芳香酸的微生物生產的制作方法

專利名稱：芳香酸的微生物生產的制作方法
技術領域：
本發明涉及由可再生(可更新，renewable)碳源(碳底物、碳基質，carbon substrate)如糖類酶促生產芳香酸。更具體地，本發明涉及一種利用宿主細胞微生物生產芳香酸的改進方法，其中宿主細胞包括能夠主動(積極或活性，actively)地將所述芳香酸分泌出所述宿主細胞(例如排入到培養基中)的酶促泵(enzymatic pump)。盡管本發明將主要提及肉桂酸、對羥基肉桂酸和對羥基苯甲酸的生產進行描述，但是本發明的方法也有利地用于其他芳香酸的微生物生產。
芳香化合物的化學合成是基于非再生碳源的，經常會需要許多能量和/或昂貴的化學活化和保護基團和/或大量的溶劑。因此，在許多情況下，芳香化合物的化學合成從環境的角度看是不理想的。此外，芳香酸的化學合成經常是費時費力的。因此，芳香酸的大規模合成優選采用微生物生產體系和可再生碳源如糖類來進行。
商業上重要的芳香酸的實例包括肉桂酸(稱為CA)、對羥基肉桂酸(稱為PHCA)以及對羥基苯甲酸(稱為PHB)。PHCA是生產液晶聚合物(LCP)的有用單體。LCP可以用于電子連接器以及電信和航空航天應用。耐滅菌輻射(消毒射線，sterilizing radiation)的LCP也使得這些材料能夠用于醫療器件以及化學和食品包裝應用中。此外，PHCA能夠用于日光屏蔽產品和化妝品以及作為食品的抗氧劑。通稱為香豆素(coumarin)或氧代肉桂酸(oxy-cinnamic acid)的一種用于防止高血壓和中風的重要藥物是CA的衍生物。對CA和相關化合物的生成和代謝綜述參見J.A.Hoskins的綜述(1984；Journal of Applied Toxicology，4283-292)。
PHB也用作合成LCP的單體，其也是一種食品防腐劑，并在化妝品制劑中用作穩定劑。另外，PHB也用作合成藥物、醫藥、染料和增塑劑的化學中間體。PHB的酯已知為對羥基苯甲酸酯類，其在除臭劑、止汗藥和大范圍的其他消費品中用作抗菌防腐劑。
CA和PHCA都在植物中天然生成，其中它們在植物的木質素生物合成途徑中用作中間體(Plant Biochemistry，Ed.P.M.Dey，Academic Press，1997)。從植物中分離和提純CA和PHCA的方法是已知的(R.Benrief，etal.，Phytochemistry，1998，47，825-832；WO 97/2134)。
PHB的化學合成在先前已經進行過描述(JP05009154；US5399178；US4747614；US3985797)。獲得所述芳香酸的方法是耗時和繁瑣的和/或能量苛求的，而其生產的生物方法能夠提供一種簡單并且可持續(sustainable)的解決方案。
PHB的微生物生產描述于WO 01/92539。該專利不同于本發明之處在于，PHB并不是由可再生原料如糖類進行生產的，而是由預先形成(preformed)的底物甲苯生產的。不同于本發明，該方法對持續性(sustainability)并沒有提供解決方案。
利用糖發酵途徑的CA和PHCA的微生物生產從WO02/090523獲知，其中將微生物宿主細胞加以設計具有涉及芳香酸合成的關鍵酶，以使其生產所需要的芳香酸。然而，已知微生物生產方法的產物收率的進一步優化和改進受到以下事實的限制一旦生產出來，芳香酸通常會累積在宿主細胞中。因此，累積的產品抑止涉及其生產的一種或多種酶，使得進一步增加芳香酸合成收到限制。這種現象也稱為負反饋控制機制(negative feedback control mechanism)。
本發明現在提供一種理解，將包括外排泵(流出泵，efflux pump)的宿主細胞有利地用于芳香酸的微生物生產，其中外排泵能夠主動地將芳香酸輸送到細胞外。
