專利名稱：：具有降低的飽和脂肪酸水平的轉基因植物及其制備方法
技術領域：
：本發明大致涉及轉基因植物領域。更具體而言，本發明涉及用于改變植物中脂肪酸代謝，用于降低由這種植物制備的種子油的飽和脂肪酸含量的分子技術。該技術例如在由產油植物獲得具有提高了營養價值的種子油的商業生產中具有實用性。
背景技術：
：為了研制出用于特殊目的而設計的植物油，改變植物中脂肪酸(FA)代謝已引起極大的興趣。油的性質由影響營養成份和氧化穩定性的其脂肪酸組成決定。在各種類型的脂肪和油中，飽和FA的水平是主要的健康關注點。因此，在市場上提供具有較低的飽和FA含量的植物油已變得越來越緊迫。在大部分植物油中飽和脂肪酸的主要組成為16:0(棕櫚酸)和18:0(硬脂酸)。在植物油市場，具有小于7％飽和FA含量的油可以標為“低脂”，而具有小于3.5％飽和FA含量的油可以標為“無脂”。蕓苔(Brassicanapus)種子油的飽和脂肪酸一般較低，但是也難以使飽和脂肪酸水平低于界限為7％飽和FA含量的“低脂”。之前，為了解決上述問題，已經進行了嘗試。例如，已經制備了包含參與脂肪酸代謝的異種植物基因的轉基因植物(參見如ShahS，WeselakeR(2003)FarmingFortheFuture，AARIproject#19990032，FinalReport，pp.1-82；和Yao等人，PlantBiotechJ2003，1221)。然而，這些轉基因植物顯示轉基因植物中飽和脂肪酸少量下降或沒有下降。例如，Yao等人(2003)報道了與擬南芥(Arabidopsis)的ADS1基因在雪里紅(B.juncea)種子中的表達相關的1～2％飽和FA水平的下降。在本文中，原核基因提供了一種引人注目的對植物基因的替代，然而，原核蛋白在植物背景中經常表現有限的活性或沒有活性(參見如，HahnJJ，EschenlauerAC，NarrolMH，SomersDA，SriencF(1997)Growthkinetics，nutrientuptake，andexpressionoftheAlcaligenesentrophuspoly(β-hydroxybutyrate)synthesispathwayintransgenicmaizecellsuspensioncultures.BiotechProg13347-354)。先前已經說明，可以通過制備表達異種Δ-6去飽和酶(得自于藻青菌、琉璃苣或月見草)的轉基因植物，以實現亞油酸(C18Δ9，12)、聚不飽和脂肪酸轉化為γ-亞油酸(GLA，C18Δ6，9，12)來提高植物種子油的營養價值(參見美國專利第5552306、5614393、5663068、5789050、6355861、6683232號，和美國專利申請公開第20040078845號)。亞油酸(C18Δ9，12)為基本飲食成分，其不能被脊椎動物合成且通常由植物來源獲取；脊椎動物細胞可以在脂肪酸的Δ-9位置引入雙鍵，但是不能在脂肪酸鏈的Δ-9雙鍵和甲基端之間引入另外的雙鍵。哺乳動物可以將亞油酸轉化為γ-不飽和酸(GLA，C18Δ6，9，12)，其然后可以被轉化為多數前列腺素的基本前體花生四烯酸(20:4)。因此，仍然需要能夠提供具有較低的飽和脂肪酸水平的種子油的轉基因植物。
發明內容本發明提供降低由植物制備的種子油中飽和脂肪酸水平的分子技術。具體地，本發明的分子技術以對降低由所述的植物制備的種子油中飽和脂肪酸含量有效的水平，在植物中表達具有Δ-9去飽和酶活性的酶(即，其使脂肪酸在Δ-9位置去飽和)。所以，在本發明的一個技術方案中提供了一種包括與內質網駐留和回收信號(endoplasmicreticulumretentionandretrievalsignal)序列可操作地連接的來自于原核生物的Δ-9去飽和酶的重組多肽。所述的Δ-9去飽和酶來自于原核生物，例如藻青菌，如藍細菌(Anacystisnidulans)。在實施方案中，所述的Δ-9去飽和酶包括(a)具有SEQIDNo.列出的氨基酸序列的多肽；(b)與(a)中所限定的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)所限定的多肽的變異體或同源物；(c)與(a)中限定的多肽具有至少50個相同的連續氨基酸，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)中所限定的多肽的片斷。在一個實施方案中，所述的Δ-9去飽和酶包括具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列的多肽，且內質網膜駐留和回收信號具有氨基酸序列KKSS(SEQIDNo.5)。本發明還提供編碼如上所限定的重組多肽的核酸分子；包括與啟動子可操作地連接的所述核酸分子的載體；用這種載體轉化的宿主細胞；和一種轉基因植物細胞包括包含與導致重組多肽在所述的轉基因植物細胞中表達的啟動子可操作地連接的上述核酸分子的轉基因元件。本發明進一步提供一種制備轉基因植物的方法，包括(a)用上述核酸分子或包括這種核酸的載體轉化植物細胞，其中，所述的核酸與實現重組多肽在所述的植物細胞中表達的啟動子可操作地連接；和(b)由步驟(a)中制備的轉化植物細胞再生植株。本發明還提供了一種轉基因植物，該轉基因元件包括包含與導致重組多肽在所述的轉基因植物中表達的啟動子可操作地連接的上述核酸分子的轉基因元件。與相同種類的野生型植物相比，本發明的轉基因植物和植物細胞例如在具有降低的飽和脂肪酸含量的種子油的生產中具有實用性。具體實施例方式作為本發明的實施例，本發明的中請人開發了轉基因蕓苔植物，與目前市售的品種相比，證明了飽和脂肪酸百分含量約下降了40％。這是通過在蕓苔植物中表達包括與內質網(ER)回收和駐留信號KKSS(SEQIDNo.5)融合的SEQIDNo.2的Δ-9去飽和酶的重組多肽實現的。申請人發現，融合到KKSS(SEQIDNo.5)的Δ-9去飽和酶的表達使蕓苔種子油的飽和FA含量顯著下降，而單獨的去飽和酶基因(即，沒有融合到KKSS(SEQIDNo.5))在降低蕓苔種子油的飽和脂肪酸水平上不是很有效。