針對乙型流感病毒膜蛋白基因的siRNA序列及其應用的制作方法

專利名稱：針對乙型流感病毒膜蛋白基因的siRNA序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域和生物信息學領域。本發明涉及流行性感冒的預防與治療。本發明還涉及核酸技術領域。具體地說涉及RNA干擾技術，更具體地涉及具有抑制乙型流感病毒復制與感染和/或乙型流感病毒基因表達的小分子干擾核糖核酸及其應用。
背景技術：
流行性感冒簡稱流感，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病，是一種重要的公眾健康問題。甲型流感病毒常以流行形式出現，引起世界性大流行，它在動物中廣泛分布，也能在動物中引起流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒常常引起局部暴發，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出現，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。
流行性感冒是世界上很猖獗的傳染病，曾多次席卷全球，給人類帶來巨大災難。流感病毒感染后容易發生繼發性感染，死亡率非常高。由于流感病毒傳播迅速、流行廣泛，抗原易變異，人群的特異性免疫狀況不穩定，因此可引起局部地區流行或世界性大流行。
盡管乙型流感病毒不象甲型流感病毒那樣常引起世界性大流行，但它常常引起局部暴發，而且流感的流行常由甲型和乙型流感病毒引起，在流感病毒中常出現甲、乙型流感病毒間基因混合顯型現象，因此乙型流感病毒的表面抗原是三聯流感疫苗的重要組成部分。
流感病毒屬正粘病毒科，是有包膜的單負鏈、分節段的RNA病毒。乙型流感病毒的基因組由8個單獨的單鏈RNA片段組成，一般認為RNA1節段編碼PB2蛋白；RNA2編碼PB1；RNA3編碼PA；RNA4編碼HA；RNA5編碼NP；RNA6編碼NA和一個NB非結構蛋白；RNA7編碼M1和M2，可能還有M3；RNA8編碼兩個非結構蛋白NS1和NS2。其中，RNA片段7編碼的M1和M2蛋白是膜蛋白，M1是病毒粒中最豐富的一種多肽，具有型特異性，是流感病毒型劃分的主要依據之一；推測它的功能是在子代病毒裝配中起重要作用，同時對病毒顆粒核心部分起保護作用。M2是一種完整的膜蛋白，是流感病毒顆粒表面的第三種抗原；它的功能是起質子通道作用，控制HA合成過程中高爾基體的pH值，允許病毒脫殼中病毒顆粒內部的酸化。
目前，預防流感的較好措施是接種疫苗，但由于流感病毒編碼表面抗原的基因容易發生突變或重配，致使表面抗原發生變異，出現新的抗原，使原有的疫苗不再有效。除疫苗外，也有抗流感病毒的藥物正在積極開發。至今，國際上抗流感的藥物主要是神經氨酸酶抑制劑，但這些藥物存在副反應和耐藥性等問題，所以目前世界上還沒有一種治療流感的有效藥物。鑒于近兩年流感病毒活動頻繁，應用現代科技手段發展方便有效的抑制流感病毒感染的方法就顯得尤為重要。
RNA干擾(RNA interfering，RNAi)技術是近年來新發展起來的一種高效的、特異性強的基因阻斷技術，是一種由雙鏈RNA介導的、轉錄后mRNA水平關閉相應基因表達的序列特異性基因沉默機制，它也是體內基因組抵御外在感染和內部轉座的一種保護機制，廣泛存在于各種生物，如植物、真菌、昆蟲、后生動物和哺乳動物，包括人類。簡言之，該技術就是當把21-23個核苷酸長的雙鏈RNA片段(dsRNA)導入細胞或組織中后，后者會使目的mRNA被切割，從而降解mRNA，阻礙或阻止了由mRNA翻譯成相應蛋白質的過程。它的作用在基因功能研究領域和各種疾病的治療領域尤其是病毒性疾病的治療領域已顯現出不可估量的價值。通過RNAi技術，選擇不同的靶位點應用siRNA抑制病毒復制與侵染已在多種病毒中公開(Adelmen et al.，Insect Mol Biol，10265-273(2001)；Gitlin et al.，Nature，418，430 434(2002)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，100(5)2718-2723(2003)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，101(23)8676-8681(2004)；Hu WY et al.，Curr Biol，121301-1311(2002)；Haasnoot et al.，Biomed Sci，2003，10607-616(2003)；Chen W et al.，J.Virol，78(13)6900-7(2004)；Jia Q et al.，J Virol，773301-3306(2003)；Park WS et al.，Nucleic Acids Res，30(22)4830-4835(2002)；Capodici J et al.，J Immunol，1695196-5201(2002)；Coburn GAet al.，J Virol，769225-9231(2002))。
2002年12月20日，Small RNA & RNAi被Science雜志評為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性進展，是生物醫學領域近20年來，可與人類基因組計劃(human genomics program，HGP)相提并論的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以調節和關閉基因的表達，進而調控細胞的各種高級活動。人們對小RNA分子的深入研究必將大大推進基因功能的研究，更為各種病毒性疾病和腫瘤等疾病的根治，開辟新的治療途徑，具有極其重要的理論和實際意義，它必將對生物學和醫學的發展產生深遠的影響。
膜蛋白(M1、M2，統稱為M)是乙型流感病毒在感染細胞內進行復制和成熟與裝配所必需的。設計并合成特異性針對編碼膜蛋白基因序列全長的多種dsRNA，并將其同時導入患者體內，可以選擇性降解膜蛋白的mRNA，阻斷其蛋白表達，使乙型流感病毒在感染細胞中無法完成復制過程，從而切斷病原體在體內的代謝途徑，有效控制疾病進程。由于乙型流感病毒是RNA病毒，而設計的dsRNA與病毒的vRNA和cRNA都具有序列同源性，因而采用RNA干擾手段，有可能直接引發病毒vRNA和cRNA的降解，從而在根本上清除感染細胞中的病毒。
本發明應用RNAi技術，通過siRNA進行乙型流感病毒的抑制研究，為抑制流感病毒的復制與感染提供新的途徑，也為流行性感冒的預防與治療提供新的思路。有效的siRNA靶位點不僅可以作為新的化學藥物靶位點，而且siRNA可以直接作為強有效的藥物用于流行性感冒的預防與治療，特異性強，不易引起副反應，給藥方便、快捷，避免現行疫苗對突變流感病毒和其他動物流感病毒引起的突發流行性感冒的不能保護以及化學藥物的副反應。我們認為目前研制和開發治療流行性感冒的dsRNA藥物不但具有實際可操作性而且擁有良好的應用前景。
這里引用的所有出版物、專利和專利申請，無論前述或后述，在此都以其完整形式引入作為參考。

發明內容
本發明涉及以下按順序編號的段落中定義的主題1.分離的流感病毒小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列為流感病毒膜蛋白編碼基因上的連續10-30個(優選，15-27個，更優選19-23個)核苷酸。
2.如段落1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列為SEQ ID NO1-SEQ ID NO6中任意一條序列。
3.與段落1或2的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸序列，或其互補序列。
4.包含段落1-3任一個的序列的核酸構建體。
5.段落1-4任一個所述的siRNA靶序列在篩選抗流感病毒藥物中的應用。
6.小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含段落1-3序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒膜蛋白基因的表達和/或流感病毒的復制和/或感染。
7.如段落6所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
8.如段落7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸為發夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區域形成雙鏈RNA區域。
9.段落6-8任一個所述的核苷酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段的長度優選為8-50個核苷酸，優選10-30(更優選15-27，最優選19-23，如19、20或者21)個。
10.段落6-9任一個所述的核苷酸，其中，雙鏈RNA的互補區域至少有10個(優選15個，更優選18個)堿基對。
