專利名稱：一種高產促胰島素激素的畢赤酵母工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種高產促胰島素激素畢赤酵母工程菌(Pichia pastoris)及其構建方法，屬于分子生物領域。
背景技術：
促胰島素激素(GLP-1)的化學名稱是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1)，是一種通過與胰島β細胞表面的特異受體相互作用而使葡萄糖誘導的胰島素分泌顯著增強的物質。研究證實GLP-1能刺激胰島素分泌，且血糖越高GLP-1的作用越強；但如血糖濃度恢復至正常值時，GLP-1就不會再繼續作用，因而不會產生低血糖現象；此外，GLP-1還同時減少胰島細胞損傷，改善胰島細胞結構，修復胰島細胞功能，提高胰島細胞活力并延長其壽命、抑制胰升糖素的釋放、調控胰腺β細胞特異基因表達并通過這種基因調控改善葡萄糖運轉和代謝，提高β細胞對葡萄糖的反應性以及降低食欲和抑制胃的排空等。因此目前GLP-1被認為是可用于從根本上治療糖尿病的物質，對于糖尿病的治療具有重要意義。
中國專利(CN1363654A)公開了一種以大腸桿菌為宿主細胞構建生產GLP-1的工程菌并用于液體發酵培養，產生和積累含有GLP-1(7-36)的包涵體，通過細胞破碎和包涵體的分離純化得到融合蛋白，再經過融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)的純化得到產品。
國內有文獻報道張志珍等人利用大腸桿菌來生產hGLP-1[中國生物化學與分子生物學報，2002，2，18(1)5-8]。張志珍等人采用亞磷酸二酯法合成hGLP-1cDNA的6個寡核苷酸片段，拼接成完整的hGLP-1cDNA，構建重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)獲得表達菌株，高密度發酵培養，純化得到GST融合蛋白。純化后GST-rhGLP-1重組蛋白的含量為2.1g/L。
國外文獻報道說，Egel-Mitani等人利用釀酒酵母(S.cerevisiae)生產短肽(包括)GLP-1、GLP-2、GRPP等，其中在野生型的釀酒酵母中GLP-1的發酵產量能達到34.3mg/L，(US6110703/Novo Nordisk/S，2000.08.29)。
發明內容
本發明的目的是提供一種畢赤酵母(Pichia pastoris)GLP-1高產工程菌株及其構建方法，以期利用該高產工程菌大規模地發酵生產促胰島素激素(GLP-1)。
本發明是利用畢赤酵母真核表達系統來生產GLP-1，其表達產物蛋白不會產生高度抗原性，表達量極高并可分泌到胞外，在獲得高產率的同時克服了用大腸桿菌表達系統生產GLP-1時所得產物不易純化且容易產生免疫源性的缺點，以本發明菌株生產的產品特別適合醫藥治療用途。
本發明GLP-1高產菌株經鑒定GLP-1產量可達到100mg/L，遠遠高于前述國外文獻報道的利用釀酒酵母生產GLP-1。
目前國內外尚無構建畢赤酵母(Pichia pastoris)GLP-1工程菌的報道。
本發明目的通過以下技術方案實現1)構建畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9GLP-1根據畢赤酵母表達載體pPIC9質粒多克隆位點的序列特點，設計上游引物和下游引物；將克隆的GLP-1直接連入T-vector得到pMDGLP-1，用Smal I和Not I酶切得到GLP-1基因片段；質粒pPIC9用XhoI酶切后補平粘端；再用Not I酶切，回收大片段；將GLP-1基因片段與pPIC9大片段通過T4DNA連接酶連接，篩選陽性轉化子從而完成畢赤酵母表達載體pPIC9GLP-1的構建。
2)構建畢赤酵母GLP-1生產菌株重組質粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之線性化，再以醋酸鋰轉化法轉化畢赤酵母菌株GS115感受態細胞；在MD培養基上培養兩天，挑取陽性轉化子，獲得畢赤酵母GLP-1生產菌株。
