專利名稱：胚胎的玻璃化冷凍、簡易解凍和直接移植法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種玻璃化胚胎冷凍、解凍和直接移植方法，特別是用于哺乳動物的胚胎冷凍、解凍和移植方法，屬胚胎生物技術領域。
背景技術：
1972年Whittingham首次采用二甲基亞砜(DimethylsulfoxideDMSO)為主體抗凍保護劑冷凍保存小鼠的2～8-細胞胚胎獲得成功，并移植產下后代。他們所采用的冷凍液濃度為1.5Mol/L，使用程序化降溫冷凍儀。冷凍解凍后胚胎成活率為50％～70％，胚胎妊娠率為65％，產仔率48％。程序化冷凍方法自發明以來，經各國研究者反復試驗，并對各種冷凍保護劑進行篩選，使胚胎冷凍解凍后存活率達到90％以上，而冷凍程序基本不變，即-6℃植冰后，以-0.33℃/min的速率降至-30～-35℃，平衡后，再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液氮，整個過程約3個小時完成，到目前為止該方法仍被使用，稱之為常規冷凍法。
常規冷凍的程序復雜、耗時長、效率低，更不適于邊遠牧區的胚胎冷凍保存和移植。為此，1985年Rall等發明胚胎玻璃化冷凍方法，使冷凍勿需借助冷凍儀，可在室溫下進行操作。程序得到極大地簡化。后經許多研究者的改進，目前胚胎的玻璃化冷凍方法僅需1分鐘左右即可完成一個程序。胚胎冷凍解凍后存活率95％以上，移植妊娠率達60％～70％，產仔率平均為56％。產仔率比傳統的程序化冷凍方法提高了8％。
但是，由于玻璃化冷凍液濃度非常高(6Mol/L以上)，胚胎在玻璃化冷凍液中的平衡時間一般不宜超過2分鐘，即投入液氮中冷凍保存。因此，對于玻璃化冷凍保存的胚胎，移植前必須將胚胎由冷凍細管中推出，置于一定濃度(0.3～1.0Mol/L)的蔗糖溶液中5分鐘左右，以脫除抗凍保護劑，并在顯微鏡下回收胚胎，將胚胎重新裝管后再行移植。解凍過程不僅十分煩瑣，且容易丟失胚胎，需要有操作熟練的技術人員。這些條件都制約了玻璃化冷凍方法在生產中的推廣應用。
發明內容
本發明的目的是要提供一種胚胎的玻璃化冷凍、簡易解凍和直接移植法，以簡化胚胎玻璃化冷凍方法的解凍步驟，為使玻璃化冷凍的胚胎移植易于生產中推廣應用。
為了達到本發明的目的所采取的技術方案包括以下胚胎的玻璃化冷凍法將冷凍液和解凍液分段裝入細管內，每段液體之間都用一段空氣隔開，其中在一段冷凍液中置入了經過預處理液處理過的胚胎，然后將細管封口、投入液氮，其特征在于，裝入細管內的冷凍液和解凍液各有兩段，其裝管順序為首先裝入一段解凍液(6)，然后裝入一段空氣(3)，接著裝入一段冷凍液(5)，再裝入一段空氣(3)，然后再裝入一段冷凍液(4)，并在該段冷凍液中置入胚胎，接著再裝入一段空氣(3)，最后在管端裝入一段解凍液(2)并封閉管口；裝入細管內的冷凍液與解凍液的體積比值小于或等于1∶5。
上述的胚胎的玻璃化冷凍方法中，所述的冷凍液為EFS30，解凍液為0.3～1Mol/L蔗糖溶液。
上述的胚胎的玻璃化冷凍法中，所述的裝入細管中的第二段解凍液(2)的長度為0.4～1.5cm，以0.5cm左右為宜。
上述的胚胎的玻璃化冷凍法中，裝管時，按順序吸入7.5cm長的解凍液-1cm長的空氣-0.4cm長的冷凍液-0.5cm長的空氣-0.6cm長的冷凍液-1cm長的空氣，將胚胎移入0.6cm長的冷凍液節段后，吸入0.5cm長的解凍液后封口，投入液氮冷凍。
