快速分析抗腫瘤中藥作用機理的dna芯片及其方法

專利名稱：快速分析抗腫瘤中藥作用機理的dna芯片及其方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種能夠快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片及其工藝。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病，已成為繼心血管疾病之后居各類疾病死亡率的第二致死病因。在我國，每年約有90萬腫瘤病人死亡，并且近年來死亡人數呈逐年遞增的趨勢。因此，世界各國都投入巨資研究開發抗腫瘤藥物。很明顯抗腫瘤藥物市場前景廣闊。盡管到目前為止已有數十種化療或輔助抗腫瘤藥物可以用于臨床治療，但大多數藥物只能使病情緩解，無法達到治愈的目的。尤其是大多數死亡率很高而又很常見的癌癥，如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌藥物。因此，迫切需要新的、具有明顯療效的抗癌藥物的研究和開發。目前，中藥正逐步為世界所認識、接受是不可否認的事實與潮流，特別是中藥在抗癌、治癌方面有著明顯的優勢，得到國際的公認。有統計表明，歐美大藥廠研制一種新的合成藥物需要7～10年的時間和0.8～3.5億美元，而有些藥物如抗腫瘤藥，篩選命中率更低至萬分之一。而我國的瑰寶中藥有數千年輝煌歷史、深入系統的理論和豐富寶貴的治療經驗，中藥材資源及相關方劑數不勝數，更有各種抗癌的古方、驗方、秘方。應該能夠大有所為，但如何讓中國已知抗癌功效的中藥進入規范嚴格的國際市場，其瓶頸就是分析出成分復雜的中藥復方、單方的分子作用機理。這需要發明一種全新的系統。這種系統的特點必須是①能夠快速的大規模分析藥物作用原理；②通用性強；③適用范圍廣；④不局限于一種或一類藥物。DNA芯片(DNA Microarray)技術，是順應人類基因組計劃(HGP)的進行而產生的一種高通量、大規模研究基因功能的新技術，在基因芯片的表面，以微陣列(array)的方式固定有成千上萬的寡核苷酸(oligo)或cDNA。使用DNA芯片可以大規模的對研究者感興趣的基因表達進行測定。人類基因組計劃(HGP)獲得了大量基因信息，包括關鍵疾病基因的確定，為藥物作用提供了大量的新靶點。隨著分子腫瘤學、分子藥理學的發展，越來越多的證據表明，抗腫瘤藥物發揮作用的機理均通過影響腫瘤細胞基因表達而進一步引起細胞和瘤體表型的改變。藥物作用后細胞內基因表達變化特征與細胞和瘤體表型改變呈現內在規律，根據這種規律，可以在未觀察到細胞表型變化之前就推測藥物的作用機理。藥物引發的基因表達變化非常復雜，呈現基因相互作用和調控后的級聯反應。因此，根據個別基因的變化來推測藥物最終引起的表型變化往往有失偏頗。而通過觀察基因群的變化，雖復雜但能反映藥物作用的內在規律。傳統的分子生物學技術均無法在同一時間內分析大量的基因表達變化，而基因表達譜芯片集成了成千上萬種基因，因此使在同一時間內分析大量的基因表達變化成為可能。

發明內容
為了解決傳統的分子生物學技術均無法在同一時間內分析大量的基因表達變化的缺陷，本發明提供一種快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片及其方法，它可以縮短藥物研究開發周期及減少藥物研究開發費用，加快中藥進入國際市場。本發明的目的是這樣實現的快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片由下述具有轉錄，細胞周期，癌基因和腫瘤抑制基因，應激反應蛋白，DNA合成、重組和修復，凋亡相關蛋白，細胞黏附受體蛋白，細胞信號傳導，細胞外通訊蛋白，細胞受體，細胞骨架/遷移蛋白，免疫系統蛋白，膜通道和轉運蛋白，代謝，翻譯后修飾/蛋白折疊，細胞交通定位，DNA結合及染色質蛋白，細胞外基質轉運蛋白，細胞內傳導/效應/調節子，細胞表面抗原，RNA處理、周轉和轉運，翻譯，蛋白周轉，其他功能，和細胞外基質生物學功能的基因片段組成。