本發明提供了一種用于從可再生碳源微生物生產芳香酸的方法，其利用能夠生查所述芳香酸并且包括用于所述芳香酸的外排泵的宿主細胞。在本發明的方法中，宿主細胞能夠將芳香酸分泌到培養基中，使得將細胞中的產品累積以及可以想象到的負反饋降低到最低程度。因此，與采用不能有效分泌所生產的芳香酸的宿主細胞的現有微生物生產體系相比，能夠獲得更高的產物收率。另外，本方明的方法不需要收獲和進一步處理宿主細胞以獲得所需的終端產物。相反，富集終端產物的宿主細胞培養基能夠被取出并進行進一步處理，以分離和/或純化產物。因此，雖然本發明提供的方法的使用簡單，其能夠以連續模式實施，但是分批培養也是可能的。
可再生碳源是指植物或動物來源的碳源，其能夠被宿主細胞用作生長底物，并且通常是宿主細胞可發酵培養基的部分。可再生碳源的實例包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、淀粉、淀粉水解產物、以及糖漿；醇類，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、以及甘油；以及有機酸。
用于本發明方法中的合適的宿主細胞包括這樣的微生物細胞其能夠生產芳香酸并且對疏水溶劑(如甲苯和辛醇)表現為耐受表現型(tolerant phenotype)。然而，非耐受溶劑但確實包括能夠排出芳香酸的外排泵的(細菌)宿主細胞也可以用于本發明。
已經描述拉許多有助于耐受溶劑的不同機理，其中之一涉及能量依賴性外排泵，其主動地將毒性溶劑保持在細胞內部之外。耐受溶劑的宿主細胞有利地用于本發明，這是因為賦予抗或耐有機溶劑性的泵表現出了具有非常寬的專一性(特異性)，其能夠將借助于其化學-物理特性累積到細菌膜中的有機化合物如芳香化合物、醇類、烷烴等作為底物(Kieboom et al.，1998，J.Biol.Chem.27385-91)。借助于類似的化學-物理特性，非游離的芳香酸也能有效地與細胞膜分離，其中它們充當這樣的泵的底物。
在本發明的一個具體實施方式
中，宿主細胞，優選格蘭氏陰性細菌，包括質子依賴性的耐受性/結瘤(結瘤作用，nodulation)/細胞分裂(RND)家族的外排泵成員。RND型外排泵屬于多藥抗性(MDR)泵。它們也具有極寬的底物專一性，并保護細菌細胞免受抗生素對原生質細胞膜兩側的作用。這個家族的成員已經表現出與涉及排出與結瘤信號化(nodulationsignaling)的抗生素、金屬和寡糖有關。RND型外排泵通常起到跨越格蘭氏陰性細菌的外部和細胞質膜以及周緣胞質空間的三組分組件(three-component assembly)的作用。用于本發明方法的合適RND-型外排泵的實例能夠在Tseng，T.T.，Gratwick，K.S.，Kollman，J.，Park，D.，Nies，D.H.，Goffeau，A.，& Saier Jr.，M.H.(1999)，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.1107-125中找到。
在一個
具體實施例方式
中，本文提供的用于從可再生碳源生產芳香酸的方法利用包括耐溶劑泵的宿主細胞，優選惡臭假單胞菌S12(P.putidaS12)的耐溶劑泵srpABC(Isken et al.，1996 J.Bacteriol.1786056；Kieboomet al.，1998.J.Biol.Chem.27385-91)。由srpABC基因編碼的蛋白質的演繹(deduced)氨基酸序列與RND家族的外排泵的那些氨基酸序列具有廣泛的同源性。其由一起橫跨格蘭氏陰性細菌的內部和外部細胞膜的三種蛋白質組分構成內膜轉運蛋白(SrpB類似物)、外膜通道(SrpC類似物)和周緣胞質連接蛋白(SrpA類似物)。顯示SrpA、SrpB和SrpC與涉及多藥抗性的其他蛋白質之間的種系發生的關系(phylogeneticrelationship)的系統樹圖在Kieboom et al.，1998 J.Biol.Chem.27385-91中示出。srpABC編碼蛋白質顯示出與用于在銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中發現的mexAB/oprM編碼的多藥抗性泵的那些蛋白具有最大的同源性。SrpA、SrpB和SrpC分別與MexA、MexB和OprM具有57.8％、64.4％和58.5％的同一性。在本發明的一個具體實施方式