上述的胚胎的玻璃化冷凍法中，裝管時，按順序吸入6cm長的解凍液-1cm長的空氣-0.4cm長的冷凍液-0.5cm長的空氣-0.8cm長的冷凍液-1cm長的空氣，將胚胎移入0.8cm長的冷凍液節段后，吸入1.8cm長的解凍液后封口，投入液氮冷凍。
上述的胚胎的玻璃化冷凍法中，所述的裝管時，按順序吸入8.2cm長的解凍液-0.5cm長的空氣-0.3cm長的冷凍液-0.5cm長的空氣-0.5cm長的冷凍液-1cm長的空氣，將胚胎移入0.5cm長的冷凍液節段后，吸入少許解凍液后封口，投入液氮冷凍。
經過上述的胚胎的玻璃化冷凍法冷凍的胚胎的簡易解凍和移植法為，在室溫下，將冷凍保存胚胎的細管由液氮中取出后，空氣浴4～6s，然后浸入20～25℃水浴中，待內容物融解后，取出細管，來回顛倒甩動細管，使細管內的液體混合均勻后，即實施胚胎移植。
上述的胚胎的簡易解凍和移植法中，所述的室溫以20～25℃為佳。
由于本發明采用了獨特的裝管方法，盡量減少了細管內冷凍液節段的長度，增加了解凍液節段的長度，解凍時，待內容物溶解后，使管內的冷凍液和解凍液充分混合，達到稀釋冷凍液，脫除抗凍保護劑的效果，所以本發明有如下優點(1)最大限度地簡化了胚胎玻璃化冷凍保存方法的解凍程序。本發明采用細管法玻璃化冷凍保存胚胎，解凍時胚胎不需出管脫毒，而是直接在管內使冷凍液和解凍液相混合，以達到稀釋冷凍液，同時在管內脫除胚胎內部具有化學毒性作用的抗凍保護劑，所以本解凍方法比傳統的解凍方法簡單、胚胎不丟失。利用該方法解凍后，胚胎在管內3～12min，都能保證其存活率在95％左右，培養后囊胚孵化率達70％以上，不僅時間上能完全保證完成一個移植過程，而且總體水平比常規冷凍法和其他玻璃化冷凍法效果好、效率高。
(2)解決了冷凍前管內冷凍液和解凍液的合理配置和解凍后管內直接混合，使胚胎脫除抗凍保護劑后即可移植。該方法實現了玻璃化冷凍胚胎在管內脫毒、直接移植，簡易方便，可操作性強，有利于在生產中推廣。
圖1為本發明的裝管方法模式圖。
實施例在如圖1所示的裝管方法中，1為棉栓及封口；2為封口液(其成分與6同)；3為空氣段；4為含胚胎的冷凍液；5為冷凍液；6為解凍液。
本發明的玻璃化胚胎冷凍方法的發明點在于冷凍液和解凍液在細管內的配置與其他方法不同。由圖1可以看出，本裝管布置與現有玻璃化胚胎冷凍技術的“5段法”相比，減少了空氣節數，也縮短了冷凍液節段的長度，這樣可以保證用較多的解凍液來稀釋高濃度的冷凍液，完成脫除胚胎內部抗凍保護劑的過程。由于冷凍液節段很短，如果裝入胚胎后，在冷凍液移行的過程中，胚胎容易丟失。因此，本發明設計上使含有胚胎的冷凍液段4基本處于細管的后端，盡量減少冷凍液的移行，防止胚胎丟失進入解凍液中，造成胚胎冷凍后由于結晶而死亡。另外，如圖所示，布置冷凍液節段“5”的作用是避免在裝管時解凍液進入含胚胎的冷凍液節段4，改變該冷凍液濃度；而節段“2”的主要作用是封口時浸潤封口粉，使其膨脹，防止封口不嚴密。
在如圖所示的實施例的裝管操作中首先在細管的棉栓端吸入約7.5cm長的解凍液(0.3～1Mol/L蔗糖溶液)，然后吸入約0.4cm和約0.6cm(導入胚胎)兩段冷凍液，各液體間由空氣隔開，基本布滿了整個細管，最后封口的解凍液為0.5cm，使液體向前移動時，胚胎脫落、丟失的機會減少。
采用上玻璃化冷凍方法冷凍的胚胎，可以實現細管內解凍和直接移植解凍時，胚胎無需出管脫毒，而是將管內冷凍液和解凍液段經甩動充分混合，以脫除胚胎內部抗凍保護劑，即可實施移植。方法簡單，可操作性強，生產中易于推廣。
