腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌m33的培養方法

專利名稱：腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌m33的培養方法
技術領域：
本發明涉及培養腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌M33的生物工藝學方法，并涉及在該方法中用來增加具有高腈水合酶的生物量產率的培養基。
化學化合物的工業生物工藝生產方法的發展已經引起對具有特定酶的微生物產生巨大的興趣，這些酶可用于所選定的生物催化反應。它們的實例是用于酰胺合成的生物工藝生產方法，該方法基于一些能夠合成腈水合酶的微生物，該酶催化有機酸的腈基轉化為相應的酰胺。在這方面，能夠將丙烯腈轉化為丙烯酰胺的細菌菌株特別具有價值。
各種微生物的培養方法在具有催化活性的生物量或生物催化劑的生產上起重要作用。通常存在兩種選擇來增加每單位體積肉湯培養基的酶活性產率(總活性以U/ml計)1.激活(細菌)細胞的酶合成，或換句話說增加特定酶的活性(干生物量的U/mg)2.提高每單位體積肉湯培養基的活性細胞(活性生物量)的產率。
英國專利2087926A和此處引用的專利文獻中，描述了棒狀桿菌(corynebacterium)菌株N-774(發酵研究所(Fermentation ResearchInstitute)的保藏號FERM 4446)的培養方法。顯示腈水合酶的該菌株培養于無機培養基，該培養基含有濃度至少0.2mg/L的水溶鐵化合物和以重量計1％的酪蛋白水解產物(酪蛋白氨基酸)。該方法的缺點在于酪蛋白水解產物的成本高和所獲得的腈水合酶的活性低比活性＝53.3U/mg，干生物量＝5.66mg/mL，總活性＝301.7U/mL。
已知有機酸的腈基和酰胺，尤其是丙酸和異丁酸，引起誘導腈水合酶。在這方面，從美國專利第4,555,487號推斷出將這些化合物，其是已知的酶誘導試劑或誘導劑，加于綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)B23株(FERM BP-187)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)PS1株(FERM BP-188)，能夠獲得具有62.65U/mg比活性和335.8U/mL總活性的生物量(5.36g/L干生物量)。
該方法的缺點在于使用昂貴的誘導劑和所獲得的細胞的腈水合酶活性低。
EP0115781所描述的用于誘導綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)B23株(FERM BP-187)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)PS1株(FERM BP-188)的培養基不僅包括已描述的誘導劑，例如美國專利第4,555,487號中的，也包括用于增加酶活性的一種或多種α-氨基酸。例如，α-氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸等，以0.1至10.1g/L的濃度使用。然而，以該方法獲得的生物量的比活性不超過105.7U/mg，并且總活性不超過428.1U/mL。
利用培養紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33株已經獲得更高的腈水合酶活性，如德國專利4480132所描述的。該出版物顯示，在含有葡萄糖(濃度5g/L)的合成培養基中培養該菌株期間，可能獲得具有比活性高達200U/mg和總活性高達360U/mL的細胞。所提出方法的基本優點是培養基的簡單性，其不包含任何昂貴的成分。然而，提高葡萄糖濃度至20g/L，總活性的增加不超過1368U/ml。
歐洲專利0362829中所描述培養紫紅紅球菌J1株(FERM BP-1487)的方法是工業上適合的方法。其培養基包含便宜的誘導劑(尿素(濃度15g/L)和二價鈷)，所提議的培養方法使得能夠獲得具有578U/mg比活性的細胞。為了增加細胞產率(生物量產率)向培養基加入蛋白胨和酵母提取物。然而，獲得的總活性不超過2480U/mL，因為生物量的產率僅4.3g/L。在工業條件下上調培養步驟增加細胞產率至28g/ml；伴隨著特定腈水合酶活性下降至76U/mg和總活性下降至2100U/mL(YamamaH.，Kobayashi M.，“Nitrile hydratase and Application to IndustrialProduction of Acylamide”，Biosci.Biotech.Biochem.，60(9)，1391-1400，1996)。
