β－聯蛋白/TCF激活轉錄的調節的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：426659閱讀：3610來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：β－聯蛋白/TCF激活轉錄的調節的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及調節由β-聯蛋白/TCF激活的轉錄的化合物和方法，例如，選擇性抑制Wnt/β-聯蛋白途徑靶向的基因。
            
背景技術：
             Wnt/β-聯蛋白途徑引發在正常發育和癌癥的起始和發展中均至關重要的信號級聯(Wodarz等人，“Mechanisms of Wnt signaling indevelopment，”Annu.Rev.Cell Dev.Biol.1459-88(1998)；Morin，P.J.，“Beta-catenin signaling and cancer”，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，“The promise and perils of Wnt signaling throughbeta-catenin，”Science 2961644-46(2002)；Oving等人，“Molecularcauses of colon cancer，”Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002))。該途徑的特點是它激活了多功能蛋白β-聯蛋白的轉錄作用。在正常細胞中，大多數β-聯蛋白發現于連在鈣黏著蛋白上的細胞膜上，它在這里在細胞黏著中發揮重要的作用。另一β-聯蛋白庫發現于胞質和核中，它在這里調節轉錄(Gottardi等人，“Adhesion signalinghow beta-catenininteracts with its partners，”Curr.Biol.11R792-4(2001))。在其作為質膜處細胞黏著介體及作為轉錄激活劑的不同作用中，β-聯蛋白與蛋白宿主相互作用，大部分蛋白宿主盡管缺少顯著的序列同源性，卻競爭相同的β-聯蛋白犰狳蛋白重復單元。晶體結構與突變研究已經描繪出幾種蛋白的β-聯蛋白對不同的犰狳蛋白重復單元的結合部位(Gottardi等人，“Adhesion signalinghow beta-catenin interacts with its partners”，Curr.Biol.11R792-4(2001)；Huber等人，“The structure of thebeta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligandrecognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。
            
β-聯蛋白的胞質庫通過被其中包括糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、酪蛋白激酶-1α(CK-1α)、支架蛋白、軸蛋白和腫瘤抑制物、腺瘤性結腸息肉(APC)的“破壞復合體”磷酸化而得以調節(Behrens J.，“Controlof beta-catenin signaling in tumor development”，Ann.N.Y.Acad.Sci.91021-33(2000)；討論33-5)。在不存在Wnt信號傳導的情況下，磷酸化標記胞質β-聯蛋白以進行Skp1-滯蛋白-F box(SCF)定向的遍在蛋白化和蛋白體降解。激活Wnt途徑使GSK-3β的功能失活，防止β-聯蛋白磷酸化，從而使β-聯蛋白在胞質中積聚，并隨后易位至核中，在這里形成轉錄活性復合體并驅動其靶基因的表達。靶基因激活中的關鍵步驟是β-聯蛋白和轉錄因子的T細胞因子(TCF)/淋巴樣細胞增強因子(LEF-1)家族成員之間復合體的形成(Brantjes等人，“TCFLadyJustice casting the final verdict on the outcome of Wnt signaling”，Biol.Chem.383255-61(2002))。為了生成轉錄活性復合體，β-聯蛋白募集轉錄輔激活物CREB-結合蛋白(CBP)或其緊密關聯的同源物p300(Hecht等人，“The p300/CBP acetyltransferases function astranscriptional coactivators of beta-catenin in vertebrates”，EMBO J.191839-50(2000)；Takemaru等人，“The transcriptional coactivator CBPinteracts with beta-catenin to activate gene expression”，J.Cell Biol.149249-54(2000))以及基礎轉錄機制的其它組分。
            
β-聯蛋白/TCF復合體激活Wnt響應基因轉錄的精確機制尚不明確，但是β-聯蛋白有關轉錄激活的結構域已經描繪為NH2-和COOH-端(Staal等人，“Wnt signals are transmitted through N-terminallydephosphorylated beta-catenin，”EMBO 363-68(2002))。β-聯蛋白的COOH-端區由大約100個氨基酸組成，已經顯示它與TATA結合蛋白(TBP)相互作用(Hecht等人，“Functional characterization of multipletransactivating elements in beta-catenin，some of which interact with theTATA-binding protein in vitro”，J.Biol.Chem.27418017-25(1999))。當與LEF-1融合時，COOH-端便足以促進反式激活作用(Vleminckx等人，“The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessaryand sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopuslaevis，”Mech.Dev.8165-74(1999))。β-聯蛋白的NH2-端部分由大約130個氨基酸組成，其含有蛋白體降解所需的GSK-3β磷酸化位點。
            
正常情況下Wnt/β-聯蛋白調節一系列與促進增殖和分化有關的基因的表達。但是，＞85％的結腸癌中，破壞復合體的組分之一APC、和/或β-聯蛋白本身是變異的，這導致核β-聯蛋白的增加和靶基因的組成型激活(constitutive activation)(Fearnhead等人，“Genetics of colorectalcancerhereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis”，Br.Med.Bull.6427-43(2002))。許多這些在細胞的生長、增殖和分化中發揮關鍵作用的基因，包括細胞周期蛋白D1(Shtutman等人，“The細胞周期蛋白D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965522-27(1999)；Tetsu等人，“Beta-cateninregulates expression of細胞周期蛋白D1 in colon carcinoma cells，”Nature 398422-26(1999))和c-myc(He等人，“Identification of c-MYCas a target of the APC pathway”，Science 2811509-12(1998))，以及穿入性生長所必需的基因如基質裂解蛋白(matrilysin)(Crawford等人，“The metalloproteinase matrilysin is a target of beta-catenintransactivation in intestinal tumors”，Oncogene 182883-91(1999))、纖連蛋白(Gradl等人，“The Wnt/Wg signal transducer beta-catenin controls纖連蛋白expression”，Mol.Cell.Biol.195576-87(1999))、CD44(Wielenga等人，“Expression of CD44 in Apc and Tcf mutant miceimplies regulation by the WNT pathway”，Am.J.Pathol.154515-23(1999))、和μPAR(Mann等人，“Target genes of beta-catenin-Tcell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectalcarcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))均被不適當地激活。
            
根據大多數結直腸癌與β-聯蛋白信號傳導途徑的激活有關，并且根據多種突變導致該激活這一事實，明確需要有削弱β-聯蛋白核功能的藥物。本發明提供對抗β-聯蛋白/TCF介導的轉錄的試劑，并進一步提供相關優勢，如下文所詳細說明。
            

            發明內容
            
簡言之，本發明提供對抗β-聯蛋白/TCF介導的轉錄的試劑，以及它們的使用方法。一方面，本發明提供使β-聯蛋白/TCF響應基因的亞型被特異性減量調節的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發明提供使CBP和β-聯蛋白之間的結合被破壞，但是結構相關的輔激活物p300和β-聯蛋白之間的結合不被破壞的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發明提供使由CBP而非由p300啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。此外，本發明提供使由p300而非由CBP啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發明提供用化學試劑處理癌細胞以使細胞周期G1階段的發育停滯的方法，其中延長用化學試劑進行處理誘發正常結腸細胞(colonocyte)中檢測不到的細胞凋亡。例如，癌細胞可以是結腸、乳腺、前列腺等等。
            
例如，一方面，本發明提供調節β-聯蛋白誘發的基因表達的方法。該方法包括使組合物與試劑接觸，這里的組合物包含β-聯蛋白、CBP和p300，而且β-聯蛋白具有結合到CBP與p300的可能性。所述試劑以有效改變β-聯蛋白結合到CBP與p300的可能性的量存在。換句話說，在不存在該試劑的情況下，β-聯蛋白與CBP和p300結合的程度與存在試劑的情況下觀察到的不同。例如，取決于其化學結構，試劑可以增加CBP在β-聯蛋白上的結合，同時任選地降低p300在β-聯蛋白上的結合；或者增加p300在β-聯蛋白上的結合，同時任選地降低CBP在β-聯蛋白上的結合。該方法可以在體內或先體外后體內進行。一方面，該方法先體外后體內進行，組合物包括干細胞。另一方面，該方法在體內進行，組合物在哺乳動物內。本發明的方法可以用于治療多種醫學病癥。例如，在本發明的各個方面哺乳動物可以罹患癌癥，而用量對于治療癌癥是有效的；組合物在細胞內，而試劑增加細胞分化的可能性；組合物在細胞內，而試劑增加細胞增殖的可能性。
            
另一方面，本發明提供包含β-聯蛋白、CBP、p300和試劑的組合物。β-聯蛋白具有結合到CBP與p300的可能性，而且試劑以有效改變β-聯蛋白結合到CBP與p300的可能性的量存在于組合物中。換句話說，在不存在試劑的情況下，β-聯蛋白與CBP和p300結合的程度與存在試劑的情況下觀察到的不同。例如，取決于其化學結構，試劑可以增加CBP在β-聯蛋白上的結合，同時任選地降低p300在β-聯蛋白上的結合；或者增加p300在β-聯蛋白上的結合，同時任選地降低CBP在β-聯蛋白上的結合。該組合物可以在體內或先體外后體內。一方面，該組合物先體外后體內，并且組合物進一步包含干細胞。另一方面，該組合物在體內，并且組合物在哺乳動物如小鼠內。
            
另一方面，本發明提供調節Wnt途徑活性的方法，其包括(a)使Wnt途徑的組分與激活Wnt途徑的化合物相接觸，以提供激活的Wnt途徑；以及(b)使激活的Wnt途徑與完全或基本上干擾p300與聯蛋白之間結合但是極少或者不干擾CBP與聯蛋白之間結合的化學試劑相接觸。任選地，Wnt途徑在細胞內。任選地，該方法先體外后體內進行。任選地，激活Wnt途徑的化合物選自LiCl和GSK抑制劑。
            
另一方面，本發明提供調節細胞增殖的方法，其包括(a)在使一定比例的群體增殖且一定比例的群體分化的條件下提供細胞群體；以及(b)向群體中加入化學試劑，在此所述試劑導致增殖細胞的比例相對于分化細胞的比例增加。在該方法的各種最佳實施方式中化合物干擾p300與聯蛋白之間的結合；該方法進一步包括向群體中加入激活Wnt途徑的試劑；所述的細胞群體是干細胞群體；該方法先體外后體內進行；該方法進一步包括加入導致細胞群體分化的試劑，例如，群體中的細胞分化形成血細胞或者群體中的細胞分化形成神經元細胞。
            
另一方面，本發明提供將干細胞保持在未分化狀態下的方法，其包括使干細胞與抑制細胞分化或促進細胞增殖的試劑相接觸，所述試劑的量對于將干細胞保持在未分化狀態下是有效的。在某些實施方式中，用于該方法的試劑相對于β-聯蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用。
            
簡言之，在其它方面，本發明提供相對于β-聯蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/CBP相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有β-聯蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/CBP相互作用；相對于β-聯蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有β-聯蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用；促進β-聯蛋白從核易位至胞液的方法，該方法包括向細胞中加入化合物，所述細胞包括核和胞液，核含有β-聯蛋白，所述化合物導致β-聯蛋白從核易位至胞液；選擇性地抑制由WNT/β-聯蛋白途徑靶向的基因的表達的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有由WNT/β-聯蛋白途徑靶向的基因，所述化合物導致由WNT/β-聯蛋白途徑靶向的基因表達的變化。
            
在本發明的方法和組合物中，化學試劑任選地選自結構式(I)的化合物 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
在某些實施方式中，結構式(I)的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環己基C0-2烷基。
            
在某些實施方式中，A為-(CHR3)-，B為-(C＝O)-，D為-(CHR5)-，E為-(C＝O)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(II)  
            
  其中，R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如結構式(I)中所定義。
            
在某些實施方式中，A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(C＝O)-(XR9)-，并且化合物具有如下通式(III) 其中，R1、R2、R4、R6、R9、W和X如結構式(I)中所定義，Z為氮或CH(當Z為CH時，X為氮)。
            
在某些實施方式中，A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(IV) 其中，R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如結構式(I)中所定義，Z為氮或CH，附帶條件為當Z為氮時，n為0，當Z為CH時，X為氮并且n不是0。
            
在某些實施方式中，化合物具有如下通式(VI) 其中，Ra為具有8至11個環成員的二環芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子，R6為5至7元單環芳基，其可以具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，而且化合物中的芳環可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基。任選地，Ra為萘基、喹啉基或異喹啉基，Rb為苯基、吡啶基或哌啶基，所有這些基團均可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。在某些實施方式中，Ra為萘基，Rb為苯基，其可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
            
在某些實施方式中，化合物選自化合物1、3、4和5。
            
在其它方面，本發明提供篩選方法，即可以鑒別生物活性化合物和/或評價其效力的方法。例如，本發明提供鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含CBP1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的β-聯蛋白的部分與含步驟(a)的CBP1-111的部分相結合；以及(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制含CBP1-111的所述部分與含β-聯蛋白的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。
            
任選地，上述方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分與β-聯蛋白的結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
本發明還提供鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含β-聯蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含CBP 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的CBP 1-111的部分與含步驟(a)的β-聯蛋白的部分相結合；(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯蛋白的所述部分與含CBP 1-111的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。
            
任選地，上述方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
本發明還提供鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含有(1)與CBP 1-111相結合的β-聯蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使CBP 1-111從β-聯蛋白上分離；以及(c)當確定步驟(a)的所述小分子使β-聯蛋白與CBP 1-110的結合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。
            
任選地，上述方法可以進一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(f)當確定步驟(d)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
本發明還提供鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含p300 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯蛋白的部分與步驟(a)的含p300 1-111的部分相結合；以及(d)當確定所述步驟(a)的小分子抑制含p300 1-111的所述部分與含β-聯蛋白的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。
            
任選地，上述方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
本發明還提供鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含β-聯蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含p300 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含p300 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯蛋白的部分相結合；(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯蛋白的所述部分與含p300 1-111部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。
            
任選地，上述方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
本發明還提供鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含有(1)與p300 1-111結合的β-聯蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使p300 1-111從β-聯蛋白上分離；以及(c)當確定步驟(a)的所述小分子使β-聯蛋白與p300 1-111的結合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。
            
任選地，上述方法可以進一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(f)當確定步驟(c)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
在其它方面，本發明提供核酸和肽序列，這些序列可以用作例如治療劑，或者用于例如篩選方法。因此，在不同的示范性方面，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO1或者與SEQID NO1的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2或者與SEQ IDNO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1或者與SEQ IDNO1的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO3或者與SEQID NO1的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4或者與SEQ IDNO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3或者與SEQ IDNO3的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；以及基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白。
            
以下進一步詳細說明了本發明的這些及相關方面。
            

            