快速分析抗腫瘤中藥作用機理的方法按照下述步驟進行分析一、選擇上述DNA芯片作為分析抗腫瘤中藥作用機理的芯片；二、選擇臨床常規使用的以及民間流行的抗腫瘤中藥作為工具藥物；三、選擇常用的腫瘤細胞株作為細胞模型；四、用上述抗腫瘤中藥分別作用于細胞模型后，利用CCK8方法篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，提取mRNA，與DNA芯片雜交檢測藥物作用的基因；五、應用生物信息學對藥物反應基因進行統計和分類；六、依據藥物標志基因和特異性中瘤基因的變化規律，進行分子細胞水平的機理驗證。本發明的快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片及其方法具有許多商用價值和科研價值，具體表現為(1)能夠快速分析已知臨床使用的中藥以及民間秘方的抑制癌細胞的分子機理，改變中藥的出口困難的窘境。(2)該系統能夠作為一種商品，廣泛應用于臨床、醫藥行業以及實際生產中。(3)探明分子作用機理，尋找到新的藥物靶點，為下一步開發小分子藥物設計提供候選靶點。


圖1為CCK-8法檢測藥物對Hela癌細胞的半抑制率結果圖；圖2為CCK-8法檢測藥物對AGZY癌細胞的半抑制率結果圖；圖3為CCK-8法檢測藥物對PC3癌細胞的半抑制率結果圖；圖4為DNA片斷化實驗結果圖，其中C對照，T藥物處理，M標記；圖5為癌細胞經5，7，4-三羥異黃酮處理前的形態圖；圖6為癌細胞經5，7，4-三羥異黃酮處理后的形態圖；圖7為染料木素對PC3細胞6小時處理表達譜芯片熒光圖；圖8為RT-PCR驗證TGF-β基因的表達變化結果圖，其中M分子量標記，C對照，S樣品；圖9為RT-PCR驗證VEGF165和VEGF121基因的表達變化結果圖，其中M分子量標記，C對照，S樣品；圖10為RT-PCR驗證Cyclin B和Cyclin A基因的表達變化結果圖，其中M分子量標記，C對照，S樣品；圖11為5，7，4-三羥異黃酮藥物抑制PC3癌細胞的基因通路圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式的快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片的基因類型、參數詳見表1～2。
具體實施方式
二.本實施方式按照下述步驟快速分析抗腫瘤中藥作用機理一、選擇抗腫瘤中藥作為工具藥物，它們可以是亞砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羥異黃酮、大豆皂甙、大豆甾醇等中的一種或幾種。二、本發明采用的篩選抗腫瘤藥物的細胞株是目前常用的腫瘤細胞株，它們是早幼細胞白血病HL-60、慢性髓細胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宮頸癌Hela等中的一種或幾種。三、用上述抗腫瘤中藥分別作用于細胞模型后，利用CCK8方法篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，依據其半抑制濃度值IC50。