文獻中描述了培養紫紅紅球菌M33株的另一種方法(Kim B-Y.，KimJ-C.，Lee H-H，Hyun H-H.，“Fed-batch Fermentation for Production ofNitrile Hydratase Rhodococcus rhodochrous M33”，Biotechnol.BioprocessEng.，611-17，2001)。該方法包括在含純合成培養基的5升發酵罐中進行限制葡萄糖、補料-分批的發酵，該培養基由KH2PO4、K2HPO4、Fe2SO4×7H2O、EDTA-2Na、MgSO4×7H2O、NaCl、CoCl2×6H2O、尿素和葡萄糖組成。通過不斷的計量加入40％濃度的葡萄糖溶液和向葡萄糖溶液三次周期性加入CoCl2×6H2O(0.01g/L)，可獲得24g/L的細胞產率和120U/mg的腈水合酶比活性。然而，經過約115小時的相對長時間發酵后，獲得的總活性不超過2882U/mL。
因此，仍然存在對培養腈水合酶生產菌株的生物工藝學方法的需求，以便能夠增加具有高腈水合酶活性的生物量的工業產率。
因此，本發明的一個目標是提供這樣的方法。
已經令人驚奇地發現，培養腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌的方法實現了本發明的目標，所述生產腈水合酶的紫紅紅球菌例如是M33株，其以保藏號DSM 14230保藏于DSMZ，Deutsche Sammlug vonMikroorganismen und Zellkulturen Gmbh(德國微生物保藏中心)，Marschroder Weg 1b，D-38124，不倫瑞克，德國，該方法使用如下培養基進行培養，該培養基基于12至60mM的磷酸鹽緩沖液，滿足細胞對磷的需求并在培養期間維持pH在5.5至9.0，并在最初提供的葡萄糖耗盡后計量加入作為新碳源的乙酸。
根據本發明，使用的培養基滿足細胞對磷的需求并在培養期間維持pH在5.5至9.0。優選這樣的培養基含有作為額外生長因子的玉米提取物。
在本發明的方法中，尤其優選在培養基中使用作為額外生長因子，加入的玉米提取物例如為玉米漿(corn steep liquor)的形式，以例如1至10g/L的濃度加入。所用的玉米提取物可以是任意的玉米漿，其包括玉米顆粒成分，成分已經作為常規浸漬步驟的結果以濃縮形式進入溶液。根據本發明，優選使用由Cerestar Deutschland GmbH，Krefeld提供的稱作Cerestar 15840的玉米漿。
優選能用于本發明方法的培養基(下文簡稱SI)具有下列成分(g/L)a.)7.9g/L NaH2PO4×12H2Ob.)1.8g/L K2HPO4c.)0.02至0.04g/L CoCl2×6H2Od.)1.0g/L MgSO4×7H2Oe.)0至10g/L玉米提取物f.)20至90g/L葡萄糖g.)4至20g/L尿素。
尤其是使用如下培養基，這些培養基中已經加入1至10g/L濃度的玉米提取物，優選2至8g/L，更優選2至6g/L。最優選，所使用的玉米提取物以4g/L濃度在培養基中使用。
培養基的基礎是12至60mM的磷酸鹽緩沖液，其滿足細胞對磷的需求并在培養期間維持pH在5.5至9.0，使用葡萄糖和乙酸作為碳源，以及使用乙酸作為除葡萄糖外的新的額外碳源。
非常優選，在本發明的方法中使用35.3mM的磷酸鹽緩沖液。
有利的是培養基含有20至90g/L的作為碳源的葡萄糖，優選20至60g/L，和更優選20至40g/L，特別對于在振蕩培養瓶中的培養。除了葡萄糖，乙酸可用作碳源，優選碳源通過兩相法加入，特別對于實驗室或工業規模的發酵罐中培養。
該方法的第一相特征在于以培養基最初含有的第一碳源為基礎的紫紅紅球菌M33株的最初的、強烈細胞生長，第一碳源優選為20g/L葡萄糖。葡萄糖耗盡后，發酵在已知為補料-分批的過程的第二相中持續，其中乙酸用作碳源。不昂貴的乙酸能夠替換適合培養的葡萄糖，并且所述的乙酸確保高腈水合酶比活性和高總活性。
有利的是，作為選擇乙酸能夠以其水溶性鹽的形式加入，特別優選乙酸鈉作為水溶性乙酸鹽。在本發明的一個實施方案中，葡萄糖耗盡后計量加入根據本發明待用的水溶性乙酸鹽，其中優選情形使用的乙酸鈉以1至4g/L的補料濃度加入。尤其優選以3g/L的補料濃度加入乙酸鈉。