與從野生型蕓苔得到的種子油的約7.2％飽和脂肪酸含量相比，這里描述的轉基因蕓苔品系含有低至約4.3％的飽和脂肪酸。在這些品系中，蕓苔中主要的飽和脂肪酸(16:0和18:0)均降低。在本文中，脂肪酸中雙鍵的位置由在符號“Δ(delta)”后從羧基端到具有雙鍵的碳的碳數表示。雙鍵總數在總碳數之后的冒號后表示。例如，亞油酸表示為18:2Δ9，12，其由下面的結構式表示CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH。但是，本領域中也使用其它命名脂肪酸的習慣，如，雙鍵的位置可以由在符號“ω(omega)”后從脂肪酸的甲基端到具有雙鍵的碳的碳數表示。在本文中，“本發明的多肽”為具有與內質網駐留和回收信號序列可操作地連接的、來自于原核生物的Δ-9去飽和酶的重組多肽。在本文中，“本發明的核酸分子”為編碼本發明的多肽的重組核酸分子。在本文中，“野生型”植物或植物細胞為未經改造以表達本發明的多肽的植物或植物細胞。在本文中，“Δ-9去飽和酶活性”指在飽和脂肪酸的Δ-9位置引入雙鍵的能力，如16:0、18:0、20:0或22:0飽和脂肪酸或其任意組合。術語“重組體”指某物已被重組，所以當對于核酸構建體時，該術語指包括通過分子生物學技術連接或構建的核酸序列的分子。當對于蛋白質或多肽時，術語“重組體”指使用通過分子生物學技術構建的重組核酸構建體表達的蛋白質或多肽分子。當對于遺傳組成時，術語“重組體”指具有親代基因組中沒有出現的新的等位基因組合的配子、后代、細胞或基因組。重組核酸構建體可以包括連接到、或被處理而連接到核酸序列的核苷酸序列，該核苷酸序列在自然界不與核酸序列連接，或該核苷酸序列在自然界于不同的位置與核酸序列連接。所以，對于構建為“重組體”的核酸，是指已經使用基因工程，即通過人介入處理的核酸分子。重組核酸構建體可以如通過轉化引入宿主細胞。這種重組核酸構建體可以包括來源于相同的宿主細胞物種或不同的宿主細胞物種的序列，其已被分離并再引入到宿主物種的細胞中。作為宿主細胞的初始轉化結果，或者作為隨后的重組和/或修復事件的結果，重組核酸構建體序列可以整合到宿主細胞基因組中。Δ-9去飽和酶本發明的實施例中使用的Δ-9去飽和酶來源于藍細菌，其為一種藻青菌(Ishizaki-Nishizawa等人，1996)且具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列。這種蛋白質在與脂質結合的飽和脂肪酸的Δ-9位置引入順式雙鍵(或去飽和)。它對于16:0脂肪酸具有較高的特異性，但也使如18:0的較大的飽和脂肪酸去飽和。在Nishizawa等人的美國專利第6,043,411號、在NatureBiotechnology141003-1006中詳細描述了該蛋白，并以入藏登記號X77367在EMBLGeneBank中登記，所有這些參考文獻在這里作為參考。編碼該去飽和酶的基因這里指“來源于藍細菌的des9(SEQIDNo.1)”，但在本領域有時稱為DSG基因。從其它原核來源得到的Δ-9去飽和酶可以用于本發明。例如，在本發明中可能有用的Δ-9去飽和酶的合適的原核來源包括但不限于細菌，如屬于水花微囊藻屬、粗集胞屬(Synechocystis)、魚腥藻屬、隱球藻屬(Aphanocapsa)、鞭枝藻屬(Mastigocladus)、菱形藻屬(Nitzchia)、聚球藻屬(Synechococcus)和螺旋藻屬的藻青菌。高等植物含有16:0FA的量大于18:0FA。所以，具有與16:0FA底物高親和力的Δ-9去飽和酶優選用于實施本發明。本發明多肽的Δ-9去飽和酶成分可以是天然Δ-9去飽和酶的變異體，例如缺失，包括平截和片斷；插入和添加，包括標記多肽和融合蛋白；和替代，如定位突變體和等位變異體。例如可以通過替代、去除或添加天然Δ-9去飽和酶或其片斷中的一個或多個氨基酸殘基，并篩選生物活性來制備變異體。用于實施本發明的合適的變異體可以具有如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的與天然去飽和酶的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性。Δ-9去飽和酶還可以是已知Δ-9去飽和酶(如來自于藍細菌的Δ-9去飽和酶SEQIDNo.2))的同源物。可以使用標準分子生物學技術或通過尋找存放在遺傳數據庫中的同源序列而鑒定同源物。用于實施本發明的合適的同源物可以具有如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的與天然去飽和酶(如來自于藍細菌的Δ-9去飽和酶(SEQIDNo.2))的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性。用于實施本發明的合適的片斷可以具有至少50個與天然Δ-9去飽和酶相同的連續氨基酸，且具有Δ-9去飽和酶活性。例如，合適的片斷可以具有至少約50、100、150、200或250個與天然Δ-9去飽和酶相同的連續氨基酸。內質網駐留和回收信號在產油植物中，脂質結合脂肪酸的油合成和去飽和發生在細胞的ER中，尤其是種子中細胞的ER中。因此，通過將酶定位于ER可以提高在真核細胞中參與脂肪酸代謝的原核酶(如去飽和酶)的活性。在真核細胞中，許多跨膜蛋白被加工并轉運到細胞表面。通過向所述蛋白質中加入適當的信號序列可以在內質網(ER)中回收并駐留這些蛋白質中的一些。例如，下面的氨基酸序列可以起到ER駐留和回收信號序列的作用(a)KDEL(SEQIDNo.4(參見，如VandenBroeck等人，(1985)Nature313，358；和Michaelis等人，(1982)Ann.Rev.Microbiol.36，425)；(b)KKXX(SEQIDNo.3)，其中，X為任一氨基酸，特別是KKSS(SEQIDNO5)(Vincent等人，(1998)J.Biol.Chem.273950-6)；(c)HDEF(SEQIDNo.6)(LehmannK.等人。