專利名稱：神經元再生的制作方法
技術領域：
本發明涉及神經元存活和軸突再生，并且具體地涉及中樞神經系統(CNS)中神經生長的調控。本發明還提供組合物和使用所述組合物來提高神經存活和促進軸突生長的方法。
在所有動物物種的CNS和外周神經系統(PNS)的發育過程中，軸突和樹突充分地延長。然而，在成年人中，CNS中軸突和樹突再生隨著進化發展而日益喪失。在PNS中，在施加損傷后，所有脊椎動物物種的軸突都能夠再生，至少在某種程度上再生。然而，在哺乳動物的CNS中，損傷后的軸突再生限于軸突萌發。然而，神經過程的再生在更低等脊椎動物物種中是可能的。
神經膠質是控制軸突再生的決定性決定因素。在發育過程的CNS中和在成人PNS中，哺乳動物的神經膠質允許軸突生長。因此，當施加損傷時，成年哺乳動物PNS的神經膠質可以重新表達它們的早期軸突生長-促進潛力，并且促進再生。某些低等脊椎動物的CNS神經膠質在成年時期保持允許軸突的再生。相反，成年哺乳動物的CNS神經膠質在損傷后不重新表達它們的發育生長特性。
神經營養因子(NTF)存在于神經系統的正常發育過程中。在這樣的發育中，神經靶點結構產生有限量的特異性NTFs，NTFs是投射到靶點結構中的神經元存活、分化和生長所必需的。NTFs促進成熟神經元的存活和/或維持，并且是CNS損傷后神經再生的主要決定因素。此外，外周神經膠質(神經膜細胞)產生神經營養因子(NTF)，推測所述神經營養因子負責成人PNS損傷后的軸突再生。然而，長期的實驗證明移植到CNS中的外周神經移植物在超過損傷后30天(dpl)不再維持CNS軸突再生，并且到100dpl，大部分軸突降解了，大概是由于外周神經移植物中的神經膜細胞在移植后大約20天停止產生NTFs，這可能是由于缺少軸突接觸。
CNS髓磷脂是軸突生長抑制劑的豐富來源，包括髓磷脂相關的糖蛋白(MAG)、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)、Nogo和硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)，其通過結合Nogo受體(NgR)而阻滯軸突生長。Nogo受體與LINGO-1(含有LRR和Ig結構域的Nogo受體相互作用蛋白)和p75神經營養蛋白受體(p75NTR)相關，其中p75神經營養蛋白受體(p75NTR)是腫瘤壞死因子受體家族的一員。后者通過激活下游Rho-A而傳導抑制信號，這導致順序的ROCK/LIM激酶/肌動蛋白絲切蛋白肌動蛋白絲解聚以及生長錐瓦解。因此，NgR、p75NTR和RhoA抑制分子一起形成軸突生長抑制途徑的主要因素。應該理解，許多其它分子，諸如ROCK/LIM、肌動蛋白絲切蛋白和LINGO-1也參與所述途徑。
盡管許多年來進行了無數的嘗試，但是，從來沒有實現治療性的CNS中的神經再生。例如，Logan等(Eur.J.Neurosci.1994 16(3)355-63)研究了損傷CNS中轉化生長因子β1(TGFβ1)調控水平的作用，以觀察是否可以誘導神經元再生。在一些環境中，TGFβ1是一種神經營養因子，并且還是有力的纖維發生因子，刺激包括CSPG(一種軸突生長抑制性配體)的基質分子的產生，由此潛在地調控所述軸突生長抑制途徑。他們證明TGFβ1參與瘢痕形成，其又限制瘢痕區域周圍損傷的CNS中軸突投射的生長，這可能是通過如本文所含的CSPG的抑制性配體對活性軸突生長的抑制。他們表明，阻滯TGFβ1活性不抑制瘢痕，但是存在很少或沒有相關的軸突生長，這表明阻滯瘢痕形成和某些種類抑制分子的產生沒有引起增強的軸突再生。
因此，對于提供可以在CNS中促進神經生長的再生性治療存在顯而易見的需求。這樣的治療可以用來使得損傷或患病的神經能夠在損傷之后存活、再生并且重新起作用。因此，本發明人決定將他們的研究集中在神經元抑制途徑上，以觀察這一途徑的調控是否能夠增強-NTF刺激的神經元存活和軸突生長。
按照本發明的第一方面，提供一種適合下調編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達的基因沉默分子。
按照本發明的第二方面，提供一種用作藥物的適合下調編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達的基因沉默分子。
按照本發明的第三方面，提供適合下調編碼參與Rho-A抑制途徑的蛋白的基因的表達的基因沉默分子用于制備促進神經元存活和軸突生長的藥物中的應用。
本發明人研究了許多生物化學途徑，以評估它們是否可以被調控以影響神經元生長。他們的研究確定Rho-A抑制途徑是一個令人驚訝的良好的調控靶點。通過表達“Rho-A抑制途徑”，我們意指軸突生長抑制途徑，其中其包括NgR、p75NTR和RhoA抑制分子。
他們開始檢測Rho-A途徑的各種調控子，以觀察是否可以促進軸突生長，盡管沒有成功(例如，參見上文)。然而，令人驚訝地，按照本發明第一方面的基因沉默分子(例如siNA)的應用證明是有效的，并且的確刺激神經生長。此外，令人驚訝地，本發明人已經確定，按照本發明的基因沉默分子還有用于促進神經元存活(即，它們減少程序性細胞死亡對神經元的清除)。因此，第一方面的分子具有按照第二方面的醫學應用，并且更具體地，已經表現出刺激按照第三方面的神經元存活和軸突生長。
優選地，所述藥物用于促進CNS中神經元存活和軸突再生。CNS損傷可以由手術、外傷、加壓、挫傷、橫切、神經毒性或其它物理損傷引起，由脈管系統藥理性或其它損傷包括出血或局部缺血損傷引起，或者由神經退化或其它神經疾病引起。特征在于消弱的或失敗的軸突生長的疾病，其可以用所述藥物進行治療，優選地特征在于神經損傷的疾病。例如，所述疾病可以是慢性的或急性的腦外傷、脊髓損傷、神經毒性、中風、青光眼、視神經損傷、CNS出血、面神經損傷，其由非急需施行的手術(electivesurgery)、神經加壓、震蕩、局部缺血(ischaemia)、燒傷等引起。
本發明人更吃驚的是確定按照本發明的分子可以用于治療特征在于增加的細胞死亡的病癥。因此，他們已經確定所述藥物還可以用來治療神經元存活是顯著問題的病況。例如，所述藥物可以用于治療神經退化疾病，諸如癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、運動神經元疾病、CJD等。
按照本發明的第四方面，提供適合下調編碼參與Rho-A抑制途徑的蛋白的基因的表達的基因沉默分子用于制備抑制細胞程序性細胞死亡的藥物中的應用。
術語“基因沉默分子”，我們意指干擾討論基因表達的任何分子。這樣的分子可以是反義分子(反義DNA或反義RNA)或核酶分子。核酶和反義分子可以用于抑制編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的轉錄，或者抑制所述基因的mRNA的翻譯。反義分子是以序列特異性方式與核酸如DNA或RNA結合的寡核苷酸。當與具有互補序列的mRNA結合時，反義RNA防止所述mRNA的翻譯。三聯體分子是指結合雙聯體DNA的單反義DNA鏈形成線性對應的三聯體分子，因而防止轉錄。特別有用的反義核苷酸和三聯體分子是與編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的DNA有義鏈(或mRNA)互補或結合的那些分子。
能夠催化RNA底物的特異性裂解的酶促RNA分子的核酶的表達，還可以用于阻滯蛋白翻譯。核酶作用機制包括核酶分子與互補的靶點RNA的序列特異性雜交，然后是核酸內切性裂解，例如錘頭狀基序核酶。
優選地，所述基因沉默分子是短干擾核酸(siNA)。
優選地，按照本發明的分子沉默NgR、p75NTR和/或RhoA抑制性分子的基因。
當所述分子是siNA分子時，它可以是雙鏈的，并且因此包括有義和反義鏈。siNA分子可以包括siDNA分子或siRNA分子。然而，優選所述siNA分子包括siRNA分子。因此，按照本發明的siNA分子優選地通過RNA干擾(RNAi)而下調基因表達。
RNAi是動物和植物中序列特異性的轉錄后基因沉默作用。它使用小干擾RNA分子(siRNA)，所述siRNA是雙鏈的的，并且在序列上與沉默的(靶點)基因同源。因此，siRNA分子與由靶點基因轉錄產生的mRNAs的序列特異性結合允許非常特異性的基因表達的靶點‘擊倒’。
作為一種實驗方法，本發明人設計并且生產了許多siRNA分子，目的是檢測它們在調控Rho-A抑制途徑中的效果。令人驚訝地，本發明人發現，使用許多表現出針對參與Rho-A抑制途徑的各種蛋白的序列特異性的siRNA分子的確導致對所述途徑的抑制解除，并且導致提高的軸突生長以及提高的神經元存活。這使得他們相信按照本發明的分子的應用可能是一種用于增強軸突長出(outgrowth)的抑制解除的內源機制以及提高的神經元存活的有用技術。
編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因可以被視作靶點基因。優選地，siNA分子基本上與靶點基因的編碼序列的至少一個區域相同，以能夠下調所述靶點基因。優選地，siNA分子序列和靶點基因區域之間的同一性程度是至少60％的序列同一性，優選地，至少75％的序列同一性，優選地至少85％的同一性；至少90％的同一性；至少95％的同一性；至少97％的同一性；和最優選地，至少99％的同一性。