公式抑制率(％)＝(對照組OD值-用藥組OD值)/對照組OD值×100四、用上述實驗獲得的藥物IC50濃度處理相應腫瘤細胞系，提取mRNA，與DNA芯片雜交，檢測藥物作用下基因表達水平變化。具體步驟腫瘤細胞用中藥相應的IC50濃度處理5分鐘，30分鐘，1小時，2小時，4小時，8小時，12小時，24小時后，利用RNeasy RNA試劑盒提取各時間段總RNA，通過紫外分光度計檢測RNA的Ratio值。進一步利用Oligotex mRNA Midi試劑盒純化分離mRNA，選取Cy3和Cy5為熒光物，進行后標記，利用紫外分光光度計檢測標記效率。探針與雜交液(含50％甲酰胺)均勻混合，平鋪于芯片表面，蓋上Takara的芯片專用蓋玻片，置于42℃避光水浴20小時進行雜交。取出雜交后的芯片，利用嚴謹的洗片方法進行后處理，自動化的洗片機保證芯片之間的差異程度降到最低。經過洗滌后的芯片立刻用Axon4000A型掃描儀進行掃描，采集數據，獲得藥物對特定細胞株的基因表達譜。根據生物信息學聚類分析，獲得藥物作用細胞株后，具有表達規律的靶基因。利用Western blot(免疫印記)以及RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈反應)驗證這些基因的表達規律，推測中藥抑制癌細胞的分子機理。
具體實施方式
三本實施方式以5，7，4-三羥異黃酮藥物為例，對本發明做詳細說明一、制備DNA芯片1、本實施方式使用17000個PCR擴增產物作為點樣DNA(基因類型、參數詳見表1～2)，用50％DMSO(二甲基亞砜)將PCR產物溶解至濃度為0.2μg/μl～0.5μg/μl，成為點樣工作液(注PCR產物點樣前應變性99.9℃5min，迅速放于冰上)。2、將點樣工作液按所需要的點陣模式進行排列，轉移到384孔的微孔板中，即可開始點樣(溫度20～23℃，相對濕度40～50％)，采用Telechem公司的醛基化玻片進行點樣。3、點樣完畢后，玻片在室溫防塵條件下放置過夜，放置一周更好。4、取出過夜放置的玻片，以60mJ/cm2的能量進行紫外交聯兩次。5、芯片的后處理(在做芯片的后處理前應在玻片上標記好DNA點陣的位置，因為后處理后點陣將看不到)①紫外交聯固定后，將玻片在0.2％SDS(十二烷基磺酸鈉)溶液中潤洗2次，每次2min，以去掉未結合上的DNA；②將玻片在滅菌去離子水中室溫洗2次，每次2min；③將玻片放入95～100℃(剛停止沸騰)的水中，水浴2min，使DNA變性；④取出玻片，室溫放置5min，使之冷卻；⑤將玻片置于新鮮配制的NaBH4溶液(1.5克NaBH4溶于450ml PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液中，然后加入133ml 100％乙醇)中，處理5分鐘以封閉自由醛基；⑥將玻片置于0.2％SDS中潤洗3次，每次1min；⑦將玻片置于滅菌去離子水中潤洗2次，每次1min；⑧700rpm/min離心干燥3min，得到可供使用芯片，芯片在室溫下防塵保存。
二、CCK-8法分析5，7，4-三羥異黃酮對不同的癌細胞的殺傷抑制率1、經過文獻檢索以及實驗分析，5，7，4-三羥異黃酮微溶于水，而易溶于Na2CO3，將其配成母液10mM，然后經過濾膜過濾除菌；2、CCK-8法分析5，7，4-三羥異黃酮對不同的癌細胞的殺傷抑制率，IC50(50％抑制率)檢測；CCK-8實驗步驟①細胞計數；②播種5.6×104細胞/ml，每孔90ul，放置于培養箱(37度，5％的CO2)培養24h；③加藥每孔10ul混勻，放置于培養箱培養48h；④加CCK-8溶液每孔10ul混勻，注意不要產生氣泡，放置于培養箱培養4h(CCK用之前要37度水浴5min)；⑤于酶標儀450nm進行讀數，從而得出細胞存活率。藥物濃度(五個不同梯度)見圖1～3。3、5，7，4-三羥異黃酮藥物導致AGZY癌細胞凋亡的確認通過DNA ladder(DNA片斷化)以及AGZY細胞形態檢測來檢測凋亡(見圖4～6)。4、處理時間選取通過對PC3細胞進行5分鐘，30分鐘，1小時，2小時，4小時，8小時，12小時，24小時藥物處理，利用RNeasy RNA試劑盒提取各時間段總RNA，通過紫外分光度計檢測RNA的Ratio(比值)值，進一步利用Oligotex mRNA Midi試劑盒純化分離mRNA。