(2001)PlantPhysiol.Oct；127(2)436-49)；(d)KEEL(SEQIDNo.7)和KDQL(SEQIDNo.8)(ManabuMurakami，TakayoshiOhba，FengXu，SeijiShida，EisakuSatoh，KyoichiOno，IchiroMiyoshi，HiroyukiWatanabe，HiroshiIto，和ToshihikoIijima“GenomicorganizationandfunctionalanalysisofmurinePKD2L1”(2004)JBCPapersinPress.2004年11月17日出版，原稿號為M411496200)。本發明的實施例證明，可以通過將原核Δ-9去飽和酶(如SEQIDNo.2)與ER駐留和回收信號序列(如KKSS(SEQIDNo.5))可操作地連接而提高植物(如蕓苔)中該酶的活性，從而使由植物制備的種子油的飽和脂肪酸水平顯著下降。盡管本發明的實施例使用KKSS(SEQIDNo.5)作為ER駐留和回收信號序列，但是其它ER駐留和回收信號序列(如KKXX，其中X為不是“S”的氨基酸)可以用于在ER中回收并駐留蛋白質。本發明的范圍不限于任何特別的原核Δ-9去飽和酶或任何特別的信號序列，或其任何特別的組合。這就是說，本發明可以使用其它Δ-9去飽和酶及其它ER駐留和回收信號序列。所以，用于實施本發明的適當的ER駐留和回收信號序列的例子包括但不限于KDEL(SEQIDNo.4)、KKSS(SEQIDNo.5)、HDEF(SEQIDNo.6)、KEEL(SEQIDNo.7)和KDQL(SEQIDNo.8)。術語“可操作地連接”是指將對于編碼序列的表達必要的調節序列及ER回收和駐留信號序列以相對于編碼序列適當的位置和正確的讀碼框置于DNA構建體中，以實現基因的表達。為了有效的連接，將ER駐留和回收信號序列加到Δ-9去飽和酶的羧基端。ER駐留和回收信號序列可以在本發明多肽的最后的羧基端部分，或者其后可以接另外的氨基酸。可以通過編碼Δ-9去飽和酶的基因的基因工程加上所述的信號序列。核酸分子術語“DNA構建體”這里指用于轉化細胞的DNA基因序列。術語“表達盒(expressioncassette)”這里指包括已在其5′和3′端連接有啟動子和終止子調節序列的編碼區以實現基因和基因產物在轉化植物細胞中適當表達的DNA序列。在本發明的實施例中，申請人構建了一種DNA構建體，其包含兩個表達盒第一組件包括與編碼信號KKSS(SEQIDNo.5)的核苷酸序列可操作地連接的藍細菌的des9基因(SEQIDNo.1)，來自于蕓苔的種子特異性napin啟動子，和來自于豌豆的rbcs3′轉錄終止子；和第二表達盒包括表達有助于鑒定和篩選轉化植物細胞和植物的基因產物的啟動子、編碼區和終止子。第二表達盒為可選擇的，因為其它方法可以用于鑒定和選擇轉化體。可以采用任何適當的篩選方法進行篩選，例如抗生素篩選(如卡那霉素、慶大霉素、潮霉素)；在植物中不存在的特異性糖的代謝標記基因(如Syngenta公司的PositechTM篩選系統；和磷酸甘露糖異構酶)；除草標記基因(如拜耳公司的pat和bar，和Monsanto公司的EPSPS)；可見篩選標記，如綠色熒光蛋白等。在本發明的情況中，使用卡那霉素抗性進行篩選。在本發明的實施方案中，申請人使用強效的種子特異性貯藏蛋白napin啟動子。但是其它種子特異性啟動子可以用于本發明中，包括但不限于十字花科蛋白(cruciferin)啟動子、羥化酶啟動子、豆球蛋白啟動子(ShasanyAK等人，(2000)IndianJExpBiol.Apr；38(4)363-72)、菜豆球蛋白啟動子和玉米醇溶蛋白啟動子。可能使用不是種子特異性的啟動子，但是這種啟動子在降低植物種子油產品的飽和FA含量方面不那么有效。在本發明的實施例中，編碼區也在3′端與作為調節序列的rbcs3′轉錄終止子可操作地連接。其它也可用于本發明中的有用的3′調節序列包括但不限于胭脂堿合成酶聚腺苷酸化區(NOS)和章魚堿聚腺苷酸化區(OCS)。所述的DNA構建體可以方便地于適合在細菌宿主中繁殖的第一載體中構建，然后被切斷并連接到用于引入到植物宿主中的第二載體。用于引入到植物宿主中的適當載體的例子包括pCAMBIA(國際農業分子生物學應用中心(CAMBIA))載體系列、pBI載體系列(BD生物科學公司的Clontech部)和基于pKYLX71的載體(Scharld等人，(1987))。載體的選擇部分取決于預期的轉化機理，即農桿菌介導的轉化或直接的基因轉移。轉化和轉基因植物和植物細胞可以使用本領域的技術人員公知的任何DNA導入(參見，例如“Plantgenetictransformationandgeneexpression；alaboratorymanual(植物遺傳轉化和基因表達，實驗手冊)”DraperJ等人，Eds.BlackwellScientificPublications，1988)產生包括本發明的核酸的轉化植物細胞和轉基因植物。這些DNA導入包括但不限于農桿菌介導的轉染、基因槍(biolistic)DNA導入、原生質體電穿孔、直接DNA攝取、PEG處理原生質體、UV激光微光束、雙生病毒(Geminivirus)載體、脂質體介導的DNA攝取、磷酸鈣處理原生質體、和以包覆有轉化DNA的微珠攪動細胞懸浮液。在這些DNA導入當中，由于農桿菌的使用能保證穩定的轉化，所以其優選用于如蕓苔的雙子葉植物。使用農桿菌的方法包括使用野生型腫瘤質粒的中間載體法(nature，287(1980)p.654；Cell，32(1983)p.1033；EMBOJ.，3(1984)P.1525)，使用缺乏T-DNA腫瘤形成基因區的載體的中間載體法(EMBOJ.，2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)p.629)，二元載體法(Bio/Technology，1(1983)p.262；Nature，303(1983)p.179；Nucl.AcidsRes.，12(1984)p.8711)等。可以使用這些方法中的任一方法。用農桿菌感染植物的方法包括對培養細胞直接接種、原生質體共培養和葉盤(leaf-disk)法。