專利名稱：細菌質粒的制作方法
技術領域：
本發明涉及細菌質粒。
質粒是染色體外小的可獨立復制的DNA分子，大多為環狀，幾乎存在于所有細菌和部分真核細胞以及線粒體中。質粒的大小在約1.5-300kb之間。
通常，細菌質粒為環狀、共價、閉合以及超螺旋的。它們常常攜帶針對抗生素或重金屬的抗性基因、用于代謝非典型底物的基因或者一系列種屬特異性特征的基因，如代謝特性或毒力因子。一些質粒可被從一個細胞轉移至另一個細胞。因為根據目前的觀點，細菌的致病性也部分由其質粒的性質決定，因此日益需要澄清質粒DNA的性質。
已知腸桿菌科細菌家族中有14個主要變種合6個其它變種，其可形成不同的特性。典型的例子是埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。大腸桿菌(E.coli)是細菌遺傳學的經典對象。只有發現并表征了大腸桿菌不同的毒力因子，才能發現該種屬菌株在人和動物病原學上不同表現的普遍令人滿意的解釋。其中有的菌株為極端性的，從無毒力到高度毒力，如最近傳播的稱為“EHEC”的變種的例子。已經有一系列腸道外以及腸道大腸桿菌菌株的毒力因子被描述，其中部分已被很好地表征。對致病性大腸桿菌菌株，已發現血清型變種O6:K5毒力因子例如溶血蛋白和P傘毛粘附等，這些曾認為不出現在該血清型變種的非致病性代表菌中。
通常毒力基因在腸桿菌屬的大質粒(約60kb)上可見。也有帶小的所謂隱蔽性質粒的腸桿菌屬，其功能至今無法方便的測定。
因為已知大腸桿菌的毒力因子也至少部分存在于質粒基因上，因此需要針對腸桿菌屬特別是大腸桿菌中質粒的鑒定和表征的進一步研究，以改善例如腸桿菌屬感染后疾病的診斷和治療的可能性。質粒或其細菌性載體或相應的合成DNA可用于治療或預防疾病，也可用于在微生物分析或診斷中以及營養生理學或微生態制劑方面的用途。此外，特別是在大腸桿菌中有的質粒已知為遺傳工程中的表達載體，因此也需要增進對這類質粒性質的了解。
根據上述目的進行了針對大腸桿菌菌株DSM6601的分子遺傳學研究。在DNA序列分析的數據庫程序幫助下，研究了獲自該菌株的DNA序列，并與已知的其它細菌DNA序列比較。
菌株DSM6601含有兩個大小分別為3177bp和5552bp的小質粒，分別表述為pMUT1和pMUT2。
小質粒pMUT1的DNA以線性片段形式被亞克隆至載體pUC18，用HindIII限制性酶切后測定了DNA序列。由
圖1可見。所得DNA序列通過與GenEMBL數據庫進行同源性比較進行檢查；比較結果示于圖2。
此次比較中，HindIII插入位點固定為位置1。質粒pMUT1的DNA位置200至800bp處與其它腸桿菌屬質粒的不同復制起始位置(復制起點)有明顯的同源性，特別是同質粒NTP1、NTP16和CloDF13。在位置950bp開始有一個570bp長的質粒NTP16同源區，其最初從鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中分離出來。此同源區含有mobA基因，該基因是質粒NTP16移動以及轉錄起點(oriT)。此外，從位置1790至1920bp發現與基因parA和cer明顯同源的區域，其對于質粒分子的穩定性、連續轉錄和細胞分裂過程中的質粒分配十分重要。對于剩余DNA區域未鑒定出明顯同源區。
此外，將質粒pMUT1的DNA序列轉錄為氨基酸序列并分析開放閱讀框架的存在。研究了6種不同閱讀框架的可能性。總共發現5個大小為143、62、56、49和48個氨基酸的開放閱讀框架。分析的圖示結果示于圖3。
類似地，將較大質粒pMUT2用限制性酶SphI線性化后亞克隆至載體pUC18，隨后全部測序。DNA序列示于圖4。在GeneEMBL數據庫程序幫助下研究用此法獲得的DNA序列與已知DNA序列的同源性。結果圖示于圖5。質粒pMUT2的DNA與大腸桿菌不同ColE1質粒的復制區在位置890至1660bp明顯同源。在3800至4950bp區也發現一個與ColE質粒的明顯同源區。在此處認為其為ColE1質粒移動區的同源區。發現位置3770至4980bp區與溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)菌株A1同源。在該質粒上有在巴斯德氏菌屬中編碼抗微生物抗性蛋白質的基因。然而，由于同源區橫跨屬間區，所以可能也含有質粒移動必須的序列。
鑒定了與其它腸桿菌屬質粒明顯同源的兩個區。由此發現它含有質粒移動必需的復制區域起點和移動區。pMUT2的剩余DNA部分中未鑒定出明顯同源區。
