專利名稱：包含與Ⅱ型糖尿病有關的單核苷酸多態性的多核苷酸、包含該多核苷酸的微陣列和診斷 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及與II型糖尿病有關的多核苷酸，包含該多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒，和分析與II型糖尿病有關的多核苷酸的方法。
背景技術：
所有生物體的基因組在它們持續進化的過程中經受自發突變，產生先祖核酸序列(progenitor nucleic acid sequences)的變體形式(Gusella，Ann.Rev.Biochem.55，831-854(1986))。所述變體形式可賦予相對于先祖形式的進化優點或缺點，或可為中性形式(neutral)。在一些情況中，變體形式賦予致死的缺點，并且不遺傳到該生物體的后代。在另外的情況中，變體形式將進化優點賦予物種，并最終整合入該物種大多數成員的DNA中且有效地變為祖先形式。在許多情況中，祖先及變體形式都幸存并在物種的種群中共存。序列的多種形式的共存引起多態性。
已知幾種不同類型的多態性(polymorphisms)，包括限制性片段長度多態性(RFLPs)、短串聯重復(STRs)、可變數串聯重復(VNTRs)和單核苷酸多態性(SNPs)。其中，SNPs具有相同物種的個體之間單核苷酸變異的形式。當SNPs在蛋白編碼序列中發生時，任一種多態性形式可引起缺陷或變體蛋白的表達。在另一方面，當SNPs在非-編碼序列中發生時，這些多態性中的一些可導致缺陷或變體蛋白的表達(例如，作為缺陷剪接(defective splicing)的結果)。其他的SNPs可以完全不具有表型效應(phenotypic effect)。
已知人SNPs以大約1,000bp中1個的頻率發生。當這樣的SNPs誘導表型的表達，如疾病時，含有該SNPs的多核苷酸可用作診斷疾病的引物或探針。特異性地與該SNP結合的單克隆抗體也可用于診斷疾病。目前，SNPs的核苷酸序列和功能的研究正由許多研究所進行。鑒定出的人SNPs的核苷酸序列和其他實驗結果已經制成數據庫以使其便于獲得。
雖然迄今可利用的發現顯示，具體的SNPs存在于人基因組或cDNAs上，但還沒有揭示出所述SNPs的表型效應。除去少量的SNPs之外，大多數SNPs的功能也還沒有公開。
已知糖尿病患者總數的90-95％罹患II型糖尿病。II型糖尿病是這樣的病癥，其在異常產生胰島素或對于胰島素具有低敏感性的患者中發生，由此導致血糖水平的巨大變化。當胰島素分泌的紊亂導致II型糖尿病的條件時，不能將血糖轉移到體細胞，這使得食物向能量的轉化變得困難。已知遺傳原因在II型糖尿病中起作用。II型糖尿病的其它危險因子是年齡超過45、糖尿病肥胖癥(obesity)、高血壓(hypertension)和高膽固醇水平(high cholesterol level)的家族史(familial history)。目前，主要通過使用空腹血糖(fasting blood glucose)(FSB)測試、口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)等測定病理的表型改變，即，血糖水平來進行糖尿病的診斷[National Institute of Diabetes和Digestive和KidneyDiseases of the National Institutes of Health，http://www.niddk.nih.gov，2003]。當作出II型糖尿病的診斷時，通過鍛煉、特殊飲食、體重控制、藥物治療等可預防II型糖尿病或可延遲其發病。在這點上，可以說II型糖尿病是一種非常需要早期診斷的疾病。Millenium Pharmaceuticals Inc.報道可根據HNF1基因上存在的基因型變異(genotypic variations)來進行II型糖尿病的診斷和預測[PR newswire，Sept 1，1998]。Sequenom Inc.報道FOXA2(HNF3β)基因與II型糖尿病高度相關[PR Newswire，Oct 28，2003]。雖然有關于與II型糖尿病有關的一些基因的報道，但是已將發生II型糖尿病的研究集中在特定人群中一些染色體的特定基因上。為此，研究結果可根據人的種類變化。此外，還沒有鑒定出造成II型糖尿病原因的所有成因基因(causative gene)。通過所述的分子生物技術來診斷II型糖尿病現在是罕見的。另外，在II型糖尿病發病前的早期診斷目前是不可行的。因此，越來越需要找到新的與II型糖尿病高度相關的SNPs和存在于整個人基因組中的相關基因，并需要使用所述的SNPs和相關基因進行II型糖尿病的早期診斷。
發明詳述本發明的技術目標本發明提供了含有與II型糖尿病有關的單核苷酸多態性的多核苷酸。
本發明也提供了微陣列和II型糖尿病診斷試劑盒，其每個包括含有與II型糖尿病有關的單核苷酸多態性的多核苷酸本發明也提供了分析與II型糖尿病有關的多核苷酸的方法。
本發明的公開本發明提供了用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸，其包括選自核苷酸序列SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列的至少10個連續的核苷酸，并包括在所述核苷酸序列的多態性位點(第101位)的核苷酸，或其互補多核苷酸。
所述多核苷酸包括含有核苷酸序列的多態性位點的至少10個核苷酸的連續跨度(span)，所述核苷酸序列選自SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列。所述多核苷酸長度為10至400個核苷酸，優選10至100個核苷酸，而且更優選10至50個核苷酸。在此，SEQ ID NOS1-80中每個核苷酸序列的多態性位點位于101位。