不同氨基酸/多肽/核酸序列之間相似性百分數的計算可以進行如下。首先通過ClustalX程序(成對參數缺口開口10.0，缺口延伸0.1，蛋白基質Gonnet 250，DNA基質TUB；多重參數缺口開口10.0，缺口延伸0.2，延遲分歧序列30％，DNA轉變重量0.5，陰性基質off，蛋白基質gonnet系列，DNA重量TUB；蛋白缺口參數，殘基特異性罰分on，親水性罰分on.親水殘基OPSNDQERR，缺口分離距離4，末端缺口分離off)產生多重比對。然后從所述多重比對計算同一性百分數為(N/T)*100，其中N是兩種序列分享相同殘基的位置的數目，和T是進行比較的位置總數。備選地，同一性百分數可以作為(N/S)*100計算，其中S是進行比較的較短的序列的長度。氨基酸/多肽/核酸序列可以從頭合成，或者可以是天然氨基酸/多肽/核酸序列，或其衍生物。
一種基本上相似的核苷酸序列應該由在嚴緊條件下與本文提及的任何核酸序列或它們的補體雜交的序列所編碼。對于嚴緊條件，我們意指核苷酸在45℃左右在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與過濾結合的DNA或RNA雜交，然后在5-65℃左右在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌至少1次。備選地，基本上相似的多肽可以在至少1個，但是少于5，10，20.50或100個氨基酸不同于按照本發明的肽序列。
由于遺傳密碼的簡并性，清楚地，任何核酸序列可以是不同的或改變的，而基本上不影響其所編碼的蛋白序列，以提供其功能變體。適宜的核苷酸變體是具有通過在所述序列內編碼相同氨基酸的不同密碼子的取代(因此產生沉默改變)而改變的序列的那些核苷酸。其它適宜的變體是那些具有同源核苷酸序列但是包括通過取代編碼具有同它所取代的氨基酸相似的生物物理特性的側鏈的氨基酸(以產生保守改變)而改變的序列的全部或部分的核苷酸。例如，小的非極性、疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；大的非極性、疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；中性極性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電荷(堿性)氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
精確的蛋白或DNA序列比對是一種復雜的過程，其已經由許多研究者詳細地研究過。特別重要的是序列的最佳匹配和為得到這樣的匹配引入缺口之間的平衡(trade-off)。在蛋白的情形中，匹配計分的方法也是重要的。盡管其它同等實用的矩陣是本領域的技術人員已知的，但是PAM矩陣(例如，Dayhoff，M.等，1978，Atlas of protein sequence and structure，Natl.Biomed.Res.Found.)和BLOSUM矩陣家族量化保守取代的性質和可能性，并且用于多重比對運算法則中。常用的多重比對程序ClustalW，以及其windows版本ClustalX(Thompson等.，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680；Thompson等，1997，Nucleic Acids Research，24，4876-4882)是產生蛋白和DNA多重比對的有效方法。
通常，自動產生的比對需要人工比對，應用專門訓練的使用者關于要研究的蛋白家族的知識，例如，主要保守位點的生物知識。盡管其它的程序，諸如JalView或Cinema也是適用的，但是，一種這樣的比對編輯程序是Align(http://www.gwdg.de/～dhepper/download/；Hepperle，D.，2001:Multicolor Sequence Alignment Editor.Institute of Freshwater Ecology andInland Fisheries，16775 Steehlm，Germany)。
蛋白之間同一性百分數的計算發生在通過Clustal產生多重比對的過程中。然而，如果所述比對是人工改良的，或者為了兩種序列的謹慎比較，這些值需要重新計算。在比對中計算關于成對蛋白序列的這一值的程序包括PHYLIP系統發展包裝中的PROTDIST(Felsenstein；http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html)，其使用“相似性表格”選項作為氨基酸取代(P)的模型。對于DNA/RNA，在PHYLIP的DNADIST程序內存在相同的選項。
在一個優選的實施方案中，所述分子是siNA分子，并且包括大約5bp-50bp，更優選地10bp-35bp，甚至更優選地，15bp-30bp，并且還更優選，18bp-25bp。優選地，所述siNA分子為20bp-23bp，并且更優選地，所述siNA分子包括21bp或22bp。最優選地，所述siNA分子包括少于22bp。
適宜的siNA分子的設計是一種復雜的過程，并且包括非常認真地分析靶點mRNA分子的序列。然后，使用相當多的創造性努力，本發明人必須選擇具有確定的核苷酸堿基組成的確定的siNA序列，其將具有引起RNA干擾所需要的親和性以及穩定性。
因此，為了可以確定適宜的siNA序列，靶點基因的編碼序列首先由本發明人仔細審閱，以定位其靶點區域，所述靶點區域編碼靶點mRNA。優選地，所述靶點序列的靶點區域包括二腺嘌呤起始序列，和最大60％的GC含量。優選地，所述分子包括低于50％的GC含量。使用在5’末端選擇的靶點基因的mRNA序列的DNA副本，設計siNA分子的反義鏈。
siNA分子可以從頭合成，或者通過微生物產生。例如，siNA分子可以由細菌如大腸桿菌(E.coli)產生，在這種情形中，優選所述siNA分子的有義和反義鏈的3’末端可以包括一種8核苷酸序列5’-CCTGTCTC-3’。這與siNA分子有效轉錄所需要的T7啟動子引物的互補序列相對應。優選地，這一8核苷酸序列在使用siNA分子之前被去除，以下調靶點基因。
適于下調編碼p75NTR受體的基因表達的特別優選的siNA分子序列包括下列序列p75NTR序列序列1，5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’(SEQ ID No.1)；序列2，5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’(SEQ ID No.2)；序列3，5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’(SEQ ID No.3)；序列4，5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’(SEQ ID No.4)；和序列5，5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3’(SEQ ID No.5)。
應該理解，這樣的siNAs可以包括尿嘧啶(siRNA)或胸腺嘧啶(siDNA)。
本發明人通過在實施例1和實施例2中所述的方法檢測這5種siNA分子的每一種。
本發明的一個重要特征是按照本發明的基因沉默分子可以與刺激神經突生長的分子組合應用，以對軸突生長和神經元存活具有令人驚訝的協同作用。單獨使用，這些試劑具有中等或最小的作用，而組合應用，這些試劑可以顯著地提高神經再生。適當的生長刺激劑的實例可以包括任何NTF(TRK依賴型或TRK不依賴型)，例如，睫狀神經營養因子(CNTF)或成纖維生長因子2(FGF2)。應該理解，CNTF是視網膜神經節細胞(RGC)中神經突的有效生長刺激劑，和FGF2是背根神經節神經突(DRGN)中神經突的有效生長刺激劑。可以與所述分子組合應用的其它NTFs包括NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，FGF-1，FGF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，和VIP(Oppenheim.1996，Neuron 17195-197)。
實施例1描述將針對p75NTRmRNA的siNA分子遞送到在抑制性CNS髓磷脂的存在下用CNTF處理的培養的視網膜神經節細胞(RGC)中的檢測范例。如在
圖1中所示，本發明人驚訝地發現，在抑制性CNS髓磷脂的存在下，SEQ ID No.1-5確定的上述siNA分子中的每一種與CNTF組合，在RGCs中誘導神經元存活和神經突發生。由5種siNA分子中的4種(除SEQ ID No.2外的全部)引起的神經突發生程度與在不存在髓磷脂和存在CNTF時誘導的程度相當。每種序列表現出神經長出途徑的抑制解除作用(即，抵消抑制性髓磷脂的作用)，通過下調編碼p75NTR的基因的表達并且因而下調其下游信號成分而進行。
甚至更令人驚訝的是下調p75NTR的具有SEQ ID No.2的siNA分子在下列各項中引起顯著的增加(a)具有神經突的RGCs的數目，和(b)平均神經突長度，并且顯著地促進(c)RGC存活。因此，不但SEQ ID No.2如同其它4種siNA’s一樣引起該途徑的抑制解除作用，它還能夠誘導比不存在髓磷脂時刺激的更多的神經生長。這是特別令人驚訝地，由于某種未知的機制，SEQ ID No.2能夠刺激超過在不存在髓磷脂時觀察到的生長的生長。這可能是由于所述分子是不同于髓磷脂的解除抑制的抑制劑。
因此，特別優選siNA分子包括SEQ ID No.2，并且特別優選這一分子與NTF組合用于臨床應用。