11.如段落6-10任一個所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸為具有10-30(優選，15-27，更優選19-23)對堿基的雙鏈RNA分子，所述雙鏈中至少有10個(優選15個，更優選18個)堿基互補配對。
12.如段落6-11任一個所述的核糖核酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段的GC含量為35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如約50％。
13.如段落6-12任一個所述的核糖核酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段與已知人類基因和基因表達片段無顯著的同一性。
14.如段落6-13任一個所述的核糖核酸，其中，所述反義RNA片段包含與段落1或2所述siRNA靶序列有至少10個(優選15個，更優選18個)堿基互補的序列，正義RNA片段序列與所述反義RNA片段序列有至少10個(優選15個，更優選18個)堿基互補。
15.如段落6-14任一個所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段與反義RNA片段之間的互補區域含18、19、20、或21對互補堿基。
16.如段落6-15任一個所述的核糖核酸，其中，所述反義RNA片段序列與SEQ ID NO1-SEQ ID NO6所示的任意一條序列有至少10個(優選15個，更優選18個)堿基互補。
17.如段落6-16任一個所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段與反義RNA片段的3’端包含至少兩個脫氧寡核苷酸的末端，一般為脫氧胸苷酸TT。
18.如段落6-17任一個所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反義RNA片段序列包含SEQ ID NOX，正義RNA片段序列包含SEQ IDNO(X-6)，X為7-12中的任一整數。
19.如段落6-18任一個所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段自5’端開始的19個核苷酸序列中的堿基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數量之和占除去3’端的TT以外的19個核苷酸數量的比例為35％-75％(即G/C比例)，所述反義RNA片段及其一個核苷酸的突變體與已知人類基因和基因表達片段無同一性。
20.如段落6-19任一個所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其中，用化學合成方法直接合成或者用質粒載體在細胞或體內表達，或者在體外合成、轉錄后用Dicer酶消化的方法獲得。
21.DNA序列的組合，其包括編碼正義RNA片段的第一DNA序列和編碼反義RNA片段的第二DNA序列，所述正義RNA片段包含段落1-3的序列所編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒膜蛋白基因的表達和/或流感病毒的復制和/或感染。
22.段落21的DNA序列的組合，其中正義RNA片段和反義RNA片段如段落7-20任一個中所定義。
23.段落21的DNA序列的組合，第一DNA序列和第二DNA序列包含在兩種不同的DNA分子中，這兩種不同的DNA分子優選分別另外含有與第一DNA序列有效連接的第一啟動子和與第二DNA序列有效連接的第二啟動子。
24.段落21的DNA序列的組合，其中，第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中，優選地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA鏈中；更優選地，所示正義RNA片段和反義RNA片段表達為一種RNA分子，還優選的是，所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區域；所述DNA分子可以另外含有與第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效連接的啟動子。
25.包含段落21-24任一個的DNA組合的載體或者載體組合。
26.分離的宿主細胞，優選哺乳動物細胞，特別是狗腎傳代(Madindarby canine kidney，MDCK)細胞，其中，所述細胞包含段落21-24任一個的DNA組合或者段落25所述的載體或者載體組合。
27.一種動物模型，其中，所述動物模型包含段落21-24任一個的DNA組合或者段落25所述的載體或者載體組合。
28.如段落27所述的動物模型，其中，所述的動物模型為9-11日齡的雞胚。
29.包含段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合的組合物，特別是藥物組合物。
30.段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中所述藥物用于治療和/或預防流感病毒引起的流行性感冒或其它相關疾病。
31.段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒的復制和/或感染。
32.段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒蛋白質的表達。
33.抑制流感病毒的復制和/或感染的方法，包括給予段落29的組合物。
34.抑制宿主細胞中流感病毒蛋白質的表達的方法，將宿主細胞與段落29的組合物接觸。
35.以上段落任一個的主題，其中流感病毒是乙型流感病毒，特別是乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、B/Jiangsu/10/03。
以下結合附圖進一步說明本發明。基于這些說明，本發明的上述方面和其它方面對于本領域技術人員而言是明顯的。
附圖簡述

圖1siRNA表達載體質粒的構建。
圖2針對膜蛋白編碼基因的siRNA的篩選。應用針對膜蛋白編碼基因不同靶位點的乙型流感病毒特異siRNA，篩選能敲低M-FL融合基因的表達，即有效抑制MDCK細胞中螢火蟲熒光素酶表達的siRNA。圖示空白對照為不轉染siRNA、只轉染熒光素酶表達載體的細胞，對照siRNA為轉染能表達無關siRNA的質粒及熒光素酶表達載體的細胞，其它為轉染能表達針對膜蛋白編碼基因不同靶位點的特異siRNA表達載體及熒光素酶表達載體的細胞。縱坐標表示以轉錄活性內對照的海腎熒光素酶為標準化的螢火蟲熒光素酶活性。圖中的每一個數據表示三個重復實驗的平均值。
圖3細胞中質粒表達No.3號siRNA在病毒感染后不同時間對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖4細胞中轉染不同量的No.3號siRNA表達質粒對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖5細胞中轉染不同量的化學合成No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖6siRNA對新產生病毒粒子的抑制圖7細胞中質粒表達各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖8細胞中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制圖9細胞中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制圖10細胞中No.3號siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較圖11雞胚中質粒表達各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖12雞胚中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制圖13雞胚中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制圖14雞胚中化學合成No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖15雞胚中No.3號siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較具體實施方式
本發明人選取乙型流感病毒膜蛋白編碼基因中高度保守的序列作為siRNA的靶序列，并且以靶序列中的連續10-30(優選，15-27，更優選19-23)bp的序列設計siRNA。細胞和動物模型攻毒實驗證明，以乙型流感病毒基因組中高度保守的序列作為靶序列，應用能與靶序列特定位點上的核苷酸序列互補配對的siRNA，可以阻斷該基因在細胞和動物模型中的復制與表達，從而有效地抑制不同乙型流感病毒毒株在細胞和動物模型的復制與感染，以達到治療流行性感冒的目的。