SEQ ID NOS1-80的每個核苷酸序列是多態性序列。該多態性序列指含有多態性位點的核苷酸序列，在該多態性位點處發生單核苷酸多態性(SNP)。所述多態性位點指多態性序列的位置，在該位置發生SNP。所述核苷酸序列可為DNAs或RNAs。
在本發明中，SEQ ID NOS1-80的多態性序列的多態性位點(第101位)與II型糖尿病相關。這通過源自II型糖尿病患者和正常人的血樣的DNA序列分析得到確認。SEQ ID NOS1-80的多態性序列與II型糖尿病的關聯和所述多態性序列的特點總結于表1-1、1-2、2-1和2-2。
表1-1
表1-1(續)
表1-2
表1-2(續)
表2-1
表2-1(續)
表2-2
表2-2(續)
在表1-1和1-2中，欄中的內容定義如下。
-Assay ID代表標記物名稱。
-SNP為SNP多態性位點的多態性堿基。此處，A1和A2分別代表低頻等位基因(low mass allele)和高頻等位基因(high mass allele)，作為根據同源MassEXTEND(hME)技術(Sequenom)序列分析的結果，并為了實驗的方便任意地設計。
-SNP序列代表含有SNP位點的序列，即，在101位含有等位基因A1或A2的序列。
-在等位基因頻率欄，cas_A2、con_A2和Delta分別代表病例組的等位基因A2頻率、正常組的等位基因A2頻率和cas_A2與con_A2之差的絕對值。此處，cas_A2為病例組中的(基因型A2A2頻率×2+基因型A1A2頻率)/(樣品數×2)，而con_A2為正常組中的(基因型A2A2頻率×2+基因型A1A2頻率)/(樣品數×2)。
-基因型頻率代表每種基因型的頻率。此處，cas_A1A1、cas_A1A2和cas_A2A2分別為病例組中具有基因型A1A1、A1A2和A2A2的個體的數目，而con_A1A1、con_A1A2和con_A2A2分別為正常組中具有基因型A1A1、A1A2和A2A2的個體的數目。
-df＝2代表具有兩個自由度的chi-平方值。chi-value代表chi-平方值，p-值基于chi-值確定。Chi_exact_p-Value代表卡方檢驗(chi-square test)的Fisher精確檢驗的p值。當基因型的數目小于5時，卡方檢驗的結果可能不準確。在這點上，需要通過Fisher精確檢驗確定更準確的統計顯著性(p-值)。Chi_exact_p-Value是在Fisher精確檢驗中使用的變量。在本發明中，當p-值≤0.05時，認為病例組的基因型與正常組的不同，即，病例組和正常組之間有顯著的區別。
-在危險等位基因欄，當參考等位基因是A2而且病例組的等位基因A2頻率大于正常組的等位基因A2頻率(即，cas_A2＞con_A2)時，就把等位基因A2看作危險等位基因。而在相反的情況下，則把等位基因A1看作危險等位基因。
-優勢率(odd ratio)代表病例組中危險等位基因的可能性與正常組中危險等位基因的可能性的比例。在本發明中，使用Mantel-Haenszel優勢率方法。CI代表優勢率的95％置信區間，并通過(置信區間的下限，置信區間的上限)表示。當1落在置信區間內時，認為危險等位基因與疾病的關聯不顯著。
-HWE代表Hardy-Weinberg平衡。此處，con_HWE和cas_HWE分別代表正常組和病例組中相對于Hardy-Weinberg平衡的偏差度。基于卡方檢驗(df＝1)中chi_值＝6.63(p-值＝0.01，df＝1)，把大于6.63的值看作Hardy-Weinberg不平衡(HWD)，而小于6.63的值看作Hardy-Weinberg平衡(HWE)。
-Call rate代表可以對其基因型進行解釋的樣品的數目比實驗中應用的樣品總數。此處，cas_call_rate和con_call_rate分別代表病例組和正常組中可解釋基因型的樣品的數目與應用的樣品總數(300個體)的比例。
表1和2顯示了基于NCBI build 123的SNP標記物的特性。
如表1-1、1-2、2-1和2-2所示，根據本發明的SEQ ID NOS1-80的多態性標記物的卡方檢驗，chi_exact_p-Value在95％置信區間內的4.54×10-4-0.0104范圍內。這顯示，在SEQ ID NOS1-80的多態性標記物中，等位基因發生頻率的期望值和測量值之間有顯著的差異。優勢率范圍為1.34-2.43，這顯示SEQID NOS1-80的多態性標記物與II型糖尿病有關。
本發明的SEQ ID NOS1-80的SNPs以顯著的頻率在II型糖尿病患者組和正常組中發生。因此，本發明的多核苷酸可以有效地應用于II型糖尿病的診斷、指紋分析(fingerprinting analysis)和治療。具體地，本發明的多核苷酸可用作診斷II型糖尿病的引物或探針。此外，本發明的多核苷酸可用作治療II型糖尿病的反義DNA或組合物。
本發明也提供了等位基因特異性的用于診斷II型糖尿病的多核苷酸或其互補體，其與包括至少10個核苷酸的連續跨度的多核苷酸雜交，其含有選自核苷酸序列SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列的多態性位點的核苷酸。
等位基因-特異性的多核苷酸指特異性地與每個等位基因雜交的多核苷酸。即，等位基因-特異性的多核苷酸具有在SEQ ID NOS1-80的多態性序列中區分多態性位點的核苷酸，并特異性地與每個這樣的核苷酸雜交的能力。雜交在嚴謹條件下進行，例如，1M或更小的鹽濃度和25℃或更高的溫度。例如，5×SSPE(750mM NaCl，50mM Na磷酸鹽，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的條件對于等位基因-特異性探針雜交是適合的。