中，宿主細胞包括屬于RND-家族外排泵的外排泵，其由內膜轉運蛋白、外膜通道和周緣胞質連接蛋白組成，其中所述蛋白質顯示出與惡臭假單胞菌S12的SrpA、SrpB或SrpC蛋白質具有至少50％，優選至少55％的同源性。事實上，任何能夠將芳香酸用作底物的功能相當的已知溶劑外排泵都適用于本發明的方法中。
Kieboom等的論文涉及耐溶劑性的細菌。其討論了涉及質子依賴性流出體系中的蛋白質，如由惡臭假單胞菌的srpABC基因編碼的蛋白質，在調節對(外源)毒性分子的抗藥性中的作用，該有毒分子例如能夠被細菌用作碳源的毒性碳氫化合物(烴)底物或有利地被用于微生物生產精細化學品以向細菌提供疏水性底物的毒性非極性溶劑(例如甲苯)。DeBont等(Trends in Biotetchnology 1998，Vol.16，P493-499)也涉及微生物生產精細化學品遇到的毒性問題。具體而言，其描述了使用耐溶劑性細菌，這種細菌允許在發酵期間使用有機溶劑從水相提取有毒產物。Romos等(J.of Bacteriology Vol.180，p.3323)也涉及耐溶劑性細菌。其描述了惡臭假單胞菌株DOT-T1E中的甲苯和辛醇耐受性以及甲苯敏感性的辛醇耐受性的突變體(突變株)的產生和表征。在與MexB基因(其屬于RND-型外排泵家族)同源的基因中發現了突變。因此，現有技術并未披露或提出如本發明所披露的用于從可再生碳源微生物生產芳香酸的方法。他們僅僅教導了外排泵可用于外源加入的毒性分子(底物、底物溶劑或產物溶劑)的排出，其中毒性分子已從非再生(即化石性)碳源化學合成。相反，通過本發明的宿主細胞生產并由外排泵排出的芳香酸并非是外源加入的毒性分子。而且，它們通常是由宿主細胞自身生產的自然形成的分子。令人驚訝的是，本發明表明外排泵也適合用于排出從可再生碳源內部生產的芳香酸。正如實施例中所證實的那樣，芳香酸的排出顯著地提高了芳香酸的產量。
在一個優選的具體實施方式
中，本發明的方法使用假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)，優選惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，更優選惡臭假單胞菌菌株S12作為生產芳香酸的宿主細胞。
在一個
具體實施例方式
中，提供了一種使用宿主細胞進行微生物生產CA、PHCA和PHB的方法，該宿主細胞能夠將可發酵的碳源轉化為芳香氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)，隨后轉化為芳香酸CA、PHCA和PHB。一旦生產出來，這些芳香酸就通過外排泵，優選通過質子依賴性的耐受性/結瘤/細胞分裂(RND)家族的外排泵成員，更優選srpABC主動地輸送到宿主細胞外。
苯丙氨酸和酪氨酸(在本發明的方法中作為芳香酸的前體)在微生物中是自然存在的。然而，對于最佳的芳香酸合成來說，宿主細胞優選過量生產(over-produce)一種或多種芳香酸前體(例如，芳香氨基酸)，以使底物水平(濃度)不會限制通過宿主細胞的芳香酸生產。提高微生物中芳香氨基酸合成的方法在本領域是已知的。在一個具體實施方式
中，對宿主細胞進行選自以增大對芳香氨基酸的毒性類似物的耐受性。例如，可選擇對苯丙氨酸或酪氨酸的毒性(間-氟-)類似物具有耐受性的突變型微生物。這些不敏感的突變體經常生產出高水平的苯丙氨酸和酪氨酸(GB1071935；US3,709,785)。