本發明的一個目的就是提供一組流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因組上的小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列及其應用。其中當藥物，包括所篩選出的小干擾RNA(siRNA)序列與這些靶序列中的一個或幾個特異性地作用，可以阻斷引起流行性感冒的流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因在人體或動物體內的復制或表達，從而抑制流感病毒的復制與感染，達到治療流行性感冒的目的。
本發明的另一目的就是提供一組用于預防和治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的靶向小分子干擾核糖核酸、DNA、其載體、宿主細胞及其制備方法和應用。
發明人相信，本發明的原理在于特異性siRNA針對病毒基因組保守序列，抑制病毒的mRNA(但本發明并不受該原理的束縛)。針對流感病毒(特別是乙型流感病毒)膜蛋白(M1、M2)、病毒的virion RNA(vRNA)和互補RNA(cRNA)，設計并化學合成siRNA及制備含特異siRNA編碼DNA的質粒，并將此化學合成siRNA或含特異siRNA編碼DNA的質粒轉入選定的靶細胞進行抗流感病毒(特別是乙型流感病毒)的研究。通過特異性抑制病毒的膜蛋白的轉錄和復制途徑，最終為人類和動物提供治療和預防流感病毒(特別是乙型流感病毒)感染的快速便宜的有效藥物。
本發明所要解決的問題是針對病毒基因組靶序列提供攻擊流感病毒(特別是乙型流感病毒)的小干擾RNA分子(siRNA)，用于預防或治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)感染引起的流行性感冒及與其密切相關的呼吸道疾病。為此本發明采用權利要求書中定義的技術方案。
在一方面，本發明提供了分離的流感病毒小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其選自(1)流感病毒膜蛋白編碼基因上的連續10-30個(優選，15-27個，更優選19-23個)核苷酸；(2)SEQ ID NO1-SEQ ID NO6中任意一條序列；(3)與(1)或者(2)的序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸序列；(4)從(1)或者(2)的序列發生了1-5個(優選1-3個，更優選1-2個，最優選1個)核苷酸插入、替代和/或缺失。
為了序列比較，可以采用Lasergene生物信息軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默認參數進行序列的最佳比對。或者，為了序列比較，可以利用以下方法進行序列的最佳比對Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math 2482)；Needleman和Wunsch的同一性比對算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；這些算法的計算機執行程序(Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測。
適合于確定序列同一性和序列相似性百分數的算法的一個優選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述或者默認參數，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發明的多核苷酸和肽的序列同一性百分數。執行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。
因此，本發明包括與本文所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當采用本文所述方法(例如采用標準參數的BLAST分析)時，與本發明多核苷酸序列相比含有至少50％序列同一性、優選至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。
在其它實施方案中，本發明指向在中等嚴緊條件下與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補序列能夠雜交的多核苷酸。在分子生物學領域中雜交技術是熟知的。
典型地，“雜交條件”根據測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如，“最大嚴緊性”典型地發生在約Tm-5℃(低于探針Tm 5℃)；“高等嚴緊性”發生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴緊性”發生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴緊性”發生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據。例如，6×SSC＝極低嚴緊性；3×SSC＝低至中等嚴緊性；1×SSC＝中等嚴緊性；0.5×SSC＝高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。
對于要求高選擇性的應用，典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性在內的雜交條件。
為便于說明，用于檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領域技術人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
所述靶序列可以是流感病毒膜蛋白編碼基因、膜蛋白編碼基因的轉錄產物、cDNA、或者其mRNA。所述的靶序列可以是流感病毒(特別是乙型流感病毒)的RNA基因組序列，或病毒粒子RNA序列(virionRNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互補RNA序列(complementaryRNA，cRNA)。
優選地，所述siRNA靶序列為與SEQ ID NO1-SEQ ID NO6中任意一條序列的連續10個(優選15個，更優選18個)核苷酸序列相同的序列。更優選的是，所述的siRNA靶序列為與SEQ ID NO1-SEQID NO6所示的任意一條序列。
本發明提供了一系列流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因上可以被siRNA或反義核酸序列攻擊的靶序列，因此，凡是可以作用于本靶序列以阻斷病毒基因在感染的人或動物體內復制或表達的核苷酸片段都是本發明所要求保護的范圍。
本發明還提供上述siRNA靶序列的互補序列。
本發明還提供包含siRNA靶序列或其互補序列的核酸構建體。
本發明還提供siRNA靶序列在篩選抗流感病毒藥物中的應用。所述抗流感病毒(特別是乙型流感病毒)藥物優選為治療或預防流感病毒(特別是乙型流感病毒)所引起的流行性感冒及其它相關疾病的藥物。
另一方面，本發明提供小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含本發明靶序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒膜蛋白基因的表達和/或流感病毒的復制和/或感染。
在本發明中，術語“小分子核糖核酸”、“小分子干擾核糖核酸”或“siRNA”、“本發明核糖核酸”可互換使用，它們都指能夠抑制流感病毒(特別是乙型流感病毒)靶基因表達、包括正義RNA片段區域(例如SEQ ID NO1-SEQ ID NO6中任意一條序列)和反義RNA片段區域(例如SEQ ID NO7-SEQ ID NO12中任意一條序列)的核糖核酸(RNA)。
相關地，本發明還提供DNA序列的組合，其包括或者由編碼正義RNA片段的第一DNA序列和編碼反義RNA片段的第二DNA序列組成，所述正義RNA片段包含本發明靶序列所編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒膜蛋白基因的表達和/或流感病毒的復制和/或感染。
在本發明的這方面，所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
例如，本發明的siRNA可以為發夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區域形成雙鏈RNA區域。
正義RNA片段和反義RNA片段的長度優選為8-50個核苷酸，優選10-30(更優選15-27，最優選19-23，如19、20或者21)個。但也可以更長或者更短。
在正義RNA片段和反義RNA片段形成的雙鏈RNA的互補區域至少有10個(優選15個，更優選18個，如19、20或者21個)堿基對。優選地，所述正義RNA片段與反義RNA片段之間的互補區域含18、19、20、或21對互補堿基。