在本發明中，等位基因-特異性的多核苷酸可為引物。如本文所使用的，術語“引物”指單鏈寡核苷酸，其在合適的條件下，例如，在包含四種不同的三磷酸核苷和聚合酶如DNA或RNA聚合酶或逆轉錄酶的緩沖液中以及合適的溫度下，作為模板-指導的進行DNA合成的起始點。所述引物的合適長度可根據使用目的變化，通常為15-30個核苷酸。通常，較短的引物分子需要較低的溫度以與模板形成穩定的雜交體。引物序列不需要與模板完全互補，但必須足夠互補以與模板雜交。優選地，引物的3’-末端與SEQ ID NOS1-80的每個多態性位點(第101位)的核苷酸對比(align)。引物與含有多態性位點的目標DNA雜交并開始等位基因擴增(allelic amplification)，其中引物呈現與目標DNA的完全同源性。引物是成對使用，其第二個引物與相反鏈雜交。擴增產物通過使用兩條引物擴增得到，其意味著有特異性的等位基因形式。本發明的引物包括用于連接酶鏈式反應(LCR)的多核苷酸片段。
在本發明中，等位基因-特異性的多核苷酸可為探針。如本文所使用的，術語“探針”指雜交探針，即，能夠序列-特異性地與核酸的互補鏈結合的寡核苷酸。這樣的探針可為肽核酸，如由Nielsen等在Science 254，1497-1500(1991)中公開的。根據本發明的探針是等位基因-特異性的探針。在這點上，當在源自相同物種的兩個成員的核酸片段中有多態性位點時，所述的探針與源自一個成員的DNA片段雜交，而不與源自另一個成員的DNA片段雜交。在此情況下，雜交條件應足夠嚴謹以允許通過等位基因之間雜交強度的顯著差異而只與一個等位基因雜交。優選地，探針的中部，即15個核苷酸的探針的第7位，或16個核苷酸的探針的第8或第9位，與SEQ ID NOS1-80的核苷酸序列的每個多態性位點對應。因此，可引起等位基因之間雜交中的顯著差異。本發明的探針可用于檢測等位基因的診斷方法中。所述診斷方法包括基于核酸雜交的檢測方法，例如，southern印跡。在將DNA芯片用于基于核酸雜交的檢測方法的情況中，可以作為在DNA芯片的基板上固定的形式提供探針。
本發明也提供了用于診斷II型糖尿病的微陣列，其包括本發明的多核苷酸或其互補的多核苷酸。微陣列的多核苷酸可以為DNA或RNA。所述的微陣列除了包括本發明的多核苷酸外，與普通的微陣列相同。
本發明也提供了包括本發明的多核苷酸的II型糖尿病診斷試劑盒。該II型糖尿病診斷試劑盒除包括本發明的多核苷酸之外，可包括聚合所必需的試劑，例如，dNTPs、各種聚合酶和著色劑。
本發明也提供了在個體中診斷II型糖尿病的方法，其包括將核酸樣品從所述的個體分離；和測定SEQ ID NOS1-80的多核苷酸或其互補多核苷酸中至少一個多態性位點(第101位)的核苷酸。此處，當樣品核酸的至少一個多態性位點的核苷酸與表1-1、1-2、2-1、2-2、3、4和5中顯示的至少一個危險等位基因相同時，可確定該個體具有較高的可能性被診斷為有發生II型糖尿病的危險。
將核酸樣品從所述的個體中分離的步驟可通過常規的DNA分離方法進行。例如，可通過使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目標核酸然后純化來獲得核酸樣品。除PCR之外，可以應用LCR(Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等，Science 241，1077(1988))、轉錄擴增(transcription amplification)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989))、自動維持序列擴增(self-sustained sequence replication)(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874(1990))或基于核酸序列的擴增(NASBA)。后兩種方法與基于等溫轉錄的等溫反應相關，并產生30或100倍的RNA單鏈和DNA雙鏈作為擴增產物。
根據本發明的實施方案，測定多態性位點的核苷酸的步驟包括，將核酸樣品雜交到微陣列上并檢測雜交結果，在所述的微陣列上固定了用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸或其互補多核苷酸，所述多核苷酸包括源自核苷酸序列SEQ ID NOS1-80的至少10個連續核苷酸并包括多態性位點(第101位)的核苷酸。
微陣列和通過將探針多核苷酸固定在基板上來制備微陣列的方法在有關的技術領域中是熟知的。將本發明的與II型糖尿病相關的探針多核苷酸固定在基板上可使用常規方法容易地進行。核酸在微陣列上的雜交和雜交結果的檢測在有關的技術領域中也是熟知的。例如，可以通過用產生可檢測信號的標記物質，如熒光物質(例如，Cy3和Cy5)標記核酸樣品，將標記的核酸樣品雜交到微陣列上，并檢測由標記物質產生的信號來進行雜交結果的檢測。
根據本發明的另一個實施方案，作為測定多態性位點的核苷酸序列的結果，當檢測到至少一個選自SEQ ID NOS2.4，5，8，9，11，13，16，18，20，21，23，25，27，30，32，33，36，38，40，42，44，46，47，49，51，53，55，57，59，62，63，65，67，69，71，75，77，和80的含有危險等位基因的核苷酸序列時，可確定所述個體具有較高的可能性被診斷為處于發生II型糖尿病的危險中。如果在個體中檢測到更多危險等位基因的核苷酸序列，那么可以確定所述個體具有更高的可能性被診斷為處于發生II型糖尿病的危險中。
在下文中，將通過實施例更具體地描述本發明。然而，僅僅為了說明而提供如下的實施例，因此本發明并不局限于如下實施例。
本發明的效果本發明的多核苷酸可用于II型糖尿病的診斷、治療或指紋分析。
包括本發明的多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒可用于有效診斷II型糖尿病。