葉盤法在許多情況中便于用在直接且容易地制備大量轉化植物。可以通過在如Murashige-Skooge培養基的已知培養基中培養轉化植物細胞而再生植株，所述的培養基可以添加篩選抗生素和/或植物生長激素。將生根幼苗移植到土壤中并培養，以長成再生植株。在下述實施例中，使用農桿菌T-DNA介導的植物轉化將上述DNA構建體引入到蕓苔植株的基因組中。簡要地說，使用農桿菌二元載體系統，植物細胞核的轉化通過以下步驟完成a)將來自于藍細菌的des9基因(SEQIDNo.1)及回收和駐留信號KKSS(SEQIDNo.5)插入到載體中，b)將載體引入到農桿菌中，c)共培養從幼苗切下的絨毛葉與重組農桿菌的懸浮液，隨后在非選擇性培養基中接種，d)將植物組織轉移到選擇性培養基中以鑒定轉化組織，e)鑒定轉化組織和f)從轉化組織再生植株。轉基因的表達水平可以根據其插入到核基因組的位置和數目而變化。所以，應再生幾個轉化體，并應檢驗轉基因的表達和改變的脂肪酸構成。可以用本領域中任何適當的技術分析脂肪酸構成，例如(a)氣相色譜(GC)脂肪酸甲基酯(FAME)、丁基/丁醇酯、2-丙醇(propan-2-ol)酯(參見，例如，國際標準化組織方法參考號ISO55081990(E)，“Animalandvegetablefatsandoils-Analysisbygaschromatographyofmethylestersoffattyacids(動物和植物脂肪和油-用脂肪酸甲基酯的氣相色譜分析”)；(b)高效液相色譜(HPLC)吸附色譜、手性色譜、銀離子色譜、反相色譜；(c)質譜(MS)皮考啉基酯、二甲基唑啉(DMOX)、吡咯烷、二甲基二硫化物衍生物(DMSO)；(d)紅外光譜(IR)；和(e)傅立葉變換紅外光譜(FTIR)。一般而言，只有那些證明其種子油的飽和脂肪酸含量顯著下降的轉基因植物(即其中，與同種野生型植株相比，種子油的飽和脂肪酸含量降低了約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％或更多)是所希望的，且將被篩選用于進一步培養。本發明的實施例證明，用與ER回收和駐留信號可操作地連接的藻青菌Δ-9去飽和酶轉化蕓苔(歐洲油菜(Brassicanapus))，導致了種子油的總飽和脂肪酸含量下降。然而，油合成的生物化學(如脂肪酸的去飽和)和這些代謝反應的亞細胞定位與其它油種子農作物相似。所以，本發明的分子技術可以應用于其它雙子葉和單子葉油種子植物，包括但不限于大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻。本發明還提供前述轉基因植物的細胞和組織(特別是種子)。前述轉基因植物和其后代可以用于通過雜交和篩選將感興趣的基因轉移到其它基因型、栽培種、變種等。所以，本發明提出的分子技術可以用于產生大量攜帶本發明的重組核酸的雜種植物，以制備具有降低的飽和脂肪酸水平的種子油。與明確且單獨地指明各個公開或專利申請作為參考引用一樣，本說明書中在這里引用的公開和專利申請用于參考。引用任何公開是由于其公開日早于申請日，不應理解為由于現有的發明，本發明沒有資格早于這種公開。通過以下實施例現在將更詳細地說明本發明，這些實施例決不是要限制本發明的范圍。實施例實施例1沒有ER信號的基因構建使用在起始和終止密碼子緊鄰的外側的兩個引物中引入XhoI位點的下列引物，從藍細菌(聚球藻屬，ATCC#33912)擴增des9基因(SEQIDNo.1；837bp)的開放讀碼框DSG-XhoI-5′CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(SEQIDNo.9)和DSG-XhoI-3′CCCCCCTCGAGTTAGTTGTTTGGAGACGCCACTTTG(SEQIDNo.10)。凝膠純化PCR產物，用XhoI消化并連接到大腸桿菌載體pBluescript(BS/KS)，然后測序以確定其同一性。然后通過XhoI從BS/KS切除des9基因(SEQIDNo.1)并連接到植物載體pKYLX-Napin中。該載體是通過用來自于蕓苔的種子特異性Napin啟動子代替載體pKYLX71(Scharld等人，1987)的雙35S啟動子而構建的。通過限制性酶切消化分析幾個重組載體以鑒定對于啟動子和終止子具有正確的des9基因插入方向的克隆。重組載體(pC7)被測序以確定適當的連接，且在植物載體中引入的des9基因插入沒有重排。實施例2用ER信號構建基因使用在起始和終止密碼子緊鄰的外側的兩個引物中引入XhoI位點的下列引物，從藍細菌(聚球藻屬，ATCC#33912)擴增des9基因(SEQIDNo.1)的ORF(837bp)DSG-XhoI-5′CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(SEQIDNo.9)和des9-3′-ERCCCCCCCTCGAGTTAAGAAGACTTTTTGTTGTTTGGAGACGCCAC(SEQIDNo.11)在des9-3′-ER引物中，des9基因的終止密碼子被轉化成氨基酸K，并且其后再加上三個氨基酸(KSS)，之后是一個新的終止密碼子和XhoI位點。凝膠純化PCR產物(由于增加4個氨基酸，現為849bp)，用XhoI消化，連接到BS/KS并測序以確定其同一性。然后通過XhoI從BS/KS切除des9基因并連接到植物載體pKYLX-Napin中。分析幾個重組載體以鑒定對于啟動子和終止子具有正確的des9基因插入方向的克隆。重組載體(pC8)被測序以確定適當的連接，且在植物載體中引入的des9基因插入沒有重排。實施例3載體引入到農桿菌中然后通過三親交配將兩個構建體(pC7和pC8)均從大腸桿菌DH5α轉移到根瘤農桿菌GV3101中。使用大腸桿菌HB101中的pRK2013作為輔助質粒(Ditta等人，1980)。在50mg/L的利福平、20mg/L的慶大霉素和15mg/L的四環素平板上幾輪篩選轉接合子。為了確定沒有重排發生，從轉接合子提取質粒，用限制性內切核酸酶消化，并與從大腸桿菌DH5α純化的質粒對比。