在一個實施方案中，本發明的siRNA為具有10-30(優選，15-27，更優選19-23)對堿基的雙鏈RNA分子，所述雙鏈中至少有10個(優選15個，更優選18個)堿基互補配對。
在一個優選的實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段的GC含量為35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如約50％。
在一個優選的實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段與已知人類基因和基因表達片段無顯著的同一性。顯著的同一性是指至少60％，例如70，80、90％同一性。
優選的是，所述正義RNA片段自5’端開始的19個核苷酸序列中的堿基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數量之和占除去3’端的TT以外的19個核苷酸數量的比例為35％-75％(即G/C比例)，所述反義RNA片段及其一個核苷酸的突變體與已知人類基因和基因表達片段無顯著同一性。
在一個具體實施方案中，所述反義RNA片段包含與如下所述siRNA靶序列有至少10個(優選15個，更優選18個)堿基互補的序列(1)流感病毒膜蛋白編碼基因上的連續10-30個(優選，15-27個，更優選19-23個)核苷酸；或者(2)SEQ ID NO1-SEQ ID NO6中任意一條序列；正義RNA片段序列與所述反義RNA片段序列有至少10個(優選15個，更優選18個)堿基互補。
在另一個具體實施方案中，所述反義RNA片段序列與SEQ ID NO1-SEQ ID NO6所示的任意一條序列有至少10個(優選15個，更優選18個)堿基互補。
在另一個具體實施方案中，所述正義RNA片段與反義RNA片段的3’端包含至少兩個(例如2、3、4、5個)脫氧寡核苷酸的末端，一般為脫氧胸苷酸TT。
優選地，所述反義RNA片段序列包含SEQ ID NO7到SEQ ID NO12所示的任意一條序列或與前述序列有連續10個(優選15個，更優選18個)堿基相同的序列。
特別優選的是，所述干擾核糖核酸的反義RNA片段序列包含SEQID NOX，正義RNA片段序列包含SEQ ID NO(X-6)，X為7-12中的任一整數。
在一個優選實施方案中，反義RNA片段包含與本發明靶序列編碼的RNA序列全長互補的RNA序列。
在該實施方案中，優選地，在所述正義RNA片段中，在本發明靶序列編碼的RNA序列3’還含有至少兩個(例如2、3、4、5個)連續的脫氧胸苷酸作為正義RNA片段的3’末端；而且，在所述反義RNA片段中，在與本發明靶序列編碼的RNA序列全長互補的RNA序列3’還含有至少兩個(例如2、3、4、5個)連續的脫氧胸苷酸作為反義RNA片段的3’末端。
在一個具體例子中，正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為21個核苷酸，正義RNA片段和反義RNA片段各自的3’端為兩個連續的脫氧胸苷酸(TT)，兩個RNA片段除去3’端的TT以外的19個核苷酸上的堿基互補形成雙鏈，但它們3’端的兩個TT卻以單鏈的形式存在。
本發明的小分子干擾核糖核酸(siRNA)可用化學合成方法直接合成或者用質粒載體在細胞或體內表達，或者在體外合成、轉錄后用Dicer酶消化的方法獲得。
本發明所述的小干擾RNA可以是化學合成的雙鏈RNA；也可以是載體或表達框架表達的雙鏈RNA，所述載體或表達框架中可采用例如RNA聚合酶III啟動子和RNA聚合酶III終止子調控小干擾RNA在哺乳動物細胞中的表達，RNA聚合酶III啟動子包括人源或鼠源的U6啟動子和人H1啟動子等。
本發明所述的小干擾RNA可以是由作用于一個靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個基因的多個靶序列或多個基因上的靶序列的多個小干擾RNA組成；所述的靶序列可以是流感病毒(特別是乙型流感病毒)的RNA基因組序列，或病毒粒子RNA序列(virionRNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互補RNA序列(complementaryRNA，cRNA)。具體地，本發明所述的小干擾RNA可以由序列表中的至少一個序列組成。
本發明的siRNA可通過本文實施例中公開的方法或者本領域已知的方法篩選。在一個實施方案中，將候選siRNA在病毒感染前和/或病毒感染后導入體外培養細胞或體內，通過病毒滴度降低篩選出能有效防治流感病毒(特別是乙型流感病毒)的小干擾RNA。
在本發明的DNA序列的組合中，第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在兩種不同的DNA分子中。這兩種不同的DNA分子優選分別另外含有與第一DNA序列有效連接的第一啟動子和與第二DNA序列有效連接的第二啟動子。
第一DNA序列和第二DNA序列也可以包含在同一種DNA分子中。優選地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA鏈中。更優選地，所示有義RNA片段和反義RNA片段表達為一種RNA分子。還優選的是，所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區域。同樣，所述DNA分子可以另外含有與第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效連接的啟動子。
可用于本發明中的啟動子可以是天然靶基因的天然啟動子、異源啟動子、組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子或者發育調節型啟動子。
當第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中時，所述DNA分子可以另外在編碼有義RNA片段和反義RNA片段的DNA序列之間含有一個接頭。該接頭可以包含一種含有功能基因如選擇性標記基因的表達盒。或者，所述接頭可以包含調節序列如內含子加工信號。
當第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中時，所述有義RNA片段和反義RNA片段也可以表達為兩種RNA分子。此時，優選地，第一DNA序列與第一啟動子有效連接，而第二DNA序列與第二啟動子有效連接；或者，第一DNA序列和第二DNA序列可以與一種雙向啟動子有效連接。
當第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中時，在所述DNA分子中第一DNA序列和第二DNA序列可以包含于所述DNA的互補鏈中。
在這方面，所述第一DNA序列和第二DNA序列優選可以瞬時轉染入宿主細胞中。但是，在某些實施方式中，所述第一DNA序列和第二DNA序列也可以穩定地整合在宿主細胞的基因組中。
在另一方面，本發明還提供包含本發明DNA組合的載體或者載體組合。該載體或者載體組合可以是一個載體或者多個載體，只要它們合在一起包含本發明的DNA組合即可。例如，本發明的DNA組合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在同一個載體中。或者，本發明的DNA組合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在不同的載體中。
所述載體可以是質粒、病毒顆粒及其他載體形式。表達載體中的本發明第一DNA序列和第二DNA序列可以可操作地和表達控制序列連接，表達控制序列包括但不限于用于翻譯起始和轉錄終止的核糖體結合位點，優選的包含一個或多個選擇標記。
本發明還包括上述流感病毒(特別是乙型流感病毒)siRNA表達載體的構建。siRNA表達載體可采用本說明書中公開的或者本領域已知的方法構建。本發明所構建的流感病毒(特別是乙型流感病毒)siRNA表達載體經PCR、序列測定表明構建成功，在體外感染流感病毒(特別是乙型流感病毒)的細胞模型和體內感染流感病毒(特別是乙型流感病毒)的雞胚動物模型中，通過血凝滴度檢測實驗證實表達載體表達的siRNA能較為明顯地抑制病毒復制與感染。
另一方面，本發明還提供分離的宿主細胞，優選哺乳動物細胞，特別是狗腎傳代(Madin darby canine kidney，MDCK)細胞，其中，所述細胞包含本發明的DNA組合或者載體或者載體組合。所述宿主細胞可以是用本發明的載體經基因工程產生的宿主細胞。所述宿主細胞可以是大腸桿菌，真菌如酵母，昆蟲細胞如sf9，動物細胞(尤其是哺乳動物細胞)如非洲綠猴腎細胞(Vero)、CHO或人類細胞等。優選地，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。更優選地，所述哺乳動物細胞為狗腎傳代(Madin darby canine kidney，MDCK)細胞。
通過本文的闡述，適當的載體、宿主細胞的選擇都在本領域技術人員的知識范圍內。
另一方面，本發明還提供一種動物模型，其中，所述動物模型包含本發明的DNA組合或者載體或者載體組合。優選的例子是，所述的動物模型為9-11日齡的雞胚。