根據本發明分析與II型糖尿病有關的多核苷酸的方法可有效地檢測II型糖尿病的存在或危險。
本發明的優選實施方式實施例實施例1在此實施例中，DNA樣品提取自患者組和正常組的血流，所述患者組由已被診斷為II型糖尿病患者并正在治療中的300個韓國人組成，所述正常組由沒有II型糖尿病癥狀并且與患者組同年齡的300個韓國人組成，并評價特異性的SNPs的出現頻率。所述SNPs選自已知的數據庫(NCBI dbSNPhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)或(Sequenom:http://www.realsnp.com/)。與選擇的SNPs附近的序列雜交的引物用于測試DNA樣品中SNPs的核苷酸。
1.DNA樣品的制備DNA樣品從II型糖尿病患者和正常人的血流中提取。DNA提取根據已知的提取方法(Molecular cloningA Laboratory Manual，p 392，Sambrook，Fritsch和Maniatis，2nd edition，Cold Spring Harbor Press，1989)和由Centrasystem制造的商業試劑盒的說明書進行。在提取的DNA樣品中，只使用具有至少1.7的純度(通過A260/A280nm)的DNA樣品。
2.目標DNAs的擴增目標DNAs為包含待分析的SNP的預定的DNA區域，它們通過PCR擴增。PCR通過如下列條件的常規方法進行。首先，制備目標基因組DNAs。然后，制備下述PCR混合物。
水(HPLC級) 2.24μl10x緩沖液(15mM MgCl2，25mM MgCl2) 0.5μldNTP混合物(GIBCO)(每種25mM) 0.04μlTaq pol(HotStar)(5U/μl) 0.02μl正向/反向引物混合物(每種1μM)0.02μlDNA 1.00μl
總體積5.00μl此處，根據已知數據庫中SNP的上游和下游序列設計正向和反向引物。這些引物在下面的表3中列出。
PCR的熱循環如下在95℃溫育15分鐘；95℃ 30秒，在56℃ 30秒，和在72℃ 1分鐘進行45輪循環；在72℃溫育3分鐘并貯存于4℃。結果，得到擴增的DNA片段，其長度為200個或更少的核苷酸。
3.分析擴增的目標DNA片段中SNPs使用從Sequenom可得到的同源MassExtension(hME)技術來進行擴增的目標DNA片段中SNPs的分析。MassExtension技術的原理如下。首先，設計立即終止于目標DNA片段中SNPs之前的引物(亦稱為“延伸引物”)。然后，將引物與目標DNA片段雜交并進行DNA聚合。此時，聚合溶液含有一種試劑(例如ddTTP)，該試劑使聚合反應在摻入與第一個等位核苷酸(例如，A等位基因)互補的核苷酸之后立即終止。這樣一來，當第一個等位基因(例如，A等位基因)存在于目標DNA片段中時，得到的產物中只有與該第一個等位基因互補的核苷酸(例如，T核苷酸)從引物延伸。另一方面，當第二個等位基因(例如，G等位基因)存在于目標DNA片段中時，與該第二個等位基因互補的核苷酸(例如，C核苷酸)被添加到引物的3’-末端，然后引物被延伸直到加入與最接近的第一個等位核苷酸互補的核苷酸(例如，T核苷酸)為止。從引物延伸的產物的長度通過質譜法測定。由此，可以鑒定存在于目標DNA片段中的等位基因。實驗條件舉例如下。
首先，將未反應的dNTPs從PCR產物中去除。為此，加入1.53μl的去離子水，0.17μl的HME緩沖液，0.30μl的蝦堿性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase，SAP)并在1.5ml試管中混合以制備SAP酶溶液。將試管在5,000rpm離心10秒。此后，將PCR產物加入SAP溶液管，密封、在37℃溫育20分鐘然后85℃ 5分鐘，并貯存于4℃。
接著，使用擴增的目標DNA片段作為模板進行同源延伸。用于此延伸的反應溶液的組成如下。
水(納米級去離子水) 1.728μl
hME延伸混合物(含有2.25mMd/ddNTPs的10x緩沖液) 0.200μl延伸引物(每種100μM) 0.054μlThermosequenase(32U/μl) 0.018μl總體積 2.00μl將反應溶液與先前制備的目標DNA溶液徹底地混合，并進行spin-down離心。將含有產物混合物的試管或平板緊密地封好，在94℃溫育2分鐘，接著是94℃ 5秒、52℃ 5秒及72℃ 5秒40個循環的同源延伸，并貯存于4℃。所得到的同源延伸產物以樹脂(SpectroCLEAN)洗滌。用于延伸的延伸引物在下面的表3中列出。
表3用于擴增的引物和用于目標DNAs同源延伸的延伸引物
使用質譜法，MALDI-TOF(基質輔助的激光解吸和離子化-飛行時間法(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight))來檢測延伸產物中的多態性位點的核苷酸。MALDI-TOF根據如下原理操作。當將分析物暴露于激光束時，它與離子化的基質一起，在真空狀態下飛向位于相對側的檢測器。此時，計算分析物到達檢測器所花費的時間。具有越小質量的物質越快到達檢測器。根據這些DNA片段和SNPs的已知核苷酸序列之間的質量差異測定目標DNA片段中SNPs的核苷酸。
使用MALDI-TOF檢測目標DNAs多態性位點的核苷酸的結果表1-1、1-2、2-1和2-2中顯示。每個等位基因可以以個體中的純合子(homozygote)或雜合子(heterozygote)的形式存在。然而，給定種群中雜合子頻率與純合子頻率之間的分布不超過統計上的顯著性水平。根據孟德爾遺傳定律(Mendel’sLaw of inheritance)和哈迪-溫伯格定律(Hardy-Weinberg Law)，構成種群的等位基因的基因組成(genetic makeup)以恒定的頻率保持。當基因組成具有統計顯著性時，可認為它具有生物學意義。本發明的SNPs以統計上的顯著水平在II型糖尿病患者中出現，如表1-1、1-2、2-1和2-2中所示，并因此能夠有效地用于診斷II型糖尿病。