三、探針標記及芯片雜交實驗將各時間點樣本mRNA(信使核糖核酸)和原始細胞reference RNA(參考RNA)進行雜交分析。步驟如下(1)用amino allyl-dUTP(氨基酰脫氧尿苷酸，AA dUTP)修飾cDNA引物退火①在冰上于1.5ml離心管中加入以下成分mRNA(500ng，小于9μl) Xμl隨機引物 1μloligo(dt)(寡聚脫氧胸腺嘧啶) 1μl水(試劑盒提供)Yμl總體積11μl注意如使用總RNA，則略去隨機引物，oligo(dT)的使用量為3μl；②用吸頭上下輕輕混勻；③反應體系于70℃溫育5min；④室溫冷卻10min，使引物與mRNA模板退火；⑤離心15s。
延伸①在以上的反應體系中加入以下成分(最后加酶)5Xbuffer(緩沖液) 4μl0.1M DTT(二硫蘇糖醇) 2μlNucleotide mix(核苷酸混合物) 1μlAA-dUTP(氨基酰脫氧尿苷酸) 1μl反轉錄酶 1μl總體積20μl②用吸頭輕混，離心15s，過激混將使酶降；③42℃溫育1.5小時；④將cDNA(互補DNA)放于冰上立即純化或-20℃儲存。
(2)純化amino allyl修飾的cDNA
降解mRNA①水浴調整至37℃；②在每個反應管中加2μl 2.5M NaOH；③用漩渦混合器混勻，離心15s；④37℃溫育15min；⑤在每個反應管中加入10μl 2M HEPES；⑥用漩渦混合器混勻，離心15s；⑦cDNA現在可以用來純化或者貯存于-20℃。
用GFX純化試劑盒純化cDNA(在用GFX純化之前，需準備新配置的0.1M，pH＝9.0的NaHCO3)①在每個柱上加500μl capture buffer(捕捉緩沖液)；②將未純化的cDNA轉移至柱上，上下吸5次混勻；③13 800g離心30s；④棄去管底部的液體，將柱重新放入收集管；⑤加600ul 80％的乙醇，13 800g離心30s；⑥棄去液體，重復步驟5，共洗3次，最后一次洗后，棄去液體，將管重新放入同一收集管；⑦13 800g離心15s，除去殘留乙醇，棄掉管；⑧將GFX柱轉移至新管，加60μl 0.1M NaHCO3，使液體覆蓋整個膜；⑨室溫1～5min，13 800g離心1min收集純化的aminoallyllabelled cDNA(氨基酰標記的cDNA)；⑩立刻進行以下的反應。
(3)用Cy3、Cy5標記amino allyl修飾的cDNA后標的偶聯反應(避光操作)①將cDNA直接放入CyDye NHS ester(Cy染料NHS酯)的1.5ml管中，用吸頭反復重懸數次，13 800g離心1分以使所有液體收集于底部；②室溫避光作用60～90min；③加15μl 4M的羥胺于每個反應管；④上下吸數次混勻，室溫暗處作用15min；⑤繼續以下的純化反應。
純化熒光標記的cDNA(用CyScribe GFX純化試劑盒，wash buffer在使用前加入40ml的無水乙醇，加后密封以防揮發)①將GFX柱放入干凈的收集管，加500ul capture buffer(捕捉緩沖液)；②將未純化的cDNA(20-100μl)轉移至每個柱，用吸頭輕柔混五次；③立即于13 800g離心30s，cDNA探針在capture buffer中超過10min將會使產量降低；④棄去底部液體，將柱重新放入收集管；⑤加600μul的wash buffer(沖洗緩沖液)，13 800g離心30s；⑥重復步驟⑤，共需洗三次，不要縮減洗的次數；⑦最后一次洗后，另需離心10s以充分除去wash buffer；⑧將柱轉移至新的收集管，加60μl的elution buffer(洗脫緩沖液)，使其覆蓋整個膜，將elution buffer預熱至65度將會使收率提高5％；⑨室溫作用1～5min，13800g離心1min收集標記的cDNA；⑩重復步驟⑨，在260nm下檢測cDNA濃度，649nm和550nm分別檢測Cy5和Cy3的摻入率。