            
圖1.化合物1抑制β-聯蛋白/TCF轉錄。
            
A(i)和A(ii).化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的結構。
            
B(i)和B(ii).化合物1選擇性地抑制β-聯蛋白/TCF報道基因構成物(construct)，IC50為5μM。用β-聯蛋白/TCF熒光素酶構成物轉染SW480細胞(105)(圖1B(i))。用化合物1處理細胞(1-64μM)。處理后24小時后制備溶胞產物，并對其進行雙熒光素酶化驗。數據以不同形式示于圖1B(ii)。
            
C.化合物1對NFAT受體構成物沒有影響。將用NFAT受體構成物穩定轉染的Jurkat細胞，右圖(right panel)，用PMA(10ng/ml)/洛諾霉素(1μg/ml)刺激，并用化合物1(0.781-50μM)處理。處理后24小時后制備溶胞產物，并對其進行雙熒光素酶化驗。所有實驗進行兩份，數值以平均+/-標準偏差作圖。
            
D.CBP是化合物1的分子標靶。將SW480細胞的核抽提物與覆有化合物2(25μM)的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培育。將小珠洗滌3次，對洗脫物進行凝膠電泳，并用抗CBP抗體進行免疫印跡。箭頭指向在大小上和對CBP的免疫反應性相應的條帶。
            
E.14C標記的化合物1與CBP結合。通過引入14C標記的酪氨酸制備化合物1。將SW480細胞用表達全長爪蟾(Xenopus laevis)β-聯蛋白(2.2μg)或全長小鼠CBP(1.1μg)的載體轉染。將50μg核溶解產物(NE-PER kit，Pierce)用20μM14C標記的化合物1(7.16×104CPM)、及DMSO(0.5％)或100μM和200μM的冷化合物1處理。使用G-25 1cc柱(Pharmacia)將溶解產物脫鹽，以除去未結合的14C標記的化合物1，并測量14C標記的化合物1的結合。
            
圖2.CBP而并非p300的前111個氨基酸特異性地結合化合物1。
            
A.野生型和CBP缺失構成物的示意圖。
            
B.CBP(1-111)含有化合物1的最小結合結構域。SW480細胞中CBP缺失構成物的表達水平如圖所示(上圖)。10μg的總蛋白進行凝膠電泳，并使用抗His抗體進行免疫印跡。將表達CBP缺失構成物的SW480細胞的全細胞溶解產物結合到覆有100μM化合物2的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠上。結合部分進行凝膠電泳，并使用抗His抗體進行免疫印跡(下圖)。箭頭指向與覆有化合物2的小珠保持結合的構成物。
            
C.過量的化合物1與CBP(1-111)而非p300(1-111)競爭。將CBP缺失構成物、CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)和p300缺失構成物、p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)轉染至SW480細胞中。將全部細胞溶解產物與鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠或者覆有100μM化合物2的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培育(下圖)。CBP構成物(1-111、1-211和1-351)和p300構成物(1-111、1-211和1-351)在小珠上的結合受到過量化合物1(150μM)的攻擊。
            
D.CBP(1-111)以不依賴于磷酸化的方式與化合物1結合。CBP(1-111)或p300(1-111)在大腸桿菌中表達，并通過Ni-NTA-瓊脂糖(考馬斯亮藍(Commassie blue)染色的凝膠)提純。CBP(1-111)如圖所示(右上)。使用抗His抗體對1和3μl的提純蛋白進行免疫印跡。箭頭指向通過其適當抗體識別的重組蛋白。增量的提純CBP(1-111)(0.5、1和3μl)和p300(1-111)(1、3和5μl)與覆有100μM化合物2的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培育。洗滌小珠，對洗脫蛋白進行凝膠電泳，之后用抗His抗體進行免疫印跡。箭頭指向PVDF膜上的蛋白。使用過量化合物1(300μM)攻擊特異結合的相互作用。
            
E.CBP的Δ1-111+NLS構成物不能拯救被化合物1抑制的β-聯蛋白/TCF轉錄。將SW480細胞用(0.1-1)μg表達全長或CBP(Δ1-111+NLS)的表達載體轉染。轉染過后24小時用化合物1(25μM)或對照物(0.5％DMSO)處理細胞。處理過后24小時制備溶解產物，并對其進行雙熒光素酶化驗。
            
圖3.化合物1破壞β-聯蛋白/CBP復合體但不破壞p300/β-聯蛋白復合體。
            
A.將全長爪蟾β-聯蛋白(1.1、2.2和3.3μg)或者鼠CBP(0.14、0.28、0.55、1.1和2.2μg)質粒在SW480細胞內與β-聯蛋白/TCF(1.1μg)報道基因構成物一起共轉染。使用空pcDNA3載體使各反應中所用DNA的量均等。化合物1處理過后24小時進行雙熒光素酶化驗。所有實驗進行兩份，數值以平均+/-標準偏差作圖。
            
B.化合物1與β-聯蛋白競爭CBP。將SW480細胞用5或10μM化合物1或對照物(0.5％DMSO)處理。處理過后24小時，將溶解產物與覆有對照抗體或者抗CBP抗體或抗p300抗體的小珠一起培育。對共免疫沉淀的蛋白進行凝膠電泳，并用抗β-聯蛋白抗體進行免疫印跡。箭頭指向免疫沉淀的β-聯蛋白(成對)。
            
C.CBP(1-111)是與β-聯蛋白相互作用的最小區。用覆在蛋白A-瓊脂糖小珠上的抗β-聯蛋白抗體對用CBP缺失系列轉染的SW480細胞進行免疫沉淀。將免疫復合體洗滌并進行凝膠電泳，之后使用抗His抗體進行免疫印跡。箭頭指向與小珠保持結合的構成物。
            
D.化合物1與β-聯蛋白競爭CBP而非p300構成物。將CBP(1-111、1-211和1-351)和p300(1-111、1-211和1-351)構成物均轉染至SW480細胞中(下圖)。轉染過后48小時制備全部細胞溶解產物，并使用上述的蛋白A-瓊脂糖-抗β-聯蛋白抗體進行免疫沉淀(中圖)。將免疫復合體洗滌并進行凝膠電泳，使用抗His抗體進行免疫印跡。箭頭指向結合的蛋白(上圖)。為了進行競爭化驗，將小珠上的免疫復合體用50μM化合物1攻擊。
            
E.CBP和p300與公認的β-聯蛋白結合基序(SEQ ID NOS47-55)的序列排比。公認的序列是加框的。使用程序BLAST進行NCBI數據庫中蛋白序列的排比。
            
F.CBP 1-111(CBP M1，SEQ ID NO2)與p300 1-111(p300M1，SEQ ID NO4)的序列排比。
            
圖4.化合物1降低核的β-聯蛋白A.β-聯蛋白免疫熒光顯微法。將對數期的SW480(左)和HCT116(右)細胞固定并用抗β-聯蛋白紅(上圖，A)或者抗CBP(上圖，B)綠染色。中圖顯示了SW480(左)和HCT116(右)細胞中重疊的β-聯蛋白和CBP。下圖顯示用化合物1(25μM)處理24小時后β-聯蛋白在SW480胞質(左)和HCT116細胞胞質膜(右)上的重新分布。
            
B.β-聯蛋白的蛋白質印跡分析。使用25μg來自SW480細胞抽提物的總蛋白在用化合物1處理24小時或不進行處理的情況下進行胞質和核β-聯蛋白的檢測。
            
圖5.化合物1抑制細胞周期蛋白D1的表達。
            
A.細胞周期蛋白D1水平隨化合物1處理而降低。對經25μM化合物1或對照物(0.5％DMSO)處理4、8或24小時的25μg SW480全細胞溶解產物進行蛋白質印跡分析。使用抗細胞周期蛋白D1抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc.)進行免疫印跡。
            
B.細胞周期蛋白D1和c-myc啟動子被CBP和p300在體內占有。ChIP(見材料和方法)說明化合物1處理后發生c-myc啟動子的CBP和p300占有。對來自化合物1(25μM)或對照物(0.5％DMSO)處理8小時的SW480細胞的c-myc啟動子進行ChIP化驗。使用CBP(AC-26，由Harvard University，Boston，MA的Dr.David Livingston慷慨贈送)或p300(C-20，Santa Cruz Biotechnology Inc.)特異性抗體在進行化合物1或對照物(DMSO)處理的情況下，評價啟動子被CBP或p300占有。
            
圖6.  
            
A.化合物1使G1中的細胞停滯。對經化合物1(25μM)(右)或對照物(0.5％DMSO)(左)處理24小時的SW480(下圖)和HCT116(上圖)細胞進行FACS分析。將5.5×106細胞固定并用碘化丙錠(PI)染色。箭頭標出G0/G1、S和G2/M。
            
B.化合物1選擇性地激活結腸癌細胞系中的胱天蛋白酶。將SW480和HCT116(左圖)細胞(105)連同正常結腸細胞CCD18Co(右圖)用對照物(0.5％DMSO)或化合物1(25μM)處理。處理過后24小時，將細胞溶解，并測量胱天蛋白酶-3/7的酶活性。通過從經處理的樣品(化合物1或對照物)減去空白(對照物，無細胞)的單位值計算相對熒光單位(RFU)，并作圖。
            
圖7.化合物1以依賴劑量的方式降低軟瓊脂中的集落生長。
            
A.向三孔SW480(5000細胞/孔)中加入濃度漸增的5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)和化合物1(0.25-5lμM)。將細胞洗滌并懸浮在軟瓊脂生長培養基中。8天后對集落數目(直徑大于60lμM的集落)進行計數，并針對化合物濃度作圖。標出三次測量的平均值±SE。在不存在化合物的情況下，對照的集落數為1,637±71。
            
B.化合物1的作用示意圖。不想受其理論束縛，申請人提出β-聯蛋白/TCF復合體以依賴輔激活物的方式調節其下游靶基因的表達。更具體地說，提出核的β-聯蛋白/TCF有差異地與CBP或p300結合，三元復合體驅動β-聯蛋白/TCF響應基因亞型的表達。化合物1特異性并選擇性地靶向β-聯蛋白/TCF/CBP復合體，但不靶向β-聯蛋白/TCF/p300復合體，并對依賴CBP的基因，如細胞周期蛋白D1、軸蛋白2和hnkd的表達進行減量調節。盡管化合物1處理阻斷了β-聯蛋白/CBP的相互作用，卻增加了可用于表達如下基因的β-聯蛋白/TCF復合體，所述基因的啟動子可以利用輔激活物(c-myc)或優選地利用p300作為輔激活物(c-jun和fra-1)。
            
圖8提供制備用于實施本發明的化學試劑的一般合成示意圖。
            
圖9提供制備用于實施本發明的化學試劑的一般合成示意圖。
            
圖10.化合物3的代謝分析A.大鼠體內化合物3及其代謝產物的二極管陣列示蹤圖(上圖)和總離子電流(下圖)。
            
B.人體內化合物3及其代謝產物的二極管陣列示蹤圖(上圖)和總離子電流(下圖)。
            
具體實施例方式
            
本發明提供對抗β-聯蛋白/TCF介導的轉錄的試劑，及其相關的方法。一方面，本發明提供使β-聯蛋白/TCF響應基因的亞型被特異性減量調節的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發明提供使CBP和β-聯蛋白之間的結合被破壞，但是結構相關的輔激活物p300和β-聯蛋白之間的結合不被破壞的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發明提供使由CBP而非由p300啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。此外，本發明提供使由p300而非由CBP啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關方面，本發明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發明提供用化學試劑處理結腸癌細胞以使細胞周期G1階段的發育停滯的方法，其中延長用化學試劑進行處理誘發正常結腸細胞中檢測不到的細胞凋亡。
            
以下提供這些方法和試劑更為具體的細節。但是，在提供這些細節之前，提供以下定義以幫助讀者理解本發明的公開內容。
            
定義SEQ ID NO1是核酸序列tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcggacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac tcggccccgc cggtcccggg ccccacaaccgcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctcgccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaacttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcgaatgacagca cagattttgg atcattgttt gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg。
            
SEQ ID NO2是氨基酸序列MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDSTDFGSLFDLENDLPDELIPNGGELGLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSAN。
            
SEQ ID NO3是核酸序列ccttgtttgt gtgctaggct gggggggagagagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgcgggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg tcggagagag gcggcagggg ccagaacagtggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg cgacccccag ccccctcccg tccgcacacacccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc gtcgacgcta ggggggacca ttacataacccgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgctccagcactgg。
            
SEQ ID NO4是氨基酸序列MAENVVEPGPPSAKRPKLSSPALSASASDGTDFGSLFDLEHDLPDELINSTELGLTNGGDINQLQTSLGMVQDAASKHKQLSELLRSGSSPNLNMGVGGPGQVMASQAQQSSPGLGL。
            
小分子抑制劑術語“小分子”是指分子量低于約5,000g/mol的化學化合物。化合物可以是有機或無機的，可以是合成或天然的，例如，可以分類為肽、寡核苷酸、肽模擬物、寡核苷酸模擬物、寡糖、寡糖模擬物、天然產物類似物或衍生物，或者純合成的化合物，其可以包括例如一個或多個無環基、環狀基、碳環基、雜環基、多環基和/或芳香基。術語“抑制劑”是指將本文所公開的兩種多肽，例如β-聯蛋白與CBP或者β-聯蛋白與p300之間的結合抑制到統計學上顯著的程度的化合物。換句話說，與不存在抑制劑時發生的結合相比，在存在抑制劑的情況下將兩種多肽之間的結合降低到統計學上顯著的程度。優選地，該抑制足以實現對細胞性質的影響，例如接受小分子抑制劑的受試者內的治療反應。
            
β-聯蛋白CBP相互作用β-聯蛋白和CBP均為公知的多肽。例如，參見Morin，P.J.，Bioessays 211021-30(1999)和Hecht等人，EMBO J.191839-50(2000)。β-聯蛋白與CBP之間的相互作用已經過證明和測量。例如，參見Takemaru等人，J.Cell.Biol.149249-54(2000)。術語β-聯蛋白CBP相互作用是指這兩種蛋白之間發生的結合。
            
假定的在小分子已經被驗證具有例如β-聯蛋白/TCF激活轉導的調節物的活性之前，將小分子視為假定的調節物。當小分子表現出調節物活性時，那么可以將其稱為β-聯蛋白/TCF激活轉導的調節物。類似地，在小分子已經被驗證為如β-聯蛋白CBP相互作用之類的蛋白-蛋白相互作用的抑制劑之前，小分子可以被稱為β-聯蛋白CBP相互作用的假定抑制劑。
            