序列表<110>三星電子株式會社<120>包含與II型糖尿病有關的單核苷酸多態性的多核苷酸、包含該多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒以及使用它們分析多核苷酸的方法<130>PN058287<160>200<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1taaaaacaga tgggtgatcc cagtcctcta aatataatcg gggatgccaa atcttttcaa60agagaattca tatatacaac ttaaaggcca aggagcccaa ctcaatcaaa atttgagcca120ggatatgcta agttcaatca gcttgaatat gggcaaagtg taagacctag ccagcacttc180agatatatac agagaaccac a 201<210>2<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>2taaaaacaga tgggtgatcc cagtcctcta aatataatcg gggatgccaa atcttttcaa60agagaattca tatatacaac ttaaaggcca aggagcccaa ttcaatcaaa atttgagcca120ggatatgcta agttcaatca gcttgaatat gggcaaagtg taagacctag ccagcacttc180agatatatac agagaaccac a 201<210>3<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3gtctgttttt catgggataa tttttattga tctatatcca aattgaattt gaatatactt60tattcctatg taatctcctt tgtcctctca aagacattta attttttttt ccaatactgt120atttttccgt cctaaaattt ccatttgttt cttttatagt ttttatttta ttgctgagat180acttctatca tgtctttcac c 201<210>4
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<210>16<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>16taacaactta ccagttacta tattgacatt tatcaagtat tttctggagg tgatgcctta60gttgaaagat gagggaaaag ggaacatttc aggtataaag ccaggcgaga caggaagact120acagggcagg gagcctttcg cttccctaaa aactgcactg cagctgcaca aatcccatta180ctctgtcttc atgtatagga t 201<210>17<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>17tgttttaagt tctcaccttt cccatgatgc aacagagaca actatgtcag aattcagaaa60aacaaagatg aaaatgtaat atccatgaag aataagacaa atcaaattat atcatacctg120aaagaaacgg aattttgttt ttaaggcaaa caagatccag cagatataat ttttggctct180tttgccacat acaaatcact a 201<210>18<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>18tgttttaagt tctcaccttt cccatgatgc aacagagaca actatgtcag aattcagaaa60aacaaagatg aaaatgtaat atccatgaag aataagacaa gtcaaattat atcatacctg120aaagaaacgg aattttgttt ttaaggcaaa caagatccag cagatataat ttttggctct180tttgccacat acaaatcact a 201<210>19<211>201<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>19cacaacccac tgacctcagg tagacctgtg tgtgcctacc tgggcctctg cctacctggt60ttctcttctc tattttcttg ttagaggatc ccactcacct tgatatgtct gctcctggaa120cctgtccctt ggaatcaagg attctgaaga tccaggcctc ttaggcttat ctccactccc180