還可能通過在苯丙氨酸和/或酪氨酸的生物合成中過表達(overexpress)一種或多種關鍵基因而獲得具有增大了苯丙氨酸和酪氨酸生產的重組宿主細胞(Ikeda 2003.Amino acid Production processes.P.1-35.in T.Scheper(Ed.)，Advances in Biochemical Engineering/Biotchnology，Vol.79.Springer-Verlag，Berlin Heidelberg)。
具有對間-氟-苯丙氨酸提高了耐受性的重組微生物被有利地作為宿主細胞用于微生物生產CA、PHCA和PHB的方法中。苯丙氨酸通過苯丙氨酸解氨酶(PAL；EC4.3.1.5)的作用酶促地轉化為CA。因此，除了外排泵外，本發明的宿主細胞優選包括至少一種基因編碼的PAL活性。術語“PAL活性”是指蛋白質催化苯丙氨酸轉化為CA的能力。
在植物中，CA隨后通過肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、細胞色素P450依賴性的單加氧酶(monooxygenase)(P450)轉化為PHCA。因此，很明顯，一種可能的途徑是借助于苯丙氨酸解氨酶(PAL)從苯丙氨酸生成PHCA。然而，這個途徑還需要第二種酶，即肉桂酸-4-羥化酶的存在，這種酶在大多數微生物中很少。可獲得信息表明，從一些植物和微生物獲得的PAL除了具有把苯丙氨酸轉化為肉桂酸的能力外，還能夠接受酪氨酸作為底物。在這樣的反應中，酶活性被指定(標明)為酪氨酸解氨酶(TAL)。酪氨酸通過TAL的轉化，導致了從酪氨酸直接形成PHCA，而沒有中間性的肉桂酸。
因此，在本發明的一個具體實施方式
中，使用的能夠生產CA和PHCA的宿主細胞包括“PAL/TAL活性”，是指包含PAL和TAL兩種活性的蛋白質。這樣的蛋白質對于作為酶促底物的酪氨酸和苯丙氨酸都具有至少部分的專一性。
然而，所有天然的PAL/TAL酶優選利用苯丙氨酸而不是酪氨酸作為它們的底物。TAL活性的水平總是低于PAL活性，但是這種差異的幅度變化的范圍很大。這個法則的例外是來自紅酵母菌屬(Rhodotorula spp.)和圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporium toruloides)的PAL/TAL酶(US4,636,466；Hanson and Havir in The Biochemicstry of Plants；AcademicNew York，1981；Vol.7，pp 577-625)，其中TAL催化活性與PAL催化活性的比率為約0.58。由于這個原因，提供的宿主細胞優選具有來自紅酵母菌屬或圓紅冬孢酵母菌的PAL/TAL基因。可替換地，宿主細胞包括“改性的PAL/TAL”活性，其是指來源于野生型PAL酶的蛋白質，但經過遺傳設計使其TAL活性大于PAL活性。同樣地，改性的PAL/TAL蛋白質具有對酪氨酸的底物專一性大于對苯丙氨酸的。獲得改性PAL/TAL蛋白質的說明能夠在WO02/090523中找到。
與CA不一樣，PHCA在假單胞菌(Pseudomonads)中通過內源酶的作用能夠被完全降解。這種降解途徑經由作為中間體的PHB(Jimenezetal.，2002.Environ.Microbiol.4824-841)。本發明提供一種通過其獲得突變體的方法，所獲得的突變體不再能夠降解PHCA或PHB。
因此，通過在假單胞菌的間-氟-苯丙氨酸耐受性突變體中引入TAL活性，就不再能夠降解PHCA或PHB，實現有效生產兩種芳香酸。
在一個
具體實施例方式
中，宿主細胞經過遺傳設計而具有一種或多種外源酶活性，使其能夠生產原本在所述宿主細胞中不能生產的芳香酸。在一個具體實施方式