應該理解，SEQ ID No.2包括4個連續的胸腺嘧啶堿基。本發明人最初認為這在RNAi方案中可能是有問題的。這是由于他們認為siNA分子中4個連續的胸腺嘧啶堿基可能模擬轉錄終止序列，因而引起RNA聚合酶從所述siNA模板上解離，而終止siNA的轉錄。幸運地，這不是這種情形，并且優選的siNA不但可以有效地在細菌中合成，而且十分有效地下調p75NTR。
因此，本發明人表明，siRNA-介導的p75NTR的擊倒在RGCs中導致CNTF-刺激的神經突長出的抑制解除作用。
本發明人對同樣的5種siNA分子進行進一步的檢測。實施例2描述將同樣的5種針對p75NTRmRNA的siNA分子遞送到在抑制性CNS髓磷脂的存在下用FGF2處理的培養的背根神經節神經元(DRGN)中。應該理解，FGF2促進DRGNs中的神經突發生，并且因此在DRGNs中作用為神經突的陽性生長刺激劑。如上所述，CNS髓磷脂作用抑制神經突發生。本發明人吃驚地發現，每種siNA分子還在DRGNs中增加細胞的存活和促進軸突生長，最有效的是具有SEQ ID No.2的siNA分子。然而，SEQ ID No.2不但如其它4種siNAs一樣引起所述途徑的抑制解除作用，它還能夠誘導比在不存在髓磷脂時刺激的更多的神經生長。這是特別令人驚訝的，由于某種未知的機制，SEQ ID No.2能夠刺激超過在不存在髓磷脂時觀察到的生長的生長。這可能是由于所述分子是不同于髓磷脂-相關分子的解除抑制的抑制劑。
因此，本發明人還證明siRNA-介導的p75NTR的擊倒在DRGN中導致FGF2-刺激的神經突長出的解除抑制作用。
適于下調編碼NgR的基因的表達的特別優選的siNA分子序列包括下列序列-NgR序列-序列1，5’-AATCTCACCATCCTGTGGCTG-3’(SEQ ID No.6)；序列2，5’-AACCTCACGCATCTCTTTCTG-3’(SEQ ID No.7)；序列3，5’-AATCAGCTCACTGATGAGGAG-3’(SEQ ID No.8)；序列4，5’-AAATGCACTCAAGGGACGTGT-3’(SEQ ID No.9)；和序列5，5’-AATGACTCTCCATTTGGGACT-3’(SEQ ID No.10)。
本發明人通過實施例2中所述的方法檢測了上述siNA分子的每一種。實施例2描述將上述5種針對NgR mRNA的siNA分子遞送到在抑制性CNS髓磷脂(生長抑制劑)的存在下用叫作成纖維生長因子2(FGF2)的NGF處理的培養的DRGNs中。本發明人發現，每種siNA分子在DRGNs中增加神經突發生，最有效的是具有SEQ ID No.6的siNA分子。令人驚訝地，SEQID No.6在存在抑制性髓磷脂時比在不存在髓磷脂刺激更多的軸突生長。
因此，特別優選siNA分子包括SEQ ID No.6。
因此，本發明人還證明siRNA-介導的NgR擊倒在DRGN中導致FGF2-刺激的神經突長出的抑制解除作用。
適于下調編碼Rho-A分子的基因的表達的特別優選的siNA分子序列包括下列序列-Rho-A序列-序列1，5’-AAGATTATGACCGTCTGAGGC-3’(SEQ ID No.11)；序列2，5’～AAGGATCTTCGGAATGATGAG-3’(SEQ ID No.12)；序列3，5’-AAGGCGGGAGTTAGCCAAAAT-3’(SEQ ID No.13)；序列4，5’-AATGAAGCAGGAGCCGGTAAA-3’(SEQ ID No.14)；和序列5，5’-AAAGACCAAAGACGGAGTGAG-S’(SEQ ID No.15)。
本發明人通過實施例2所述的方法檢測了上述siNA分子的每一種。如上文，本發明人發現，每種siNA分子在DRGNs增加神經突發生，最有效的是具有SEQ ID No.12的siNA分子。本發明人吃驚地發現，每種siNA分子在DRGNs中增加細胞的存活和促進軸突生長，最有效的是具有SEQ IDNo.2的siNA分子。然而，SEQ ID No.12不但引起所述途徑的抑制解除作用(如其它siNAs一樣)，它還能夠誘導比在不存在髓磷脂時刺激的更多的神經生長。這是特別令人驚訝的，由于某種未知的機制，SEQ ID No.12還似乎能夠刺激超過在不存在髓磷脂時觀察到的生長的生長。這可能是由于所述分子是不同于髓磷脂-相關分子的解除抑制的抑制劑。
因此，特別優選所述siNA分子包括SEQ ID No.12。
因此，本發明人表明，使用按照本發明的分子的基因沉默可以用來提高神經元存活和軸突生長。優選地，所述分子是調控NgR、p75NTR和/或Rho-A的擊倒的siRNA分子。最優選地，按照本發明的分子與NTF(例如，FGF2)聯合應用。當是這種情形時，按照本發明的分子對于解除抑制NTF刺激的軸突生長，以及令人驚訝的神經元存活非常有效。本發明人發現，在CNS髓磷脂的存在下，FGF2-刺激的DRGN中p75NTR、NgR和Rho-A的擊倒分別促進5倍、3.5倍和6.5倍增加的神經突長出。在siNA-介導的Rho-A擊倒后，神經突比p75NTR和NgR擊倒后長得更長。這表明Rho-A沉默可能是在體內促進CNS軸突再生的特別有效的解除抑制的策略。因此，特別優選按照本發明的siNA分子是SEQ ID No.12。不被任何假說束縛，本發明人相信RhoA沉默導致信號傳導途徑上游成分的令人吃驚的沉默--可能通過目前定義為反饋環的作用。
按照本發明的第五方面，提供適于下調編碼參與RhoA抑制途徑的肽的基因表達的基因沉默分子，其特征在于所述分子在存在神經突生長抑制劑分子時比在不存在所述抑制劑分子時適于誘導更多的神經元存活和軸突生長。
表達“更多的神經元存活和軸突生長”，我們意指，與不存在相同的神經突抑制劑分子相比，當存在神經突生長抑制劑分子時，獲得更高的誘導水平。
優選地，按照本發明第五方面的分子可以與NTF(例如FGF2或CNTF)組合應用，在神經突生長抑制劑分子諸如先前命名為髓磷脂-相關的分子的存在下，所述NTF的活性受到抑制。按照本發明第五方面的分子，不但顛倒由神經突生長抑制劑分子諸如指出的髓磷脂-相關分子所引起的NTF-刺激的軸突生長的抑制，而且還令人吃驚地，刺激比在不存在抑制劑分子時觀察到的更大程度的神經元存活和軸突生長。例如，所述作用大于在對照實驗中發現的作用，在對照實驗中，在不存在神經突生長抑制劑分子(例如，除去髓磷脂的CNS神經元)時用NTF刺激神經突。
優選地，按照第五方面的分子包括siNA分子，并且可以選自具有SEQID No.2，SEQ ID No.6或SEQ ID No.12確定的序列的siRNA分子的組。
按照本發明任一方面應用的基因沉默分子優選為核酸(例如，siRNA或反義或核酶)。這樣的分子可以(但不必要)是這樣的，即，其結合在要治療的受試者的細胞的DNA中。未分化的細胞可以穩定轉化所述基因沉默分子，導致產生遺傳修飾的子細胞(在這種情形中，在受試者中可能需要表達調控，例如，使用特異的轉錄因子或基因活化劑)。
基因沉默分子可以是從頭合成的，并且以足夠的量引入以在靶點細胞中誘導基因沉默(例如，通過RNA干擾)。備選地，所述分子可以通過微生物如大腸桿菌產生，然后以足夠的量引入以在靶點細胞中誘導基因沉默。
所述分子可以通過攜帶編碼基因沉默序列的核酸的載體而產生。所述載體可以包括能夠控制和/或增強核酸表達的元件。載體可以是重組載體。例如，所述載體可以包括質粒、黏端質粒、噬菌體或病毒DNA。除了使用或代替使用所述載體合成所述基因沉默分子，所述載體可以用作用所述基因沉默序列轉化靶點細胞的遞送系統。
重組載體還可以包括其它功能元件。例如，重組載體可以設計成所述載體在靶點細胞中自動復制。在這一情形中，在重組載體中可能需要誘導核酸復制的元件。備選地，所述重組載體可以設計成所述載體和重組核酸分子整合到靶點細胞的基因組中。在這一情形中，有利于靶點結合(例如，通過同源重組)的核酸序列是理想的。重組載體還可以具有編碼可以在克隆過程中用作選擇標記的基因的DNA。
當需要時，所述重組載體還可以包括控制核酸表達的啟動子或調控子或增強子。組織特異性啟動子/增強子元件可以用來調控核酸在特異的細胞類型如CNS神經元中的表達。啟動子可以是組成型的或誘導型的。
備選地，所述基因沉默分子可以以結合在載體中或者不結合在載體中而施用給靶點細胞或受試者。例如，所述分子可以結合在脂質體或病毒顆粒(例如，反轉錄病毒、皰疹病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、慢病毒(lentovirus)等)內。備選地，可以通過適當的方法例如直接的胞吞吸收而將“裸”siNA或反義分子插入到受試者細胞中。
可以通過轉染、感染、顯微注射、細胞融合、原生質體融合或彈果轟擊(ballistic bombardment)而將所述基因沉默分子轉移到要治療的受試者的細胞中。例如，轉移可以通過使用包被的金顆粒的彈果轉染；含有siNA分子的脂質體；包括基因沉默序列的病毒載體(例如，包括SEQ ID No.2，6或12的腺病毒)；或者通過直接應用所述基因沉默分子而提供直接的核酸吸收(例如，內吞)的方式進行。
在本發明的一個優選實施方案中，siNA分子可以遞送到靶點細胞(不管是在載體中還是“裸露的”)，并且然后可以依賴于宿主細胞進行復制，并且因此達到治療有效的水平。當是這種情形時，所述siNA優選地結合在能夠使得siNA(例如，SEQ ID No.2，6或12)在細胞中轉錄的表達盒中，然后干擾編碼參與Rho-A途徑的蛋白的內源mRNA的翻譯。
應該理解，按照本發明的基因沉默分子可以用于單一治療(例如，使用按照本發明的siNA’s刺激神經元存活和軸突生長)。然而，優選地，按照本發明的分子可以用作添加劑，或者與用于刺激軸突生長的已知治療組合應用。特別優選地，所述組合治療包括基因沉默分子和NTF(例如，FGF2或CNGF)。