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<210>133<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>133acgttggatg ggtcttgaca tggtccaaag 30<210>134<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>134gaggatacaa cagggctgc 19<210>135<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>135acgttggatg gactgaaggt ggtgtttttc 30<210>136<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>136acgttggatg ccatcttctg ggattatagc 30<210>137<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>137aatctcaaac caaaagcaaa atta 24<210>138<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>138acgttggatg tgttgctgac aaggaacag29<210>139<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>139acgttggatg ctgggaataa tgtttagcca c 31<210>140<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>140tgacaaggaa cagcagaata g21<210>141<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>141acgttggatg ccttcattta ctctcccctg 30
<210>142<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>142acgttggatg cgacaggagt cttggatttg 30<210>143<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>143ttactctccc ctgcttttgg 20<210>144<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>144acgttggatg tgacaaagcc acactgggt29<210>145<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>145acgttggatg tacggtgaag gaggaggatc 30<210>146<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>146tcctggccca gggagcac18<210>147<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>147acgttggatg aaggaaccaa ctcaaaccag 30<210>148<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>148acgttggatg cgatatgctt aggttctgag 30<210>149<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>149ctcaaaccag gcagcaatga a21<210>150<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>150acgttggatg gctttttgcc ctcatgcatc 30<210>151
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>151acgttggatg ctactgagac aggagagaag 30<210>152<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>152gcatcattta ttctagccaa aac 23<210>153<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>153acgttggatg aagtaaacac ccatgaccag 30<210>154<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>154acgttggatg gcttgagatc ctgaatgaac 30<210>155<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>155agccacttga ggtgaagaga 20<210>156<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>156acgttggatg gtccaagact cacttctctc 30<210>157<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>157acgttggatg acccagtggt gttatagctc 30<210>158<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>158agactcactt ctctcttcac t21<210>159<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>159acgttggatg