中，提供的宿主細胞A具有來自微生物C的酶B，而獲得一種包括能夠生產芳香酸D的外排泵的宿主細胞。繼肉桂酸和PHCA之后，苯甲酸(benzoate)和PHB也是能夠在宿主細胞中生產的芳香酸。
重組宿主細胞能夠利用本領域已知的方法獲得，用于提供具有重組核酸的細胞。這些包括具有適當質粒(也稱為媒介物)的宿主細胞的轉化、轉結合(transconjugation)、轉染或電穿孔(electroporation)，其中該質粒包括可操縱地耦合至啟動子序列以驅動表達的有用核酸結構。通常，該質粒還包括選擇標記(selection marker)，該標記賦予宿主細胞具有對選擇性試劑(selective agent)如抗生素的耐受性。在選擇性試劑存在下，即在選擇性壓力下培養宿主細胞，確保宿主細胞保留(保持)該質粒。
因此，本發明提供了一種用于提供能夠過量生產芳香酸的宿主的方法，包括通過引入適當質粒而引入PAL/TAL活性和/或使宿主細胞的種群進行隨機突變，隨后挑選提高了間-氟-苯丙氨酸耐受性的宿主細胞，篩選所述耐受性宿主細胞以優化芳香酸生產，并挑選出至少一種超量生產(與沒有發生隨機突變的親代宿主相比)芳香酸的突變宿主。
然而，選擇性試劑一般是昂貴的。特別是在大規模微生物生產體系中，優選在可能的最廉價條件下，即不使用選擇性壓力的條件下進行培養。另外，還會遇到這樣的情形宿主細胞釋放染色體外質粒(extrachromosomal plasmid)而沒有釋放對選擇性試劑的耐受性。因此，用于本發明方法中的宿主細胞優選利用并不依賴于在選擇壓力下培養的步驟進行遺傳改性并產生遺傳穩定的重組宿主細胞。在一個具體實施方式
中，提供的宿主細胞利用插入形成突變(插入突變，insertionalmutagenesis)而具有感興趣的核酸，例如編碼涉及芳香酸合成的酶如PAL的基因。本文中，將分離的核酸插入到宿主細胞的基因組(染色體組)中。該插入可以是位點定向(定點，site-directed)或隨機的。在優選的具體實施方式
中，本發明提供了一種用于提供包括插入物形成突變的宿主細胞(過量)生產芳香酸的方法。插入形成突變有利地利用了轉位子(transposon)或plasposon。Plasposon是一種具有復制起點(origin)的微型轉位子(參見Dennis and Zylstra，1998)。在更優選的具體實施方式
中，隨機插入形成突變被用來提供用于本發明方法中的遺傳性改性變異體宿主細胞。例如，提供的變異體宿主細胞(優選假單胞菌屬)樣本采集(collection)中，每個宿主細胞都包含微型轉位子，其包括隨機插入其染色體DNA的PAL基因。在每個變異體宿主細胞中，染色體DNA在轉位子結合點包含突變。在某些情況下，突變能夠導致在所述宿主細胞中涉及芳香酸代謝的遺傳成分(遺傳因子，genetic element)(例如，編碼區或調節成分)的失活。例如，通常降解或進一步代謝由宿主細胞生產的所希望的芳香酸的酶失活。這當然有助于增加芳香酸的產量。可替換地，代謝的副途徑(支路徑，side-route)由于插入形成突變步驟而失活，使得前體進入芳香酸生物合成的代謝流出物增加。
因此，在一方面，本發明提供了一種用于提供過量生產芳香酸的宿主細胞的方法，包括使宿主細胞的種群進行隨機插入形成突變；篩選所述突變的宿主細胞(也稱為“變異體”宿主細胞)以優化芳香酸的生產；以及確定至少一種能夠過量生產芳香酸(與沒有進行隨機突變的親代宿主細胞相比)的變異體宿主細胞。具體而言，這種方法包括通過篩選對芳香氨基酸的毒性類似物具有耐受性的突變體，而挑選出用于增加苯丙氨酸和/或酪氨酸積累的宿主細胞。