在另一方面，本發明還提供包含本發明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合的組合物，特別是藥物組合物。
本發明提供的小干擾RNA分子(siRNA)能夠特異性地針對流感病毒(特別是乙型流感病毒)，它可能通過細胞內的RISC(RNA-inducedsilencing complex)有效地降解流感病毒(特別是乙型流感病毒)的蛋白信使核糖核酸分子。本發明siRNA可以直接阻斷病毒基因物質的復制、病毒的繁殖與感染，還可以抑制其和致病密切相關蛋白質的合成，為治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒及與其密切相關的呼吸道疾病找到了新的有效的手段。本發明的抗流感病毒(特別是乙型流感病毒)的siRNA的作用效果顯著，無副作用，將在流感病毒(特別是乙型流感病毒)的防治中起到重要的作用。
因此，在另一方面，本發明還提供本發明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中所述藥物用于治療和/或預防流感病毒引起的流行性感冒或其它相關疾病。
本發明還涉及了上述宿主細胞在制備治療和/或預防流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒及其它相關疾病的藥物中的應用。優選地，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。更優選地，所述宿主細胞為狗腎細胞。
在另一方面，本發明還提供本發明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒的復制和/或感染。
在另一方面，本發明還提供本發明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒蛋白質的表達。本發明還涉及了上述載體在細胞中抑制流感病毒(特別是乙型流感病毒)膜蛋白表達的應用，其中，細胞中轉染上述載體能有效降低膜蛋白與螢火蟲熒光素酶融合基因的表達。
本發明所述的小干擾RNA能抑制不同流感病毒(特別是乙型流感病毒)毒株在動物細胞中的復制與感染。
本發明所述的小干擾RNA能抑制不同流感病毒(特別是乙型流感病毒)毒株在動物模型如雞胚、小鼠中的復制與感染。
本發明選取了流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因組中高度保守的區段作為靶序列，實現了siRNA對不同毒株的復制與感染的干擾作用，為RNAi技術用于預防和治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)對家禽、家畜等的感染提供新的技術路線。
在另一方面，本發明還提供抑制流感病毒的復制和/或感染的方法，包括給予本發明的組合物。
在另一方面，本發明還提供抑制宿主細胞中流感病毒蛋白質的表達的方法，包括將宿主細胞與本發明的組合物接觸。
本發明的組合物可采用本領域已知的或者本文公開的途徑給藥。給藥途徑包括但不局限于下述幾種外用(包括眼、鼻)；吸入(包括氣管內、口腔內、過皮或皮外的乳化劑或噴霧劑)；口服；注射或點滴(包括靜脈、動脈、皮下腹腔或肌肉內)；顱內給藥(包括鞘膜、腦室內)。例如，本發明用于預防或治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的小干擾RNA或上述載體可以和脂質體混合使用。給藥劑量可以由本領域技術人員經過常規試驗來確定。一般來說，siRNA分子的劑量范圍為5ng～200mg/kg體重(優選劑量范圍是5μg～5mg/kg)，此劑量可以每天一次或數次或每周一次或數次、每月一次或數次、每年一次或數次。通常可以根據測定所給藥物在體內的逗留時間、藥物在體液或組織中的濃度來決定給藥的次數和頻率。
本發明用于預防或治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的小干擾RNA可以通過呼吸道噴霧或滴注使siRNA經過肺等呼吸系統組織或器官吸收。
在可適用的本發明任何方面，優選的是，所述流感病毒是乙型流感病毒，特別是乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、或B/Jiangsu/10/03。
同現有技術相比的優點①本發明設計了一系列針對流感病毒(特別是乙型流感病毒)膜蛋白編碼基因不同靶位點的siRNA。②siRNA是天然存在于植物、真菌和動物細胞內的抗病毒小分子物質，它不但對正常基因調控有重要作用，而且是生命體內天然的抗病毒感染的基因免疫系統。③大量實驗表明siRNA是通過與其序列互補的RNA結合并引起RNA鏈的斷裂，從而抑制相應蛋白質的合成，因此特異性很高。④許多實驗說明，RNAi存在明顯的高效性，極少量的siRNA就可以引起明顯的基因沉默表型。⑤無明顯毒性和副作用。迄今為止，所有體外和體內的研究結果都表明有效劑量(0.1-10μg/kg)的siRNA對體外培養的細胞和實驗動物沒有明顯的毒性和副作用，因此siRNA是一類安全的藥物。⑥高抗突變性。流感病毒容易發生突變使已有疫苗失效，而針對高度保守靶序列的特異siRNA可以避免這些突變，因此siRNA基因藥物具有較高的抗突變性。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于舉例說明本發明而不限制本發明的范圍。下列實施例中如果未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域技術內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學和重組DNA技術的常規方法和條件，這種技術和條件在文獻中有完整解釋。參見例如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)；D.Glover主編DNA CloningA Practical Approach，vol.I & II；N.Gait主編Oligonucleotide Synthesis(1984)；B.Hames & S.Higgins主編Nucleic Acid Hybridization(1985)；B.Hames & S.Higgins主編Transcription and Translation(1984)；R.Freshney主編Animal Cell Culture(1986)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)中所述的技術和條件，或按照制造廠商所建議的條件。
下面實施例中使用了乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、B/Jiangsu/10/03作為舉例來進行試驗。但是，很明顯，本發明并不局限于這些病毒株，也可以采用其它乙型流感病毒株來進行試驗。
實施例實施例一 siRNA靶位點的設計選取siRNA靶序列遵循以下基本原則是①從轉錄本(mRNA)的起始密碼子AUG開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，這19個堿基序列盡量以G開始，且其GC含量在45～55％左右，并避開4個連續的T或A序列，作為潛在的siRNA靶位點序列。②靶序列區域距離翻譯起始點或終止點至少70-100核苷酸。③使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov)，將潛在的靶序列與人的基因組數據庫進行比較，排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列。
本發明根據上述siRNA的設計原則，在乙型流感病毒(B/Beijing/76/98)膜蛋白(M)編碼區(GenBank數據庫中的登錄號為AY687399)選取下列位點

表1 針對乙型流感病毒膜蛋白編碼區的siRNA靶位點序列表1所示的靶位點序列與相同編號的siRNA的正義RNA片段序列相同(除了正義RNA片段3’末端的“TT”外)，其在基因上的位點是從編碼膜蛋白的起始密碼子開始編號的，其在序列表中的序號見最右側一列。本表格所示序列僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例二 siRNA的化學合成siRNA的合成可委托公開對外開展合成業務的商業公司，比如美國Dharmacon公司和中國上海吉瑪生物制藥公司，具體可通過www.Dharmacon.com和www.genepharma.com獲知，所有的siRNA分子都經過2位上脫保護、脫鹽、純化、和退火形成雙鏈處理，然后溶于DEPC處理的蒸餾水中。其所采用的合成方法均為通用的方法，比如以下文獻公開的方法Scaringe SA，Wincott FE，and Caruthers MH.Novel RNA Synthesis Method Using 5’-Silyl-2’-OrthoesterProtecting Groups.J Am Chem Soc 1998；12011820-11821.
