每間隔360s加入10μL多肽溶液到蛋白溶液中，共滴28次.參比池中加入去離子水作為樣品池的熱平衡參照.須另做一空白實驗以扣除多肽稀釋熱的影響，即在樣品池中加入緩沖液，用多肽溶液滴定.蛋白的稀釋熱經測定非常小，可略去.所有的溶液都在相應溫度條件下真空脫氣處理以減小信號噪音.積分每個峰面積并扣除稀釋熱后得到結合反應熱，對多肽與蛋白的摩爾比作圖得到反應等溫線.以MicroCal公司提供的Origin軟件(版本5.0)中的獨立結合位點模型進行非線性最小方差擬合，可計算出多肽與蛋白作用的本征結合常數Kb。
發明優點和效果本發明提供了一種能能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽。它在制備過程中采用了新的組合化學技術—核糖體展示技術進行特異性結合傷寒桿菌IV纖毛結構蛋白的多肽的篩選。其最大的優點是它能特異性結合在傷寒桿菌致病過程中發揮關鍵作用的IV型纖毛上，可顯著抑制傷寒桿菌侵入人體細胞，是極有潛在臨床應用價值的生物制劑，此外還可為進一步探討傷寒桿菌的致病機制提供幫助。
圖1.DNA文庫的設計示意圖。
以設計的隨機寡核苷酸作為模板，用引物U1和引物D1進行第一輪PCR，再以第一輪PCR產物為模板，用引物U2和D1進行第二輪PCR。
圖2.核糖體文庫的制備和篩選的示意圖。
含隨機12肽的DNA文庫在體外轉錄、翻譯，轉錄產物mRNA由于缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結合，形成一個穩定的復合體結構。利用PilS-GST-Sepharose4B親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的mRNA-核糖體-多肽復合物，通過降低Mg2+濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板。
圖3.核糖體展示系統的表達示意圖。
不同數量的隨機DNA文庫，用E.coli S30 Extract System體外偶聯轉錄翻譯后，[35S]-甲硫氨酸標記的翻譯產物，于液體閃爍計數器中計數，結果見圖3，隨著DNA模板量的增加，隨機12肽核糖體文庫的翻譯產物表達量增加。
圖4.細菌侵襲試驗檢測多肽抑制傷寒桿菌侵入THP-1細胞示意圖。
由圖4可知，多肽R可抑制野生型傷寒桿菌進入THP-1細胞，其中6μM多肽R的抑制能力最強，而多肽Y不能抑制野生型傷寒桿菌進入THP-1細胞；多肽R和多肽Y均不能抑制IV型纖毛缺失的傷寒桿菌進入THP-1細胞。
圖5.等溫滴定量熱法檢測多肽和GST-PilS蛋白的親和力示意圖。
由圖5A可知，1mM多肽R滴定10μM GST-PilS蛋白溶液的發應是放熱的，多肽R和GST-PilS蛋白通過單位點結合，結合常數Kb值為0.4×105L·mol-1and2.2×105L·mol-1；由圖5B可知，多肽R和GST蛋白無結合位點。
具體實施例方式
1、制備和純化PilS-GST-Sepharose 4B將高表達PilS的pGEX-2T-pilS重組質粒菌株接種于含50μg/ml的Amp抗菌素的2×YT(配方1L水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 5g)液體培養基上，30℃振蕩培養至OD6001-2之間，加入IPTG至終濃度0.1mM誘導，30℃振蕩培養4小時濃縮菌株后超聲破碎，加入TritonX-100至終濃度為1％，輕混30分鐘后，離心取上清，加入Gluthathion-Sepharose 4B，25℃輕混30分鐘后用PBS洗滌三次，即得到純化的PilS-GST-Sepharose 4B。
2、隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫的構建和引物合成ssDNA庫為3’-CCTCTA TAT AGGTACCGA TCG(NNM)12AGG CCGGTA GTA GTA GTA GTAGTACCT AGGCCA-5’(90)(N代表A、C、T、G，M代表A、C)，第一輪PCR的上游引物U15’-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGAAGGAGATATATCCATG-3’，下游引物D15’-GGCATACACTTGAAGGTGAGCCACTACCACTTCCACTACCGGATCCATGATG-3’.第二輪PCR的上游引物U25’-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’，下游引物為D1。隨機ssDNA文庫和引物由上海博亞生物有限公司合成。
