專利名稱：一種骨髓間充質干細胞的分離及培養方法
技術領域：
本發明涉及干細胞的分離和培養，屬生物技術領域。
背景技術：
干細胞(stem cells)是指具有自我更新及多向分化潛能的原始細胞。在造血組織中存在兩種不同的干細胞，即造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)和間充質干細胞(Mesenchymalstem cells，MSCs)。MSCs能為造血干細胞定居、增殖和分化提供有利的微環境。70年代Friedenstein等首次成功地分離培養出MSCs，并發現MSCs具有多向分化潛能。MSCs存在于人類、鳥類、嚙齒類等生物的骨髓中，最近也有人從肌肉、骨組織中獲得。目前的研究已得知在一定的誘導條件下，MSCs可分化形成多種組織，如軟骨、骨和肌腱等；將MSCs注入腦，它還可分化為神經細胞。此外，MSCs易于被外源性基因轉染且穩定表達。因此，MSCs被認為是組織工程及基因治療較為理想的靶細胞。
間充質干細胞分化的組織類型廣泛，在理論上它能分化為所有的間質組織類型。因此若將它分化為骨、軟骨或肌肉、肌腱，則在治療創傷性疾病中具有極大應用價值；若將它分化為真皮組織，則在燒傷中有不可限量的應用前景。
雖然間充質干細胞有著如此獨特的性能和廣泛的用途，但因其來源有限，大大限制了其在組織工程方面及基因治療方面的廣泛應用。
從骨髓中分離MSCs的方法主要有下列幾種①貼壁篩選法利用MSCs貼壁的特性將其分離。
②密度梯度離心法用Ficoll法或Percoll法能有效的將MSCs與其他不同密度的細胞分離，是現在廣泛采用的用于分離純化MSCs的方法，其中用Percoll方法分離與培養出的MSCs大小均勻，純度較高。
③流式細胞分選法或免疫磁珠法根據細胞大小不同或者根據細胞表面的一些特殊標志來分離MSCs，該方法分選的細胞純度高，但對細胞的損傷較大，分選后細胞活力較低。
發明內容
本發明成功建立了一種骨髓間充質干細胞的分離及其培養方法，與上述方法相比本發明方法具有以下突出優點和特點
1)與密度梯度離心法相比，本法所獲得的MSCs純度高，活力較強。
2)與一般貼壁法相比，本法培養細胞所需時間短，原代細胞培養7天后細胞即可生長至對數生長期。
3)對分離的細胞無損傷。
本發明骨髓間充質干細胞的分離方法屬于細胞貼壁法，與以往不同的是，本發明方法在原代細胞培養48小時后進行換液時，采用部分換液的方法，即棄去原培養基的一半再加入新鮮的混合培養液，在去除未貼壁的細胞的同時又保留了存在于原代培養液中的造血干細胞，利用造血干細胞的旁分泌作用，使傳代培養的間充質干細胞生長的形態均一，增殖良好。本發明方法與以往的貼壁法相比，操作更簡單，培養細胞所需時間短，分離得到的間充質干細胞貼壁更快，成長狀況更良好。
通過本發明方法獲得的細胞能夠在體外長期生長和短期內穩定傳代，并具有典型的短梭狀形態，生長速度快、活力較強，特別適合用作組織工程原料或基因治療原料，同時也為干細胞的研究提供了豐富的、新的實驗材料。
本發明骨髓間充質干細胞的分離及培養方法包括1)原代培養a)取經水囊法引產后死亡的四個月胎兒股骨組織，用D-Hank’s液沖洗骨髓腔中的細胞，收集后1200rpm離心7-8分鐘；離心后棄上清，用混和培養液I吹打細胞沉淀，使之形成細胞懸液并進行細胞計數；取含有細胞的混合培養液I按細胞培養密度1～1.5×106個細胞/瓶接種于細胞培養瓶中，并用混合培養液I補足至培養液總量為8-10ml，培養兩天；b)棄去培養液的一半，再加入4～5ml新鮮的混和培養液I，置于二氧化碳孵箱繼續培養使細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，2)傳代培養待細胞生長至對數生長期后，移去原代培養瓶內的細胞培養液，用PBS溶液清洗細胞2～3次，然后向培養瓶中加入1～2ml 0.125％(質量體積百分比)的胰蛋白酶酶溶液(含0.1％EDTA)，在二氧化碳孵箱中放置2～3分鐘，觀察，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液；加入5～7ml混和培養液II，吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸液，經1200rpm離心7～8分鐘，棄上清，加入8～10ml混和培養液II，計數；將含有細胞的混和培養液II按接種密度1～1.5×106個細胞/瓶接種于新培養瓶中，并用混合培養液II補足至培養液總量為8～10ml，培養至細胞生長良好，形態均一，即完成傳代培養。