按照本發明的基因沉默分子可以與具有許多不同形式的組合物組合，特別取決于所述組合物使用的方式。因此，例如，所述組合物可以以膠囊、液體、軟膏劑、膏劑、凝膠、水凝膠、氣霧劑、噴霧劑、微膠粒、透皮貼片、脂質體的形式，或可以施用給患有以消弱的軸突生長為特征的疾病狀態的人或動物的任何其它適當形式。應該理解，本發明的組合物的賦形劑應該是對于它所給予的受試者良好耐受的賦形劑，并且優選地能夠使得所述分子遞送到需要軸突生長和/或提高神經元存活的靶點位點。
包括按照本發明的siNA’s的組合物可以以許多方法應用。例如，可以需要全身使用，在這種情形中，化合物可以包含在例如可以通過注射到血流而施用的組合物中。注射可以是靜脈內(大丸劑或灌注)、皮下(大丸劑或灌注)、心室內或蛛網膜下的。
所述化合物可以通過吸入(例如，鼻內地)而施用。
基因沉默分子還可以結合在緩慢的或延緩釋放的裝置中。例如，這樣的裝置可以插入到CNS損傷的位點，并且所述分子可以幾周或幾個月的釋放。當需要使用按照本發明的基因沉默分子進行長期治療時，以及通常需要頻繁的施用(例如，至少每日注射)的治療中，這樣的裝置可能是特別有利的。
應該理解，需要的基因沉默分子的量由它的生物活性和生物利用度決定，并且其又依賴于施用的模式、應用的分子的物理化學特性、以及它是用作單一治療還是與NTF組合治療。施用的頻率還將受到上文提及的因素以及特別是在治療的受試者內分子半衰期的影響。
施用的最佳劑量可以由本領域的技術人員確定，并且將隨著下列各項而不同使用的具體的基因沉默分子、制劑的強度、施用的模式、以及疾病病癥的晚期或嚴重性、和軸突生長需要的緊急性。取決于要治療的具體受試者的其它因素將導致需要調整的劑量，所述因素包括受試者年齡、體重、性別、日常飲食和施用時間。
已知的方法，諸如藥物工業常規所用的那些方法(例如，體內實驗、臨床試驗等)，可以用于建立按照本發明應用的具體的制劑和精確的治療方案(諸如基因沉默分子的日常劑量和施用頻率)。
一般地，取決于所用的具體基因沉默分子，0.01μg/kg體重和0.5g/kg體重之間的按照本發明的基因沉默分子的日常劑量可以用于刺激軸突生長(并且促進神經元存活)。更優選地，日常劑量在0.01mg/kg體重和200mg/kg體重之間，并且更優選地，在大約0.1mg/kg和100mg/kg之間，并且甚至更優選地在大約1mg/kg和10mg/kg之間。
當將所述分子(例如，siNA或反義的)遞送到細胞(并且在靶點細胞中不需要從頭合成)時，日常劑量可以作為單一施用(例如，單一的每日注射)而給出。典型地，治療有效劑量應該每單一劑量提供約1ng-100μg/kg的基因沉默分子，并且優選地每劑量2ng-50ng。
備選地，所述分子可以需要一天內施用兩次或更多次。作為實例，按照本發明的siNA’s可以作為兩劑(或多劑，取決于病癥的嚴重性)0.1mg/kg和10mg/kg之間(即，假定體重70kg)的每日劑量進行施用。接受治療的患者可以在醒來時服用第一劑，然后在傍晚服用第二劑(如果是兩劑方案)，或者在其后以3或4小時的時間間隔服用。備選地，可以應用緩慢釋放的裝置為患者提供最佳劑量，而無需施用重復的劑量。
按照第六方面，提供包括治療有效量的按照本發明第一方面的基因沉默分子和藥用賦形劑的組合物。
在一個實施方案中，按照本發明第六方面的組合物可以包括大約0.01μg和0.5g的基因沉默分子。更優選地，組合物的量是在0.01mg和200mg之間，并且更優選地，在大約0.1mg和100mg之間，并且甚至更優選地在大約1mg和10mg之間的基因沉默分子。最優選地，所述組合物包括大約2mg和5mg之間的基因沉默分子。
優選地，所述組合物包括大約0.1％(w/w)-90％(w/w)的基因沉默分子，并且更優選地，1％(w/w)-10％(w/w)的基因沉默分子。其余的組合物可以包括賦形劑。
本發明提供制備藥物組合物的方法，所述方法包括將治療有效量按照本發明的基因沉默分子與藥用賦形劑組合在一起。
“治療有效量”是當施用給受試者時，促進軸突生長和神經元存活的按照本發明第一或第四方面的分子的任何量。
“受試者”可以是脊椎動物、哺乳動物、家畜或人。
當用于本文時，“藥用賦形劑”是本領域普通技術人員已知的用于配制藥物組合物的任何生理學賦形劑。
在一個優選的實施方案中，所述藥物賦形劑是液體，并且所述藥物組合物是溶液的形式。在另一個實施方案中，所述藥物賦形劑是凝膠，并且所述組合物是膏劑等的形式。
是無菌溶液或混懸液的液體藥物組合物可以通過，例如，肌內、鞘內、硬膜外、腹膜內、靜脈內以及特別是皮下、大腦內或大腦室內的注射。SiNA分子可以制備成無菌固體組合物，其可以在施用時使用無菌水、鹽水或其它適當的無菌注射介質而溶解或混懸。賦形劑意欲包括必要的和惰性的粘合劑、混懸劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、防腐劑、染料以及包衣材料。
基因沉默分子和NTF的組合代表了本發明的重要特征。因此，本發明人發現，這兩種活性成分的組合對于在受傷組織中誘導神經元生長和促進細胞存活特別有利。
因此，按照本發明的第七方面，提供用于促進神經元存活和軸突生長的組合物，所述組合物包括適于下調基因的表達的基因沉默分子，以及神經營養生長因子，所述基因編碼參與Rho-A抑制途徑的肽。
按照第七方面的組合物可以用來治療患有CNS損傷的個體。
按照第八方面，提供在受試者中促進神經元存活和軸突生長的方法，所述方法包括給需要這樣的治療的受試者施用一種組合物，所述組合物包括適于下調基因的表達的基因沉默分子，以及NTF，所述基因編碼參與Rho-A抑制途徑的肽。
適當的神經營養生長因子的實例可以包括CNTF，FGF2，NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，FGF-1，FGF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，以及VIP等(Oppenheim，1996，Neuron 17195-197)。
NTF的量可以在大約0.01μg/kg體重和0.5g/kg體重之間，更優選地，大約0.1mg/kg和10mg/kg之間。
所述基因沉默分子可以包括反義分子或短干擾核酸(siNA)。
本文所述的所有特征(包括任何附屬的權利要求、摘要和附圖)，和/或所公開的任何方法或過程的所有步驟可以以除其中至少某些這樣的特征和/或步驟是互斥的組合外的任何組合與上述方面組合。
為了更好地理解本發明，并且表現其實施方案可以怎樣實施，現在通過實例的方式參考附屬的簡圖，其中圖1顯示siRNA處理后，在解離的視網膜培養物中p75NTR和Rho-A的擊倒；圖2顯示FGF2在DRGN培養物中促進神經突長出；圖3顯示CNS髓磷脂阻滯FGF2-促進的DRGN神經突長出；圖4顯示在CNS髓磷脂的存在下，FGF2-刺激的DRGN的siRNA-介導的p75NTR的擊倒；圖5顯示在髓磷脂的存在下，在FGF2-刺激的DRGN中siRNA-介導的NgR的擊倒；圖6顯示在髓磷脂的存在下，在FGF2-刺激的DRGN中siRNA-介導的Rho-A的擊倒；圖7顯示在siRNA-介導的p75NTR、NgR和Rho-A擊倒后，在CNS髓磷脂的存在下，在DRG培養物中作為與FGF2-刺激的DRGN神經突生長相關的βIII-微管蛋白的蛋白質印跡和密度定量。
實施例1材料和方法成年視網膜培養物將成年大鼠(6-8周齡)通過斷頸法處死，并且通過解剖移出視網膜，并且按照制造者的流程(Worthington Biochem，New Jersey，USA)使用目木瓜蛋白酶系統解離。在37℃在5％濕潤的CO2氛圍下，在補充了Neurobasal-A(Invitrogen)的培養基中，將含有RGC的2×106個解離的視網膜細胞在4孔培養板(Nunc，UK)中用100μg/ml聚-D-賴氨酸(Sigma，Dorset，UK)和20μg/ml分區蛋白(Chemicon.Harrow.UK)預先包被的玻璃蓋玻片上培養4d。
siRNA制備和轉染為了設計靶點-特異的siRNA雙聯體，我們應用Elbashir和合作者提出的標準(Nature 411494-498)從大鼠p75NTRmRNA的開放閱讀框(NCBI登記號NM012610)中選擇針對p75NTR的5種siRNA序列。化學合成寡核苷酸模板和控制-合成(control-scrambled)的序列(Alta Biosciences，Universityof Birmingham，UK)，并且使用Silencer siRNA構建試劑盒(Ambion.Texas，USA)構建siRNA序列。
所用的siRNA序列為-p75NTR序列-序列1.5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’；序列2，5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’；序列 3，5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’；序列4，5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’；和序列5，5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3’。
合成的序列為-反義5’-AATCGCATGCGTTCCATTTCGCCTGTCTC-3’；有義5’-AACGAAATGGAACGCATGCGACCTGTCTC-3’。