通過篩選增加希望化合物的生產水平而易于確定變異體宿主細胞(其中插入形成突變產生了有用的突變體)。由于本發明的宿主細胞能夠將芳香酸分泌到培養基中，用于生長變異體宿主細胞的培養基的等分式樣能夠很容易地分析增加芳香酸生產的存在情況。特別關注的是這樣的變異體宿主細胞其中至少一種涉及所述芳香酸降解的酶被破壞或其中所述芳香酸生物合成的代謝副途徑被破壞。根據本發明的宿主細胞在含水(水性)培養基中進行培養，其中該含水培養基包括根據標準微生物培養條件的可再生、可發酵的碳源。術語“可發酵的碳源”是指能夠被宿主細胞代謝的碳源，特別是選自由單糖(如葡萄糖)、寡糖、多糖、多醇(如甘油)以及一碳源或其混合物組成的組的碳源。在本發明中用于芳香酸生產的優選碳源是葡萄糖和甘油。
在本領域中已知的各種培養方法都可以使用，例如，連續、分批、半間歇式或給料間歇式培養。本生物技術領域的普通技術人員能夠選擇最適合使用的培養方法。在一個具體實施方式
中，本發明的方法包括在給料間歇式發酵罐中培養宿主細胞。在給料間歇式發酵罐中，連續加料直至到達最大的液體發酵罐容積或直至細胞數量達到其最大密度。然后，發酵罐可以被允許繼續或部分地或完全地放空，這取決于采用的方法。
此外，本發明提供了宿主用于微生物生產芳香酸的應用，其中宿主包括用于芳香酸的外排泵，優選質子依賴性的耐受性/結瘤/細胞分裂(RND)家族的外排泵成員，更優選惡臭假單胞菌菌株S12的耐溶劑性泵srpABC。宿主細胞可以被遺傳改性以(過量)生產芳香酸，例如通過在芳香酸生物合成中過表達至少一種關鍵酶。
在一優選的具體實施方式
中，所利用的宿主細胞是假單胞菌屬，優選惡臭假單胞菌，更優選惡臭假單胞菌菌株S12。在另一優選的具體實施方式
中，所述宿主被用于生產CA、對羥基肉桂酸(PHCA)和PHB。
本發明進一步通過以下實施例進行說明。


圖1為DNA構建pTn-1和pJWpalTn的示意性表示。
所使用的縮寫nagR/PnagAa，用于萘降解的來自睪丸酮叢毛單胞菌(Comomonas testosteroni)的調節DNA序列；rep，用于復制功能的編碼；GmR，耐慶大霉素的標記；bla，耐氨芐西林的標記；Tn，轉錄終止子；bp，堿基對實施例實施例1將來自圓紅冬孢酵母菌的編碼苯丙氨酸解氨酶的核酸序列克隆到大腸埃希菌(E.coli)-惡臭假單胞菌表達質粒中，并轉化成大腸埃希菌和惡臭假單胞菌S12。
如Sarkissian等(1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 296)所述，將編碼苯丙氨酸解氨酶的DNA(pal基因；GenBank編號X51513)利用從圓紅冬孢酵母菌mRNA獲得的cDAN樣本采集的PCR進行擴增(放大)，其中利用了設計用于pal DNA的5’-和3’-端的寡核苷酸。與pal(寡1)的5’-端同源的寡核苷酸含有另外的Kpn.I限制[酶切]位點并且與pal(寡2)的3’-端同源的寡核苷酸含有另外的NotI限制[酶切]位點(參見表1)。
表1用于實施例1～4中描述的de DNA擴增的寡核苷酸的核酸序列

PCR-擴增的pal基因用Kpnl和NotI消化，并連接(結合)到也已經用Kpnl和NotI消化的質粒pTn-1中(圖1)。這會產生DNA結構pJWpalTn(圖1)，其中pal基因在控制可誘導調節序列nagR/PnagAa下被放置(Hüsken等2001.Appl.Microbiol.Biotechnol.55571-577)。下文中，這種結構稱為nagR/PnagAa::pal盒(cassette)。
PJWpalTn通過標準的轉化步驟被引入到大腸埃希菌和惡臭假單胞菌S12宿主細胞中。經遺傳設計以表達苯丙氨酸解氨酶的惡臭假單胞菌S12稱為S12pal。宿主細胞在選擇性壓力(用于大腸埃希菌的氨芐西林和用于惡臭假單胞菌S12的慶大霉素)下進行培養以確保宿主細胞保持該質粒。
實施例2耐間-氟苯丙氨酸的惡臭假單胞菌S12pal突變體的樣本采集的形成以及篩選具有增加CA和PHCA的突變體。