3)篩選畢赤酵母GLP-1高產菌株通過PCR、Southern雜交和Western blot等方法對轉化子進行分子檢測，確證GLP-1基因已整合到畢赤酵母基因組并正確表達；將各轉化子細胞接種于BMGY液體培養基中，30℃振蕩培養40～48小時，250r/min，無菌條件下離心棄上清，換成BMMY液體培養基；在誘導過程中，每24小時加入適量甲醇使其終濃度維持在0.75％附近；培養60小時后離心收集各轉化子的上清培養基；用Tricine SDS-PAGE蛋白質電泳和密度掃描法檢測轉化子的GLP-1的分泌表達產量，篩選出畢赤酵母GLP-1高產菌株。
在克隆GLP-1基因片段時，上下游引物選擇以下方案上游引物cccgggcaaa agacattctg agggaac下游引物gcggccgctta acggccatct acg本發明的優點和特點在于a、本發明菌株GLP-1表達量極高并可分泌到胞外，易純化。本發明是畢赤酵母真核表達系統，與原核表達系統不同，它可以進行一系列翻譯后的修飾，且它可使用強效的醇氧化酶(AOX1)啟動子，在甲醇誘導下實現外源基因的高效表達。
b、本發明菌株生產出的GLP-1在氨基酸序列上被消除了胰蛋白酶的酶切位點，不易被胰蛋白酶降解，制成口服制劑時不會出現失活的問題。一般的蛋白質類口服進入胃腸以后，大多數都會被胃蛋白酶和胰蛋白酶等酶類降解，本發明菌株生產的GLP-1通過點突變的方式在其基因序列上發生突變，最后在氨基酸序列上已消除胰蛋白酶的酶切位點。產品的這一特點對于糖尿病的患者來說是一種福音，尤其是對于I型糖尿病，因其治療一直是依靠注射給藥來不斷補充胰島素的，而長期注射藥給病人帶來了很多不便和痛苦。
c、本發明菌株生產出的GLP-1在體內存活時間較天然GLP-1長。天然的促胰島素激素(GLP-1)在體內會很快被體內的特異性二肽酶IV(DPP IV)降解而失活，而本發明菌株生產的GLP-1已被巧妙地消除了促胰島素激素內二肽酶IV(DPP IV)酶切位點，能確保產物在體內保持較長時間的功能活性，提高了對糖尿病的治療效果。
d、本發明構建的GLP-1畢赤酵母工程菌的表達產物蛋白不會產生免疫源性，產品特別適合用于治療用途。
圖1、本發明構建的菌株生產的GLP-1氨基酸序列與天然GLP-1氨基酸序列對比圖2、篩選高產促胰島素激素的畢赤酵母工程菌株的技術路線具體實施方式
下面以實施例說明本發明，但并不限制本發明。
實施例11)構建畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9GLP-1根據pPIC9質粒多克隆位點的序列特點，選擇上游引物cccgggcaaa agacattctg agggaac，下游引物gcggccgctta acggccatct acg；將克隆的GLP-1直接連入T-vector得到pMDGLP-1，用Smal I和Not I酶切得到GLP-1基因片段；質粒pPIC9用XhoI酶切，然后補平粘端，再用NotI酶切，回收大片段；將GLP-1基因片段與pPIC9大片段通過T4DNA連接酶連接，篩選陽性轉化子。
20μLPCR反應體系10×Buffer2.0上游primer0.5下游primer0.5
dNTP0.4Taq DNA聚合酶 0.7模板0.3無菌雙蒸水 15.6共 20μL反應程序預變性94℃ 10min變性94℃55sec退火53℃55sec33個循環延伸72℃30sec延伸72℃5min4℃保溫2)構建畢赤酵母GLP-1生產菌株重組質粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之線性化，之后采用醋酸鋰轉化法轉化畢赤酵母菌株GS115感受態細胞。在MD培養基上培養兩天，挑取陽性轉化子獲得畢赤酵母GLP-1生產菌株。
3)篩選畢赤酵母GLP-1高產菌株通過PCR、Southern雜交和Western blot等方法對轉化子進行分子檢測，確證GLP-1基因已整合到基因組并正確表達；將各轉化子畢赤酵母細胞接種于BMGY液體培養基中，30℃振蕩培養40～48小時，250r/min，無菌條件下離心棄上清，換成BMMY液體培養基。在誘導過程中，每24小時加入適量甲醇使其終濃度維持在0.75％附近。培養60小時后離心收集各轉化子的上清培養基。用Tricine SDS-PAGE蛋白質電泳和密度掃描法來檢測轉化子的GLP-1的分泌表達產量，篩選出畢赤酵母GLP-1高產菌株。