以下是本發明的幾個實施例的實際操作方法(1)準備EFS30玻璃化冷凍保存溶液、冷凍預處理液及解凍液①EFS30以乙二醇(Ethylene glycolEG)為主體抗凍保護劑，加入聚蔗糖(Ficoll)和蔗糖(Sucrose)制成的玻璃化溶液。②10％的乙二醇(Ethylene glycolEG)按體積比(v/v)配制10％的EG作為預處理液。③0.5Mol/L的蔗糖(Sucrose)溶液以杜氏磷酸緩沖液(PBS)為基礎液配制成0.5Mol/L的蔗糖溶液，作為管內解凍液。
(2)胚胎的裝管及冷凍裝管時，用0.25ml的塑料細管按圖1所示順序吸入解凍液和冷凍液，然后平行地置于操作臺上，待經冷凍預處理液處理過的胚胎移入后，再吸入蔗糖溶液后封口，然后將細管直接投入液氮中冷凍保存。該裝管方法各節段長度為參考值，在實際操作中，由于各操作人員手法不一，可能會稍有變動，這并不影響胚胎的存活率和發育率，但必須保證的是，冷凍液與解凍液長度(或體積)的比值小于或等于1∶5，這樣混合后混合液中抗凍保護劑的濃度在2.0Mol/L以內，對胚胎毒性小。例如①裝管時，按順序吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(約7.5cm)—空氣(約1cm)—冷凍液(約0.4cm)—空氣(約0.5cm)—冷凍液(約0.6cm)—空氣(約1cm)，將胚胎移入0.6cm長的冷凍液節段后，再吸入0.5cm的蔗糖溶液后封口，然后直接投入液氮中冷凍保存。
②裝管時，吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(約6cm)—空氣(約1cm)—冷凍液(約0.4cm)—空氣(約0.5cm)—冷凍液(約0.8cm)—空氣(約1cm)，將胚胎移入0.8cm長的冷凍液節段后，吸入約1.8cm的蔗糖溶液后封口，投入液氮冷凍保存。
③裝管時，吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(約8.2cm)—空氣(約0.5cm)—冷凍液(約0.3cm)—空氣(約0.5cm)—冷凍液(約0.5cm)—空氣(約1cm)，將胚胎移入0.5cm長的冷凍液節段后，吸入少許蔗糖后封口，投入液氮冷凍保存。
以上三種裝管形式，在各節段長度上各有差異，但解凍后胚胎存活率及培養發育率均不受影響，這就允許在冷凍時操作上的視覺誤差，保證了冷凍時的可操作性。但是，如果冷凍液與解凍液的比值大于1∶5時，混合后冷凍液中的抗凍保護劑的濃度依然較高，對胚胎有較大影響，盡管解凍后胚胎存活率不受影響，但胚胎的發育率較低。
(3)解凍室溫下(20～25℃效果更佳)，將冷凍保存胚胎的細管由液氮中取出后，空氣浴4～6s后，浸入20～25℃水浴中，待內容物融解后，取出細管，拭干表面水珠，然后來回顛倒甩動細管3～4次，使管內的冷凍液與解凍液混合均勻后，即可施行胚胎移植。自胚胎解凍后到移植完畢在5～10分鐘完成為宜。
用上述方法對小鼠的桑椹胚進行玻璃化冷凍保存，解凍后混合冷凍液與解凍液，胚胎處于管內的混合液環境中5min，出管檢查，胚胎存活率達95.8％(91/95)，培養孵化率達70.5％(67/95)，移植妊娠率100％(11/11)，產仔率58.71％(91/155)。證明這種冷凍解凍方法是簡便可行的。
在裝管過程中，解凍液2要求盡量短，0.5cm左右，能滿足封口要求即可。這樣在裝管過程中含有胚胎的冷凍液節段在管內移行的距離較短，避免了胚胎的丟失。
在實際操作，上述實施例中的冷凍液(EFS30)和解凍液濃度(0.3-1.0Mol/L)可以換成其他的冷凍液(如EFS40等)或其他的解凍液濃度(如0.8Mol/L的蔗糖，甚至其他糖，如巖藻糖)，不影響本發明的實現。