接觸當將兩種物質，如化學化合物、蛋白、寡核苷酸等均置于液體培養基，如水或緩沖液中，并且不限制它們在該培養基中的活動，則這兩種物質已經彼此相接觸。此外，當將兩種物質放置得彼此接近，使得兩種物質彼此觸及時，則這兩種物質彼此相接觸。進行化驗時，當例如將它們均置于化驗培養基中時，兩種物質彼此相接觸。
            
β-聯蛋白是指一種本領域公知得蛋白，例如參見Morin，P.J.，Bioessays 211021-30(1999)；Gottardi等人，Curr.Biol.11R792-4(2001)；Huber等人，Cell 105391-402(2001)。β-聯蛋白已經鑒定為胞質膜中細胞黏著的介體和轉錄激活物。
            
術語“化驗”是指在選定的條件下將各種物質(如化學品、酶等)彼此相接觸，并且將會引起或者將不引起可檢測現象的過程或方法。是否檢測到該現象則揭示關于各種物質和/或選定條件的信息。
            
術語“抑制結合”、“抑制相互作用”、“抑制復合體形成”和類似的術語均是指將兩種蛋白之間結合的強度、等級或程度降低到統計學上顯著的程度的作用。例如，當與兩種蛋白的未復合形式相比它們在復合形式中顯著更穩定時，可以發生強的結合。在定量和定性方面蛋白-蛋白結合研究在本領域是公知的。與β-聯蛋白結合有關的例子如下說明Brantjes等人，Biol.Chem.383255-61(2002，β-聯蛋白與T細胞因子(TCF)成員的結合)；Gottardi等人，Curr.Biol.11R792-4(2001)，說明了與結合配偶體相互作用的β-聯蛋白結構元件)；和Takemaru等人，J.Cell Biol.149249-54(2000，說明了β-聯蛋白與CBP的相互作用)。
            
術語“CBP蛋白”是指也稱為CREB結合蛋白的蛋白，這里的CREB是“cAMP-應答元件結合”的縮寫。該蛋白在本領域是公知的，例如參見Takemaru等人，J.Cell Biol.149249-54(2000)和美國專利第6,063,583號。
            
CBP 1-111是指從蛋白CBP的N-端識別的CBP的前111個氨基酸。從人體中分離的CBD氨基酸1-111如上文陳述為SEQ ID NO2。相應的核酸序列如上文陳述為SEQ ID NO1。從小鼠分離的CBP氨基酸1-111為SEQ ID NO5，其如下MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDNTDFGSLFDLENDLPDELIPNGELSLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSTN。來自小鼠的相應核酸序列為SEQ ID NO6，其如下atggccgaga acttgctggacggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc ggcttctccg cgaatgacaacacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt cctgatgagc tgatccccaa tggagaattaagccttttaa acagtgggaa ccttgttcca gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttcttagaggaggcag cggctctagc atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctgtgcaacaggg ccttggtggc caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac。
            
p3001-111是指從蛋白p300的N-端識別的p300的前111個氨基酸。從人體中分離的p300氨基酸1-111如上文陳述為SEQ ID NO4。編碼該肽的相應的核酸序列如上文陳述為SEQ ID NO3。
            
已知β-聯蛋白天然地與包括p300和CBP在內的許多種不同的蛋白相互作用，即形成復合體(例如，參見Hecht等人，EMBO J.191839-50(2000)。當存在多種不同的潛在結合配偶體時，β-聯蛋白將會與那些潛在的配偶體結合到不同的程度，其取決于β-聯蛋白與潛在結合配偶體之間的結合強度。當β-聯蛋白與那些結合配偶體中至少一種(第一結合配偶體)之間的結合程度相對于β-聯蛋白與那些結合配偶體至少另一種(第二結合配偶體)之間的結合程度減少時，發生β-聯蛋白結合的選擇性抑制。這一結合的相對降低可以看作β-聯蛋白與第一結合配偶體之間的結合降低，而不影響β-聯蛋白與第二結合配偶體之間的結合；或者它可以看作β-聯蛋白與第一結合配偶體之間的結合降低，而β-聯蛋白與第二結合配偶體之間的結合增加；或者它可以看作β-聯蛋白與第一結合配偶體之間的結合降低，同時β-聯蛋白與第二結合配偶體之間的結合降低，只要β-聯蛋白與第一結合配偶體之間結合的降低大于β-聯蛋白與第二結合配偶體之間結合的降低。
            
術語“p300蛋白”是指本領域公知的蛋白。例如，參見Gusterson，R.J.等人，J.Biol.Chem.2003Feb 28；278(9)6838-47；An和Roeder，J.Biol.Chem.2003 Jan 17；278(3)1504-10；Rebel，V.I.等人，Proc NatlAcad Sci USA.2002 Nov 12；99(23)14789-94；和美國專利第5,658,784號，以及其中所引用的參考文獻。
            
基本上提純是指核酸或多肽是分離的，并且基本不含其它核酸或多肽，即所述的核酸或多肽是主要活性成分。本文所用的術語“分離的”是指從在其天然態下與其正常結合的基本上所有其它分子中分離出的分子。基本上提純和分離的分子是制備中存在的主要物種。基本上提純的分子可以多于60％，優選75％，更優選90％，最優選95％不含其它天然混合物中存在的分子(排除溶劑)。術語“分離的”不是要包括在其天然態中存在的分子。
            
短語“結合CBP與p300的可能性”是指β-聯蛋白分子結合CBP與p300的概率。通過指定條件下結合CBP的β-聯蛋白分子的數目與結合p300的β-聯蛋白分子數目的比例，可以表達和/或測量這種概率。類似地，“改變β-聯蛋白結合CBP與p300可能性”的試劑是指與反應混合物中不存在化合物時的比例相比，當反應混合物中存在該化合物時改變上述比例的化合物。
            
術語“細胞分化而不是增殖的可能性”是指細胞分化而不是增殖的概率。通過指定條件下分化細胞數目與增殖細胞數目的比例，可以表達和/或測量這種概率。“增加細胞分化而不是增殖的可能性”的試劑是指與不存在化合物時的分化細胞數目與增殖細胞數目的比例相比，當存在該化合物時增加該同樣比例的化合物。類似地，“增加細胞增殖而不是分化的可能性”的試劑是指與不存在化合物時的增殖細胞數目與分化細胞數目的比例相比，當存在該化合物時增加該同樣比例的化合物。
            
短語“Wnt途徑”是指可以通過Wnt蛋白(分泌的糖蛋白)與卷曲的七跨膜跨度(seven-transmembrane-span)受體結合引發的信號級聯。這一途徑在本領域中是已知的，并且進行了表征，它是大量文章和綜述的主題(例如，參見Huelsken和Behrens，J.Cell Sci.1153977-8，2002；Wodarz等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.1459-88(1998)；Morin，PJ.，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，Science 2961644-46(2002)；Oving等人，Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002)；Sakanaka等人，Recent Prog.Horm.Res.55225-36，2000)。
            
短語“Wnt途徑的活性”是指該途徑至少一個組分的活性。例如，在某些實施方式中，Wnt途徑的活性可以指β-聯蛋白在誘發靶基因表達中的活性。Wnt途徑的許多成分在本領域中是已知的，其包括但不限于Cerberus(Cer)、FrzB、Dickkopf(DKK)、LRP、異源三聚G蛋白、Dsh、酪蛋白激酶Iα(CKIα)、GSK3β、βTrCP、ACP、軸蛋白、CBP、p300、β-聯蛋白、TCF、Froucho等。
            
“激活Wnt途徑”的化合物是指當存在于具有Wnt途徑的系統中時，導致β-聯蛋白誘發靶基因表達的化合物。許多β-聯蛋白誘發其表達的靶基因在本領域中是已知的，其包括但不限于Conductin、Myc、Twin、細胞周期蛋白D1、Nkd、Ubx、En-2、PPARδ、Xbra、ID2、Siamois、Xnr3、MMP7、TCF-1、存活蛋白等。這些基因也可以稱為“Wnt/β-聯蛋白途徑靶向的基因”。
            
短語“選擇性抑制Wnt/β-聯蛋白途徑靶向基因的表達”是指抑制Wnt/β-聯蛋白途徑靶向基因的亞型的表達，但是不抑制其它Wnt/β-聯蛋白途徑靶向的基因的表達。盡管不想受任何特定機理的束縛，本發明的發明人推測可以通過破壞β-聯蛋白與其某些但并非全部潛在的結合配偶體之間的結合，來實現基因表達的選擇性抑制。
            
試劑一方面，本發明提供可用于上述方法的試劑。除化合物1之外，其它可用于本發明方法的試劑可以通過對通式(I)的化合物進行篩選來鑒別 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
在一個實施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環己基C0-2烷基。
            
在一個實施方式中，E的R1、R2、R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的殘余部分，而A的R3、B的R4或D的R5選自氨基酸側鏈部分或其衍生物。
            
在另一個實施方式中，A的R3、D的R5、E的R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的殘余部分，而在B的R1、R2和R4中的一個或多個，并且在一個方面其全部表示氨基酸側鏈。在這種情況下，術語“化合物的殘余部分”表示共價結合到回折擬態結構的R3、R5、R6、R7、R8和/或R9位置的任何分子部分、試劑、化合物、載體、分子、連接基團、氨基酸、肽或蛋白質。該術語也包括氨基酸側鏈部分及其衍生物。
            
這里所使用的術語“化合物的殘余部分”表示共價結合到回折擬態結構的任何分子部分、試劑、化合物、載體、分子、原子、連接基團、氨基酸、肽或蛋白質。該術語也包括氨基酸側鏈部分及其衍生物。在本發明的一個方面，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和/或R9中的任意一個或多個位置可以表示化合物的殘余部分。在本發明的一個方面，R1、R2和R4中的一個或多個表示氨基酸側鏈部分或其衍生物。
            
這里所使用的術語“氨基酸側鏈部分”表示任何天然蛋白質中所存在的氨基酸側鏈部分，包括(但是不限于)表1中載明的天然氨基酸的側鏈部分。本發明的其它天然氨基酸側鏈部分包括(但是不限于)3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羥賴氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸。此外，在本發明的實際應用中也可以使用糖基化的氨基酸側鏈，包括(但是不限于)糖基化的蘇氨酸、絲氨酸和天門冬酰胺。
            
表A氨基酸側鏈部分氨基酸-H甘氨酸-CH3丙氨酸-CH(CH3)2纈氨酸-CH2CH(CH3)2亮氨酸-CH(CH3)CH2CH3異亮氨酸-(CH2)4NH3+賴氨酸-(CH2)3NHC(NH2)NH2+精氨酸  
            
組氨酸-CH2COO-天門冬氨酸-CH2CH2COO-谷氨酸-CH2CONH2天門冬酰胺-CH2CH2CONH2谷酰胺   苯丙氨酸酪氨酸  色氨酸-CH2SH半胱氨酸-CH2CH2SCH3甲硫氨酸-CH2OH絲氨酸-CH(OH)CH3蘇氨酸脯氨酸羥基脯氨酸除天然氨基酸側鏈部分外，本發明的氨基酸側鏈部分還包括它們的各種衍生物。這里所使用的氨基酸側鏈部分的“衍生物”包括天然氨基酸側鏈部分的變體和/或變異。例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸側鏈部分通常可以被歸類為低鏈烷基、低鏈芳基或低鏈芳烷基部分。氨基酸側鏈部分的衍生物包括其它直鏈或支鏈的、環狀或非環狀的、取代或非取代的、飽和的或非飽和的低鏈烷基、低鏈芳基或低鏈芳烷基部分。
            
這里所使用的“低鏈烷基部分”含有1-12個碳原子，“低鏈芳基部分”含有6-12個碳原子，而“低鏈芳烷基部分”含有7-12個碳原子。因此，在一個實施方式中，氨基酸側鏈衍生物選自C1-12烷基、C6-12芳基和C7-12芳烷基，并且在一個更優選的實施方式中，其選自C1-7烷基、C6-10芳基和C7-11芳烷基。
            
本發明的氨基酸側鏈衍生物進一步包括低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分的取代衍生物，其中取代基選自(但是不限于)以下化學部分的一個或多個-OH、-OR、-COOH、-COOR、-CONH2、-NH2、-NHR、-NRR、-SH、-SR、-SO2R、-SO2H、-SOR和鹵素(包括F、Cl、Br和I)，其中各個R的存在獨立地選自直鏈或支鏈的、環狀或非環狀的、取代或非取代的、飽和或不飽和的低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分。此外，本發明的環狀低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分包括萘，以及雜環化合物，例如噻吩、吡咯、呋喃、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷、吡啶、嘧啶、嘌呤、喹啉、異喹啉和咔唑。氨基酸側鏈衍生物進一步包括低鏈烷基和低鏈芳烷基部分的烷基部分的雜烷基衍生物，包括(但是不限于)烷基和芳烷基的磷酸酯和硅烷。
            
代表性的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9部分具體包括(但是不限于)-OH、-OR、-COR、-COOR、-CONH2、-CONR、-CONRR、-NH2、-NHR、-NRR、-SO2R和-COSR，其中各個R的存在如上所述。
            
在另一個實施方式中，除了可以是氨基酸側鏈部分或其衍生物(或者R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是化合物的殘余部分)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是促進化合物與另一個部分或化合物連接的連接基團。例如，本發明的化合物可以連接到一種或多種用于診斷或篩選化驗的公知化合物上，例如生物素。此外，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是將化合物連接到固體載體(例如在固相肽合成中所使用的載體)上的連接基團。在此實施方式中，連接到另一個部分或化合物上、或者到固體載體上，優選在R1、R2、R7或R8、或者R9位置上，更優選在R1或R2位置上。
            
在A是-(CHR3)-、B是-(C＝O)-、D是-(CHR5)-、E是-(C＝O)-并且G是-(XR7)n-的實施方式中，本發明的回折擬態化合物具有下式(II)  
            
  其中R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如上所述。在優選實施方式中，R1、R2和R7表示化合物的殘余部分，并且R3或R5選自氨基酸側鏈部分。
            
在A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-、G是-(C＝O)-(XR9)-的實施方式中，本發明的回折擬態化合物具有下式(III) 其中R1、R2、R4、R6、R9、W和X如上所述，Z是氮或CH(當Z是CH時，則X是氮)。在優選實施方式中，R1、R2、R6和R9代表化合物的殘余部分，并且R4選自氨基酸側鏈部分。
            
在更具體的實施方式中，其中A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-并且G是(XR7)n-，本發明的回折化合物具有下式(IV) 其中R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如上所述，并且Z是氮或CH(當Z是氮時，則n是0，當Z是CH時，則X是氮并且n不是0)。在優選實施方式中，R1、R2、R6和R7代表化合物的殘余部分，并且R4選自氨基酸側鏈部分。在一個方面，當Z和X都是CH時，R6或R7選自氨基酸側鏈部分。
            