實施例4蕓苔轉化使用由Moloney等人(1989)開發的實驗方案用pC7和pC8基因構建體轉化蕓苔品種“Wester”。簡而言之，盡可能接近頂端分生組織但不包括它，用快刀從五天齡幼苗切下包括葉柄的充分展開的絨毛葉。將葉柄的剪切端短暫地浸入到1ml含有des9基因構建體的根瘤土壤桿菌的液體培養物(OD約0.5)中。然后將葉柄埋入培養皿中的MMO-BA共培養培養基[具有芐基腺嘌呤(BA)的Murashige最小有機物(MMO，Invitrogen公司，伯靈頓，加拿大)]中，以使外植體垂直豎立。平板用橡皮膏密封，并在25℃、16h亮/8h暗、70～80mE下置于生長室中2～3天。通過將外植體轉移到含有300mg/L特美汀(Timentin)(GlaxoSmithKline，密西沙加，加拿大)的MMO-BA培養基中誘導愈傷組織。實施例5完整植株的篩選和再生通過將外植體轉移到含有300mg/L特美汀和20mg/L卡那霉素的MMO-BA培養基的平板中而誘導從愈傷組織形成芽。將芽從外植體上切下并放入含有具有抗生素(但沒有BA)的MMO培養基的品紅容器中。當芽以正常的形態和頂端優勢長出時，將其轉移到生根培養基[含有抗生素和萘乙酸(NAA)的MurashigeandSkoog(MS)培養基]中。一旦形成良好的根系，則將植物從容器中移出，用流水清洗掉大部分瓊脂，并轉移到潮濕的盆栽土中，用罐遮蓋以避免干燥。然后將它們放入濕度箱中，并緩慢移開遮蓋物以使更多空氣進入，使植物強壯。實施例6轉化體的鑒定使用des9基因特異性引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定作為轉基因植物的再生植株。將從再生轉化植株得到的T1種子胚切成較小的塊并置于含有卡那霉素的篩選平板中。從轉基因植物得到的胚或都為綠色，或為綠色和灰白色的結合(比例取決于整合的轉基因的數量)，而從非轉基因植物得到的種子都為灰白色。這是由于二元載體被構建為攜帶與des9基因串連的新霉素磷酸轉移酶(NptII)基因。通過DNA(Southern)印跡分析確定des9基因整合到蕓苔基因組中。根據Dellaporta等人(1983)分離從幼葉得到的基因組DNA。用只在二元載體的表達盒一端剪切的限制性內切酶消化10μg基因組DNA。然后被消化的DNA在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳，按照廠商的指導轉移至尼龍膜(Amersham加拿大有限公司，渥克維爾，多倫多)，并用通過隨機引物標記而標記有[α-32P]-dCTP的des9基因(生命技術公司(LifeTechnologies)，格蘭德艾蘭，紐約)探測。按照Sambrook等人(1989)，在65℃下進行雜交和清洗印記。des9基因在轉基因蕓苔植物中的表達通過RT-PCR和RNA(Northern)印跡由RNA分析而確定。按照Verwoerd等人(1989)中描述的方法從幼葉提取總RNA。該RNA在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在尼龍膜上印跡并與des9基因探針雜交。雜交和清洗條件與DNA雜交的條件相同。實施例7種子的脂肪酸分析按照國際標準化組織方法參考號ISO55081990(E)，“Animalandvegetablefatsandoils-Analysisbygaschromatographyofmethylestersoffattyacids(動物和植物脂肪和油-通過氣相色譜分析脂肪酸的甲基酯)”確定從成熟種子得到的總酰基脂質的脂肪酸組成。在5mL聚丙烯瓶中的1mL石油醚中用鋼棒碾碎50～100mg種子。粗粉沉降后，將0.5mL上清液轉移到含有1.2mL甲基化溶液(2％甲氧基鈉的甲醇溶液)的玻璃管中。徹底混合后，溶液在室溫下孵化30分鐘。向上述溶液中加入1mL雙蒸水，充分混合并在室溫下放置10分鐘以使相分離。分離后，從上層取200μL，在GC自動取樣瓶中用另外300μL石油醚稀釋，并取1μL注入到GC柱中。以氦為載氣于28.0mL/分鐘的流速下，在裝有30m×0.25mm(i.d.)柱(HP-INNOWAX，交聯聚乙二醇)的火焰離子化氣相色譜儀(型號6890，HewlettPackard，密西沙加，多倫多)上進行FAME的分離。箱溫度為以5℃/分鐘的速度從180℃升至230℃，并在230℃保持13分鐘。通過與FAME標準品的保留時間比較來確定峰，且FAME的相對比例測定為總峰面積的百分比。表1攜帶與編碼KKSS(SEQIDNo.5)ER回收和駐留信號連接的來源于藍細菌的des9基因(SEQIDNo.1)的轉基因蕓苔植物(C8-19.1)、只攜帶des9基因的轉基因植物(C7-15)和非轉化植物(WT)的種子的脂肪酸含量(mol％)。參考文獻“Plantgenetictransformationandgeneexpression；alaboratorymanual”，DraperJ.etal.Eds.BlackwellScientificPublications，1988.Nature，284(1980)p.654.Cell，32(1983)p.1033.EMBOJ.，3(1984)P.1525.EMBOJ.2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)p.629.Bio/Technology，1(1983)p.262.Nature，303(1983)p.179.Nucl.AcidsRes.，12(1984)p.8711.DellaportaSL，WoodJ，HicksJB(1983)AplantDNAmini-preparationversionII.PlantMolBiolRep119-21.DittaM.J.