tgttcaaggg aaacagcatg 30<210>160<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>160acgttggatg ggagtggaca aaatgtaaag 30<210>161<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>161cagctcctag aaccaacaga 20<210>162<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>162acgttggatg tggaaagaga ttgcactgcc 30<210>163<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>163acgttggatg acaggctaat agcgtggttg 30<210>164<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>164cctcaatgta acaaggaca 19<210>165<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>165acgttggatg tgcctcttat ccaacatgag 30<210>166<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>166acgttggatg ggtgaagaat ggcttaaaag 30<210>167<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>167tcttatccaa catgagaatc ca 22<210>168<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>168acgttggatg taaggctgag gacatgttgc 30<210>169<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>169acgttggatg aaagaagtgg caaaggcagg 30<210>170<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>170gctctgtctt tatatgaat 19<210>171<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>171acgttggatg cttgcaccat tatcattgcc 30<210>172<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>172acgttggatg tcttaatggt catgcgtggg 30<210>173<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>173
ttgccaattt gcagatg 17<210>174<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>174acgttggatg gtctcataaa gcacaaccaa c 31<210>175<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>175acgttggatg gtcacttggt tctaaatgtg g 31<210>176<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>176aagcacaacc aactacatgc 20<210>177<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>177acgttggatg actacaggaa gaagaaacag 30<210>178<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>178acgttggatg ctctcgatca ctttggagac 30<210>179<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>179agaagaaaca gaaagtgtgt 20<210>180<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>180acgttggatg gttgctacag agaacagaag 30<210>181<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>181acgttggatg gttctcccct tagattgacc 30<210>182<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>182gagaacagaa gtaaaacca 19