這些化合物可以通過使用合適的起始組分分子(下文中稱為“組分片段”)而制備。簡單的說，在具有式(I)的回折擬態結構的合成中，使第一和第二組分片段偶聯以形成結合的第一-第二中間體，如果必要，使第三和/或第四組分片段偶聯以形成結合的第三-第四中間體(或者，如果商品化，可以使用單獨的第三中間體)，然后使結合的第一-第二中間體與第三-第四中間體偶聯以提供第一-第二-第三-第四中間體(或者第一-第二-第三中間體)，將該中間體環化從而生成本發明的回折擬態結構。或者，式(I)的回折擬態結構可以通過單獨的組分片段在溶液中逐步地，或者如固相肽合成中所常用的一樣通過固相合成，進行連續偶聯而制備。
            
制備本發明的化合物的具體組分片段及其組裝如圖8所示。例如，“第一組分片段”可以具有下式S1 其中R2如上所述，并且R是適用于肽合成的保護基，其中該保護基可以連接到聚合載體上以使固相合成能夠進行。合適的R基團包括烷基，并且在優選實施方式中，R是甲基。在圖8中，R基團之一是聚合(固體)載體，在該圖中顯示為“Pol”。這種第一組分片段可以通過H2N-R2和CH(OR)2-CHO的還原性胺化作用，或者通過H2N-R2與CH(OR)2-CH2-LG(其中LG代表離去基團，例如鹵素(Hal)基團)之間的取代反應而容易地合成。
            
“第二組分片段”可以具有下式S2 其中P是適用于肽合成的氨基保護基團，L1是羥基或羧基-活化基團，并且R4如上所述。優選的保護基團包括叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)，叔丁氧基羰基(BOC)、甲氧基羰基(MOC)、9H-芴甲氧羰基(FMOC)，和丙烯氧基羰基(Alloc)。N-保護的氨基酸是商品化的；例如可從各種來源得到FMOC氨基酸。為使第二組分片段與第一組分片段反應，L1是羧基-活化基團，并且通過本領域中公知的羧基活化方法可以容易地完成羧基到活化羧基的轉換。合適的活化羧酸基團包括酸鹵，其中L1是例如氯或溴的鹵素；酸酐，其中L1是例如乙酰基的酰基；活性酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯和五氟苯基酯；以及其它活性中間體，例如使用例如二環己基碳二亞胺(DCC)的碳二亞胺在偶聯反應中形成的活性中間體。因此，市售的N-保護氨基酸可以通過本領域技術人員公知的手段轉化為羧酸活性形式。
            
在氨基酸的疊氮衍生物充當第二組分片段的情況下，這種化合物可以通過Zaloom等人所公開的反應(J.Org.Chem.465173-76，1981)，由相應的氨基酸制備。
            
或者，本發明的第一組分片段可以具有下式S1’ 其中R如上所定義，并且L2是離去基團，例如鹵原子或甲苯磺酰基，并且本發明的第二組分片段可以具有下式S2’ 其中R2、R4和P如上所定義。
            
本發明的“第三組分片段”可以具有下式S3 其中G、E、L1和L2如上所定義。合適的第三組分片段可以是各種來源的市售產品，或者可以通過有機化學中公知的方法制備。
            
在圖8中，式(1)的化合物的A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-并且E是-(CR6)-。如圖9所示，其中的羧基在B位并且R基團在B位的式(1)的化合物，即，其中A是-(CHR3)-并且B是-(C＝O)-的化合物，可以用與圖8所示方法類似的方法制備。圖9也說明了向第一-第二-第三組分中間體中加入第四組分片段，而不是在與第一-第二中間體片段反應之前將第四組分片段附在第三組分片段上。此外，圖9說明了其中D是-(CHR5)-(而不是圖8所示的-(C＝O)-)并且E是-(C＝O)-(而不是圖8所示的-(CHR6)-)的本發明的化合物的制備過程。最后，圖9說明了其中G是NR7的化合物的制備過程。
            
因此，如上所述，式(I)的回折擬態化合物可以通過以下方法合成，使第一組分片段與第二組分片段反應從而生成結合的第一-第二中間體，然后繼續使結合的第一-第二中間體與第三組分片段反應以提供結合的第一-第二-第三-第四中間體，然后使該中間體環化以生成回折擬態結構。
            
式(III)和(IV)的回折擬態結構可以通過與以上公開的模塊化組分合成相類似的技術而制備，但是對組分片段進行適當的更改。
            
例如，可以通過以下通式說明用于本發明的化合物 其中，R1為具有8至11個環成員的二環芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子，R2為5至7元單環芳香環，其可以具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，而且化合物中的芳環可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基。
            
優選地，R1為萘基、喹啉基或異喹啉基，R2為苯基、吡啶基或哌啶基。更優選地，R1為萘基，R2為苯基。
            
在另一優選的實施方式中，化合物具有如下的(6S，10R)-構型 其中R1和R2與前述具有相同的含義。在另一優選的實施方式中，通式(I)的化合物具有如圖1A所示的化學結構，該化合物在本文中稱為化合物1。可以根據授予Molecumetics Ltd.的美國專利第6,184,223號的公開內容制備具有通式(I)的化合物。前述討論是在化合物1的活性方面進行的，但是，在本方法中可以對結構式(I)的其它化合物進行活性篩選。
            
以下文獻中可以找到其它用于本發明的示范性試劑PCT申請公開第WO03/031448號、美國專利公開第US20040072831號、美國申請第10/803,179和10/826,972號，其標題均為“回折擬態及其相關方法”(“Reverse-Turn Mimetics and Method Relating Thereto”)。
            
核酸分子一方面，本發明提供各種核酸分子，其編碼可用于篩選試劑的多肽，與β-聯蛋白和p300之間的相互作用相比，該試劑選擇性地抑制β-聯蛋白和CBP之間的相互作用。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長人(或小鼠)CBP蛋白。如本文所使用，兩種核酸的百分比同源性使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-10，1990)的BLAST程序以默認參數確定。這些程序運行Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7，1993)修改的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8，1990)中的算法。例如，BLAST程序可以自網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，核酸分子編碼含有天然CBP序列(如人CBP或小鼠CBP)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，核酸分子含SEQ ID NO1或SEQ ID NO6。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內的片段與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內的片段與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內的片段與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長人p300蛋白。在某些實施方式中，核酸序列編碼含有天然p300序列(如人p300或小鼠p300)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，核酸分子含SEQ ID NO3。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長p300蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內的片段與SEQ ID NO3片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO3的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內的片段與SEQ ID NO3片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，核酸分子編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO3的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內的片段與SEQ ID NO3片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，核酸序列編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
根據本發明的核酸分子可以通過用限制性內切酶或其它核酸酶來消化對全長CBP和p300蛋白編碼的核酸分子而得到。編碼全長CBP和p300蛋白的核酸分子可以從基因組DNA或cDNA中通過本領域已知的作法分離(參見Sambrook和Russell，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001)。可以使用對應于SEQ ID NO1、3或6區域的核酸探針篩選基因組或cDNA庫。適于篩選基因組或cDNA庫的核苷酸通常長度為20-40個堿基，并可以用多種有助于檢測的分子進行標記(如放射性核素、酶標記、蛋白標記、熒光標記或生物素)。基因組和cDNA庫可以在多種適當的載體中構建，其包括質粒、噬菌體、酵母人工染色體和黏端質粒載體。另外，庫可以從市場上購買(如Clontech，Palo Alto，CA)。
            
也可以使用其它方法獲得根據本發明的核酸分子。一種優選的方法是進行聚合酶鏈式反應，以擴增期望的編碼CBP和p300蛋白的核酸分子區域(例如編碼含CBP或p300前111個氨基酸殘基的多肽的區域)。例如，PCR擴增的具體方法見于Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates andWiley-Interscience，NY 1995。
            
另一種獲得核酸分子的方法是通過使用能夠結合CBP 1-111或p300 1-111的多肽探針的表達克隆。所述探針可以包括針對CBP 1-111、p300 1-111或其片段的抗體。表達克隆方法描述于Sambrook和Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience，NY 1995；和Blackwood和Eisenman，Methods in Enzymology 254229-40，1995。
            
還可以使用合成化學技術制造本發明的多聚核苷酸，得到本文所公開的序列。遺傳密碼的簡并使得可以存在另外的編碼SEQ ID NO1、3或6中所列的氨基酸序列的核苷酸序列。所有這些核苷酸序列均在本發明的范圍之內。
            
編碼CBP或p300片段的核酸序列可以與多種異源序列融合，例如編碼親和性標記(如GST和His-tag)的序列和編碼分泌信號的序列。與編碼親和性標記的序列融合使人們可以通過融合標記進行親和性提純，有助于所編碼多肽的提純。與編碼分泌信號的序列融合使人們可以從細胞溶解產物、壁膜間隙、韌皮部，或者從生長或發酵培養基中回收多肽，也有助于所編碼多肽的提純。適用的分泌信號是廣泛存在的，并且在本領域中是公知的(例如von Heijne，J.Mol.Biol.18499-105，1985)。
            
如上文所述，本發明的核酸分子還可以包括SEQ ID NO1、3或6中列出的天然核酸分子的變異體(包括等位基因)。這種變異體包括天然變異體(例如簡并形式、多態性、剪接變異體或突變體)和本領域中已知的基因工程產生的變異體。
            
多肽序列一方面，本發明提供多種用于篩選試劑的多肽分子，與β-聯蛋白和p300之間的相互作用相比，該試劑選擇性地抑制β-聯蛋白和CBP之間的相互作用。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2(或SEQ ID NO5)或者與SEQ ID NO2(或SEQ IDNO5)的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的肽，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白(如人或小鼠CBP)。如本文所使用，兩種肽的百分比同源性使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-10，1990)的BLAST程序以默認參數確定。這些程序運行Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad Sci.USA 905873-7，1993)中修改的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8，1990)的算法。例如，BLAST程序可以自網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，根據本發明的多肽包括含有天然CBP序列(如人CBP或小鼠CBP)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，多肽分子含SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內的片段與SEQ ID NO2片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成。在不同的最佳實施方式中，所述肽與SEQ ID NO2的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內的片段與SEQ ID NO2片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述的肽與SEQ ID NO2的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內的片段與SEQ ID NO2片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長人p300蛋白。在某些實施方式中，多肽包括含有天然p300序列(如人p300或小鼠p300)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述的多肽含SEQ ID NO4。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長p300蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內的片段與SEQ ID NO4片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽組成。在不同的最佳實施方式中，所述的肽與SEQ ID NO4的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內的片段與SEQ ID NO4片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述的肽與SEQ ID NO4的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成的。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內的片段與SEQ ID NO4片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優選的實施方式中，所述的肽結合β-聯蛋白。
            
在某些實施方式中，本發明的多肽包含保守氨基酸變換，即，替換SEQ ID NO2或4中帶相似電荷或不帶電荷的氨基酸。保守氨基酸變換涉及將一種氨基酸替換成側鏈結構相關的氨基酸類別中的另一種氨基酸。天然氨基酸通常分為四類酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、堿性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、非極性(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、和不帶電荷的極性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時也歸類為芳香氨基酸。非天然氨基酸也可用于形成本發明的多肽。
            
本發明還提供CBP或P300融合蛋白，其包括融合到含有一種或多種異源多肽的氨基酸序列上的CBP或P300片段或其同源物。這種異源多肽可以對應于任何來源的天然多肽，或者可以是重組工程產生的氨基酸序列。融合蛋白可用于提純、產生針對氨基酸序列的抗體，并用于多種化驗系統。常用于融合蛋白構建的蛋白包括β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)、自身熒光蛋白，包括藍色熒光蛋白(BFP)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、熒光素酶、辣根過氧化物酶(HRP)和氯霉素乙酰轉移酶(CAT)。此外，融合蛋白的構建中可以使用附加表位，其包括組氨酸(His)標記、FLAG標記、流感血凝素(HA)標記、Myc標記、VSV-G標記和硫氧還蛋白(Trx)標記。其它的融合結構可以包括麥芽糖結合蛋白(MBP)、S-標記物、Lex aDNA結合結構域(DBD)融合、GAL4 DNA結合結構域融合、和單純皰疹病毒(HSV)BP 16蛋白融合。
            
本發明的多肽可以通過各種本領域已知的方法得到。例如，可以通過例如親和力色譜的生化方法分離含SEQ ID NO2(或SEQ ID NO4)的CBP(或p300)片段。可用于CBP或p300多肽的親和基質可以是其上連有針對SEQ ID NO2或4或其片段制得的抗CBP或抗p300單克隆或多克隆抗體的固相。或者，可以將已知的結合CBP或p300(如β-聯蛋白)的多肽用作分離CBP或p300多肽或其片段的親和基質。
            
其它分離CBP、p300或其片段的生化方法包括制備性凝膠電泳、凝膠過濾、親和力色譜、離子交換和反相色譜、層析聚焦、等電聚焦和蔗糖或甘油密度梯度(Deutscher，Methods in EnzymologyGuide toProtein Purification，第182卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Chapter38，1990；Balch等人，Methods in Enzymology，第257卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Chapter 8，1995)。
            
根據本發明的多肽也可以通過化學合成，如固相肽合成法產生(Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.852149，1964)。也可以使用本領域公知的標準液相法來合成含SEQ ID NO2或4或其同源物的多肽(Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin，1984；Bodanszky，Peptide Chemistry，Springer-Verlag，Berlin，1993)。可以分離新合成的多肽，例如通過高效液相色譜，并且可以使用質譜或氨基酸序列分析對其進行表征。
            
根據本發明的多肽也可以通過重組DNA法產生。可以將本發明提供的編碼SEQ ID NO2或4或其同源物的核酸克隆到適當的表達載體中。這種載體有市售，或者可以由本領域技術人員構建，并含有轉錄和翻譯所必需的表達元件。如果適當的話，所選的載體也可以用于原核或真核宿主體系中，只要表達和調控元件的來源是相容的。例如，可以使用具有針對SEQ ID NO2或4或其片段的抗體的親和力色譜、離子交換色譜、HPLC、尺寸排阻色譜、硫酸銨結晶、電共焦、或制備性凝膠電泳來分離宿主細胞中產生的或者由細胞分泌的重組多肽(主要參見Ausubel等人，見上文；Sambrook等人，見上文)。通常，分離提純的蛋白在考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠上證實為單條帶。
            