按照制造者的指導(Invitrogen)，使用Oligofectamine試劑(Invitrogen)，在4孔培養板(Nunc)中，用siRNA轉染RGC。轉染5 h后，加入補充的Neurobasal-A，并且在細胞裂解和免疫組化之前，在存在/不存在CNS髓磷脂(來自N.Gregson的饋贈，Kings College London，UK)下再培養72 h。
抗體單克隆β-III微管蛋白(1∶100)和多克隆抗-p75NTR(1∶500)都來自Sigma，Poole，UK。單克隆192-Ig(1∶100用于免疫組化，和1∶500用于蛋白質印跡)購自Oncogene Research Products，San Diego，USA。山羊抗人NgR(1∶100用于蛋白質印跡)和單克隆抗人Rho-A(26C4)用于通過免疫組化(1∶200)和蛋白質印跡(1∶200)(Santa Cruz，C.A.，USA)而定位Rho-A。
組織制備和免疫組化將至少3只大鼠的組通過麻醉過量而處死，并且切離它們的視網膜和視神經(ON)，包埋在OCT(Miles mc，CA，USA)中，并且在液氮中冷凍。在-20℃從ON和視網膜(Bright Instrument Co.Ltd.，Cambridgeshire，UK)上切下10μm厚的縱向低溫切片，收集到Vectabond包被的載玻片(VectorLaboratories，Cambridgeshire，UK)上，空氣干燥，并且按先前所述(Mol CellNeurosci 21301-311)處理進行免疫組化。將培養的視網膜細胞固定在4％低聚甲醛中，并且也按先前所述(Lorber等.，2002，Mol Cell Neurosci21301-311)進行處理。
神經突長出檢測通過使用Axiovision軟件(Zeiss，Hertifordshire，UK)追蹤每一神經突，從捕獲的βIII-微管蛋白免疫染色的RGC圖片檢測神經突長出，并且在每一蓋玻片上檢測50RGC的最長的神經突(n＝3，3次獨立實驗)。然后計算平均神經突長度。
蛋白提取和蛋白質印跡在ON粉碎后第0，6，8和20d，將在每一處理組中的大鼠殺死，并且提取來自6個匯集的ON的蛋白，按先前所述(J Biol Chem 27732820-32829)進行處理用于蛋白質印跡分析。為了通過蛋白質印跡確定siRNA處理的RGC培養物中p75NTR的水平，按先前所述(Winton等，2002，J Biol Chem.157565-570)，將6×106個細胞/siRNA裂解并點樣。
統計學分析計算樣品平均數，并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，Version 4.0，San Diego，USA)，通過單向變量分析(ANOVA)，然后用Dunnett’s方法進行post-hoc檢測，而分析顯著性。
結果在抑制性CNS髓磷脂的存在下，siRNA-介導的p75NTR擊倒下調Rho-A，并且增強CNTF-刺激的神經突長出本發明人使用解離的RGC的原代培養物建立CNS損傷的體外模型，并且發現100ng/ml的非Trk-依賴型神經營養蛋白CNTF促進最理想的RGC神經突長出，并且這種CNTF-介導的長出受到10μg/ml大鼠CNS髓磷脂的抑制(未顯示)。在存在髓磷脂而生長的CNTF-刺激的RGC中，使用siRNAp75NTR而獲得p75NTR擊倒，并且結果在圖1中顯示，其中-(a)顯示使用SEQ ID No.2確定的p75NTRsiRNA的完全擊倒，和使用p75NTR的其它siRNA序列的‘部分’擊倒，以及當在存在髓磷脂用CNTF刺激RGC時對Rho-A活化的同時抑制。因此，所有的siRNA序列都表現出功效。(b)來自視網膜細胞培養物的第二蛋白質印跡表明合成的序列對p75NTR和Rho-A沒有作用，這證明SEQ ID No.2作用的特異性。(c)體外擊倒，特別是用SEQ ID No.2，將神經突長出水平恢復到在不存在髓磷脂時觀察到的水平，并且SEQ ID No.2顯著地刺激神經突長出，高于在不存在髓磷脂時觀察到的水平。SEQ ID No.2還顯著地促進RGC存活(***P＜0.0001，在存在髓磷脂時，序列2相對于CNTF，ANOVA)。注意SEQ ID No.1-5都阻滯髓磷脂的抑制作用。(d)使用雙免疫組化，在存在CNTF下生長的βIII-微管蛋白+RGC表現在somata和神經突中的p75NTR免疫染色。然而，在SEQ ID No.2.-介導的p75NTRsiRNA實驗中，βIII微管蛋白+RGC表現出完全的(somata和神經突)或部分的(只有神經突)p75NTR擊倒。刻度條，50μm。
在所有的對照培養物(未處理的RGC，用CNTF處理的RGC，以及用CNTF和CNS髓磷脂處理的RGC)中，檢測到p75NTR和Rho-A的顯著水平(圖1a)。在遞送5種p75NTRsiRNA(SEQ ID Nos 1-5)后，SEQ ID Nos 1和3誘導顯著的p75NTR擊倒(70-80％，通過蛋白質印跡密度計量學而定量(未顯示))，而SEQ ID No.2引起100％的p75NTR擊倒和其處理形式(胞外結構域(ECD)p55和胞內結構域(ICD)p25片段) (圖1a)。所有5種檢測的p75NTRsiRNA序列還顯著地抑制Rho-A-GTP的水平，并且使用序列1-3完全阻滯了活化(圖1a)。SEQ ID No.2的對照合成序列沒有在p75NTR水平或在Rho-A活化中引起變化，如在單獨的蛋白質印跡中所示(圖1b)。
與存在髓磷脂時只用CNTF觀察到的數目相比，在用SEQ ID No.2在培養的RGC中擊倒p75NTR/p55/p25以及因而抑制Rho-A活化后，在存在髓磷脂時用CNTF刺激生長神經突的RGC的數目發生5倍的增加(圖1c)，伴隨RGC神經突長度的5倍的延長(圖1c)。此外，在培養4天后，下調p75NTR/p55/p25和抑制Rho-A活化與顯著增加的RGC存活相關(圖1c)。有趣地，在抑制性CNS髓磷脂的存在下，所有5種siRNA序列將CNTF-刺激的RGC神經突長出恢復到在不存在髓磷脂時用CNTF觀察到的水平(圖1c)。然而，SEQ ID No.2令人驚訝地增強RGC神經突的長出，高出當沒有CNS髓磷脂用CNTF刺激時觀察到的水平。與單獨的CNTF對照相比，存在CNTF和合成序列2而生長的RGC在神經突長出中沒有表現出差異(圖1d)。
盡管本發明人不希望受到任何假說的束縛，但是他們相信這些結果表明，通過siRNA-介導的p75NTRmRNA翻譯沉默而擊倒p75NTR阻滯Rho-AGDP向Rho-A GTP轉化，因而通過保持生長錐完整性在抑制性環境中增強CNTF-誘導的RGC神經突長出，并且可能通過增強的肌動蛋白多聚化作用而提高。
討論檢測的5種siRNA分子的每一種表現出對RhoA抑制途徑的抑制解除作用。特別地，在存在抑制性髓磷脂時，比不存在所述抑制劑時，SEQ IDNo.2.令人驚訝地有效地刺激更多的生長。在體外，siRNA-介導的p75NTR的擊倒導致完全阻滯下游抑制性信號傳導分子Rho-A的活化，并且在CNS髓磷脂存在下，CNTF-刺激RGC存活和神經突長出顯著地增強。同時，部分消除p75NTR，除了SEQ ID No.2.之外的p75NTRsiRNA序列還導致對Rho-A活化的顯著抑制，并且在存在CNS髓磷脂時，通過CNTF恢復RGC神經突長出。在存在CNS髓磷脂時，SEQ ID No.2.引起所有p75NTR形式和Rho-A的完全擊倒，同時增強比在不存在髓磷脂時觀察到的生長高2倍的神經突長出。這表明，即使不存在髓磷脂，CNTF的神經營養功效受到抑制性分子的控制。盡管我們不希望受到任何假說的束縛，本發明人相信這些可能包括CSPG、肝配蛋白、腦信號蛋白等。
總之，本發明人結果表明，在NTF-刺激的再生RGC中，存在一種下調p75NTR介導的生長錐(cone)衰弱(collapse)的內源機制，包括對下游Rho-A-介導的抑制信號傳導的抑制。這種p75NTR的內源下調作用可以通過應用p75NTR-靶向的siRNA而有效地增加。因此，siRNA技術提供一種其它的治療策略，以幫助再生的軸突克服CNS的抑制環境。對于成功的CNS修復，神經元死亡可能是比最初的想法更大的障礙，并且使用適當的NTFs和按照本發明的分子增強神經元存活以及軸突再生的組合治療策略，是在損傷后促進CNS軸突再生、細胞存活和恢復功能的優選的方法。
實施例2材料和方法成年DRGN培養物將L4-L7 DRG對從成年大鼠(6-8周齡)解剖下來，并且在37℃含有5％CO2的濕潤氛圍中，使用含有0.1％膠原酶(Sigma，Poole，England)和200U/ml DnaseI(Worthington Biochem，New Jersey，USA)的Neurobasal-A(Invitrogen，Paisley，UK)溶液處理2hr，將其解離成單細胞，搗幾次，并且通過15％牛血清白蛋白梯度離心以去除碎片。將解離的細胞沉淀下來，然后重懸在含有B27補充物、L-谷氨酰胺和Gentimicin的Neurobasal-A(補充的Neurobasal-A，所有的都來自Invitrogen)中。在37℃含有5％CO2的濕潤氛圍中，在存在和不存在大鼠CNS髓磷脂(來自Dr.Norman Gregson，King’sCollege London，UK)下，將1,500DRGN/孔在4孔組織培養板(Nunc.UK)中用100μg/ml聚-D-賴氨酸然后用20μg/ml層粘連蛋白-I(Sigma，Dorset，UK)預先包被的無菌玻璃蓋玻片上培養72hr。