在本發明的另一個實施方案中，水溶性乙酸鹽，優選乙酸鈉，存在于最初的批培養中。當pH升至7.5至8.5后，然后將乙酸以20至50％、優選30％濃度的水溶液計量加入。有利的是，通過在pH7.5至8.5、尤其在7.9的pH-啟動補料計量加入乙酸水溶液。
此外，本發明的方法可通過在發酵期間以一定的次數和合適濃度計量加入待加入的組分來進行，優選CoCl2×6H2O和尿素，其中鈷作為輔助因子以及尿素作為誘導劑。
具體而言，對誘導腈水合酶，在培養基中計量加入4至20g/L尿素和0.02至0.04g/L的CoCl2×6H2O。優選一些尿素在培養基的最初批中以誘導劑存在，優選濃度為4g/L，并且在最初提供的葡萄糖耗盡后，優選地以6g/L的補料濃度計量加入剩余的尿素。
根據本發明，在基于葡萄糖作為碳源的指數生長期的開始，通過將CoCl2×6H2O(優選0.01g/L的投料濃度)與培養基混合加入CoCl2×6H2O輔助因子，然后，在葡萄糖耗盡后，加入更多的CoCl2×6H2O輔助因子，優選地以0.03g/L的補料濃度計量加入。
令人驚奇地是已經發現，在進行本發明時，如果在指數生長期的開始時計量加入CoCl2×6H2O，優選以0.01g/L的補料濃度加入，發酵時間可以縮短。
在溫度25至30℃，在擋板式培養瓶(振蕩培養器)中和在實驗室和工業發酵罐中進行本發明方法的菌株培養，培養時間從48至170小時。在本發明方法的優選實施方案中，發酵期間氧的供應，特別是對于工業發酵罐，被控制在相對氧分壓大于30％，優選≥50％。
本發明的用于培養腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌M33的方法的優點在于，通過使用本發明的培養基，尤其是當將玉米提取物用作額外的生長因子時，其能夠不僅產生大量的含腈水合酶的生物量(產率至多達到39.5g/L干生物量)，也產生具有高腈水合酶比活性的生物量(至多達315U/mg)，而腈水合酶總活性達到7169U/mg，如從下面實施例推論出。
與已知的培養腈水合酶生產菌株的方法不同的是，根據本發明的本方法特征在于使用基于12至60mM磷酸鹽緩沖液的培養基，所述培養基在培養期間滿足細胞對磷的需求并維持pH在5.5至9.0，其特征還在于在最初提供的葡萄糖耗盡后，計量加入作為新碳源的乙酸。而且，可將玉米漿形式的玉米提取物用作額外的生長因子。此外，有利的是培養基中可用于培養的葡萄糖可以被不昂貴的乙酸代替，因此當使用本發明的方法可以確保得到高腈水合酶比活性和高總活性。
測量腈水合酶活性的標準試驗將1ml的于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中的2％濃度的丙烯腈與1ml的M33細胞懸浮液混合，該懸浮液通過先前的肉湯培養物離心、洗滌和隨后在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中再懸浮細胞獲得。懸浮液包含0.08至0.6mg的細胞(干重)。反應在20℃進行5分鐘，之后通過加入20μl濃鹽酸終止反應。利用氣相色譜或光度測定法測定所形成的丙烯酰胺的濃度。
腈水合酶活性用下列單位給出·比活性-以mol計的丙烯酰胺/分鐘×干生物量的mg＝[U/mg]·總活性-以mol計的丙烯酰胺/分鐘×培養物肉湯的ml＝[U/ml]利用下列實施例闡述本發明
實施例1在含有50ml培養基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.02CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；2.0玉米提取物；pH7.2±0.2)和含有葡萄糖(50g/L)和尿素(4至20g/L)的擋板式培養瓶(250ml)中接種1ml紫紅紅球菌M33株接種培養物。接種物已經在同樣培養基中培養超過24小時。在30℃，以180rpm(圓周運動)在振蕩培養器中進行培養超過96小時。測定生物量的產率和細胞的腈水合酶活性。結果列于表1。
表1
實施例2在含有50ml培養基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.02CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；16.0尿素；pH7.2±0.2)和含有葡萄糖(50g/L)和玉米提取物(0至10g/L)的擋板式培養瓶(250ml)中接種1ml紫紅紅球菌M33株接種培養物。接種物已經在同樣培養基中培養超過24小時。在30℃，以180rpm(圓周運動)在振蕩培養器中進行培養超過96小時。測定生物量的產率和細胞的腈水合酶活性。結果列于表2。