本發明還提供含SEQ ID NO2或4或其同源物和異源多肽的融合蛋白。這種融合蛋白可以通過將兩個蛋白片段共價連接，或者通過分子生物學領域的標準方法制得。例如，如本領域已知，可以使用重組DNA法制備融合蛋白，這通過生成含編碼序列的DNA結構，該編碼序列選自SEQ ID NO2或4，并在合適的閱讀框架中使核苷酸編碼第二個蛋白片段并在宿主細胞中表達DNA結構。許多構建融合蛋白的試劑盒可以獲自為研究實驗室提供實驗工具的公司，例如，其包括Promega Corporation(Madison，WI)、Stratagene(La Jolla，CA)、Clontech(Mountain View，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)、MBL International Corporation(MIC；Watertown，MA)、和QuantumBiotechnologies(Montreal，Canada；1-888-DNA-KITS)。
            
使用方法本發明提供結構式(I)的化合物，其抑制β-聯蛋白/TCF誘導的轉錄亞型。例如，如實施例中所詳述，化合物1選擇性地阻斷β-聯蛋白和CBP的相互作用，卻不干擾β-聯蛋白和p300的相互作用，其中p300與CBP密切相關。化合物1處理導致β-聯蛋白從核到胞質的重新分布，選擇性地抑制CBP與某些靶基因(如c-myc和細胞周期蛋白D1)的啟動子的結合，從而抑制這些基因的表達。此外，化合物1選擇性地激活轉化中，但是不正常的結腸細胞中的凋亡胱天蛋白酶，導致癌細胞的G1/S期停滯，并降低轉化的結直腸細胞的增殖。因此，本發明的化合物可以具有多種用途，例如治療癌癥、降低腫瘤生長、增加細胞凋亡、調控β-聯蛋白誘發的基因表達和類似用途。
            
一方面，本發明提供相對于β-聯蛋白/p300的相互作用，選擇性地抑制β-聯蛋白/CBP相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，其中所述的組合物包括β-聯蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯蛋白/p300的相互作用，選擇性地抑制β-聯蛋白/CBP的相互作用。
            
另一方面，本發明提供相對于β-聯蛋白/CBP的相互作用，選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，其中所述組合物包括β-聯蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯蛋白/CBP的相互作用，選擇性地抑制β-聯蛋白/p300的相互作用。某些化合物1的類似物對于β-聯蛋白/p300復合體是選擇性的。
            
蛋白-蛋白相互作用(如β-聯蛋白與p300之間的相互作用、和β-聯蛋白與CBP之間的相互作用)、以及試劑對蛋白-蛋白相互作用的影響，可以通過本領域已知的任何合適方法表征和/或測量。這些方法可以包括使用親和力提純的重組β-聯蛋白、CBP和p300蛋白或其片段的體外結合化驗。在某些實施方式中，可以將一種蛋白組分首先固定在固體載體(如ELISA板)，以便于蛋白-蛋白相互作用的檢測和測量。蛋白-蛋白相互作用還可以使用體內結合化驗表征，例如免疫沉淀法和蛋白質印記分析，如實施例中所述。
            
另一方面，本發明提供促進β-聯蛋白從核易位至胞液的方法，該方法包括向細胞中加入化合物，所述細胞包括核和胞液，所述的核含有β-聯蛋白，而且所述化合物導致β-聯蛋白從核易位至胞液。β-聯蛋白從核易位至胞液可以通過免疫熒光分析檢測，如實施例中所述。
            
另一方面，本發明提供選擇性地抑制WNT/β-聯蛋白途徑靶向基因的表達的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有WNT/β-聯蛋白途徑靶向的基因，所述化合物導致WNT/β-聯蛋白途徑靶向基因表達的變化。
            
如上文所述，本發明提供影響CBP啟動的基因表達的方法，并在優選的實施方式中提供優先于影響p300啟動的基因表達而影響CBP啟動的基因表達的方法。本發明還提供影響p300啟動的基因表達的方法，并在優選的實施方式中提供優先于影響CBP啟動的基因表達而影響p300啟動的基因表達的方法。考慮到CBP與p300之間的結構相似性，和許多本領域技術人員將CBP和p300視為生物功能基本相同這一事實，本發明尤其值得注意。該效力可以應用于諸如存活蛋白表達的影響。
            
一方面，本發明提供調節β-聯蛋白誘發的基因表達的方法，該方法包括使組合物與試劑接觸，這里的組合物包含β-聯蛋白、CBP和p300，β-聯蛋白具有結合CBP與p300的可能性，而且所述試劑以有效改變β-聯蛋白結合CBP與p300的可能性的量存在。在示范性方面，調節的形式可以是增加CBP與β-聯蛋白的結合，并任選地同時降低p300與β-聯蛋白的結合。或者，調節的形式可以是增加p300與β-聯蛋白的結合，并任選地同時降低CBP與β-聯蛋白的結合。所述的組合物可以是細胞。
            
所關注的基因表達和試劑對這些基因表達的影響可以通過本領域已知的任何適當方法進行。這些方法包括使用cDNA微點陣、具有擴增所關注基因用的引物的RT-PCR、和測量所關注基因的啟動子驅動的報道基因活性和ChIP化驗。
            
另一方面，本發明提供調節Wnt途徑活性的方法，其包括(a)使(i)含Wnt途徑組分的組合物與(ii)激活Wnt途徑的化合物相接觸，以提供激活的Wnt途徑；和(b)用完全或基本上干擾p300與β-聯蛋白之間結合，但是極少或者不干擾CBP與β-聯蛋白之間結合的化學試劑調節Wnt途徑的活性。
            
另一方面，本發明提供促進細胞增殖的方法，其包括(a)在一定比例的群體增殖且一定比例的群體分化的條件下提供細胞群體；和(b)向群體中加入化學試劑，在此所述試劑導致增殖細胞的比例相對于分化細胞的比例增加。
            
細胞增殖和細胞分化可以通過本領域已知的任何適當方法進行表征。這些方法包括流式細胞分析和軟瓊脂化驗，如實施例中所述。
            
另一方面，本發明提供將干細胞保持在未分化狀態下的方法，其包括使干細胞與抑制細胞分化或促進細胞增殖的試劑相接觸，所述試劑的量對于將干細胞保持在未分化狀態下是有效的。在某些實施方式中，所述試劑能夠降低β-聯蛋白與p300之間的相互作用，而不干擾β-聯蛋白與CBP之間的相互作用。
            
干細胞療法為治療多種變形疾病提供了可能，這些變形疾病是由特定細胞類型過早死亡或功能失常且機體不能將其替換或恢復所導致的。干細胞的可能治療用途包括器官移植患者的免疫調節、如肌肉營養不良、多發性硬化和類風濕性關節炎之類的自身免疫病的治療、如中風、骨髓損傷和燒傷之類的受損組織的修復、如Lou Gehrig氏病之類的神經變形疾病和如帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病之類的神經系統病癥的治療、白血病、鐮形細胞貧血、心臟病和糖尿病的治療。對于大多數干細胞療法來說，可以在體外培養胚胎干細胞或成熟干細胞，誘導其分化成期望的細胞類型并移值到患者體內。對了干細胞的成功培養來說，干細胞需要保持未分化狀態。
            
為了將干細胞保持在未分化狀態下，可以在不同的干細胞培養階段使用根據本發明的化合物，例如促進細胞增殖或抑制細胞分化的化合物。例如，這種化合物可以在從其來源組織中分離干細胞時使用。或者，可以在一定的培養期之后將其加入到培養基中。它還可以持續存在于培養基中，將干細胞保持在未分化狀態下。通過將化合物的量調節到使干細胞保持在未分化狀態，或者與不存在化合物時培養的干細胞相比干細胞的分化得以降低，并且細胞培養的其它方面(例如細胞生存率和細胞增值率)不受有害影響的水平，可以對化合物的濃度進行優化。
            
本發明的這些和其它方法可以用化學試劑實施，例如本文識別為化合物1的化學試劑以及它的類似物。
            
篩選化驗可以根據以下方法對結構式(I)的化合物以及其它試劑進行本文所述的活性的篩選。
            
例如，一方面，本發明提供鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含CBP 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯蛋白的部分與步驟(a)的含CBP 1-111的部分相結合；以及(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制所述含CBP 1-111的部分與含β-聯蛋白的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含p3001-111的部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
另一方面，本發明提供鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含β-聯蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含CBP 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含CBP 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯蛋白的部分相結合；以及(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制所述含β-聯蛋白的部分與含CBP 1-111的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含p3001-111的部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
另一方面，本發明提供鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含有(1)與CBP 1-111結合的β-聯蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使CBP 1-111從β-聯蛋白上分離；以及(c)當確定步驟(a)的所述小分子使β-聯蛋白與CBP 1-111的結合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含p3001-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制所述含p300 1-111的部分與β-聯蛋白相結合；以及(f)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
一方面，本發明提供鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含p300 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯蛋白的部分與步驟(a)的含p300 1-111的部分相結合；以及(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制所述的含p300 1-111的部分與含β-聯蛋白的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含CBP1-111的部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
另一方面，本發明提供鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含β-聯蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含p300 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含p300 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯蛋白的部分相結合；以及(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制所述的含β-聯蛋白的部分與含p300 1-111的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含CBP 1-111的部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
另一方面，本發明提供鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含有(1)與p300 1-111相結合的β-聯蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使p300 1-111從β-聯蛋白上分離；以及(c)當確定步驟(a)的所述小分子使β-聯蛋白與p300 1-111的結合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制所述含CBP 1-111的部分與β-聯蛋白相結合；以及(f)當確定步驟(d)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
蛋白-蛋白相互作用(如β-聯蛋白與p300之間的相互作用、和β-聯蛋白與CBP之間的相互作用)、以及試劑對蛋白-蛋白相互作用的影響，可以通過本領域已知的任何適當方法表征和/或測量。例如，用于本發明的方法的適當化驗手段為等溫滴定量熱法(ITC)。ITC實驗可以使用MicroCal MCS等溫滴定量熱儀(MicroCal，Northampton MA)基本上按照制造商所建議進行。簡言之，將CBP C1片段針對含50mMPIPES(pH7.5)和0.1mM EDTA的透析緩沖液進行廣泛透析。向蛋白樣品中加入DMSO至0.05％的最終濃度，以對應于稀釋的藥物樣品。使用Bradford蛋白化驗(Bio-Rad laboratories，Hercules CA)測定蛋白濃度，其使用牛血漿γ球蛋白作為標準物(Bio-Rad)。由于溶解性的限制，通過將5-15ul CBP C1[223uM]注入到充有23.3uM假定的小分子抑制劑的樣品細胞中進行ITC實驗。假定的小分子抑制劑在樣品細胞中飽和之后評估稀釋熱，并且使用Origin 5.0軟件包(MicroCal)計算熱力學參數。稀釋熱越高表明假定的小分子抑制劑與CBP片段之間的結合越強。假定的小分子抑制劑與CBP片段之間的較強結合鑒別出可以更有效地破壞CBP結合，例如CBP與β-聯蛋白結合的小分子。
            
藥物組合物和給藥可以將根據本發明的核酸分子、肽和化合物加入到適于給藥的藥物組合物中。這種組合物典型地含核酸分子、肽或化合物和藥學可接受的載體。“藥學可接受的載體”是指與藥物給藥相容的溶劑、分散介質、覆層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物活性物質的介質和試劑的使用是本領域公知的。也可以將輔助活性化合物加入到組合物中。
            
可以將本發明的藥物組合物腸胃外、局部、口服或定位給藥以進行治療處理。可以使用多種水相載體，例如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸和類似物，也可以包括其它提高穩定性的蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。生成的組合物可以通過傳統的公知滅菌技術進行滅菌。可以將溶液包裝備用，或者在無菌條件下過濾并凍干，給藥之前將凍干的制劑與無菌溶液混合。
            
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。可以將它們包封在明膠膠囊中，或者壓入到藥片中。為了口服治療給藥，可以將活性化合物與賦形劑結合，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。組合物可以包括藥物相容的粘合劑和/或佐劑材料作為其一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑和類似物可以含有任意的下列成分或性質相似的化合物粘合劑(如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠)；賦形劑(如淀粉或乳糖)、分裂劑(如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉)；潤滑劑(如硬脂酸鎂或Sterotes)；助流劑(如膠狀二氧化硅)；甜味劑(如蔗糖或糖精)；或調味劑(如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑)。
            
對于吸入式給藥，可以將化合物從加壓容器或分配器中以氣溶膠噴霧的形式輸送，該加壓容器或分配器含有適當的推進劑，例如二氧化碳之類的氣體，或者噴霧器。
            
可以通過經粘膜或經皮方式進行系統給藥。對于經粘膜或經皮給藥，制劑中使用適于待滲透載體的滲透劑。這些滲透劑通常是本領域已知的，例如，對于經粘膜給藥，其包括去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜給藥可以通過使用鼻用噴霧或栓劑完成。對于經皮給藥，如本領域通常己知，可以將活性化合物配制到油膏、軟膏、凝膠或乳劑中。
            
在一個實施方式中，活性化合物與保護化合物在機體內不被迅速排泄的載體一起制備，例如可控釋放制劑，其包括植入物和微膠囊輸送系統。可以使用可生物降解并且生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制備方法對本領域的技術人員來說是顯而易見的。材料也可以購自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.。
            
尤其有利的是以便于給藥的劑量單位形式配制劑量均勻的口服或腸胃外組合瓦。本文所用的劑量單位形式是指物理上分散的、適合作為待治療受試者單一劑量的單位；每單位含有預定量的活性化合物，該預定的量計算成與需要的藥物載體結合產生期望的治療效果。對本發明的劑量單位形式的具體要求直接依賴于以下幾個方面并由其指示活性化合物的獨特性質和待實現的具體治療效果，以及配制這種個體治療用活性化合物的技術本身的限制。
            
這些化合物的毒性和治療效力可以通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥物方法測定，例如測定LD50(50％的群體致死的劑量)和ED50(50％的群體治療有效的劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比即為治療指數，其可以表達為比值LD50/ED50。表現出大的治療指數的化合物是優選的。盡管可以使用表現出有毒副作用的化合物，應當小心地設計將這種化合物靶向受侵襲組織處的輸送系統，以便將對未受染細胞的潛在損害降至最低，從而減輕副作用。
            
細胞培養物化驗和動物研究中得到的數據可以用于配制用于人的劑量范圍。這種化合物的劑量優選地處于包括ED50而毒性很小或無毒的循環濃度范圍以內。劑量可以取決于所采用的劑量形式和所利用的給藥途徑在該范圍內變化。對于任何用于本發明方法的化合物來說，治療有效劑量可以最初從細胞培養物化驗來評估。可以在動物模型中配制劑量以達到包括細胞培養物中測定的IC50(即實現半數癥狀最大抑制的測試化合物的濃度)的循環血漿濃度范圍。這種信息可以用于更精確地測定可用于人的劑量。血漿中的水平可以通過例如高效液相色譜測量。
            