siRNA制備和轉染同實施例1，使用Elbashir和合作者提出的標準(Elbashir等.，2001，同前所述)，設計針對p75NTR、NgR和Rho-A的siRNA。仔細審看大鼠p75NTR、NgR和Rho-A的編碼序列，以確定具有二腺嘌呤起始序列并且包括低于50％GC含量的可能的區域。所用的siRNA序列為-
p75NTR序列-SEQ ID No.1，5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’；SEQ ID No.2，5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’；SEQ ID No.3，5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’；SEQ ID No.4，5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’；和SEQ ID No.5，5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3’。
NgR序列-SEQ ID No.6，5’-AATCTCACCATCCTGTGGCTG-3’；SEQ ID No.7，5’-AACCTCACGCATCTCTTTCTG-3’；SEQ ID No.8，5’-AATCAGCTCACTGATGAGGAG-3’；SEQ ID No.9，5’-AAATGCACTCAAGGGACGTGT-3’；和SEQ ID No.10，5’-AATGACTCTCCATTTGGGACT-3’。
Rho-A序列-SEQ ID No.11，5’-AAGATTATGACCGTCTGAGGC-3’；SEQ ID No.12，5’-AAGGATCTTCGGAATGATGAG3’；SEQ ID No.13，5’-AAGGCGGGAGTTAGCCAAAAT-3’；SEQ ID No.14，5’-AATGAAGCAGGAGCCGGTAAA-3’；和SEQ ID No.15，5’-AAAGACCAAAGACGGAGTGAG-3’。
將所選的序列進行BLAST搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)，以確保與其它基因沒有顯著的同源性。有義siRNA模板在5’端以AA二聚體起始，然后接著19個與靶點序列互補的核苷酸。有義和反義模板的3’端都包括8個核苷酸的序列5’-CCTGTCTC-3’，其與所述siRNA有效轉錄所需要的T7啟動子引物的互補序列相對應。去保護的和脫鹽的寡核苷酸模板和對照-合成的序列是化學合成的(Alta Biosciences，University of Birmingham，UK)。
SEQ ID No.16合成的p75NTR Seq 25’-AATCGCATGCGTTCCATTTCG-3’；SEQ ID No.17合成的NgR15’-AACTTCCACCATTTGGCGGTC-3’；SEQ ID No.18合成的Rho-A Seq 25’-AAGAGTTCATCTGAGTAGGAG-3’。
將Oligofectamine試劑(Invitrogen)用于4孔組織培養板(Nunc)進行siRNA轉染。在一個管中，將0.84μg siRNA/孔混合在50μl Opti-MEM(Invitrogen)中，同時第二個管含有3μl Oligofectamine(Invitrogen)和12μlOpti-MEM(Invitrogen)。將這些管在室溫下溫育5min，然后將這兩種溶液合并，并且允許在室溫下再溫育25min，以便形成復合物。然后，將整個混合物補充Opti-MEM(Invitrogen)達到需要的用量，以允許每孔DRGN加入150μl轉染培養基。在轉染5hr后，向轉染培養基中加入補充的Neurobasal-A，使得終濃度為500μl/孔，并且在進行細胞裂解(用于蛋白質印跡分析)或免疫組化之前，將DRGN再培養48 hr。
抗體單克隆β-III微管蛋白抗體(Sigma)以1∶100應用以通過免疫細胞化學(ICC)標記DRGN神經突，并且在蛋白質印跡中以1∶500應用。多克隆抗-p75NTRAb用于鑒定和定位p75NTR(Sigma，1∶500稀釋用于蛋白質印跡和ICC)。單克隆192-Ig用于鑒定和定位25kDa加工的p75NTR細胞質片段(Oncogene Research Products.San Diego，CA，USA，1∶200稀釋用于蛋白質印跡)。Rho-A(單克隆和多克隆Abs，都以1∶200稀釋用于蛋白質印跡和ICC)和多克隆抗-NgR Ab(1∶100稀釋用于蛋白質印跡和ICC)購自Santa CruzBiotechnology，CA，USA。
免疫細胞化學在用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次之前，將DRG培養物在4％低聚甲醛上固定10min(TAAB Laboratories，Berkshire，UK)，在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1％Triton X-100(Sigma)的PBS中封閉，并且用1∶100稀釋在含有0.5％BSA和0.5％吐溫-20(Sigma)的PBS中的相應的一級抗體在濕潤的房間里在室溫下溫育1hr。然后將細胞在PBS中洗滌3次，并且用1∶100稀釋在PBS-T-BSA中的Alexa Fluor 488(綠色)或Texas Red(紅色)(二者都來自Molecular Probes)在室溫下溫育1hr。在PBS中進一步洗滌后，將蓋玻片包埋在FluorSave(Calbiochem，San Diego，USA)中，并且在熒光顯微鏡(Carl Zeiss，Welwyn-Garden City，UK)下觀察。
神經突長出的檢測使用Axiovision軟件(Carl Zeiss)從用Axiovision檢測工具隨機選擇的30個DRGN/蓋玻片捕獲βIII-微管蛋白+免疫染色的DRGN神經突的顯微照片。神經突長度表示為平均值±SD。由于神經突長出是廣泛的，所以所述軟件不能用于檢測siRNA擊倒實驗的神經突。在這樣的情形中，將DRGN細胞裂解物用于βIII-微管蛋白的蛋白質印跡，作為神經突長出的檢測。
蛋白提取和蛋白質印跡為了確定siRNA處理的DRG培養物中的p75NTR、NgR和Rho-A的水平，將細胞用PBS洗滌2次，并且用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)在37℃溫育15min，然后搗碎，并且在1300rpm離心5min。將DRG細胞沉淀重懸在冰冷的含有20mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，0.5mM EGTA，150mMNaCl，1％NP-40(Sigma)和蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的裂解緩沖液中，并且在冰上溫育30min。在4℃13,000rpm離心30min后，使用比色DC蛋白檢測(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，將裂解物的蛋白濃度標準化。在用于蛋白質印跡分析之前將勻漿物和細胞裂解物保存在-70℃。
將每種樣品(40μg總蛋白)在90℃用2×Laemmeli上樣緩沖液溫育4min，并且在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上分離。將蛋白轉移到PVDF膜(Millipore UK，Gloucestershire，UK)上，在室溫下在含有0.1％吐溫20和5％脫脂牛奶的Tris-緩沖鹽水中封閉1hr。將膜用相應的抗體印跡過夜。對于檢測，使用增強的化學發光(ECL)系統(Amersham，Buckinghamshire，UK)和HRP-綴合的二級抗體(1∶1,000，Amersham)。將每一印跡去除，并且然后用相關的抗體重新探測。
DRGN存活siRNA-介導的擊倒后，在熒光顯微鏡下通過仔細審查每種siRNA 9個蓋玻片的全區域而計數βIII-微管蛋白+DRGN數目。按下文所述，計算DRGN/蓋玻片的平均數，并且進行統計學分析。
密度計量在3次獨立的實驗中，對于每種siRNA的蛋白質印跡和抗體評估進行3次，并且在相關情形中，使用ScionImage軟件(Scion Corporation/NIH Image，USA)通過密度計量學而定量印跡。
統計學分析計算樣品的平均值，并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，Version 4.0，San Diego，USA)通過單向變量分析(ANOVA)，分析顯著性，然后通過Dunnett’s方法進行post-hoc檢測以確定統計學顯著的組。
結果FGF2促進DRGN神經突長出為了檢測所選的siRNA序列的功效，本發明人首先建立體外模型，其中將非Trk-依賴型神經營養因子FGF2用于刺激DRGN中神經突的長出，并且結果在圖2中顯示，其中-A，無FGF2；B，1ng/ml FGF2；C，10ng/ml FGF2；D，100ng/ml FGF2；E，200ng/ml FGF2在DRGN神經突長度中引起劑量-依賴型增加；和F，通過圖像分析而定量βIII-微管蛋白+平均值±SD神經突長度，表明用10ng/mlFGF2獲得最理想的神經突長出，此后平均神經突長出下降。(***P＜0.0001，10ng/ml FGF2相對于0ng/ml)。