表2
*對該起始混合物計量加入0.01g/L FeSO4×7H2O。
從上面的數據，證明加入玉米提取物導致腈水合酶比活性和總腈水合酶活性的增加。玉米提取物的最佳濃度是4g/L。
實施例3含有50ml培養基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.02CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；16.0尿素；4.0玉米提取物pH7.2±0.2)的擋板式培養瓶(250ml)中含有濃度為20至90g/L的葡萄糖。接種物和培養瓶接種如實施例1進行。表3總結了測定的生物量產率和細胞腈水合酶活性。
表3
從表3可以看出，在培養基中細胞產率和總腈水合酶活性的增加與葡萄糖濃度的增加成比例。這得自于事實上所有的培養基成分以無限制的濃度存在。
實施例4在含有1.5升培養基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.01CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；16.0尿素；4.0玉米提取物；pH7.2±0.2)和含有葡萄糖(5g/L)的3升實驗室發酵罐中接種100ml紫紅紅球菌M33株接種培養物。接種物已經在同樣組分的培養基中培養超過24小時。
培養條件·溫度 30℃·攪拌速度 560rpm·換氣速率 1.5vvm(體積/體積/分鐘)發酵18小時后，每2小時計量加入1.5g/L葡萄糖直到終濃度達到40g/L。結果顯示生產出了具有215U/mg比活性的16.4g/L的干生物量。總活性是3526U/mL。
實施例5如實施例4所述，在含有1.5升培養基“SI”(以g/l計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；0.01g CoCl2×6H2O；1.0g MgSO4×7H2O；16.0尿素；4.0玉米提取物；pH7.2±0.2)和含有20g/L葡萄糖的3升實驗室發酵罐中進行接種。培養條件也同實施例4。發酵24至36小時和耗盡所有葡萄糖后，計量加入6g/L尿素、3g/L乙酸鈉和0.03g/LCoCl2×6H2O。培養基pH增加后，計量加入30％濃度的乙酸(補料分批)。在這些條件下，發現在超過72小時里生產出了具有315U/mg比活性的19.6g/L的干生物量。總活性是6174U/mL。
實施例6在含有7.0升培養基“SI”(以g/L計組成7.9Na2HPO4×12H2O；1.8KH2PO4；1.0MgSO4×7H2O；4.0尿素；4.0玉米提取物，pH7.2±0.2)和含有20g/L葡萄糖的15升實驗室發酵罐中接種4％(v/v)紫紅紅球菌M33株接種培養物。接種物作為振蕩培養物已經在同樣培養基中培養超過24小時。
培養條件·溫度29-30℃·換氣速率0.5vvm·重疊壓 0.3bar·相對氧分壓 ≥50％(通過攪拌速度控制)·攪拌速率300至600rpm發酵12小時后(指數生長期開始)，計量加入0.01g/L CoCl2×6H2O。發酵21至23小時和耗盡所有葡萄糖后，計量加入6g/L尿素、3g/L乙酸鈉和0.03g/L CoCl2×6H2O。培養基的pH升至7.9后，計量加入乙酸(30％)形式的新碳源，并調節pH至7.9(pH-啟動的補料(pH-stat feeding))。在這些條件下，發現僅在66.5小時里便生產出了具有294U/mg比活性的19.9g/L的干生物量。總活性是5851U/mL。
由于事實上指數生長期前CoCl2×6H2O沒有加入，相比于實施例5可能減少發酵時間。
實施例7在具有15m3容量和含有10m3培養基“SI”(以g/L計組成3.48H3PO4；0.74KOH；用于調節pH至6.9的NaOH；0.01CoCl2×6H2O；1.0MgSO4×7H2O；4.0尿素；4.0玉米提取物，pH7.2±0.2)和含有20g/L葡萄糖的工業生產發酵罐中接種5％(v/v)紫紅紅球菌M33株接種培養物。接種物先前已經以預發酵的方式培養了超過24小時，再次使用“SI”。