以下實施例用來對本發明進行說明，其不應當理解為對本發明的限定。
            
制備實施例制備實施例1(N-Fmoc-N’-R3-肼基)-乙酸的制備(1)N-Fmoc-N’-甲基肼的制備 為2L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和鈣管。加入硫酸甲基肼(20g，139mmol，其中R3是甲基)的THF(300mL)溶液，并且加入DiBoc(33g，153mmol)的THF溶液。經2小時，用加料漏斗滴加入飽和碳酸氫鈉水溶液(500mL)，同時劇烈攪拌。6小時后，緩慢加入Fmoc-C1(39g，153mmol)的THF溶液。所得到的懸浮液在0℃下攪拌6小時。用乙酸乙酯(EA，500mL)萃取該混合物，并且保留有機層。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發。無需純化進行下一步。
            
為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和鈣管。加入由前步得到的產物在MeOH(300mL)中的溶液，并且用加料漏斗緩慢加入濃鹽酸(30mL，12N)，同時在冰水浴中用磁力進行攪拌，并且攪拌過夜。用EA(1000mL)萃取該混合物并且保留有機層。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發。通過用正己烷和EA重結晶來對殘余物進行純化，從而得到N-Fmoc-N’-甲基肼(32.2g，83％)。1HNMR(DMSO-D6)δ7.90～7.88(d，J＝6Hz，2H)，δ7.73～7.70(d，J＝9Hz，2H)，7.44～7.31(m，4H)，4.52～4.50(d，J＝6Hz，2H)，4.31～4.26(t，J＝6Hz，1H)，2.69(s，1H)。
            
(2)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁基酯的制備    
            
為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和連接到鈣管的回流冷凝器。加入N-Fmoc-N’-甲基肼(20g，75mmol)的甲苯(300mL)溶液。緩慢加入溴乙酸叔丁酯(t-butylbromo acetate，22g，111mmol)的甲苯(50mL)溶液。緩慢加入Cs2CO3(49g，149mmol)。緩慢加入NaI(11g，74mmol)同時劇烈攪拌。在回流溫度下將反應混合物攪拌1天。過濾產品混合物并且用EA(500mL)萃取。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發。用己烷∶EA＝2∶1的溶液通過色譜對產品進行純化以得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(19.8g，70％)。
            
1H-NMR(CDCl3-d)δ7.78～7.75(d，J＝9Hz，2H)，δ7.61～7.59(d，J＝6Hz，2H)，7.43～7.26(m，4H)，4.42～4.40(d，J＝6Hz，2H)，4.23(b，1H)，3.57(s，2H)，2.78(s，3H)，1.50(s，9H)。
            
(3)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸的制備 為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和連接到鈣管的回流冷凝管。加入(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(20g，52mmol)。緩慢加入鹽酸溶液(150mL，在二氧己環中的4M溶液)，同時在冰水浴中劇烈攪拌。反應混合物在室溫下攪拌1天。在減壓下于40℃下將該溶液完全濃縮。加入飽和NaHCO3水溶液(100mL)，并且用乙醚(100mL)洗滌水層。在0℃下緩慢滴加濃鹽酸(pH2-3)。萃取該混合物并且保留有機層(500mL，MC)。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發。用正己烷和乙酸乙酯通過重結晶對殘余物進行純化，從而得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)乙酸(12g，72％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ12.38(s，1H)，8.56(b，1H)，7.89～7.86(d，J＝9Hz，2H)，7.70～7.67(d，J＝9Hz，2H)，7.43～7.29(m，4H)，4.29～4.27(d，J＝6Hz，2H)，4.25～4.20(t，J＝6Hz，1H)，3.47(s，2H)，2.56(s，3H)。
            
制備實施例2(N-Moc-N’-R7-肼基)-乙酸的制備(1)(N’-甲氧基羰基-肼基)乙酸乙基酯的制備  
            
  將MOC-NH-NH2(50g，0.55mol)溶解在DMF(300ml)中，然后向反應容器中加入溴乙酸乙酯(68ml，0.555mol)和碳酸鉀(77g，0.555mol)。將該混合物加熱到50℃并保持5小時。反應完成后，將該混合物過濾，并且用EtOAc稀釋，然后用鹽水洗滌(3次)。粗產品用柱純化(洗脫液Hex/EtOAc＝4/1)，從而得到72克無色的油。
            
(2)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸乙基酯 將乙基酯(10g，0.05mol)、碳酸鉀(6.9g，0.05mol)和R7-溴(14.1g，0.06mol)溶解在DMF(200ml)中，并且將該混合物加熱到50℃并保持5小時。反應完成后，將該混合物過濾，并且用EA稀釋，然后用鹽水洗滌(3次)。用色譜純化粗產品(洗脫液Hex/EtOAc＝4/1)。
            
(3)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸 將烷基化的乙基酯(9.5g，0.03mol)溶解在THF/水(1/1，ml)中，并且在0℃下加入2N的NaOH(28.3ml)溶液。在室溫將該混合物攪拌2小時。當在紫外下檢測不到起始的酯時，用EA稀釋該溶液，然后分離。用1N的鹽酸將水層酸化到pH3～4，并且用DCM萃取化合物(3次)。合并的有機層經MgSO4干燥后進行蒸發，得到黃色固體。
            
制備實施例3  
            
  (1)Nβ-Moc-Nα-芐基-肼基甘氨酸的制備 該化合物是根據文獻的程序而制備的。(Cheguillaume等，Synlett2000，3，331)。
            
(2)1-甲氧基羰基-2，8-二芐基-6-甲基-4，7-二氧-六氫-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪的制備將溴乙縮醛樹脂(60mg，0.98mmol/g)和芐胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在配有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用轉爐[RobbinsScientific]將該反應混合物振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂，從而得到第一組分片段。
            
將Fmoc-丙氨酸(4當量，市售，第二組分片段)，HATU(PerSeptiveBiosystems，4當量)和DIEA(4當量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到樹脂中。在室溫下將反應混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將該反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
將Nβ-Moc-Nα芐基-肼基甘氨酸(4當量，制備實施例2中的化合物(3)，其中R7是芐基，第三組分片段)、HOBT[Advanved ChemTech](4當量)和DIC(4當量)的DMF溶液加入到以上制備的樹脂中。在室溫下將反應混合物振蕩3小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
            
在室溫下用甲酸(2.5ml)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產品。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.51(d，3H)，2.99(m，1H)，3.39(d，1H)，3.69(m，1H)，3.75(m，1H)，3.82(s，3H)，4.02(d，1H)，4.24(d，1H)，4.39(d，1H)，4.75(d，1H)，5.14(q，1H)，5.58(dd，1H)，7.10-7.38(m，10H)。
            
制備實施例4 實施例2R2＝-Bn，R4＝-CH3實施例3R2＝-CH3，R4＝-CH3(1)N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯的制備 迅速地攪拌在15ml的CH2Cl2中的N-甲基肼羧酸9H-芴-9-基甲基酯(107mg，0.4mmol)和15ml的飽和NaHCO3水溶液的冰冷卻的兩相混合物，同時加入在甲苯中的1.93M光氣(1.03ml，2mmol)作為單獨的部分。將反應混合物攪拌30分鐘，收集有機相，并且用CH2Cl2萃取水相。合并的有機相經MgSO4干燥后，過濾，真空濃縮以得到作為泡沫狀固體的128mg(97％)氨基甲酰氯。[警告光氣蒸汽劇毒。
            
在通風櫥中使用]。該產品無需進一步純化即用于以下的固相合成。
            
(2)2，5-二甲基-7-芐基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(30mg，0.98mmol/g)和芐胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用轉爐[RobbinsScientific]將反應混合物振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂，以得到第一組分片段。
            
將Fmoc-丙氨酸(3當量，第二組分片段，市售)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3當量)和DIEA(3當量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到樹脂中。在室溫下將反應混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂，從而將第二組分片段加入到第一組分片段上。
            
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
將上述步驟(1)中所獲的N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯(結合的第三和第四組分片段，5當量)、DIEA(5當量)的DCM溶液加入到上述制備的樹脂中。在室溫下將反應混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂加入10ml)。在室溫下將反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
在室溫下用異氰酸芐酯(4當量)和DIEA(4當量)在DCM中的混合物對該樹脂進行4小時的處理。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
            
在室溫下用甲酸將該樹脂處理14小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產品。
            
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.98(s，3H)，3.18(m，1H)，3.46(m，1H)，4.37-4.74(m，5H)，5.66(dd，1H)，6.18(m，1H)，7.10-7.40(m，10H)。
            
制備實施例52，5，7-三甲基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備根據制備實施例4所述的相同程序制備題述化合物，但是使溴乙縮醛樹脂與甲基胺溶液進行反應而非芐胺。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.99(s，3H)，3.03(s，3H)，3.38(m，1H)，3.53(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.52(q，1H)，4.59(dd，1H)，5.72(dd，1H)，6.19(br.t，1H)，7.10-7.38(m，5H)。
            
制備實施例62-甲基-5-(對羥基苯甲基)-7-萘甲基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(30mg，0.98mmol/g)和萘甲胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。使用轉爐[RobbinsScientific]將反應混合物在60℃下振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF、然后用DCM清洗該樹脂，從而得到第一組分片段。
            
向該樹脂中加入Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3當量)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3當量)和DIEA(3當量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液。在室溫下將反應混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂，從而將第二組分片段加入到第一組分片段上。
            
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
向以上制備的樹脂中加入N’-Fmoc-N-肼基碳酰氯(5當量)、DIEA(5當量)的DCM溶液。在室溫下將反應混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM、和DMF清洗該樹脂。
            
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂中加入10ml)。在室溫下將反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
在室溫下用異氰酸芐酯(4當量)和DIEA(4當量)在DCM中的混合物將該樹脂處理4小時。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
            
在室溫下用甲酸將該樹脂處理14小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產品。
            
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.80-2.98(m，5H)，3.21-3.37(m，2H)，4.22-4.52(m，2H)，4.59(t，1H)，4.71(d，1H)，5.02(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.51(d，1H)，6.66(t，2H)，6.94(dd，2H)，7.21-8.21(m，12H)。
            
制備實施例72-甲基-6-(對羥基苯甲基)-8-萘基-4，7-二氧-六氫-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(60mg，0.98mmol/g)和萘胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。使用轉爐[Robbins Scientific]將反應混合物在60℃下振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂。
            
將Fmoc-Tyr(OBut)-OH(4當量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4當量)和DIEA(4當量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到該樹脂中。在室溫下將反應混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
將Nβ-Fmoc-Nα-芐基-肼基甘氨酸(4當量)、HOBT[AdvancedChemTech](4當量)和DIC(4當量)的DMF溶液加入到以上制備的樹脂中。在室溫下將反應混合物振蕩3小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂。向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂中10ml)。在室溫下將反應混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
            
在室溫下用異氰酸芐酯(4當量)和DIEA(4當量)在DCM中的混合物將該樹脂處理4小時。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂后，在室溫下用甲酸(2.5ml)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產品。
            
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.73(s，3H)，3.13(d，1H)，3.21-3.38(m，3H)，3.55(d，1H)，3.75(t，1H)，4.22(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.79(d，1H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.68(d，2H)，6.99(d，2H)，7.21-8.21(m，12H)；MS(m/z，ESI)564.1(MH+)586.3(MNa+)。
            
實施例質粒CBP和p300的缺失構造在市售的pTriEx-3載體(Novagen，Madison，WI)中表達。鼠CBP的缺失系列通過PCR從Vollum Institute，Portland，OR的Dr.Richard Goodman慷慨贈送的全長小鼠CBP質粒產生。擴增的區域在5’-端具有BamH I部位，在3’-端具有Not I部位，使人們可以用表達載體pTriEx-3的ATG進行框內克隆。為了進行識別和提純，也可以對質粒在COOH-端用6X-組氨酸和單純皰疹病毒(HSV)標記物進行框內克隆。用于克隆CBP C-端切除構造的正向引物為5′-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGATGGCCGAGAACTTGCTG-3′(SEQ IDNO7)。用于CBP-C1(1-334)、-C2(1-634)、-C3(1-1594)、-C4(1-2062)、-C5(1-2623)、-C6(1-3094)、-C7(1-3694)的反向引物為C15′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCC-GCGTTTGTACTGTTCGGCTG-3′(SEQ IDNO8)，C25′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCTCC-ATTCATGACTTGAGC-3′(SEQ ID NO9)，C35′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCGTTTTT-CAGGGTCTGC-3′(SEQ ID NO10)，C45′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC AGCTGGTAAAGC-TGGCTG-3′(SEQ IDNO11)，C55′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCATGTTGGAGAGAGGGC-AT-3′(SEQ ID NO12)，C65′-CGTGTATA CAGCTGTGCGGCCGCAGAACCTTGTAAATCCTC-3′(SEQ ID NO13)，C75′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCTGTAGTAGGCTGCATC-3′(SEQ IDNO14)。CBP的N-端切除構造用以下反向引物生成5′-GTATACAGCTGTGCGGCCGCCAAACCCTCCACAAACTTTTC-3′(SEQ ID NO15)。CBP-C8(4081-7324)、-C9(4534-7324)、-C10(5074-7324)、-C11(5674-7324)、C12(6282-7324)、-C13(6754-7324)的正向引物為C85′-GATATCTGAGCTCG-TGGATCCGGAAGCTGGGGAGGTTTTT-3′(SEQ ID NO16)，C95′-GATATCTGAGCTCGTGGAT-CCGAAGAAGATGCTGGACAAG-3′(SEQ ID NO17)，C105′-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGTCC AAATGGTCCACTCTG-3′(SEQ ID NO18)，C115′-GATATCTGAGCTCGTGGAT CCGTCTCCTACCTCAGCACCA-3′(SEQ ID NO19)，C125′-GATATCTGAGCTC GTGGATCCGAACATCCTTAA-ATCAAAC-3′(SEQ ID NO20)，C135′-GATATCTGAGCCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATG-CAA-3′(SEQ ID NO21)。使用C-端切除構造的正向引物和N-端切除構造的反向引物，將全長小鼠CBP擴增并克隆到pTriEx-3載體中。通過使用以下經PAGE提純的正向引物，由全長CBP的PCR生成CBP(Δ1-111+NLS)，所述引物在CBP的NLS序列(劃線部分)上游含有BamH I部位5′-ATCTGAGCTCGTGGATCCGGGACCGCCCAACCCCAAACGAGCCAAACTCCAGCCGAACAGTACAAACATGGCCAGCTTA-3′(SEQ ID NO22)，其使用的反向引物是上文所述用于生成CBP N-端切除構造的引物。將插入片段克隆到pTriEx-3質粒的BamH I-Not I部位中。
            
p300的缺失構造通過PCR從Dr.David Livingston(Harvad，MA)慷慨贈送的人p300質粒(CMVβ-p300-CHA)生成。將PCR產物克隆到pTriEx-3載體的Hind III-Not I部位中。C-端切除的p300構造的正向引物為5′-GACGGTACCGGTTCGAAGCTTA-TGGCCGAGAATGTGGT-G-3′(SEQ ID NO23)。p300-P1(1-334)、p300-P2(1-634)和p300-P3(1-1054)的反向引物如下P15′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC-CAAACCTAATC CAGGACT-3′(SEQ ID NO24)，P2CGTG-TATACAGCTGTGCGGCCGCGTTGCCAGCACTTCCCAT-3′(SEQ IDNO25)，P3CGTGTATACA-GCTGTGCGGCCG CGGCCTGTTCCCGGCGCTG-3′(SEQ ID NO26)。
            