所述結果表明βIII-微管蛋白陽性DRGN神經突在單獨的Neurobasal-A上生長，達到350±35μm的平均長度(如在圖2A和F中所示)。然而，增加FGF2的濃度，達到10ng/ml，增加神經突長出(圖2B，C和F)。超過這一最佳濃度，DRGN神經突長出下降(圖2D-F)。這些結果證明FGF2可以以濃度-依賴型方式有效地促進DRGN中神經突的長出。
在CNS髓磷脂中抑制FGF2-刺激的DRGN神經突長出通過在存在一定范圍的CNS髓磷脂濃度下培養DRGN，而確定CNS髓磷脂對FGF2-刺激的DRGN神經突長出的抑制作用，并且結果顯示在圖3中，其中-A，無CNS髓磷脂；B，100μg/ml CNS髓磷脂；C，10μg/ml CNS髓磷脂；D，100μg/ml CNS髓磷脂；E，200μg/ml CNS髓磷脂在DRGN神經突長度上引起劑量-依賴型減少；和F，通過圖像分析定量平均值±SD神經突長度，表明抑制DRGN神經突長出的最理想濃度是200μg/ml CNS髓磷脂，更高濃度的CNS髓磷脂(500μg/ml)對于DRGN是有毒的。***P＜0.0001，200μg/ml相對于0μg/ml髓磷脂。
通過在存在100μg/ml CNS髓磷脂下生長DRGN(圖3B)，顯著地減少了由10ng/ml FGF2刺激的DRGN神經突長出(如圖3A所示)，而200μg/ml CNS髓磷脂幾乎完全抑制了FGF2-介導的DRGN神經突長出(圖3C)。將CNS髓磷脂的濃度增加到250μg/ml(圖3D)和500μg/ml(圖3E)完全抑制了神經突長出。然而，由于所用的最高CNS髓磷脂濃度導致增加的細胞死亡和改變的DRGN形態，我們選擇200μg/ml髓磷脂為我們后續的siRNA實驗提供最佳抑制。通過檢測神經突長度量化神經突長出而證實這些觀察(圖3F)，并且證明FGF2-刺激的神經突長出被CNS髓磷脂有效地阻滯。
p75NTRsiRNA擊倒p75NTR及其片段，并且還在DRGN中下調Rho-A本發明人已經在實施例1中證明，在5種所選的針對p75NTRmRNA的siRNA序列中，SEQ ID No.2在RGC中完全擊倒p75NTR及其處理的片段，以及下游Rho-A(參見實施例1)。來自只在FGF2存在下生長的DRG培養物細胞裂解物的蛋白質印跡分析沒有表現出p75NTR和Rho-A蛋白水平的任何變化。然而，p75NTR蛋白水平在存在FGF2和CNS髓磷脂時生長的細胞裂解物中保持不受影響，而Rho-A水平增強，這表明對抑制途徑的誘導(如圖4A所示)。
圖4中A，在siRNA-介導的基因沉默作用后細胞裂解物的蛋白質印跡表現出p75NTR蛋白的70％的擊倒，下調所有p75NTR片段，并且隨后抑制Rho-A活化；B，使用βIII-微管蛋白和p75NTR抗體的雙免疫細胞化學表明在不存在CNS髓磷脂時使用FGF2的神經突長出，而p75NTR免疫染色定位在DRGN somata和它們的神經突；C，盡管CNS髓磷脂抑制神經突長出，但是它對p75NTR免疫反應性沒有影響；D，用p75NTR序列2轉染DRGN引起與顯著的(P＜0.0001，相對于p75NTR合成的序列2)神經突長出相關的對p75NTR免疫反應性的顯著減少；E，在存在針對p75NTR序列2的合成序列時，p75NTR的免疫反應性保持，而沒有任何明顯的神經突長出。
如同用于RGC那樣(參見實施例1)，當將DRGN用相同的5種針對p75NTRmRNA的siRNA序列轉染時，序列2又引起最大的p75NTR及其處理片段p55和p25的擊倒，具有70％的效率(P＜0.0001相對合成的2)(圖4A)。由于序列2的合成譯本對于p75NTR擊倒沒有作用，所以使用SEQ ID No.2觀察到的擊倒是特異的。當將印跡去除，并且用Rho-A重新探測時，使用p75NTRsiRNA SEQ ID No.2還獲得幾乎完全的Rho-A擊倒。在存在FGF2而沒有CNS髓磷脂時，在βIII-微管蛋白+DRGN中存在p75NTR免疫反應性以及中等神經突長出(圖4B)。DRGN somata和神經突的p75NTR免疫反應性不受CNS髓磷脂和FGF2組合存在的影響，但是神經突長出顯著減小(圖4C)。
然而，在存在p75NTRsiRNA SEQ ID No.2與CNS髓磷脂和FGF2時生長的DRGN中，存在p75NTR免疫反應性的顯著減少，并且神經突長出增強(圖4D)。在存在FGF2和CN髓磷脂時，合成的對照序列2在p75NTR免疫反應性中沒有表現出變化，并且沒有神經突長出(圖4E)，這證實p75NTRsiRNASEQ ID No.2-介導的擊倒生物反應是特異的siRNA反應，其還引起下游抑制信號傳導分子Rho-A的有效擊倒。
NgR siRNA顯著擊倒DRGN中的NgR本發明人檢測了5種針對NgR mRNA的siRNA序列(SEQ ID No.6-10)用于擊倒DRGN中的NgR，并且結果顯示在圖5中，其中-A，使用siRNASEQ ID No.6，7和10，在siRNA-介導的基因沉默作用后細胞裂解物的蛋白質印跡分別表現出100％，55％和18％的NgR蛋白擊倒；B，用NgR siRNA SEQ ID No.6轉染DRGN引起免疫反應性的顯著減少，同時促進顯著的神經突長出；和C，然而，在用合成序列1轉染的DRGN中，使用βIII-微管蛋白和NgR抗體的雙免疫細胞化學沒有揭示神經突長出，并且在NgR免疫反應性中沒有變化。
本發明人表明，在存在FGF2和CNS髓磷脂時，SEQ ID No.6完全擊倒NgR(100％擊倒，P＜0.0001相對于合成的1)，如圖5A所示。siRNA NgRSEQ ID No.6的合成譯本對于NgR水平沒有影響，這證明SEQ ID No.6siRNA的特異性。在NgR擊倒后，在p75NTR及其片段中沒有調控，然而，在獲得顯著的擊倒的樣品中，活性Rho-A水平減小(圖5A)。在用NgRsiRNA SEQ ID No.6轉染的DRGN中，NgR免疫反應性顯著減小，而在存在CNS髓磷脂時，用FGF2刺激后，βIII-微管蛋白+神經突的生長增強(圖5B)。在存在FGF2和CNS髓磷脂時，合成的NgR SEQ ID No.6對NgR免疫反應性和DRGN的神經突長出沒有作用(圖5C)。
Rho-A siRNA顯著地擊倒DRGN中的Rho-A其次，本發明人構建了5種針對下游抑制性信號傳導分子Rho-A的siRNA(SEQ ID No.11-15)，并且檢測它們擊倒DRGN中Rho-A的能力，并且結果在圖6中顯示，其中-A，使用Rho-A siRNA SEQ ID No.s 11，12，13和15，在siRNA-介導的基因沉默作用后細胞裂解物的蛋白質印跡分別表現出80％，100％，10％和70％的Rho-A蛋白擊倒。全長和p75NTR處理形式的同時減少也是顯而易見的；B，用SEQ ID No.12轉染的DRGN具有減少的Rho-A免疫反應性，和旺盛的神經突長出；和C，然而，在用合成SEQ ID No.12轉染的DRGN中，使用βIII-微管蛋白和NgR抗體的雙免疫細胞化學沒有表現出神經突長出，并且在Rho-A免疫反應性中沒有變化。
在存在CNS髓磷脂時，在用FGF2刺激的DRGN中，SEQ ID No.12完全擊倒Rho-A(100％擊倒，P＜0.0001相對于合成的序列12)蛋白，而合成的譯本沒有影響(圖6A)。siRNA-介導的Rho-A擊倒與p75NTR及其片段p55和p25的顯著擊倒相關(圖6A)。在βIII-微管蛋白+DRGN中，Rho-A siRNASEQ ID No.12幾乎完全消除了Rho-A的免疫反應性，并且在存在CNS髓磷脂時，比檢測的任何其它的siRNA序列導致更多的FGF2-刺激的神經突長出(圖6B)。合成的Rho-A SEQ ID No.2對Rho-A免疫反應性和DRGN的神經突長出沒有影響(圖6C)。
從βIII-微管蛋白的蛋白質印跡量化DRGN神經突長出由于許多DRGN生長多于一個神經突，并且這些由來自相鄰DRGN的神經突點綴，所以，很難使用Axiovision軟件檢測用siRNA-介導的p75NTR、NgR和Rho-A擊倒觀察到的神經突長度。因此，βIII-微管蛋白的蛋白質印跡的密度計量學分析用來估計神經突長出，并且結果顯示在圖7中，其中A和B，與用合成的或任何其它的siRNA序列轉染的DRGN相比，在用p75NTRsiRNA SEQ ID No.2轉染的DRGN中，檢測到顯著更高的βIII-微管蛋白量(P＜0.0001，ANOVA)，與只存在FGF2和CNS髓磷脂時生長的DRGN相比，這表現出5倍的增加；C和D，使用針對NgR的siRNA，與用合成的或任何其它的siRNA序列轉染的DRGN相比，在用SEQ ID No.6轉染的DRGN中，檢測到顯著更高的βIII-微管蛋白量(P＜0.0001，ANOVA)，與只存在FGF2和髓磷脂時生長的DRGN相比，這表現出3倍的增加；E和F，使用針對Rho-A的siRNA，與用合成的或任何其它的siRNA序列轉染的DRGN相比，在用Rho-A SEQ ID No.12轉染的DRGN中，檢測到顯著更高的βIII-微管蛋白量(P＜0.0001，ANOVA)，與只存在FGF2和髓磷脂時生長的DRGN相比，這表現出6.5倍的增加。最大的βIII-微管蛋白量(反映最旺盛的神經突長出)在用Rho-A SEQ ID No.12轉染的DRGN中檢測到；和G，在siRNA-介導的p75NTR、NgR或Rho-A擊倒后，計數βIII-微管蛋白+DRGN的數目，作為細胞存活的檢測，沒有揭示出任何顯著變化。***P＜0.0001相對于使用FGF2和髓磷脂的對照DRGN。