，S.Stanfield，D.CorbinandD.R.Helsinki，1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGramnegativeconstructionofagenebankofRhizobiummeliloti.ProcNatlAcadSciUSA27，7347-7351.HahnJJ，EschenlauerAC，NarrolMH，SomersDA，SriencF(1997)Growthkinetics，nutrientuptake，andexpressionoftheAlcaligeneseutrophuspoly(β-hydroxybutyrate)synthesispathwayintransgenicmaizecellsuspensioncultures.BiotechProg13347-354.Horsch，R.B.，Fry，N.Hofmann，J.Neidermeyer，S.G.RogersandR.T.Fraley，1988.Leafdisctransformation.PlantMolecularBiologyManual，A5/1-A5/9.KluwerAcademicPublishers，Dordrecht/Boston/London.LehmannK.etal.(2001)PlantPhysiol.Oct；127(2)436-49.ManabuMurakami，TakayoshiOhba，FengXu，SeijiShida，EisakuSatoh，KyoichiOno，IchiroMiyoshi，HiroyukiWatanabe，HiroshiIto，andToshihikoIijima“GenomicOrganizationandfunctionalanalysisofmurinePKD2L1”(2004)JBCPapersinPress.PublishedNovember17，2004asManuscriptnumberM411496200.Michaelisetal.(1982)Ann.Rev.Microbiol.36，425.MoloneyM，WalkerJMandSharmaKK1989HighefficiencytransformationofBrassicanapususingAgrobacteriumvectors，PlantCellRep.8，238-242.NishizawaO，ToguriT(1996)Geneforfattyaciddesaturase，vectorcontainingsaidgene，planttransformedwithsaidgene，andprocessforcreatingsaidplant.U.S.patentnumber6,043,411.NishizawaO，FujiiT，AzumaM，SekiguchiK，MurataN，OhtaniT，ToguriT(1996)Low-temperatureresistanceofhigherplantsissignificantlyenhancedbyanonspecificcyanobacterialdesaturase.NatureBiotechnology141003-1006.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989.MolecularCloningALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.SchardlC.L.，A.D.Byrd，G.Benzion，M.A.Altschuler，D.F.HildebrandandA.G.Hunt，1987.Designandconstructionofaversatilesystemfortheexpressionofforeigngenesinplants.Gene61，1-11.ShahS，WeselakeR(2003)FarmingFortheFuture，AARIproject#19990032，FinalReport，pp.1-82.ShasanyAKetal.(2000)IndianJExpBiol.Apr；38(4)363-72VandenBroecketal.(1985)Nature313，358.VerwoerdTC，DekkerBMMandHoekemaA(1989)Asmall-scaleprocedurefortherapidisolationofplantRNAs.NucleicAcidResearch，172362.VincentMJ，MartinAS，CompansRW(1998)FunctionoftheKKXX(SEQIDNO3)motifinendoplasmicreticulumretrievalofatransmembraneproteindependsonthelengthandstructureofthecytoplasmicdomain.JBiolChem.273950-6.U.S.patentNo.5,552,306.U.S.patentNo.5,614,393.U.S.patentNo.5,663,068.U.S.patentNo.5,789,050.U.S.patentNo.6,355,861.U.S.patentNo.6,683,232.USpatentapplicationpublicationNo.20040078845.序列表<110>阿爾伯達研究理事會股份公司(AlbertaResearchCouncilInc.)