本發明提供的siRNAs由上海吉瑪生物制藥公司合成。
1.分別合成siRNA的正義鏈和反義鏈(序列見表2，表3)。
2.退火形成雙鏈siRNAs1)將合成的siRNA正義、反義鏈溶于焦磷酸二乙酸(DEPC)處理過的水中。
2)制備退火緩沖液(2×)200mM乙酸鉀，4mM乙酸鎂，60mM Hepes-KOH(pH7.4)。
3)制備20μM的siRNA貯存液2×退火緩沖液 100μlsiRNA正義鏈XμlsiRNA反義鏈YμlDEPC處理水 (100-X-Y)μl上述成分混勻，于90℃放置1分鐘，然后于37℃放置1小時。貯存于-20℃。
實施例三 siRNA表達載體的構建用帶有H1啟動子和U6啟動子的載體siBuster vector(瑞典Genordia AB公司產品，詳情見www.genordia.com)，分別連接上述設計的siRNAs靶位點序列(19個堿基)加三個接頭堿基(共22-mer)的DNA寡核苷酸鏈，形成能表達siRNAs的質粒載體(如圖1所示)。
DNA寡核苷酸鏈為正義DNA片段(對應于siRNA正義RNA片段)5’-AAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’反義DNA片段(對應于siRNA反義RNA片段)5’-AAAANNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’下劃線的18-mer與正義DNA片段G后的序列互補，這兩條DNA寡核苷酸鏈經退火形成雙鏈DNA oligos5’-AAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’正義DNA片段3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA-5’反義DNA片段1)DNA單鏈合成多家DNA合成公司均可合成。
2)DNA單鏈退火成雙鏈退火反應體系如下正義DNA片段寡核苷酸(100μM)2μl
反義DNA片段寡核苷酸(100μM)2μl10×任何一種限制性內切酶緩沖液 2μl水 14μl總量 20μl退火程序為于95℃加熱5min后，移至室溫10min，即完成退火。然后用1×相同限制酶緩沖液稀釋50倍，至終濃度為0.2M，待用。
3)連接將退火后的雙鏈DNA oligos連接入GeneBuster載體，連接反應體系為GeneBuster載體(1ng/μl)1μl退火的DNA oligos(0.2μM) 1μl5×連接酶緩沖液(含ATP) 4μlT4DNA連接酶1μl水 13μl總量 20μl4)轉化、鑒定連接產物轉化DH5α大腸桿菌，經氨芐青霉素(Amp+)抗性篩選，挑取單克隆菌落進行PCR擴增，篩選出含目的基因的陽性克隆，并進行DNA序列分析加以確定。
鑒定正確的陽性質粒即為可以在細胞中表達siRNA的質粒。
實施例四 融合蛋白表達載體的構建為了分析siRNA對各個靶序列的干擾效果，我們構建了一系列報告質粒，即將膜蛋白的編碼序列克隆到一個螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase，FL)表達載體(如pGL3)5’端，構成融合基因(如M-FL)，該基因由報告質粒經轉染進入細胞，在細胞內可表達融合的螢火蟲熒光素酶。若靶基因被siRNA干擾則螢火蟲熒光素酶(FL)的表達量降低，據此可以判斷siRNA是否特異性干擾靶基因。
實施例五 質粒表達siRNA在MDCK細胞中抑制膜蛋白表達的鑒定1.方法(1)細胞轉染用24孔細胞培養板進行細胞轉染實驗。
①轉染的前一天于24孔細胞培養板上每孔接種0.5×105個MDCK細胞(中國國家流感中心)，5％CO2培養箱37℃培養過夜。至轉染時細胞鋪滿孔面積的30-50％。
②膜蛋白(M)表達載體的轉染用陽離子脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen)轉染試劑，按其操作說明進行轉染實驗。具體用量為每孔細胞加靶基因載體170ng，作為轉錄活性內對照的海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)表達載體(pRL-TK)(Promega公司產品)17ng，siRNA表達載體0.5μg，Lipofectamine 2000 2μl。
③6小時后補加胎牛血清至終濃度為10％。于5％CO2、37℃繼續培養至72小時后檢測。
(2)熒光檢測應用Promega公司的雙熒光報告系統(Dual-luciferase ReporterAssay System)，在熒光照度儀TD-20/20 luminometer(TurnurDesigns，USA)上進行熒光檢測。
轉染后72hr收獲細胞進行熒光檢測。按照Dual-luciferaseReporter Assay System的操作說明進行。具體操作步驟為①棄細胞培養液，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗細胞兩次，以去除脫落細胞和殘留的細胞培養液。
②在每孔中加入100μl 1×裂解緩沖液(Passive LysisBuffer)。
③細胞培養板置震蕩器上震蕩裂解15min。
④取各細胞培養孔中的細胞裂解液20μl，加至熒光照度儀所用的檢測板的各孔中。
⑤檢測板的各樣品孔中加入100μl Luciferse Assay ReagentII，混勻后用熒光照度儀進行熒光強度檢測。
⑥各樣品孔中迅速加入100μl Stop & Glo Reagent，再用熒光照度儀進行熒光強度檢測。
⑦進行數據計算與分析(按照Promega公司Part#TM040技術手冊說明進行)。
(3)針對膜蛋白編碼基因的siRNA的篩選方法。
將siRNA表達載體、海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)表達載體(pRL-TK)與螢火蟲熒光素酶融合基因表達載體(M-FL)共轉染MDCK細胞，72小時后收獲細胞進行熒光檢測及數據計算與分析。實驗結果見圖2。具體結果見表2、表3。
2.結果siRNA的篩選結果抑制效率＜40％的siRNA

表2
抑制效率＞40％的siRNA

表3表2和表3中(+)表示正義RNA片段；(-)表示反義RNA片段。其中正義RNA片段序列號與表1中相應編號靶位點序列的序列號相同，正義RNA片段序列號(Y)為相應編號的反義RNA片段序列號(X，X為7-12中任一自然數)減6，即Y＝X-6。表2、表3第三列“/”左側為正義RNA片段序列號，右側為反義RNA片段序列號。如編號1的siRNA的正義RNA片段為包含SEQ ID NO1的相應序列，反義RNA片段為包含SEQ ID NO7的相應序列。
實施例六 細胞中質粒表達No.3號siRNA在病毒感染后不同時間對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制將能表達No.3號siRNAs的質粒(500ng/well)轉染培養在24孔板中的MDCK細胞，于37℃、5％CO2培養6小時(hr)后，每孔細胞經Hank’s液沖洗后加入100μl在病毒感染培養液中的乙型流感病毒B/Beijing/76/98(病毒基因工程國家重點實驗室保存株)(病毒感染量為MOI 0.001，其中MOI為感染復數)，于34℃、5％CO2感染1hr后加入新鮮的不含血清的細胞培養液(含2μg/ml TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)-胰酶(Trypsin))繼續于34℃5％CO2培養，在感染后的不同時間收獲細胞上清進行病毒滴度或病毒毒力的測定。
病毒感染培養液為DMEM中含有0.3％牛血清白蛋白，10mM Hepes，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。
病毒滴度與病毒毒力的測定如下(1)紅細胞凝集滴度(簡稱血凝滴度)的測定首先在96孔U形板的各孔中加入25μl 0.85％氯化鈉(Nacl)，再于第一孔中加入25μl病毒液，經多次吹打充分混勻后吸取25μl液體放入第二孔，依次進行稀釋，最后一孔吹打混勻后吸取25μl棄之。然后于每孔中加入25μl 1％雞血紅細胞懸液，混勻后置室溫30～60min，觀察結果，進行紅細胞凝集滴度計算。