(4)雜交及洗片雜交①將標記的兩管cDNA合并成一管，避光將cDNA蒸干；②將cDNA溶解于6μl無核酸酶的水中；③95℃變性2min；④冰上冷卻30s；⑤加1.5μl的polyA(多聚腺苷酸)(1mg/ml)以封閉polyT(多聚胸腺嘧啶)尾巴，混勻，75℃作用45min；⑥加7.5μl的雜交緩沖液(提供好的)和15μl 100％的甲酰胺，混合均勻，離心15s；⑦鋪片，不要有氣泡(將Takara的蓋玻片蓋于雜交區域，然后用移液器從蓋玻片兩側分別注入一半體積的雜交液)；⑧42℃濕盒中雜交16～18h，注意避光。
洗片盡量采用嚴謹的洗片程序。①先在250ml預熱至55℃的1×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液)+0.2％SDS(十二烷基磺酸鈉)中洗10分鐘；②然后在預熱至55℃的0.1×SSC+0.2％SDS中洗兩次，每次洗10分鐘；③室溫在0.1×SSC中洗兩次，每次1分鐘；④最后在ddH2O(雙蒸水)中浸一下(小于10s)；⑤短暫離心干燥。
四、用Axon4000A型掃描儀進行掃描，采集數據見圖7，經過雙通道激光掃描儀在波長為650nm與550nm分別掃描后，得到組圖中代表性的一張表達譜芯片熒光圖。
五、生物信息學分析經生物信息學數據分析，顯示5，7，4-三羥異黃酮藥物抑制PC3癌細胞，一些與血管生成密切相關的基因表達明顯下調，如血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF-β)和骨衍生生長因子(BDGF)等等。而與細胞生長周期相關的基因也有明顯變化，如細胞周期素A(cyclin A)、細胞周期素B(cyclin B)以及細胞分裂周期基因25(CDC25)的表達下調，然而細胞周期素G2(cyclin G2)的表達則上調了。
六、RT-PCR驗證RT-PCR驗證分析芯片得到的表達差異基因，TGF-β，VEGF，Cyclin B，Cyclin A的變化，見圖8～10。
七、分析5，7，4-三羥異黃酮藥物抑制PC3癌細胞的基因通路，由圖11可以看出，紅色表示基因表達上調，綠色表示基因表達下調，Genistein染料木素降低CDC25及cyclin B的表達，上調cyclin G2的表達，從而抑制PC3細胞的生長；而且還能通過降低VEGF，BPGF和TGF-β來抑制腫瘤血管的生成達到抗腫瘤的目的。
表1. 17000個基因芯片的基因類別


權利要求
1.一種快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片由下述具有轉錄，細胞周期，癌基因和腫瘤抑制基因，應激反應蛋白，DNA合成、重組和修復，凋亡相關蛋白，細胞黏附受體蛋白，細胞信號傳導，細胞外通訊蛋白，細胞受體，細胞骨架/遷移蛋白，免疫系統蛋白，膜通道和轉運蛋白，代謝，翻譯后修飾/蛋白折疊，細胞交通定位，DNA結合及染色質蛋白，細胞外基質轉運蛋白，細胞內傳導/效應/調節子，細胞表面抗原，RNA處理、周轉和轉運，翻譯，蛋白周轉，其他功能，和細胞外基質生物學功能的基因片段組成。
2.根據權利要求1所述的快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片的參數為探針基因類型雙鏈cDNA；cDNA片段長度≥500bp，平均1.4kb；基質玻片；點數17000；包含基因數17000；陽性對照50；陰性對照50；管家基因30；比值變化標準4；質控基因重復次數12；檢測方法雙色熒光競爭雜交法。