<120>具有降低的飽和脂肪酸水平的轉基因植物及其制備方法<130>IP06-0944-XC34<140>PCT/CA2004/002156<141>2004-12-17<150>CA2,450,000<151>2003-12-18<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>837<212>DNA<213>藍細菌(Anacystisnidulans)<400>1atgacccttgctatccgacccaagcttgccttcaactggccgaccgccctgttcatggtc60gccattcacattggagcactgttagcgttcctgccggccaactttaactggcccgctgtg120ggcgtgatggttgcgctgtattacattaccggttgttttggcatcaccctaggctggcac180cggctaatttcgcaccgtagctttgaagttcccaaatggctggaatacgtgctggtgttc240tgtggcaccttggccatgcagcacggcccgatcgaatggatcggtctgcaccgccaccat300cacctccactctgaccaagatgtcgatcaccacgactccaacaagggtttcctctggagt360cacttcctgtggatgatctacgaaattccggcccgtacggaagtagacaagttcacgcgc420gatatcgctggcgaccctgtctatcgcttctttaacaaatatttcttcggtgtccaagtc480ctactgggggtacttttgtacgcctggggcgaggcttgggttggcaatggctggtctttc540gtcgtttgggggatcttcgcccgcttggtggtggtctaccacgtcacttggctggtgaac600agtgctacccacaagtttggctaccgctcccatgagtctggcgaccagtccaccaactgc660tggtgggttgcccttctggcctttggtgaaggctggcacaacaaccaccacgcctaccag720tactcggcacgtcatggcctgcagtggtgggaatttgacttgacttggttgatcatctgc780ggcctgaagaaggtgggtctggctcgcaagatcaaagtggcgtctccaaacaactaa837<210>2<211>278<212>PRT<213>藍細菌(Anacystisnidulans)<400>2MetThrLeuAlaIleArgProLysLeuAlaPheAsnTrpProThrAla151015LeuPheMetValAlaIleHisIleGlyAlaLeuLeuAlaPheLeuPro202530AlaAsnPheAsnTrpProAlaValGlyValMetValAlaLeuTyrTyr354045IleThrGlyCysPheGlyIleThrLeuGlyTrpHisArgLeuIleSer505560HisArgSerPheGluValProLysTrpLeuGluTyrValLeuValPhe65707580CysGlyThrLeuAlaMetGlnHisGlyProIleGluTrpIleGlyLeu859095HisArgHisHisHisLeuHisSerAspGlnAspValAspHisHisAsp100105110SerAsnLysGlyPheLeuTrpSerHisPheLeuTrpMetIleTyrGlu115120125IleProAlaArgThrGluValAspLysPheThrArgAspIleAlaGly130135140AspProValTyrArgPhePheAsnLysTyrPhePheGlyValGlnVal145150155160LeuLeuGlyValLeuLeuTyrAlaTrpGlyGluAlaTrpValGlyAsn165170175GlyTrpSerPheValValTrpGlyIlePheAlaArgLeuValValVal180185190TyrHisValThrTrpLeuValAsnSerAlaThrHisLysPheGlyTyr195200205ArgSerHisGluSerGlyAspGlnSerThrAsnCysTrpTrpValAla210215220LeuLeuAlaPheGlyGluGlyTrpHisAsnAsnHisHisAlaTyrGln225230235240TyrSerAlaArgHisGlyLeuGlnTrpTrpGluPheAspLeuThrTrp245250255LeuIleIleCysGlyLeuLysLysValGlyLeuAlaArgLysIleLys260265270ValAlaSerProAsnAsn275<210>3<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內質網駐留和回收信號序列<220><221>SITE<222>(3)..(3)<223>Xaa為任一氨基酸<220><221>SITE<222>(4)..(4)<223>Xaa為任一氨基酸<400>3LysLysXaaXaa1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內質網駐留和回收信號序列<400>4LysAspGluLeu1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內質網駐留和回收信號序列<400>5LysLysSerSer1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內質網駐留和回收信號序列<400>6HisAspGluPhe1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內質網駐留和回收信號序列<400>7LysGluGluLeu1<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>內質網駐留和回收信號序列<400>8LysAspGlnLeu1<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9cccccctcgagatgacccttgctatccgacccaag35<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>primer<400>10cccccctcgagttagttgtttggagacgccactttg36<210>11<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11ccccccctcgagttaagaagactttttgttgtttggagacgccac4權利要求1.