3、雙鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴增通過兩輪PCR將單鏈DNA文庫合成雙鏈DNA文庫，2％的瓊脂糖凝膠電泳后用DNA純化回收試劑盒純化。
4、核糖體文庫的制備 將PCR擴增的隨機DNA文庫于體外轉錄—翻譯偶聯的E.coli S30 Extract System中表達。采用的E.coli S30 Extract System是適用于線性DNA模板的體外轉錄翻譯系統，將隨機DNA文庫8.5μL，氨基酸混合液(無甲硫氨酸)5μL，S30 Premix without Amino Acids 20μL，[35S]-甲硫氨酸(10.2mCi/mL)1.5μL，S30 Extract 15μL加入到用0.1％DEPC處理過夜的EP管中，30℃溫育2小時30分鐘后，冰上放置5分鐘終止反應。
5、篩選在體外轉錄翻譯混合物中加入DNase去除DNA模板，將體外轉錄/翻譯混合物加入到經無RNase的洗液(PBS pH7.4，1％Tween-20，5mM醋酸鎂)洗滌過的PilS-GST-Sepharose 4B中，4℃搖動1小時，經洗液洗滌3次后收集沉淀，沉淀溶于無RNase的水中，加入無RNase的洗脫液(50mM Tris-醋酸pH 7.5，150mM NaCl，10mM EDTA)，4℃溫育10分鐘使mRNA與核糖體解離，用RNaid Kit回收mRNA。以回收的mRNA為模板進行RT-PCR。
6、克隆和測序將經過一輪篩選的DNA文庫用BamHI和PstI酶切后，克隆到pUC19，挑取12個正確的克隆測序，得到的序列均為同一序列AGG CAG GAG AGG TCTTCT CTT TCG AAG CCG GTG GTG，相應的氨基酸序列為RQERSSLSKPVV，命名為多肽R，在西安美聯公司合成多肽R和對照隨機多肽YYKLPGHHHHYRP。
通過上述方法獲得的氨基酸序列具有以下功能和作用A、細菌侵襲試驗檢測多肽抑制傷寒桿菌侵入THP-1細胞將2、3、4、6μM的多肽R和Y分別與人傷寒桿菌Serovar Typhi J341(野生型人傷寒桿菌)、Typhi PilS-(IV型纖毛缺失的傷寒桿菌)室溫溫育15分鐘后，將傷寒桿菌加入至THP-1細胞(細胞/細菌1/10)，37℃，5％CO2，2小時反應后，用PBS反復洗滌5次以去除胞外菌，再加入慶大霉素(100μg/ml)37℃，5％CO2，1小時溫育以殺滅殘存的胞外菌，再用PBS反復洗滌5次后收獲細胞。將細胞重懸于1％TritonX-100的PBS溶液中，室溫下振蕩10分鐘裂解細胞后，取總體積的1/200涂于20mm的LB瓊脂平板上，37℃培養14-16小時后，計算平板上的菌落數。該侵襲實驗共重復3次，每次試驗每個試驗組均重復3次。
B、等溫滴定量熱法檢測多肽和GST-PilS蛋白的親和力37℃時多肽R與PilS-GST或GST蛋白相互作用的熱力學性質的測定在美國MicroCal公司生產的VP型等溫滴定量熱儀上進行。滴定實驗中，將多肽溶液裝入250μL的滴定注射器，PilS-GST或GST蛋白溶液放入1.43mL的樣品池，攪拌器以300r/min的速度攪拌，每間隔360s加入10μL多肽溶液到蛋白溶液中，共滴28次.參比池中加入去離子水作為樣品池的熱平衡參照.須另做一空白實驗以扣除多肽稀釋熱的影響，即在樣品池中加入緩沖液，用多肽溶液滴定.蛋白的稀釋熱經測定非常小，可略去.所有的溶液都在相應溫度條件下真空脫氣處理以減小信號噪音.積分每個峰面積并扣除稀釋熱后得到結合反應熱，對多肽與蛋白的摩爾比作圖得到反應等溫線.以MicroCal公司提供的Origin軟件(版本5.0)中的獨立結合位點模型進行非線性最小方差擬合，可計算出多肽與蛋白作用的本征結合常數Kb。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學<120>能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽及其制備方法<130>能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽及其制備方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>人工序列<400>1Arg Gln Glu Arg Ser Ser Leu Ser Lys Pro Val val1 5 10<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>2aggcaggaga ggtcttctct ttcgaagccg gtggtg 3權利要求
1.一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽，其具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽，其特征在于核苷酸序列為SEQIDNO.2。