對S12pal中苯丙氨酸和酪氨酸的可獲得性加以優化，以改進CA和PHCA的生產。由現有技術(本領域)可知，毒性苯丙氨酸類似物(例如間-氟-苯丙氨酸)能夠被用來選擇過量生產苯丙氨酸和/或酪氨酸的突變體。將這種方法用于本發明以獲得優化了CA和PHCA生產的生產菌株。將S12pal通過用誘變劑NTG處理而進行誘變突變，以獲得一罐(堆，bank)20,000的耐間-氟苯丙氨酸的突變體。
隨后檢測該罐中的突變體過量生產CA和PHCA的能力(與親代菌株S12pal相比較)。所有突變體的培養基在波長278nm和310nm處的吸光度分別確定為CA和PHCA的相對檢測值。選擇表現出增加或者CA或者PHCA的產量的不同突變體。對一個CA過量生產突變體(稱為S12pal1)和一個PHCA過量生產突變體(稱為S12pal2)在生長期間從可再生碳源葡萄糖分別生產CA和PHCA(實施例4)進行了更詳細的檢測。
實施例3從一罐耐間-氟苯丙氨酸的S12pal突變體中選擇具有增加PHB產量的突變體。
在現有技術中已確定，惡臭假單胞菌能夠把PHCA轉化為PHB。PHB隨后能夠被這些細菌降解。這通過惡臭假單胞菌S12能夠在作為單一碳源的PHB上生長的事實加以舉例說明。為了選擇表現出增加PHB產量的S12pal突變體，將在實施例2中獲得的該罐耐間-氟苯丙氨酸的S12pal突變體首先篩選出不再能夠利用PHB進行生長的突變體。為此，將該罐的單個突變體被轉移到補加了作為單一碳源的20mM PHB的含水礦物培養基(Hartmans et al.1989.Appl.Environ.Microbiol.552850-2855)中。獲得了不再能夠在PHB上生長的不同突變體。對一種這樣的突變體(S12pal3)的從葡萄糖生產PHB(實施例4)進行更詳細的檢測。
實施例4通過間歇式(分批)培養的S12pal、S12pal1、S12pal2和S12pal3生產CA、PHCA和PHB為了確定分別由S12pal1、S12pal2、S12pal3和其親代S12pal的CA、PHCA和PHB產量，將這些菌株在含水礦物培養基(Hartmans et al.1989.Appl.Environ.Microbiol.552850-2855)中進行間歇式培養。這種培養基補加了20mM的葡萄糖和10mg/L的慶大霉素以確保質粒保持。為了將pal基因的表達誘導入功能性苯丙氨酸解氨酶，還補充了0.1mM的水楊酸鈉。作為用于S12pal中苯丙氨酸解氨酶活性源的對照，還測試了提供的具有pTn-1質粒而沒有pal基因的惡臭假單胞菌變異體。將所有菌株在存在或缺少1mM外源加入的苯丙氨酸或酪氨酸下進行培養。利用高效液相色譜(HPLC)在不同時間點對培養基上清液中的CA、PHCA和PHB的水平(濃度)進行確定。另外，通過在不同時間點確定培養基中總細胞蛋白質含量來對細胞生長進行監控。
另外，在不同時間點從培養基制備S12pal的無細胞抽提物(無細胞提取物，cell free extract)，用于分析蛋白含量和苯丙氨酸解氨酶活性。至此，在向無細胞抽提物加入1mM的苯丙氨酸或1mM的酪氨酸之后，利用HPLC在不同時間點確定CA和PHCA的形成。
這些檢測的結果用于確定用于CA、PHCA和PHB生產的以下參數(參見表2)—在培養基或無細胞抽提物中的最大濃度
—在培養基或無細胞抽提物中生產的最大比速率。
表2用編碼苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因遺傳改性的惡臭假單胞菌S12的突變體，在間歇式培養基和無細胞抽提物中的CA、PHCA和PHB的生產

a)CVE，無細胞抽提物；S12對照，具有載體pTn-1的惡臭假單胞菌S12；S12pal，具有構造(結構)pJWpalTn的惡臭假單胞菌S12；S12pal1，源自為CA過量生產選擇的S12pal的耐間-氟苯丙氨酸的突變體；S12pal2，為PHCA過量生產選擇的耐間-氟苯丙氨酸的突變體，S12pal3，為PHB超量生產選擇的耐間-氟苯丙氨酸的突變體，+fen.，加入了1mM的苯丙氨酸；+tyr，加入了1mM的酪氨酸。