最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.一種胚胎的玻璃化冷凍法，是將冷凍液和解凍液分段裝入細管內，每段液體之間都用一段空氣隔開，其中在一段冷凍液中置入了經過預處理液處理過的胚胎，然后將細管封口、投入液氮，其特征在于，裝入細管內的冷凍液和解凍液各有兩段，其裝管順序為首先裝入一段解凍液(6)，然后裝入一段空氣(3)，接著裝入一段冷凍液(5)，再裝入一段空氣(3)，然后再裝入一段冷凍液(4)，并在該段冷凍液中置入胚胎，接著再裝入一段空氣(3)，最后在管端裝入一段解凍液(2)并封閉管口；裝入細管內的冷凍液與解凍液的體積比值小于或等于1∶5，或混合后混合液中抗凍保護劑的濃度在2.0Mol/L以內。
2.根據權利要求1所述的胚胎的玻璃化冷凍法，其特征在于，裝入細管中的第二段解凍液(2)的長度為0.4～1.5cm。
3.根據權利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷凍法，其特征在于，裝管時，按順序吸入7.5cm長的解凍液-1cm長的空氣-0.4cm長的冷凍液-0.5cm長的空氣-0.6cm長的冷凍液-1cm長的空氣，將胚胎移入0.6cm長的冷凍液節段后，吸入0.5cm長的解凍液后封口，投入液氮冷凍。
4.根據權利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷凍法，其特征在于，裝管時，按順序吸入6cm長的解凍液-1cm長的空氣-0.4cm長的冷凍液-0.5cm長的空氣-0.8cm長的冷凍液-1cm長的空氣，將胚胎移入0.8cm長的冷凍液節段后，吸入1.8cm長的解凍液后封口，投入液氮冷凍。
5.根據權利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷凍法，其特征在于，裝管時，按順序吸入8.2cm長的解凍液-0.5cm長的空氣-0.3cm長的冷凍液-0.5cm長的空氣-0.5cm長的冷凍液-1cm長的空氣，將胚胎移入0.5cm長的冷凍液節段后，吸入少許解凍液后封口，投入液氮冷凍。
6.一種采用權利要求1所述的胚胎的玻璃化冷凍法冷凍的胚胎的簡易解凍和移植法，其特征在于，在室溫下，將冷凍保存胚胎的細管由液氮中取出后，空氣浴4～6s，然后浸入20～25℃水浴中，待內容物融解后，取出細管，來回顛倒甩動細管，使細管內的液體混合均勻后，即實施胚胎移植。
7.根據權利要求7所述的胚胎的簡易解凍和移植法，其特征在于，所述的室溫以20～25℃為佳。
全文摘要
本發明公開了一種玻璃化胚胎冷凍、解凍和直接移植方法，屬胚胎生物技術領域。技術方案包括將冷凍液和解凍液分段裝入細管，每段液體用空氣隔開，其中一段冷凍液中置入了胚胎，后封口細管、投入液氮，特征是，裝入細管內的冷凍液和解凍液各有兩段，冷凍液與解凍液的體積比小于或等于1∶5，或混合后混合液中抗凍保護劑的濃度在2.0Mol/L以內。本發明的簡易解凍和移植法為，在室溫下，將冷凍保存胚胎的細管由液氮中取出，空氣浴4～6s，20～25℃水浴，取出細管，來回顛倒甩動細管，使冷凍液混合均勻，即移植胚胎。本發明極大地簡化了胚胎玻璃化冷凍后的解凍程序，實現了胚胎在管內脫毒、直接移植，簡易方便，可操作性強，利于推廣應用。
文檔編號C12N5/06GK1654635SQ20051000491
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月28日 優先權日2005年1月28日
發明者朱士恩, 楊中強, 侯云鵬 申請人:中國農業大學