3.一種用于制備權利要求1所述的能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽的方法，它包括以下步驟A、制備和純化PilS-GST-Sepharose 4B將谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白重組質粒菌株接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的2×YT液體培養基中，30℃振蕩培養至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷使其濃度為0.1mmol/L誘導，30℃振蕩培養4～6小時，濃縮菌株，超聲破碎，加入TritonX-100使其濃度為1％，輕混30分鐘，12000轉/分鐘離心10分鐘，取上清，加入谷胱甘肽瓊脂糖4B，25℃混合30分鐘，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，即得到純化的PilS-GST-Sepharose 4B；B、隨機單鏈DNA文庫的構建和引物合成構建長度為90個堿基的隨機單鏈DNA文庫3’-CCT CTA TAT AGGTACCGA TCG(NNM)12AGG CCGGTA GTAGTA GTA GTA GTACCT AGGCCA-5’第一輪PCR的上游引物U15’-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGAAGGAGATATATCCATG-3’，下游引物D15’-GGCATACACTTGAAGGTGAGCCACTACCACTTCCACTACCGGATCCATGATG-3’.第二輪PCR的上游引物U25’-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’，下游引物為D1；C、雙鏈DNA文庫的PCR擴增以單鏈DNA文庫為模板，引物U1和D1擴增得到第一輪PCR產物，用2％瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳，用Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；已回收的DNA為模板，用引物U2和D1進行擴增，得到的產物純化回收，即為雙鏈DNA文庫；D、核糖體文庫的構建將PCR擴增的隨機DNA文庫于體外轉錄—翻譯偶聯的E.coli S30 Extract System中表達，采用的E.coli S30 Extract System是適用于線性DNA模板的體外轉錄翻譯系統，將隨機DNA文庫8.5μL，無甲硫氨酸的氨基酸混合液5μL，S30 Premix without Amino Acids 20μL，10.2mCi/mL的[35S]-甲硫氨酸1.5μL，S30 Extract 15μL加入到用0.1％DEPC處理過夜的EP管中，30℃溫育2小時30分鐘后，冰上放置5分鐘終止反應；E、篩選在體外轉錄翻譯混合物中加入DNase去除DNA模板，將體外轉錄/翻譯混合物加入到經無RNase的洗液洗滌過的PilS-GST-Sepharose 4B中，4℃搖動1小時，經洗液洗滌3次后收集沉淀，沉淀溶于無RNase的水中，加入無RNase的洗脫液，4℃溫育10分鐘使mRNA與核糖體解離，用RNaid Kit回收mRNA，以回收的mRNA為模板進行RT-PCR；F、克隆和測序經過一輪篩選，將獲得的RNA-核糖體—多肽庫經RT-PCR獲得DNA庫，用BamHI和PstI消化后連于質粒pUC19上，隨機挑取單個克隆測序，得到的核苷酸序列和氨基酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的多肽及其制備方法。多肽具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，其制備步驟為首先是制備和純化PilS－GST－Sepharose 4B；其次是隨機單鏈DNA文庫的構建和引物合成；第三是雙鏈DNA文庫的PCR擴增；第四是核糖體文庫的構建；第五是篩選；第六是克隆和測序。本發明的多肽可特異性抵抗和抑制野生型傷寒桿菌對人體細胞的侵襲，制備方法簡便，整個過程都在細胞外進行，不需轉化細胞，即可以獲得大容量庫，提高了稀有克隆被分離出來的概率，增加了給定系統中被篩選序列的多樣性，可以在較短時間內進行多輪篩選。
文檔編號C12P19/34GK1683396SQ20051001838
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者章曉聯, 吳紅艷 申請人:武漢大學