3.根據權利要求1所述的快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片，其特征在于所述具有轉錄生物學功能的基因片段的數目為1547；具有細胞周期生物學功能的基因片段的數目為412；具有癌基因和腫瘤抑制基因生物學功能的基因片段的數目為423；具有應激反應蛋白生物學功能的基因片段的數目為510；具有DNA合成、重組和修復生物學功能的基因片段的數目為345；具有凋亡相關蛋白生物學功能的基因片段的數目為417；具有細胞黏附受體蛋白生物學功能的基因片段的數目為506；具有細胞信號傳導，細胞外通訊蛋白生物學功能的基因片段的數目為678，具有細胞受體生物學功能的基因片段的數目為1697；具有細胞骨架/遷移蛋白生物學功能的基因片段的數目為524；具有免疫系統蛋白生物學功能的基因片段的數目為346；具有膜通道和轉運蛋白生物學功能的基因片段的數目為667；具有代謝生物學功能的基因片段的數目為1482；具有翻譯后修飾/蛋白折疊生物學功能的基因片段的數目為534；具有細胞交通定位生物學功能的基因片段的數目為742；具有DNA結合及染色質蛋白生物學功能的基因片段的數目為379；具有細胞外基質轉運蛋白生物學功能的基因片段的數目為411；具有細胞內傳導/效應/調節子生物學功能的基因片段的數目為1669；具有細胞表面抗原生物學功能的基因片段的數目為422；具有RNA處理、周轉和轉運生物學功能的基因片段的數目為473；具有翻譯生物學功能的基因片段的數目為413；具有蛋白周轉生物學功能的基因片段的數目為633；具有其他功能生物學功能的基因片段的數目為1112；具有細胞外基質生物學功能的基因片段的數目為326。
4.利用權利要求1所述DNA芯片快速分析抗腫瘤中藥作用機理的方法，其特征在于所述分析抗腫瘤中藥作用機理的方法按照下述步驟進行分析一、選擇權利要求1所述的DNA芯片作為分析抗腫瘤中藥作用機理的芯片；二、選擇臨床常規使用的以及民間流行的抗腫瘤中藥作為工具藥物；三、選擇常用的腫瘤細胞株作為細胞模型；四、用上述抗腫瘤中藥分別作用于細胞模型后，利用CCK8方法篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，提取mRNA，與DNA芯片雜交檢測藥物作用的基因；五、應用生物信息學對藥物反應基因進行統計和分類；六、依據藥物標志基因和特異性腫瘤基因的變化規律，進行分子細胞水平的機理驗證。
5.根據權利要求4所述的利用DNA芯片快速分析抗腫瘤中藥作用機理的方法，其特征在于所述抗腫瘤中藥為亞砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羥異黃酮、大豆皂甙、大豆甾醇中的一種或幾種。
6.根據權利要求4所述的利用DNA芯片快速分析抗腫瘤中藥作用機理的方法，其特征在于所述腫瘤細胞株為早幼細胞白血病HL-60、慢性髓細胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宮頸癌Hela中的一種或幾種。
全文摘要
快速分析抗腫瘤中藥作用機理的DNA芯片及其方法，它屬于生物工程技術領域。為解決傳統的分子生物學技術均無法在同一時間內分析大量的基因表達變化的缺陷，本發明的DNA芯片所涉及到的基因包括凋亡、細胞周期調控、藥物轉化代謝等，分析抗腫瘤中藥作用機理的方法為選擇抗腫瘤中藥作為工具藥物，腫瘤細胞株作為細胞模型；用上述抗腫瘤中藥分別作用于細胞模型后，篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，然后用基因表達譜芯片檢測藥物作用的基因；應用生物信息學對藥物反應基因進行統計和分類；依據藥物標志基因和特異性腫瘤基因的變化規律，進行分子細胞水平的機理驗證。本發明可縮短藥物研究開發周期及減少藥物研究開發費用，加快中藥進入國際市場。
文檔編號C12Q1/68GK1766121SQ20051001042
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月12日 優先權日2005年10月12日
發明者韓俊, 李昌利, 顧雪鋒, 李克深, 閆作梅, 于小麗, 楊光 申請人:哈爾濱基太生物芯片開發有限責任公司