通過將4個串聯的TCF4結合部位(CCAACCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCAG-GAATTCGGTTGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGTCCTTAAG)(SEQID NO27)插入到pGL3質粒(Promega)的SV40啟動子上游的XhoI-Kpn I部位中，生成β-聯蛋白/TCF報道基因質粒，該SV40啟動子驅動下游熒光素酶基因的表達。
            
所有引物均購自Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)。克隆用的限制性內切酶加了下劃線，其購自New England Biolabs，Beverly，MA。
            
細胞培養于37℃下，將人結腸癌細胞系SW480和HCT116以及正常結腸細胞CCD18Co(ATCC，Manassas，VA)在5％CO2的氣氛中補充有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen Gibco-BRL，Baltimore，MD)中生長。
            
轉染將指數生長的SW480和HCT116細胞(105)在24孔平板或100-mm的圓盤中培養，并分別用0.5μgβ-聯蛋白/TCF報道基因和濃度漸增的效應物質粒或10μg表達載體轉染。將細胞按照說明用FuGENE6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)或Superfect(Qiagen，Valencia，CA)轉染。根據NE-PER試劑盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)所述的方法制得核抽提物。
            
熒光素酶化驗使用雙熒光素酶化驗系統(Promega)按照說明在轉染過后16-24小時在20μl細胞溶解產物上進行各組的熒光素酶化驗。使用濃度漸增的空白表達載體pTriEx-3進行標準化。
            
軟瓊脂化驗通過對之前所述方法(Moody等人，“A vasoactive intestinal peptideantagonist inhibits non-small cell lung cancer growth，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.904345-49(1993))進行修改，對SW480細胞進行軟瓊脂集落形成化驗。
            
向6孔平板(Nalge Nunc International，Roskide，Denmark)的每個孔(35mm)上覆蓋1ml含10％胎牛血清的DMEM培養基中的0.8％底層瓊脂。固化之后，向每孔中加入1ml含0.4％頂層瓊脂、10％胎牛血清、雙倍濃度化合物的DMEM培養基和5,000個存活細胞。將培養物于37℃下在5％CO2增濕培養箱中培育。每天檢測軟瓊脂上的集落，培育8天后進行拍照。對直徑＞60μm的集落進行計數。
            
免疫沉淀將細胞用含20mM Hepes pH7.9、100mM NaCl、0.5mM EDTA、0.5％Nonidet P-40、6mM MgCl2、5mM 2-巰基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物(Roche Molecular Biochemicals)的溶胞緩沖液在冰上溶解30分鐘，并通過離心澄清。將全細胞溶解產物在室溫下與特定的抗體一起培育，對于CBP-C1，使用獲自Santa Cruz Biotechnology，Inc.的A-22抗體；對于p300-P1，使用N-15抗體(Santa CruzBiothchnology，Inc.Santa Cruz，CA)；對于全長內源β-聯蛋白，使用預先結合在蛋白A-瓊脂糖小珠(Pierce，Rockford，IL)上的單克隆抗體(Transduction Laboratories，Lexington，KY)。將免疫復合體在HB S(100-150mM NaCl，如所指出，10mM Hepes pH7.9、5mM 2-巰基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物)中洗滌數次，然后進行蛋白質免疫印跡，見下文。然后用含(20mM Hepes pH7.9、500mM NaCl、和5mM含1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物的2-巰基乙醇)的緩沖液將小珠洗滌7次。
            
Pull-down化驗在室溫下，將25-100μM生物素化的化合物2在含50％DMSO和50％蛋白結合緩沖液PBB(20mM Hepes pH7.9、20％甘油、0.5mMEDTA、60mM NaCl、6mM MgCl2、0.1％Nonidet P-40、5mM 2-巰基乙醇、和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物)的緩沖液中與100μl50％的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠漿(Amersham Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL)結合過夜。將小珠用PBB洗滌3次，除去未結合的化合物2。將100-200μl含過量表達的質粒的全細胞溶解產物(見免疫沉淀部分)與小珠一起在室溫下培養3-4小時，或者在4℃下培養過夜。然后將小珠在PBB緩沖液中洗滌3次，然后對洗脫的蛋白進行SDS-PAGE電泳和蛋白質免疫印跡，見下文。在競爭化驗中，如每次實驗中所指出，將過量的化合物1與溶解產物在室溫下預培養1小時。
            
ChIP化驗SW480細胞的甲醛交聯和染色質免疫沉淀化驗如之前所述進行(Barley等人，“Acetylation of p53 activates transcription throughrecruitment of coactivators/histone acetyltransferases”，Mol.Cell 81243-54(2001)；E1-Osta等人，“Analysis of chromatin-immunopurifiedMeCP2-associated fragments”，Biochem.Biophys.Res.Commun.289733-37(2001)；Shang等人，“Formation of the androgen receptortranscription Complex”，Mol.Cell 9601-10(2002))。用于c-myc和細胞周期蛋白D1啟動子PCR的引物如下c-myc正向引物5′-TGGTAGGCGCGCGTAGTTA-3′(SEQ ID NO28)和反向引物5′-GGGCGGAGATTAGCGAGAG-3′(SEQ ID NO29)。細胞周期蛋白D1正向引物5′-TGCTTAACAACA-GTAACGT-3′(SEQ ID NO30)和反向引物5′-GGGGCTCTTCCTGGGCAGC-3′(SEQ ID NO31)。這些ChIP引物在靠近轉錄起始部位的啟動子區內，設計成TCF4結合結構域下游的大約20至30個堿基對。PCR產物的大小為大約200個堿基對。抗CBP抗體，AC-26，由Dr.David Livingston慷慨贈送。
            
蛋白質印跡化驗將上述免疫復合體在SDS-PAGE上分離，之后將其轉移到immobilon-P膜(PVDF)(獲自Millipore，Bedford，MA)。將膜用TBST(15mM Tris/HCl，pH7.4、0.9％NaCl和0.05％吐溫20)中5％的脫脂奶粉阻斷，之后用特定抗體進行印跡。使用獲自Qiagen Inc.的抗His抗體進行pTriEx-3中制成的蛋白的檢測。使用綴合在辣根過氧化物(Santa Cruz Biotechnology Inc.)上的第二抗體進行檢測。使用ECL檢測試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)對免疫印跡進行分析。
            
免疫熒光使用免疫熒光法研究CBP和β-聯蛋白在經化合物1(25μM)或對照物(0.5％DMSO)處理的SW480和HCT116細胞中的定位。對對數期的細胞進行接種，24小時后將細胞用化合物1或對照物處理。處理過后24小時，對細胞進行固定。將蓋玻片與分別針對CBP(A-22)(Santa Cruz Biotechnology)和β-聯蛋白(Transduction Laboratories)培養的抗體一起培養。涂上綴合在FITC或TRITC(JacksonImmunoResearch，Westgrove，PA)上的第二抗體之后，使用Nikon PCM2000激光掃描共焦顯微鏡對薄片進行檢測。
            
流式細胞分析(FACS)對于FACS分析，將約5×106出自PNRI處理或載體處理的細胞用70％的冷乙醇固定，并在-20℃下保存至少30分鐘。將細胞用1×PBS洗滌一次，在室溫下用碘化丙錠(PI)溶液(85μg/ml碘化丙錠、0.1％Nonidet P-40、10mg/ml RNAse)培養30分鐘。使用BeckmanCoulter EPICS XL-MCL流式細胞儀對每個樣品獲取10,000染色細胞，通過Expo32ADC軟件(Coulter Corporation，Miami，Florida，33196)測定處于細胞周期不同階段的細胞的百分比。
            
蛋白提純將CBP(1-111)和p300(1-111)表達為具有6X-His標記物的融合蛋白，并使用它們的6X-His標記物從細菌溶解產物中親和提純。將轉移的細菌沉淀(1L培養物)重新懸浮在5-10ml溶胞緩沖液(20mMHepes pH7.9、150mM NaCl、0.1％Nonidet P-40、5mM 2-巰基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物)中。將細胞通過超聲處理溶解。將澄清的溶解產物與500μl Ni-NTA-瓊脂糖小珠(Qiagen)在4℃下培養1小時。將結合的蛋白用500μl洗脫緩沖液(20mM Hepes pH7.9和150mM NaCl、1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物、5mM 2-巰基乙醇和250mM咪唑)洗脫。將洗脫出的蛋白分成等分試樣冷凍。
            
實時反向轉染-PCR分析使用RNeasy Midi試劑盒(Qiagen)進行RNA提取，并根據SYBRGreen PCR Master Mix試劑盒(Perkin Elmer Biosystems，Shelton，CT)提供的方案進行實時RT-PCR。用于細胞周期蛋白D1、軸蛋白2、hnkd、c-myc、c-jun和fra-1擴增的引物為細胞周期蛋白D1正向引物5′-AGATCGAAGC-CCTGCTG-3′(SEQ ID NO32)反向引物5′-AGGGGGAAAGAGCAAAGG-3′(SEQ ID NO33)生成大小約300bp的產物；軸蛋白2正向引物5′-GTGTGAGGTCCAC GGAAA-CT-3′(SEQ IDNO34)和反向引物5′-CTCGGGAAATGAGGTA-GAGA-3′(SEQ IDNO35)；hnkd正向引物5′-CTGGCTGCTGCTACCACCA TTGCGT-3′(SEQ ID NO36)和反向引物5′-CCAGGCCCAAATTGGG ACGT-3′(SEQ ID NO37)；c-myc正向引物5′-GAA-GAAATTCGAGCTGCTGC-3′(SEQ ID NO38)和反向引物5′-CACATACAGTCCTGGATGAT-G-3′(SEQ ID NO39)；c-jun正向引物5′-AGATGCCCGGCGAGACACCG-3′(SEQ ID NO40)和反向引物5′-AGCCCCCGACGGTCTCTTT-3′(SEQ ID NO41)；fra-1正向引物5′-ACC-CCGGCCAGGAG-TCATCCGGGCCC-3′(SEQ ID NO42)和反向引物5′-AGGCGCCTCACAAAGCGAGGAGGG-TT-3′(SEQ ID NO43)。使用β-肌動蛋白進行標準化。β-肌動蛋白的引物為正向引物5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′(SEQ ID NO44)和反向引物5′-CGTCATACTCCTCCTTGCYGATCCACA TCTGC-3′(SEQ ID NO45)。各組引物在95℃下擴增10分鐘，進行40個95℃下15秒和60℃下1分鐘的循環。
            
胱天蛋白酶-3活性化驗將SW480、HCT116和CCD18Co細胞在處理之前以每孔(96孔平板)105細胞放置24小時。向每孔中加入25μM化合物1或對照物(0.5％DMSO)。處理過后24小時，將細胞溶解，并使用胱天蛋白酶-3/7活性試劑盒(Apo-One同源胱天蛋白酶-3/7化驗，#G77905，Promega)測量胱天蛋白酶活性。通過從實驗測得的數值減去空白(對照物，無細胞)的單位值得到相對熒光單位(RFU)。
            
表1顯示了對用化合物1(25μ)或對照物(0.5％DMSO)處理4、8或24小時的SW480細胞進行實時反向轉錄-PCR(RT-PCR)分析的定量結果。在每個時間點，對1μg mRNA進行實時RT-PCR。測量內源細胞周期蛋白D1、c-myc、纖連蛋白、hnkd、軸蛋白2、c-jun和BMP-4相對于β-肌動蛋白的表達水平。通過各組平均值減去相應的獲白β-肌動蛋白的平均值，測定Δ閾值周期(Cycle of Threshold，CT)值的量。所有實驗均進行兩份。
            
化合物1通過靶向CBP來對抗β-聯蛋白/TCF轉錄由于APC突變，SW480結腸癌細胞表現出β-聯蛋白到核的組成性易位，并因此表現出高的基部(basal)β-聯蛋白/TCF轉錄，如通過TOPFLASH報道基因系統所評估(Korinek等人，“Constitutivetranscriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/-coloncarcinoma”，Science 2751784-87(1997))。相關的報道基因用于對二級結構模板小分子庫(Ogbu等人，“Highly efficient and versatilesynthesis of libraries of constrained b-stranrd mimetics”，Bioorg.Med.Chem.Lett.82321-26(1998)；Eguchi等人，“Solid-phage synthesis andstructural analysis of Bicyclic β-Turn mimetics incorporating functionalityat the i to i+3positions”，Amer.Chem.Soci.10222031-32(1999))進行β-聯蛋白/TCF介導的轉錄抑制劑的篩選。對于最初的篩選，我們選擇IC50為5μM(圖1B)的化合物1(圖1A)，并且其相對于許多其它的包括NFAT(圖1C)、CRE和AP-1(數據未顯示)在內的依賴CBP的報道基因具有極好的選擇性。化合物1在β-聯蛋白磷酸化位點有缺陷、但是表達野生型APC的HCT116細胞中表現出類似活性(數據未顯示)。
            
為了確定化合物1的分子靶底，我們對其進行衍生化以用作親和試劑，得到化合物2(圖1A)。用化合物1或載體進行預處理之后，從SW480細胞中制備核抽提物，然后與化合物2一起培養。然后將復合體在鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠上進行分離，并進行凝膠電泳。SW480細胞的核抽提物在化合物2親和柱上保留的主要條帶表觀分子量為225KDa，并通過免疫印跡法鑒別為CREB結合蛋白(CBP)(圖1D)。化合物1特異性地洗脫結合到化合物2的CBP(圖1D，比較條帶7與8)，而且在親和力色譜之前將核抽提物與化合物1(20μM)一起預培養阻斷了CBP的結合(圖1D，條帶9)。所用的抗體對CBP是特異性的，不會與p300交叉反應。因此，這些數據表明化合物1結合CBP。
            