<210>183<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>183acgttggatg tgactgttgt tagcagaggc 30<210>184<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>184acgttggatg ggtaactctc atagccaagg 30<210>185<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>185ttccagggga agctgtt 17<210>186<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>186acgttggatg ttctccgtga ctgtttcagc 30<210>187<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>187acgttggatg ggaaactacc ccacaagatg 30<210>188<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>188tgtttcagct ctgcccc 17<210>189<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>189acgttggatg gtctcccgag gagagaaatt 30<210>190<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>190acgttggatg ccctgaagtc taaataagat g 31<210>191<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>191tccttttagc ctagaagagc 20
<210>192<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>192acgttggatg gggaagactt aagcagaaac 30<210>193<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>193acgttggatg caatgcccag atgctcaatc 30<210>194<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>194tatttctctg taggggg 17<210>195<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>195acgttggatg atactacagt cctgacagag 30<210>196<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>196acgttggatg acttcttccc tccaaacctc 30<210>197<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>197tacagtcctg acagagtaaa at 22<210>198<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>198acgttggatg gctcactctt ctcaccaatg 30<210>199<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>199acgttggatg gttgccgagg catttgaaag 30<210>200<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>200ggctgcttcc cctccca 1權利要求
1.用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸，其包含選自核苷酸序列SEQID NOS1-80的核苷酸序列的至少10個連續的核苷酸，并包含在所述核苷酸序列的201位的核苷酸，或其互補多核苷酸。
2.用于診斷或治療II型糖尿病的多核苷酸，其與權利要求1的多核苷酸或其互補多核苷酸雜交。
3.權利要求1或2的多核苷酸，其長度為10至100個核苷酸。
4.權利要求1的多核苷酸，其為引物或探針。
5.用于診斷II型糖尿病的微陣列，其包含權利要求1的多核苷酸或其互補多核苷酸。
6.用于診斷II型糖尿病的試劑盒，其包含權利要求1的多核苷酸或其互補多核苷酸。
7.在個體中診斷II型糖尿病的方法，其包括(a)從個體中分離核酸樣品；和(b)在SEQ ID NOS1-80的多核苷酸或其互補多核苷酸中測定至少一個多態性位點(第101位)的核苷酸。
8.權利要求7的方法，其中測定至少一個多態性位點的核苷酸的步驟包括將所述核酸樣品在微陣列上雜交，在該微陣列上固定了權利要求1的多核苷酸或其互補多核苷酸；和檢測雜交結果。
9.權利要求7的方法，其中當檢測到至少一個選自SEQ ID NOS2.4，5，8，9，11，13，16，18，20，21，23，25，27，30，32，33，36，38，40，42，44，46，47，49，51，53，55，57，59，62，63，65，67，69，71，75，77，和80的含有危險等位基因的核苷酸序列時，可確定所述個體具有較高的可能性被診斷為處于發生II型糖尿病的危險中。
全文摘要
本發明提供了用于診斷或治療Ⅱ型糖尿病的多核苷酸，其包括選自核苷酸序列SEQ ID NOS1－80的核苷酸序列的至少10個連續的核苷酸，并包括在所述核苷酸序列的101位的核苷酸，或其互補多核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK1961074SQ200480042089
公開日2007年5月9日 申請日期2004年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者李圭祥, 金載洽, 樸卿希, 李娟受, 孫玉慶, 趙志榮, 樸娟雅, 洪性宇, 黃貞周, 全涍廷 申請人:三星電子株式會社