·溫度28-30℃·攪拌速度160-165rpm·換氣速率0.5vvm發酵24至36小時和耗盡所有葡萄糖后，向培養基中計量加入6g/L尿素、3g/L乙酸鈉和0.03g/LCoCl2×6H2O。乙酸的補料以與實施例6所描述類似的方式進行。發酵72小時后，發現生產出了具有290U/mg比活性的18.8g/L的干生物量。總活性是5452U/mL。
權利要求
1.腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33的培養方法，該菌株以保藏號DSM 14230保藏于德國微生物保藏中心，Marschroder Weg 1b，D-38124，不倫瑞克，德國，該方法特征在于使用一種培養基，所述培養基基于12至60mM磷酸鹽緩沖液并滿足細胞對磷的需求和在培養期間維持pH在5.5-9.0的范圍內，并且當所有最初提供的葡萄糖已經耗盡時，向所述培養基中計量加入乙酸作為新碳源。
2.如權利要求1定義的方法，特征在于將玉米提取物在所述培養基中用作生長因子。
3.如權利要求2定義的方法，特征在于將玉米漿和/或玉米浸漬溶液用作玉米提取物。
4.如權利要求1-3任意一項定義的方法，特征在于所述的玉米提取物在所述的培養基中以1至10g/L的濃度使用。
5.如權利要求1-4任意一項定義的方法，特征在于將葡萄糖和乙酸用作培養基中的碳源。
6.如權利要求1-5任意一項定義的方法，特征在于所述的培養基含有濃度為20至90g/L的葡萄糖作為碳源。
7.如權利要求1-6任意一項定義的方法，特征在于乙酸最初以其水溶性鹽的形式加入。
8.如權利要求1-7任意一項定義的方法，特征在于所用的水溶性乙酸鹽是乙酸鈉。
9.如權利要求1-8任意一項定義的方法，特征在于將水溶性乙酸鹽用于最初的批培養，并且當pH升至7.5-8.5，計量加入乙酸。
10.如權利要求1-9任意一項定義的方法，特征在于葡萄糖消耗后，水溶性乙酸鹽以1至4g/L的濃度計量加入，優選3g/L。
11.如權利要求1-10任意一項定義的方法，特征在于隨后以20至50％濃度水溶液的形式、優選以30％濃度水溶液的形式加入乙酸。
12.如權利要求1-11任意一項定義的方法，特征在于在pH7.5-8.5、優選pH7.9時通過pH-啟動的補料計量加入乙酸溶液。
13.如權利要求1-12任意一項定義的方法，特征在于在所述培養基中計量加入尿素和CoCl2×6H2O。
14.如權利要求1-13任意一項定義的方法，特征在于將一部分尿素作為誘導劑加入用作最初的批培養物的培養基，并且當最初提供的葡萄糖已經耗盡時，再次計量加入尿素。
15.如權利要求1-14任意一項定義的方法，特征在于在指數生長期的開始向基于葡萄糖作為碳源的培養基中加入CoCl2×6H2O，并在葡萄糖耗盡后再次計量加入。
16.如權利要求1-15任意一項定義的方法，特征在于在發酵罐培養期間控制氧的供應使得相對O2分壓大于30％，并優選≥50％。
17.用于權利要求1至16任意一項定義的方法中的培養基，包含a.)7.9g/L Na2HPO4×12H2Ob.)1.8g/L CH2PO4c.)0.02-0.04g/L CoCl2×6H2Od.)1.0g/L MgSO4×7H2Oe.)從0至10g/L的玉米提取物f.)從20至90g/L的葡萄糖g.)從4至20g/L的尿素。
18.如權利要求17定義的培養基，特征在于所述培養基含有濃度從1至10g/L的玉米提取物。
19.如權利要求17或權利要求18定義的培養基，特征在于其基于12至60mM磷酸鹽緩沖液并滿足細胞對磷的需求，且在培養期間維持pH在5.5-9.0的范圍內。
20.如權利要求17至19任意一項定義的培養基，特征在于所述的培養基包括乙酸作為進一步碳源。
全文摘要
本發明涉及腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌M33的培養方法，其中使用一種培養基，所述培養基基于12至60mM磷酸鹽緩沖液并在培養期間滿足細胞對磷的需求和維持pH在5.5－9.0的范圍內，并且當其中已有量的葡萄糖已經耗盡時，向培養基中加入乙酸作為新碳源。本發明也涉及該方法中所用的培養基。
文檔編號C12N1/38GK1961067SQ200480043243
公開日2007年5月9日 申請日期2004年4月6日 優先權日2003年4月3日
發明者約瑟夫·洛倫茨, S.·P.·沃羅寧, S.·W.·科索林, I.·N.·辛吉爾茲夫, V.·G.·德巴伯夫, A.·S.·亞年科 申請人:亞什蘭許可和知識產權有限公司