所述混合培養液I的組分為L-DMEM/IMDM為1∶1，15％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。
所述混合培養液II的組分為L-DMEM/IMDM為1∶1，10％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。
本發明方法在細胞培養條件方面沒有特殊要求，按常規保證細胞生長所需條件即能保證細胞生長良好，形態逐漸均一。
本方法最終獲得的細胞形態細長，細胞顏色致密，聚簇生長。發明人將這種源于人胎兒骨髓間充質干細胞、通過本發明方法分離、培養最終獲得的間充質干細胞命名為BMMS-03細胞。
本發明方法獲得的BMMS-03細胞的生物學特征是1)能夠在體外長期生長和短期內穩定傳代；2)具有典型的短梭狀形態，生長旺盛；
圖1 BMMS-03細胞形態學觀察圖BMMS-03細胞形態學觀察細胞伸出突起，呈短梭狀，并開始分裂增殖(圖1A)。4天后，貼壁分裂增殖的細胞形成大小不同、分散的細胞集落，細胞內可見有1～2個細胞核，核居中，核中有1～2個核仁(圖1B)。7天后，細胞生長匯合達90％以上，呈旋渦狀或平行狀排列(圖1C)。圖中A.培養后第2天；B.培養后第4天；C.培養后第7天。(圖示為100倍鏡下觀察的細胞形態)圖2流式細胞儀對BMMS-03細胞檢測結果圖。
A.CD105陽性率為97.2％；B.CD106陽性率為66.0％；C.CD34陽性率為9.2％； D.陰性對照組陽性率為0.5％.
具體實施例方式
下面通過實施例來說明本發明方法，但并不限制本發明。
實施例中所述引產胎兒股骨組織由天津醫科大學第二附屬醫院婦產科提供。
實施例中所使用混合培養液I的組分為L-DMEM/IMDM為1∶1，15％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素。混合培養液II的組分為L-DMEM/IMDM為1∶1，10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素。
實施例1(1)原代培養取經水囊法引產后死亡的四個月胎兒股骨組織，用D-Hank’s液沖洗骨髓腔中的細胞，收集后1200rpm離心8分鐘；離心后棄上清，用混和培養液I吹打細胞沉淀，使之形成細胞懸液并進行細胞計數；取含有細胞的混合培養液I，按細胞培養密度1×106個細胞/瓶接種于100ml的細胞培養瓶中，用混合培養液I補足至培養液總量為8-10ml，按常規培養兩天，棄去原培養基的一半，再加入5ml新鮮的混和培養液I，置于二氧化碳孵箱繼續培養。
(2)傳代培養待細胞進入對數生長期后，移去原代培養的培養瓶內的細胞培養液，用PBS溶液清洗細胞2次，然后向培養瓶中加入2ml質量體積百分比為0.125％的胰酶(含0.1％EDTA)，置37℃二氧化碳孵箱中2分鐘，當觀察到細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入6ml混和培養液II，吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸液，經1200rpm離心8分鐘，棄上清，加入8ml混和培養液II，吸取10ul細胞重懸液置于血球計數板上進行常規的細胞計數。取100ml標準培養瓶一個，將含有細胞的混和培養液II，按接種密度1×106個細胞/瓶，接種于新的培養瓶中，并用混和培養液H補足至培養液總量為8-10ml繼續培養至細胞生長良好，形態均一。
在培養期間，需按常規保證細胞生長所需的各種條件，例如溫度(37℃)，二氧化碳濃度(5％)，穩定的PH值及適宜的濕度等。
在倒置顯微鏡下觀察，所得細胞呈短梭狀，細胞形態均一，無接觸抑制，并且生長迅速。
目前對間充質干細胞的研究已表明，它不表達血細胞及內皮細胞的抗原，而只表達基質細胞和間質細胞特異性表面標志，即一般而言，間充質干細胞的表面抗原以CD105、CD106、CD44和CD29為陽性，而CD34、CD45、CD31和HLADR為陰性。
發明人對本發明獲得的BMMS-03進行了細胞周期檢測鑒定，結果如下經流式細胞儀檢測，第3代細胞(原代細胞傳代三次獲得的細胞)表面標志物CD105的陽性率為97.2％；CD106的陽性率為66.0％；CD34的陰性陽性率為9.2％；陰性對照組為0.5％。見圖2。