b)在培養基或CVE中通過HPLC確定的在對羥基肉桂酸中的CA的最大濃度。
c)最大比生產速率被定義為在培養基或CVE中每分鐘每克細胞蛋白累積的CA、PHCA或PHB的最大量(單位微摩爾)。Nd＝未檢測到。
權利要求
1.一種用于在微生物宿主細胞中從可再生碳源酶促生產芳香酸的方法，其中所述宿主細胞包括用于所述芳香酸的外排泵。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述外排泵是質子依賴性的耐受性/結瘤/細胞分裂(RND)家族的外排泵成員，優選耐溶劑泵，更優選惡臭假單胞菌菌株S12的耐溶劑泵srpABC。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述宿主細胞是假單胞菌屬，優選惡臭假單胞菌，更優選惡臭假單胞菌菌株S12。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞表達或過表達至少一種涉及所述芳香酸生物合成的酶。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞被遺傳改性以生產或過量生產所述芳香酸或其前體。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述芳香酸選自由肉桂酸、對羥基肉桂酸和對羥基苯甲酸組成的組。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述宿主細胞過表達苯丙氨酸解氨酶(PAL)，優選具有酪氨酸解氨酶(TAL)活性的PAL。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中通過篩選耐受芳香氨基酸的毒性類似物的突變體來選擇用于增加苯丙氨酸和/或酪氨酸積累的所述宿主細胞。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述可再生碳源選自由單糖、寡糖、多糖、多元醇、甲醇、甲醛、甲酸鹽以及含碳胺類組成的組，優選為葡萄糖和甘油。
10.一種用于提供過量生產芳香酸的宿主細胞的方法，包括將PAL/TAL活性引入到宿主細胞種群中；使所述種群發生隨機突變；選擇增加了間-氟苯丙氨酸耐受性的突變體宿主細胞；篩選增大了芳香酸產量的所述選擇的宿主細胞；以及選擇至少一種突變的宿主細胞，其與沒有發生隨機突變的親代宿主細胞相比能過量生產所述芳香酸。
11.一種宿主細胞，其可通過根據權利要求10所述的方法獲得。
12.根據權利要求11所述的宿主細胞，其中至少一種涉及所述芳香酸的降解的酶失活或其中所述芳香酸生物合成的代謝副途徑失活。
13.宿主細胞用于從可再生碳源微生物生產芳香酸的應用，其中所述宿主細胞包括外排泵，優選質子依賴性的耐受性/結瘤/細胞分裂(RND)家族的外排泵成員，更優選惡臭假單胞菌菌株S12的耐溶劑泵srpABC。
14.根據權利要求13所述的應用，其中所述宿主細胞是假單胞菌屬，優選惡臭假單胞菌，更優選惡臭假單胞菌菌株S12。
15.根據權利要求13或14所述的應用，其中所述芳香酸是肉桂酸、對羥基肉桂酸和對羥基苯甲酸。
全文摘要
本發明涉及利用可再生碳源(如糖類)的酶促生產芳香酸。本發明提供了用于由可發酵碳源微生物生產芳香酸的方法，其中利用能夠生產所述芳香酸(例如肉桂酸、對羥基肉桂酸和對羥基苯甲酸)并且包括用于所述芳香酸的外排泵的宿主細胞。優選的宿主細胞包括質子依賴性的耐受性/結瘤/細胞分裂(RND)家族的外排泵成員，優選惡臭假單胞菌菌株S12的耐溶劑泵srpABC。
文檔編號C12R1/40GK1957087SQ200480043170
公開日2007年5月2日 申請日期2004年12月23日 優先權日2004年4月21日
發明者揚·韋里 申請人:荷蘭應用科學研究會(Tno)