當使用siRNA SEQ ID No.2擊倒p75NTR時，存在CNS髓磷脂時，FGF2-介導的神經突長出增強5倍(圖7A和B)，當使用siRNA SEQ ID No.6擊倒NgR時增強3.5倍(圖7C和D)，以及當使用siRNA SEQ ID No.12擊倒Rho-A時增強6.5倍(圖6E和F)。在Rho-A擊倒后，FGF2-刺激的βIII-微管蛋白水平比在p75NTR擊倒后觀察到的水平進一步增加。這些結果表明，阻滯Rho-A最理想地解除CNS髓磷脂存在時對FGF2-刺激的DRGN神經突長出的抑制。
p75NTR、NgR和Rho-A擊倒后的DRGN存活在p75NTR、NgR和Rho-A擊倒后，培養物中存在的在髓磷脂存在時用FGF2刺激的βIII-微管蛋白+DRGN的數目保持不受影響(圖7G)。這表明，存在CNS髓磷脂時，p75NTR、NgR或Rho-A的擊倒對于FGF2-刺激的DRGN神經突長出沒有不利影響。
討論本發明人的軸突生長解除抑制策略使用siRNA靶向抑制性信號傳導級聯，而不是抑制性配體。在FGF2-刺激的DRGN中p75NTR、NgR和Rho-A的擊倒都導致解除CNS抑制性髓磷脂存在時對神經突長出抑制，Rho-A的擊倒引起最明顯的作用。最有效的siRNA，Rho-A SEQ ID No.12，促進比存在CNS髓磷脂時用FGF2觀察到的高6.5倍的FGF2-刺激的神經突長出，和比用siRNA p75NTRSEQ ID No.2觀察到的高1.5倍的FGF2-刺激的神經突長出。有趣地，siRNA-介導的p75NTR的擊倒還引起Rho-A的完全擊倒，而siRNA-介導的全部Rho-A的擊倒相反在DRGN中引起中等的但是顯著的p75NTR的擊倒。NgR的擊倒增強神經突長出最小，當與存在CNS髓磷脂時生長的DRGN相比較時，其使FGF2-刺激的神經突長出增加3.5倍。
siRNA-介導的p75NTR的擊倒本發明人已經證明siRNA-介導的p75NTR的基因沉默作用解除了CNS髓磷脂存在對RGC神經突長出的抑制(實施例1)。本發明人還表明，p75NTR的擊倒導致對Rho-A活化的抑制，由此表明對抑制性信號傳導的抑制(實施例2)。這里，本發明人使用相同的siRNA序列來在體外DRGN中研究p75NTR基因沉默的作用。存在髓磷脂時，p75NTR及其片段的擊倒以及隨后抑制Rho-A活化增強了FGF2-刺激的DRGN神經突長出，這一觀察支持下述假說抑制性配體結合分子NgR需要p75NTR以在多種神經元細胞類型中轉導其信號。
總之，結果證明p75NTR的擊倒在存在推定的抑制性環境(髓磷脂)時對于神經營養蛋白-刺激的(CNTF)RGC神經突長出具有顯著有利的影響。此外，NgR、p75NTR和Rho-A的擊倒在存在推定的抑制性環境時對于神經營養蛋白-刺激的(FGF2)DRGN神經突長出具有顯著有利的影響。這暗示神經營養蛋白-刺激的機制對神經突長出抑制的解除作用可能是一種普遍現象，并且siRNA可以增強這一作用。結果對于抑制解除策略是有希望的，并且表明針對下游信號傳導分子的RNAi在促進最理想的CNS軸突再生中是最有利的。
權利要求
1.一種基因沉默分子，其適于下調編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達。
2.按照權利要求1的基因沉默分子，其中所述基因沉默分子是反義分子、核酶分子或短干擾核酸(siNA)。
3.按照權利要求2的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括siRNA分子。
4.按照權利要求2或權利要求3的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括大約5bp-50bp。
5.按照權利要求2-4中任一項的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括小于50％的GC含量。
6.按照權利要求2-5中任一項的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括適于下調編碼p75NTR受體的基因的表達的序列。
7.按照權利要求6的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括-5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’(SEQ ID No.1)；5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’(SEQ ID No.2)；5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’(SEQ ID No.3)；5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’(SEQ ID No.4)；或5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3(SEQ ID No.5)。
8.按照權利要求2-5中任一項的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括適于下調編碼NgR的基因的表達的序列。
9.按照權利要求8的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括-5’-AATCTCACCATCCTGTGGCTG-3’(SEQ ID No.6)；5’-AACCTCACGCATCTCTTTCTG-3’(SEQ ID No.7)；5’-AATCAGCTCACTGATGAGGAG-3’(SEQ ID No.8)；5’-AAATGCACTCAAGGGACGTGT-3’(SEQ ID No.9)；或5’-AATGACTCTCCATTTGGGACT-3’(SEQ ID No.10)。
10.按照權利要求2-5中任一項的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括適于下調編碼Rho-A分子的基因的表達的序列。
11.按照權利要求10的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括-5’-AAGATTATGACCGTCTGAGGC-3’(SEQ ID No.11)；5’-AAGGATCTTCGGAATGATGAG-3’(SEQ ID No.12)；5’-AAGGCGGGAGTTAGCCAAAAT-3’(SEQ ID No.13)；5’-AATGAAGCAGGAGCCGGTAAA-3’(SEQ ID No.14)；或5’-AAAGACCAAAGACGGAGTGAG-3’(SEQ ID No.15).
12.按照任一前述權利要求的基因沉默分子，其中所述基因沉默分子包括SEQ ID No.2，SEQ ID No.6或SEQ ID No.12確定的序列。
13.按照任一前述權利要求的基因沉默分子，其中所述基因沉默分子與刺激神經突生長的分子組合應用。
14.按照權利要求13的基因沉默分子，其中所述刺激神經突生長的分子包括神經營養因子(NTF)。
15.按照權利要求14的基因沉默分子，其中所述NTF獨立地選自由下列各項組成的組CNTF，FGF2，NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，FGF-1，FGF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，以及VIP等。
16.按照權利要求15的基因沉默分子，其中所述NTF是睫狀神經營養因子(CNTF)或成纖維生長因子2(FGF2)。
17.按照權利要求1-16中任一項的基因沉默分子，其用作藥物。
18.按照權利要求1-16中任一項的基因沉默分子用于制備促進神經元存活和軸突生長的藥物中的應用。
19.按照權利要求1-16中任一項的基因沉默分子用于制備抑制細胞程序性細胞死亡的藥物中的應用。
20.按照權利要求1-16中任一項的基因沉默分子，其特征在于所述分子適于在存在神經突生長抑制劑分子時比不存在所述抑制劑分子時誘導更多的神經元存活和軸突生長。
21.一種組合物，其包括治療有效量的按照權利要求1-16中任一項的基因沉默分子，和藥用賦形劑。
22.用于促進神經元存活和軸突生長的組合物，所述組合物包括按照權利要求1-16中任一項的基因沉默分子，和神經營養生長因子。
23.按照權利要求22的組合物，其中所述NTF獨立地選自由下列各項組成的組CNTF，FGF2，NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，FGF-1，FGF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，和VIP等。
24.促進受試者中神經元存活和軸突生長的方法，所述方法包括給需要這樣的治療的受試者施用按照權利要求21-23中任一項的組合物。
全文摘要
本發明提供一種基因沉默分子，其適于下調編碼參與Rho－A抑制途徑的肽的基因的表達。所述基因沉默分子用于促進中樞神經系統(CNS)中神經元存活和軸突再生。本發明還提供組合物以及應用所述組合物提高神經存活和促進軸突生長的方法。
文檔編號C12N15/113GK101084309SQ200480044652
公開日2007年12月5日 申請日期2004年10月22日 優先權日2004年10月22日
發明者祖貝爾·艾哈邁德, 馬丁·貝里, 安·洛根 申請人:諾伊熱尼有限公司