(2)病毒毒力的檢測TCID50檢測將病毒進行倍比稀釋，接種于24孔細胞培養板培養成單層的MDCK細胞中，每個稀釋度平行加4個孔，每孔加200μl稀釋液，于34℃孵育1hr后用Hank’s溶液沖洗，然后加入含TPCK-Trypsin(TPCK處理的胰酶)的細胞維持液。在感染后每24hr補加TPCK-Trypsin，在感染后72hr收獲病毒，凍存于-80℃冰箱過夜，并用雞血紅細胞測定血凝滴度。
空斑形成單位(PFU)檢測將病毒進行10倍比稀釋，接種于含培養成單層的MDCK細胞的6-孔板中，每個稀釋度兩孔，0.5ml/孔，輕輕晃動使加入的病毒液均勻地鋪在細胞表面上，于34℃孵育1hr后用Hank’s液沖洗，然后加入第一層覆蓋液，3ml/孔，置34℃孵育72hr后加入第二層覆蓋液，24～72hr取出，計數空斑。
結果如圖3顯示，(1)沒有轉染siRNAs而只感染病毒的對照細胞中，流感病毒滴度隨時間的延長逐漸升高，說明病毒感染細胞后不斷復制，病毒產量逐步增加，至感染后72hr達到最高(HA血凝滴度為1∶128)。(2)針對無關蛋白的siRNA(對照siRNA)對病毒復制沒有影響，用實驗證實了siRNA的特異性。(3)在轉染了能表達No.3號siRNA的質粒的細胞中病毒滴度很低，說明質粒表達No.3號siRNA能在MDCK細胞中有效抑制病毒復制，而且隨著時間的延長，病毒量沒有明顯增加。由此可見，siRNA可以有效抑制病毒在細胞中的復制，而且抑制效果至少可以持續4天。
實施例七 細胞中轉染不同量的No.3號siRNA表達質粒對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例六。
培養在24孔板的MDCK細胞中轉染(如實施例五中用脂質體轉染)不同量的能表達No.3號siRNA的質粒(如圖4中顯示的量)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細胞及培養液，測定病毒滴度。結果如圖4所示。由圖4中結果可以明顯地看出，隨著表達No.3號siRNA的質粒的增加，No.3號siRNA對細胞中流感病毒的抑制效果也越來越明顯。由此可見，質粒表達No.3號siRNA可以強有效地抑制細胞中的流感病毒B/Beijing/76/98的復制與感染，而且具有量依賴性。
實施例八 細胞中轉染不同量的化學合成No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例七。
培養在24孔板的MDCK細胞中轉染(如實施例五中用脂質體轉染)不同量的化學合成No.3號siRNA(如圖5中顯示的量)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細胞及培養液，測定病毒滴度。結果如圖5所示。由圖5中顯示的結果可以看出，隨著化學合成No.3號siRNA量的增加，No.3號siRNA對細胞中流感病毒的抑制效果也越來越明顯。這進一步說明，化學合成No.3號siRNA可以強有效地抑制細胞中的乙型流感病毒B/Beijing/76/98的復制與感染，而且具有劑量依賴性。
實施例九 siRNA對新產生病毒粒子的抑制將培養在24孔板的MDCK細胞先進行病毒感染，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，2hr后再轉染能表達No.3號siRNA的質粒(500ng/well)，轉染后細胞于34℃、5％CO2繼續培養，在病毒感染后72hr收獲細胞及培養液進行病毒滴度或病毒毒力的測定。結果如圖6所示。由圖6中的結果可以看出，隨著時間的延長，沒有轉染siRNA的空白對照和轉染了無關siRNA(對照siRNA)的細胞中流感病毒的量逐漸增加，而轉染了能表達No.3號siRNA的質粒的細胞中流感病毒的量只是略有增加，這說明No.3號siRNAs能有效抑制新病毒粒子的產生。
實施例十 細胞中質粒表達各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例六。
培養在24孔板的MDCK細胞中轉染能表達各種siRNA的質粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細胞及培養液，測定病毒滴度。結果如圖7所示。由圖7中的結果可以明顯地看出，質粒表達No.1號、No.4號、No.5號、No.6號siRNA均可以有效地抑制細胞中的流感病毒B/Beijing/76/98的復制與感染。
實施例十一 細胞中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99(來自中國國家流感中心)的抑制方法同實施例六。
培養在24孔板的MDCK細胞中轉染能表達No.3號siRNA的質粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/37/99病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細胞及培養液，測定病毒滴度。結果如圖8所示。由圖8中的結果可以明顯地看出，質粒表達No.3號siRNA可以強有效地抑制細胞中的流感病毒B/Beijing/37/99的復制與感染。
實施例十二 細胞中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03(病毒基因工程國家重點實驗室保存株)的抑制方法同實施例六。
培養在24孔板的MDCK細胞中轉染能表達No.3號siRNA的質粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/37/99病毒量為MOI 0.01，感染后72hr收獲細胞及培養液，測定病毒滴度。結果如圖9所示。由圖9中的結果可以明顯地看出，質粒表達No.3號siRNA可以強有效地抑制細胞中的流感病毒B/Jiangsu/10/03的復制與感染。
實施例十三 細胞中siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較方法同實施例六。
培養在24孔細胞培養板中的MDCK細胞，一部分孔的細胞轉染能表達No.3號siRNA的質粒(500ng/well)，6hr后進行病毒感染每孔細胞接種病毒100μl，其中B/Beijing/76/98和B/Beijing/37/99病毒為MOI 0.001、B/Jiangsu/10/03病毒為MOI 0.01；另一部分孔中的細胞，感染同樣多的病毒后，在培養液中加入利巴韋林(Ribavirin)3.6μg/孔；空白對照為不加任何抑制物、只感染病毒的對照。感染病毒后細胞于34℃5％CO2培養。病毒感染后72hr收獲細胞及培養液，測定病毒滴度。結果如圖10所示。由圖中結果可以看出，No.3號siRNA和利巴韋林均能抑制細胞中乙型流感病毒的復制；利巴韋林對B/Beijing/37/99的抑制效果稍差；當細胞中轉染500ng能表達siRNAs的質粒時，對三種乙型流感病毒的抑制效果比3.6μg利巴韋林好。
實施例十四 雞胚中質粒表達各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制將500ng能表達各種siRNA的質粒分別用無血清培養基(Opti-MEMI Reduced Serum Medium，Invitrogen公司產品)進行稀釋，體積為100μl；然后與B/Beijing/76/98(6500PFU/ml)病毒液100μl混合，接種10日齡雞胚的尿囊腔。接種66hr后，收獲雞胚尿囊液，進行病毒含量測定。結果如圖11所示。由圖中的結果可以明顯地看出，質粒表達No.1、No.3、No.4、No.5、No.6號siRNA均可以強有效地抑制雞胚中流感病毒B/Beijing/76/98的復制與感染。
實施例十五 雞胚中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制方法同實施例十四。