同樣，隨后將質粒pMUT2的DNA序列轉化為氨基酸序列，并分析開放閱讀框架的存在。類似地，結果圖示于圖3。發現了帶有327、318、264、76和63個氨基酸的5個開放閱讀框架。
不僅質粒pMUT1和pMUT2此前未知，其組合也未在任何大腸桿菌菌株或其它腸桿菌屬中發現。
質粒的發現使菌株DSM6601存在用于代謝和醫藥和/或營養性生理或微生態制劑方面用途的可能性。
質粒的研究使腸桿菌屬特別是埃希氏菌屬的測定和分析更為精確。而且，這些質粒使它們作為可靠的表達載體用于遺傳工程。
現對本發明進一步以實施例的方式解釋。
實施例1質粒分離根據Birnboim等人(Birnboim，A.C.和Doly，J.(1979)核酸研究(Nucl.Acids Res.)71513-1523，一種用于篩選重組質粒DNA的快速堿提取方法)的方法進行質粒DNA的分離。
用一個細菌菌落接種3毫升LB培養基，37℃下攪拌培養過夜。在Eppendorf管中離心培養液，用吸尖去除培養基沉淀。細胞沉淀用100微升溶液I(50mM葡萄糖；10mM EDTA，pH8；25mM Tris-HCl，pH8)重懸。室溫下溫育5分鐘后加入200微升溶液II(0.2N NaOH；1％SDS)，混合至澄清，將Eppendorf管置于冰上5分鐘。然后向其中加入150微升溶液HI(3M乙酸鈉，pH4.8)，短暫攪拌直至染色體DNA出現絮狀沉淀，將沉淀再次置于冰上5分鐘。沉淀染色體DNA和細胞殘片于離心管中離心5分鐘被沉淀，帶有質粒DNA的上清液被移至新管中。為純化質粒DNA，加入50微升苯酚和150微升氯仿/異丙醇(24∶1)，短暫攪拌后離心2分鐘。水相用吸尖移至新管中。用2倍體積冰冷的乙醇沉淀質粒DNA，離心10分鐘。沉淀用70％乙醇洗滌，在Speedvac中干燥。質粒DNA在20微升雙蒸水中重懸，保存于-20℃。
實施例2DNA測序根據F.Sanger等人(Sanger，F.，Nicklen，S.，和Coulson，A.R.(1977)，美國國家科學院院(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)745463-54-67，用鏈終止抑制劑進行DNA測序)的方法進行DNA測序。
用Pharmacia LKB公司的T7測序試劑盒進行DNA測序。
變性步驟中，8微升(1.5至2微克)質粒DNA與2微升2N NaOH混合，短暫離心后室溫下溫育10分鐘。用3微升3M乙酸鈉，pH4.8，并用7微升雙蒸水和60微升無水乙醇在-70℃下15分鐘沉淀DNA。沉淀的DNA離心10分鐘，用70％乙醇洗滌并干燥。
退火反應中，變性的DNA重懸于10微升雙蒸水中，于2微升退火液和2微升引物(40ng)混合。沉淀在37℃下溫育20分鐘，以使引物與模板DNA結合。在室溫下冷卻反應物10分鐘，然后立即用于標記反應或凍存于-20℃。對于標記反應，用吸尖將3微升標記混合物、1微升[α-P32]dATP和2微升T7聚合酶(T7聚合酶用酶稀釋液以1∶5稀釋)加入退火反應沉淀中，短暫混合后室溫下溫育5分鐘。同時，已經制備好的用于末端終止反應的測序混合物(每管中帶有2.5微升“G”、“A”、“T”和“C”混合物)在37℃預熱。標記反應完成后，取其中4微升加入四種測序反應混合物的各一種，用吸尖短暫混合。末端終止反應在37℃下溫育5分鐘。分別加入5微升終止溶液結束末端終止反應。然后將沉淀轉移至95℃的溫育器中變性2分鐘，再置于冰上。按“G”、“A”、“T”、“C”的順序將2.5微升每種反應混合物加入測序膠[25.2g尿素、22ml雙蒸水、6ml 10xTBE、10ml聚丙烯酰胺(40％)、2ml過硫酸銨(16mg/ml)、60微升TEMED]。在40瓦和1500伏條件下電泳4.5小時。
權利要求
1.帶有如圖4所示DNA的序列的質粒pMUT2。
2.帶有如圖4所示核苷酸序列的DNA序列。
3.根據權利要求1的質粒pMUT2或權利要求2的DNA序列在微生物分析和/或診斷中的用途。
4.根據權利要求1的質粒pMUT2或權利要求2的DNA序列作為表達載體的用途。
全文摘要
本發明涉及帶有圖1或圖4所示核苷酸序列的質粒和DNA序列以及它們的用途。
文檔編號C12N15/70GK1727489SQ20051000594
公開日2006年2月1日 申請日期1998年4月1日 優先權日1997年4月2日
發明者J·哈克, U·索尼伯恩, J·舒爾茨, G·布路姆-奧赫勒, J·馬林卡, H·普羅比特 申請人:制藥中心有限公司