一種重組多肽，包括與內質網駐留和回收信號序列可操作地連接的來源于原核生物的Δ-9去飽和酶。2.根據權利要求1所述的重組多肽，其中所述的原核生物為細菌。3.根據權利要求1所述的重組多肽，其中所述的原核生物為屬于選自包括水花微囊藻屬、粗集胞屬和魚腥藻屬的組的屬的藻青菌藍綠藻。4.根據權利要求3所述的重組多肽，其中所述的藻青菌為藍細菌(Anacystisnidulans)。5.根據權利要求1所述的重組多肽，其中所述的Δ-9去飽和酶包括(a)具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列的多肽；(b)與(a)中所限定的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)所限定的多肽的變異體或同源物；和(c)與(a)中限定的多肽具有至少約50個相同的連續氨基酸，且具有Δ-9去飽和酶活性的(a)所限定的多肽的片斷。6.根據權利要求1所述的重組多肽，其中所述的Δ-9去飽和酶具有SEQIDNo.2中列出的氨基酸序列。7.根據權利要求1～6的任一項所述的重組多肽，其中所述的內質網膜駐留和回收信號具有選自包括以下氨基酸序列的組的氨基酸序列(a)KDEL，SEQIDNo.4；(b)KKXX，SEQIDNo.3，其中X為任一氨基酸；(c)HDEF，SEQIDNo.6；(d)KEEL，SEQIDNo.7；和(e)KDQL，SEQIDNo.8。8.根據權利要求7所述的重組多肽，其中所述的內質網膜駐留和回收信號具有氨基酸序列KKSS，SEQIDNo.5。9.一種編碼權利要求1～8的任一項中所限定的重組多肽的核酸分子。10.一種包括與啟動子可操作地連接的權利要求9的核酸分子的載體。11.一種用權利要求10的載體轉化的宿主細胞。12.根據權利要求11所述的宿主細胞，來源于油種子植物。13.根據權利要求12所述的宿主細胞，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。14.根據權利要求12所述的宿主細胞，其中所述的油種子植物為蕓苔。15.一種轉基因植物細胞，包括包含與導致重組多肽在所述的轉基因植物細胞中表達的啟動子可操作地連接的權利要求9的核酸分子的轉基因元件。16.根據權利要求15所述的轉基因植物細胞，來源于油種子植物。17.根據權利要求16所述的轉基因植物細胞，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。18.根據權利要求16所述的轉基因植物細胞，其中所述的油種子植物為蕓苔。19.一種生產轉基因植物的方法，包括(a)用權利要求9的核酸或包括這種核酸的載體轉化植物細胞，其中，所述的核酸與導致重組多肽在所述的植物細胞中表達的啟動子可操作地連接；和(b)由步驟(a)中產生的轉化植物細胞再生植株。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的植物細胞來源于油種子植物。21.根據權利要求20所述的方法，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。22.根據權利要求20所述的方法，其中所述的油種子植物為蕓苔。23.一種轉基因植物，包括含有與導致重組多肽在所述的轉基因植物中表達的啟動子可操作地連接的權利要求9的核酸分子的轉基因元件。24.根據權利要求23所述的轉基因植物為油種子植物。25.根據權利要求24所述的轉基因植物，其中所述的油種子植物選自包括蕓苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄欖、棕櫚、椰子、紅花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鱷梨和亞麻的組。26.根據權利要求24所述的轉基因植物，其中所述的油種子植物為蕓苔。27.根據權利要求23～26的任一項所述的轉基因植物，其與相同品種的野生型植株相比，產生了具有降低的飽和脂肪酸含量的油。28.根據權利要求27所述的轉基因植物，其中所述的種子油的飽和脂肪酸含量與所述的野生型植株相比，降低了約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％或更多。29.權利要求23～28的任一項所述的轉基因植物在生產與相同品種的野生型植株相比具有降低的飽和脂肪酸含量的種子油中的應用。30.根據權利要求29所述的應用，其中所述種子油的飽和脂肪酸含量與所述的野生型植株相比，降低了約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％或更多。31.根據權利要求29所述的應用，其中所述的轉基因植物為蕓苔。32.根據權利要求31所述的應用，其中所述的種子油具有低于約7mol％的飽和脂肪酸含量。33.根據權利要求31所述的應用，其中所述的種子油具有約4.0％～約4.5％的飽和脂肪酸含量。全文摘要本發明提供在種子油中具有降低的飽和脂肪酸水平的轉基因植物及其生產方法。通過這種方法培養的轉基因植物由于與內質網駐留和回收信號序列可操作地連接的原核Δ－9去飽和酶(即一種在飽和脂肪酸的Δ－9位置引入順式雙鍵的酶)的表達，在種子油中含有低水平的飽和脂肪酸。本發明的一個實施例為表達與KKSS(SEQIDNo.5)內質網駐留和回收信號序列可操作地連接的來源于藻青菌屬藍細菌的異種Δ－9去飽和酶的植物，所述的Δ－9去飽和酶將脂質結合16:0和18:0脂肪酸轉化成相應的16:1和18:1。文檔編號C12P7/64GK1930293SQ200480041766公開日2007年3月14日申請日期2004年12月17日優先權日2003年12月18日發明者薩利赫烏扎曼·山,蘭德爾·韋塞爾卡申請人:阿爾伯達研究理事會股份公司