接種的乙型流感病毒B/Beijing/37/99的毒力為5200PFU/ml。病毒滴度測定結果如圖12所示。由圖中的結果可以看出，質粒表達No.3號siRNA可以有效地抑制雞胚中流感病毒B/Beijing/37/99的復制與感染。
實施例十六 雞胚中質粒表達No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制方法同實施例十四。
接種的乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的毒力為8500PFU/ml。病毒滴度測定結果如圖13所示。由圖中的結果可以看出，質粒表達No.3號siRNA可以強有效地抑制雞胚中流感病毒B/Jiangsu/10/03的復制與感染。
實施例十七 雞胚中化學合成No.3號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例十四。
將60nmol化學合成siRNAs用Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen公司產品)進行稀釋，體積為100μL；然后與B/Beijing/76/98(6500PFU/ml)病毒液100μl或200μl混合，接種10日齡雞胚的尿囊腔。接種66hr后，收獲雞胚尿囊液，進行病毒含量測定。結果如圖14所示。由圖中的結果可以明顯看出，化學合成No.3號siRNA，無論病毒接種量為650PFU/egg還是1300PFU/egg，均可以強有效地抑制雞胚中流感病毒B/Beijing/76/98的復制與感染。
實施例十八 雞胚中siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較方法同實施例十四。
將能表達No.3號siRNA的質粒(500ng)或利巴韋林3.6μg與病毒B/Beijing/76/98(650pfu/egg)或B/Beijing/37/99(520pfu/egg)或B/Jiangsu/10/03(850pfu/egg)一起接種10日齡雞胚的尿囊腔，接種后66hr收獲雞胚尿囊液，進行病毒含量測定。結果(如圖15所示)發現，對三種病毒，只接種病毒、不介入siRNA和藥物的雞胚尿囊液(對照)中均可檢測到很高的病毒含量；而同時接種了能表達No.3號siRNA的質粒和病毒的雞胚，其尿囊液中的病毒含量很低，說明它有效地抑制了病毒的復制；利巴韋林與病毒一起接種雞胚尿囊腔，結果雞胚尿囊液中的病毒含量比只接種病毒的雞胚尿囊液中病毒量少，但比介入了siRNAs的雞胚尿囊液中的病毒含量高。由此可見，500ng能表達No.3號siRNA的質粒在雞胚中產生的siRNAs抑制乙型流感病毒復制與感染的效果比3.6μg利巴韋林好。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所<120>針對乙型流感病毒膜蛋白基因的siRNA序列及其應用<130>IDC050126<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1ggaaagaauu ugaccuaga19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>2gaaagcucag cgcuacuau19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>3gagugagacg agaaaugca19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>4ggaaggaauu gcaaaggau19<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>5ggauguaaug gaagugcua19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>6gaaguacucu cugacaaca19<210>7<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>7ucuaggucaa auucuuucc19<210>8<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>8auaguagcgc ugagcuuuc19<210>9<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>9ugcauuucuc gucucacuc19<210>10<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>10auccuuugca auuccuucc19<210>11<211>19
<212>RNA<213>人工序列<400>11uagcacuucc auuacaucc19<210>12<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>12uguugucaga gaguacuuc19
權利要求
1.分離的流感病毒小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列為流感病毒膜蛋白編碼基因上的連續10-30個(優選，15-27個，更優選19-23個)核苷酸。
2.如權利要求1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列為SEQID NO1-SEQ ID NO6中任意一條序列。
3.與權利要求1或2的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸序列，或其互補序列。
4.包含權利要求1-3任一項的序列的核酸構建體。
5.權利要求1-4任一項所述的siRNA靶序列在篩選抗流感病毒藥物中的應用。
6.小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權利要求1-3序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒膜蛋白基因的表達和/或流感病毒的復制和/或感染。
7.如權利要求6所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
8.如權利要求7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸為發夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區域形成雙鏈RNA區域。
9.權利要求6-8任一項所述的核苷酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段的長度優選為8-50個核苷酸，優選10-30(更優選15-27，最優選19-23，如19、20或者21)個。
10.權利要求6-9任一項所述的核苷酸，其中，雙鏈RNA的互補區域至少有10個(優選15個，更優選18個)堿基對。
全文摘要
本發明涉及一組針對乙型流感病毒膜蛋白編碼基因的siRNA及其制備方法和應用。選取乙型流感病毒膜蛋白(M)編碼基因中高度保守的序列作為siRNA的靶序列，并且以靶序列中的連續10－30(優選，15－27，更優選19－23)bp的序列設計siRNA。細胞和動物模型攻毒實驗證明，以乙型流感病毒基因組中高度保守的序列作為靶序列，應用能與靶序列特定位點上的核苷酸序列互補配對的siRNA，可以阻斷該基因在細胞和動物模型中的復制與表達，從而有效地抑制不同乙型流感病毒毒株在細胞和動物模型的復制與感染，以達到治療流行性感冒的目的。
文檔編號C12N15/63GK1837367SQ20051000356
公開日2006年9月27日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者高永珍, 金奇, 梁子才, 侯云德 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所