實施例21)畢赤酵母的發酵培養將各轉化子畢赤酵母細胞接種于5ml BMGY液體培養基中，30℃振蕩培養40～48小時，無菌條件下離心棄上清，換成10ml BMMY液體培養基。在誘導過程中，每24小時加入適量甲醇使其終濃度維持在大約0.75％。培養60小時后離心收集上清，不加甲醇誘導為空白對照。
BMGY and BMMY培養基的配方1％yeast extract2％peptone100mM potassium phosphate，pH 6.01.34％YNB4×10-5％biotin1％glycerol or 0.5％methanol2)目的蛋白的收集沉淀以及電泳檢測發酵液12000X離心10分鐘，得到的上清液用硫酸銨或者1/10體積的100％TCA來沉淀蛋白質，然后采用Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳來確定目的蛋白的表達情況。
3)高產畢赤酵母工程菌株的鑒定通過密度掃描法對電泳條帶進行掃描分析，以確定各個陽性轉化子的分泌表達量，篩選出畢赤酵母高產促胰島素激素的工程菌株，所得該工程菌發酵生產GLP-1的產量可以達到100mg/L。
權利要求
1.一種促胰島素激素高產畢赤酵母工程菌的構建方法，其特征在于包括a)構建畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9GLP-1根據畢赤酵母表達載體pPIC9質粒多克隆位點的序列特點，設計上游引物和下游引物，將克隆的GLP-1直接連入T-vector得到pMDGLP-1，用SmalI和NotI酶切得到GLP-1基因片段；質粒pPIC9用XhoI酶切后補平粘端；再用NotI酶切，回收大片段；將GLP-1基因片段與pPIC9大片段通過T4DNA連接酶連接，篩選陽性轉化子從而完成畢赤酵母表達載體pPIC9GLP-1的構建；b)構建畢赤酵母GLP-1生產菌株重組質粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之線性化，再以醋酸鋰轉化法轉化畢赤酵母菌株GS115感受態細胞；在MD培養基上培養兩天，挑取陽性轉化子，獲得畢赤酵母GLP-1生產菌株；c)篩選畢赤酵母GLP-1高產菌株通過PCR、Southern雜交和Western blot等方法對轉化子進行分子檢測，確證GLP-1基因已整合到基因組并正確表達；將各轉化子畢赤酵母細胞接種于BMGY液體培養基中，30℃振蕩培養40～48小時，250r/min，無菌條件下離心棄上清，換成BMMY液體培養基；在誘導過程中，每24小時加入適量甲醇使其終濃度維持在0.75％附近；培養60小時后離心收集各轉化子的上清培養基；用Tricine SDS-PAGE蛋白質電泳和密度掃描法檢測轉化子的GLP-1的分泌表達產量，篩選出畢赤酵母GLP-1高產菌株。
2.根據權利要求1所述工程菌的構建方法，其特征在于克隆GLP-1基因片段時所采用的上游引物和下游引物分別為上游引物cccgggcaaa agacattctg agggaac下游引物gcggccgctta acggccatct acg
3.根據權利要求1或2所述方法制備的促胰島素激素高產畢赤酵母工程菌。
全文摘要
本發明公開了一種高產促胰島素激素畢赤酵母(Pichia pastoris)工程菌及其構建方法。本發明運用分子生物學技術先構建畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9GLP－1，然后將其線性化后轉化進入畢赤酵母GS115中，從而獲得能夠高效分泌表達促胰島素激素的畢赤酵母工程菌，該工程菌的促胰島素激素產量可達到100mg/L。同時，利用該高產工程菌生產的促胰島素激素產品，其氨基酸序列不同于天然產品，且已被消除了胰蛋白酶切位點，因此不僅在體內不會被特異性的蛋白酶降解而能夠長時間的保持活性，而且由于不會被胰蛋白酶降解，還可以制成口服制劑使用。
文檔編號C12N15/10GK1865430SQ20051001351
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月16日 優先權日2005年5月16日
發明者李明剛, 侯建華, 方園園, 薄濤, 王翠艷, 楊少輝, 武志強, 閆瑞香 申請人:南開大學