本發明方法培養的BMMS-03細胞，能夠體外長期生長和短期內穩定傳代。經實驗觀察與驗證，體外生長的BMMS-03細胞具有典型的短梭狀形態，且生長旺盛。
實施例2(1)原代培養取經水囊法引產后死亡的四個月胎兒股骨組織，用D-Hank’s液沖洗骨髓腔中的細胞，收集后1200rpm離心7分鐘；離心后棄上清，用混和培養液I吹打細胞沉淀，使之形成細胞懸液并進行細胞計數；取含有細胞的混合培養液I，按細胞培養密度1.5×106個細胞/瓶，接種于100ml的細胞培養瓶中，用混合培養液I補足至培養液總量為8-10ml，按常規培養兩天，棄去原培養基的一半，再加入4ml新鮮的混和培養液I，置于二氧化碳孵箱繼續培養。
(2)傳代培養待細胞進入對數生長期后，移去原代培養的培養瓶內的細胞培養液，用PBS溶液清洗細胞3次，然后向培養瓶中加入1.5ml質量體積百分比為0.125％的胰酶(含0.1％EDTA)，置37℃二氧化碳孵箱中3分鐘，當觀察到細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入7ml混和培養液II，吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸液，經1200rpm離心8分鐘，棄上清，加入9ml混和培養液II，吸取10ul細胞重懸液置于血球計數板上進行常規細胞計數。取100ml標準培養瓶一個，將含有細胞的混和培養液II，按接種密度1.5×106個細胞/瓶，接種于新的培養瓶中，并用混和培養液II補足至培養液總量為8-10ml，按常規培養至細胞細胞生長良好，形態均一。
在倒置顯微鏡下觀察，所得細胞呈短梭狀，細胞形態均一，無接觸抑制，并且生長迅速。
權利要求
1.一種骨髓間充質干細胞分離、培養方法，其特征在于它包括1)原代培養；a)取經水囊法引產后死亡的四個月胎兒股骨組織，用D-Hank’s液沖洗骨髓腔中的細胞，收集后1200rpm離心7～8分鐘；離心后棄上清，用混和培養液I吹打細胞沉淀，使之形成細胞懸液并進行細胞計數；取含有細胞的混合培養液I按細胞培養密度1～1.5×106個細胞/瓶接種于細胞培養瓶中，并用混合培養液I補足至培養液總量為8～10ml，培養兩天；b)棄去培養液的一半，再加入4～5ml新鮮的混和培養液I，置于二氧化碳孵箱繼續培養使細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養；2)傳代培養；待細胞生長至對數生長期后，移去原代培養瓶內的細胞培養液，用PBS溶液清洗細胞2～3次，然后向培養瓶中加入1～2ml 0.125％(質量體積百分比)的胰蛋白酶酶溶液(含0.1％EDTA)，在二氧化碳孵箱中放置2～3分鐘，觀察，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液；加入5～7ml混和培養液II，吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸液，經1200rpm離心7～8分鐘，棄上清，加入8～10ml混和培養液II，計數；將含有細胞的混和培養液II按接種密度1～1.5×106個細胞/瓶接種于新培養瓶中，并用混合培養液II補足至培養液總量為8～10ml，培養至細胞生長良好，形態均一，即完成傳代培養。所述混合培養液I的組分為L-DMEM/IMDM為1∶1，15％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。所述混合培養液II的組分為L-DMEM/IMDM為1∶1，10％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。
全文摘要
本發明公開了一種骨髓間充質干細胞的分離及培養方法，與以往的方法相比，本法操作更為簡便，同時由于采用了部分換液的方法，從而使培養細胞所需時間縮短，分離得到的間充質干細胞純度較高，增殖較快。本發明方法所得細胞形態均一，呈長梭形，傳代后，在8代以內的細胞貼壁能力較強，生長速度較快。間充質干細胞來源有限，本方明方法為間充質干細胞的研究和應用提供了豐富的材料來源。
文檔編號C12N5/08GK1699557SQ20051001355
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月26日 優先權日2005年5月26日
發明者張曉東, 葉麗虹, 徐治立, 趙鐵軍 申請人:南開大學