進一步進行一系列研究以進一步確認化合物1結合CBP。通過在合成中加入14C-標記的酪氨酸，合成化合物1的14C-標記型。將未經β-聯蛋白或CBP表達載體轉染或者經其轉染的SW480細胞的核溶解產物，用14C-標記化合物1、以及DMSO或冷化合物1一起處理過夜。然后使用G-25柱對細胞溶解產物進行脫鹽處理，除去未結合的14C-標記化合物1，并測量放射性的結合。如圖1E所示，與對照物相比(圖1E，比較條帶2與6)，用CBP轉染的核溶解產物結合的14C-標記化合物增加了大約4-6倍，其以依賴劑量的方式被冷化合物1競爭掉(圖1E，比較條帶6與7&8)。
            
基于這一證據，推斷出化合物1結合CBP。因此，本發明一方面提供一種方法，其包括將含CBP的組合物與試劑混合，其中該試劑結合CBP。對CBP的結合干擾了CBP另外可能發生的任何其它結合反應。因此，本發明提供通過與CBP結合處理受試者的方法，其包括用有效量的試劑為對其有需要的受試者給藥。
            
化合物1特異性地與CBP的前111個氨基酸相互作用使用生物素化的類似物化合物2(圖1A)描繪CBP與化合物1結合所必需的最小區。將含過量表達的CBP片段(圖2B，上圖)的細胞溶解產物與預先與化合物2結合的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培養數小時。然后從小珠上洗脫結合的蛋白，對其進行凝膠電泳并使用抗His抗體進行免疫印跡，以檢測結合的CBP片段。如圖所示(圖2B，下圖)，與化合物2特異性結合的最小區是CBP的NH2-端氨基酸1-111(比較條帶2、3和4與其它條帶)。如共免疫沉淀實驗所預計，檢測不到與SW480細胞中過量表達的任何p300片段的結合(數據未顯示，見下文)。當在SW480細胞中過量表達CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)連同p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)時(圖2C，下圖)，過量的化合物1強烈競爭掉CBP片段的結合(圖2C，上圖，比較條帶4-6與7-9)，但是對p300片斷的結合沒有任何影響(圖2C，比較條帶10-12與13-15)。因此，可以看出化合物1結合CBP的前111個氨基酸而不是相關蛋白p300。
            
為了排除CBP與化合物1之間由其它細胞組分介導的直接聯合的可能性，并對直接結合進行測驗，我們使用6X-His標記大腸桿菌(E.coli)表達的蛋白(圖2D，右)對CBP(1-111)和p300(1-111)進行親和力提純。使用結合在鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠上的化合物2，我們闡明了CBP(1-111)而不是p300(1-111)對化合物2的特異性結合，其可以被過量的化合物1競爭掉(圖2D，右，比較條帶3-5和6-8)。該數據證實了CBP(1-111)與化合物1之間在體外的直接結合。由于化合物1與大腸桿菌中表達的CBP結合，這便降低了CBP為結合化合物1需要被哺乳動物激酶磷酸化的可能性。
            
利用構造物CBP(Δ1-111+NLS)進一步證實了CBP氨端所發揮的關鍵作用。盡管全長CBP的表達以依賴劑量的方式恢復了化合物1(25μM)對β-聯蛋白/TCF啟動子活性的抑制，CBP(Δ1-111+NLS)的表達則沒有影響(圖2E)。
            
因此，本發明一方面提供調節β-聯蛋白誘發的基因表達的方法，該方法包括使組合物與試劑接觸，其中該組合物包含β-聯蛋白、CBP和p300，并且試劑以有效降低β-聯蛋白與CBP的結合而對β-聯蛋白與p300的結合影響極小或沒有影響的量與組合物接觸。
            
化合物1與β-聯蛋白競爭CBPCBP是許多轉錄進程中的限速因素。如圖3A所示，濃度漸增的CBP而非β-聯蛋白的轉染，以依賴劑量的方式提高化合物1(12.5μM)的IC50。進行SW480細胞中的免疫沉淀化驗，以確定化合物1破壞β-聯蛋白與CBP的結合。β-聯蛋白與CBP的免疫沉淀被化合物1以依賴濃度的方式抑制(圖3B，比較條帶2、3和4，條帶1是對照物，未加抗體)。化合物1與CBP的結合是非常特異性的，因為盡管CBP與p300高度同源，該化合物并未干擾β-聯蛋白與p300的結合(圖3B，下圖，比較條帶2-4)。
            
為了進一步確認上述的β-聯蛋白/CBP相互作用，用上述的CBP和p300缺失構造(圖2A)對SW480細胞進行轉染。隨后洗滌小珠之后，CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)以及p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)保持特異性結合在免疫沉淀的β-聯蛋白上(圖3C，比較條帶2-4與5-15)。這些結合研究強調CBP與p300的NH2-端的前111個氨基酸均與β-聯蛋白結合。為了確認這一區域與化合物1的CBP結合部位重疊，我們在存在過量化合物1的情況下評估CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)以及p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)與β-聯蛋白的結合。圖3D的下圖顯示這些片段在SW480細胞中的表達水平是可比的。暴露于過量的化合物1大大地競爭去結合在β-聯蛋白上的片段，而對結合在β-聯蛋白上的p300片段則沒有影響(圖3D，上圖，比較條帶4-9與10-15)。從顯示的數據可以看出，化合物1特異性地結合在區分兩種高度同源的輔激活物CBP與p300的CBP氨基端(1-111氨基酸)上，并且競爭掉β-聯蛋白與CBP的相互作用。
            
這些結合研究突出了作為與β-聯蛋白相互作用的最小區的CBP和p300前111個氨基酸。對這些區域的序列排比顯示出與之前發表的發現于TCF、APC和E-鈣黏著蛋白中的β-聯蛋白結合基序的驚人相似性(圖3E和3F)。序列排比數據強烈顯示CBP像其它β-聯蛋白相互作用蛋白那樣，包埋了β-聯蛋白結合所需的帶負電氨基酸的保守序列端。
            
化合物1降低核β-聯蛋白檢測β-聯蛋白和CBP的亞細胞分布，以確定其定位是否受化合物1的影響。SW480細胞中的大多數內源β-聯蛋白在核內發現為CBP(圖4A)。用化合物1處理導致β-聯蛋白易位至SW480細胞中其中內源E-鈣黏著蛋白的表達受限的胞質(圖4A，比較上圖的對照物與下圖的經處理的細胞)(de Vries等人，“In vivo and in vitro invasion in relation tophenotypic characteristics of human colorectal carcinoma cells”，Br.JCancer 71271-77(1995))。用核轉運抑制劑細霉素B的處理消除了化合物1誘導的β-聯蛋白的胞質轉運，這表明圖4A中觀察到的β-聯蛋白的核輸出是由于化合物1對β-聯蛋白/CBP復合體的破壞(數據未顯示)。因此，我們推斷破壞β-聯蛋白與CBP的結合導致β-聯蛋白的核水平降低。通過蛋白質免疫印記分析觀察了化合物1誘導的β-聯蛋白從SW480細胞的核易位至胞質(圖4B)。
            
通過β-聯蛋白靶基因調節分化并利用輔激活物細胞周期蛋白D1基因在許多不同腫瘤類型中不適當地表達，已知它是Wnt/β-聯蛋白途徑的直接靶底(Shtutman等人，“The cyclin D1gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965522-27(1999)；Tetsu等人，“Beta-catenin regulates expressionofcyclin D1in colon caminoma cells”，Nature 398422-26(1999))。為了測定化合物1對這一β-聯蛋白/TCF途徑的直接靶底的表達的影響，在處理過后4、8和24小時的時間點，對提取自經化合物1(25μM)或對照物處理的細胞的mRNA進行實時反向轉錄-PCR(RT-PCR)(表1)。表1顯示了對用化合物1(25μ)或對照物(0.5％DMSO)處理4、8或24小時的SW480細胞進行定量實時反向轉錄-PCR(RT-PCR)分析的結果。在每個時間點，對1μg mRNA進行實時RT-PCR。測量內源細胞周期蛋白D1、c-myc、纖連蛋白、hnkd、軸蛋白2、c-jun和BMP-4相對于β-肌動蛋白的表達水平。通過將各組平均值減去獲自β-肌動蛋白的相應平均值，測定Δ閾值周期(CT)的量。所有實驗均進行兩份。
            
表1實時RT-PCR  
            
     
            
使用β-肌動蛋白基因對數據進行標準化。通過將各組平均值減去獲自β-肌動蛋白基因的相應平均值測定Δ閾值周期(CT)值。細胞中mRNA的量越低，相應的ACT值越高。如表1所總結，與對照細胞相比，經化合物1處理的細胞中觀察到細胞周期蛋白D1信息的ΔCT值以依賴于時間的方式增加。另外還評估了細胞中的細胞周期蛋白D1的蛋白水平。對經處理的SW480細胞的全細胞溶解產物進行凝膠電泳和蛋白質免疫印跡分析。如圖5A所示，用化合物1(25μM)處理時，細胞周期蛋白D1的水平有明顯的降低，處理過后4小時開始降低，處理后24小時增加(比較條帶1與2、3與4、以及5與6)。
            
此外，選擇先前已經在文獻中報道為β-聯蛋白/TCF轉錄的直接靶底的基因亞型，進行實時RT PCR分析。在這些型當中，軸蛋白2和人類裸表皮(human naked cuticle，hnkd)的信息水平(Yan等人，“Elevatedexpression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814973-78(2001))如預計那樣被減量調節(表1)。但是，對于幾種β-聯蛋白/TCF調節的基因來說，信息水平則顯著增加，例如c-myc(He等人，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway”，Science 2811509-12(1998))、c-jun和fra-1(表1)(Mann等人，“Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factorsignaling in human colorectal carcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))。因此，化合物1僅僅抑制β-聯蛋白靶基因亞型的表達。
            
化合物1抑制細胞周期蛋白D1而不抑制c-myc(二種已知的β-聯蛋白信號傳導的靶基因)的表達這一結果，結合化合物1對CBP而不是p300的特異性，說明p300被c-myc啟動子選擇性利用可以使它避免被化合物1阻抑。為了評價內源c-myc啟動子上的輔激活物的使用，對經化合物1(25μM)或對照物(0.5％DMSO)處理的SW480細胞進行染色質免疫沉淀(ChIP)化驗。如圖5B所示，c-myc啟動子在經對照物處理的細胞中被輔激活物CBP和p300占有，大多數被CBP占有。用化合物1處理則完全并且選擇性地阻斷CBP與c-myc啟動子的聯合，并伴隨著p300聯合水平的增加。與c-myc啟動子相似，用化合物1處理完全并且選擇性地阻斷CBP與細胞周期蛋白D1啟動子的聯合(圖5B，下圖)。與之形成鮮明的對比，p300不能夠代替CBP結合細胞周期蛋白D1基因的啟動子。這一結果與實時RT-PCR和蛋白質免疫印跡分析獲得的數據相一致(表1和圖5A)。因此，化合物1選擇性地降低CBP而不是p300與β-聯蛋白調節的啟動子的亞型的結合。
            
為了進一步研究化合物1的選擇性，使用Clontech Atlas HumanCancer1.2Array(#7851-1)進行cDNA微點陣分析。數據表明化合物1對總體基因轉錄具有良好的選擇性效應(表2-5)。用25μM化合物1處理8小時之后的SW480細胞，分析得到～2％的基因被增量調節大于2倍，而～0.3％的基因被減量調節大于50％(表2-3)。
            
表2SW480細胞中通過用25μM化合物1處理8小時增量調節的基因  
            
     
            
     
            
表3SW480細胞中通過用25μM化合物1處理8小時減量調節的基因  
            
     
            
表4SW480細胞中通過用25μM化合物1處理24小時增量調節的基因  
            
     
            
     
            
表5SW480細胞中通過用25μM化合物1處理24小時減量調節的基因  
            
     
            
化合物1導致G1/S階段停滯并激活胱天蛋白酶活性已經顯示對細胞周期蛋白D1基因表達的抑制導致細胞周期G1/S階段的停滯(Shintani等人，“Infrequent altemations of RB pathway(Pb-p16INK4A-cyclin D1)in adenoid cystic carcinoma of salivaryglands”，Anticancer Res.202169-75(2000))。將HCT116(圖6A，上圖)和SW480(圖6A，下圖)細胞用化合物1(25μM)(圖6A，右)或對照物(0.5％DMSO)(圖6A，左)處理24小時。隨后將細胞用碘化丙錠(PI)染色，并通過FACS細胞熒光測定法分析DNA含量。如預期的那樣，對照細胞(圖6A，左)經歷正常的細胞周期，而經化合物1處理的細胞(圖6A，右)在細胞周期G1/S階段顯示出積聚增加。因此，可以看出化合物1導致G1階段細胞的停滯。
            
胱天蛋白酶是通常在指定的細胞群體中通過凋亡刺激觸發而激活的半胱氨酸蛋白酶。為了評價SW480、HCT116和野生型結腸細胞(CCD18Co細胞)中的凋亡誘導，將細胞用化合物1(25μM)或對照物(0.5％DMSO)處理24小時，然后進行胱天蛋白酶-3/7活性化驗。如圖6B所示，與CCD18Co細胞相比，化合物1在SW480和HCT116細胞中特異性地顯著激活胱天蛋白酶-3/7途徑。
            
化合物1降低轉化的結腸直腸細胞的增殖使用經化合物1(0.25-5μM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)處理的SW480細胞進行軟瓊脂集落形成化驗。如圖7A所示，化合物1在集落形成的數目上顯示出依賴劑量的降低。化合物1和5-FU的IC50值分別為0.87±0.11μM和1.98±0.17μM。因此，化合物1增加胱天蛋白酶活性，并降低通過激活β-聯蛋白信號傳導的突變而轉化的結腸直腸細胞的體外生長。
            
化合物4和化合物5在Min小鼠模型中降低腫瘤生長化合物4、化合物5或運載體在野生型和Min小鼠中給藥。化合物4同樣是化合物1的類似物(圖1A)。各種處理之后測量這些小鼠的小腸和結腸中息肉形成的數目(表6)。數據顯示當以大約300mpk給藥時，與僅用運載體處理的對照小鼠相比，化合物4和化合物5均降低min小鼠中的息肉數目。
            
表6化合物4和化合物5對Min小鼠模型中息肉數目的影響  
            
     
            
     
            
化合物3的細胞毒性使用不同來源的癌細胞測量化合物3(化合物1的類似物，圖1A)和其它抗癌治療劑的細胞毒性。結果顯示濃度低于或類似于其它抗癌治療劑(即順氯氨鉑、5-FU、ADR(阿霉素))的濃度時，化合物3導致癌細胞死亡(表7)。
            
表7細胞毒性  
            
     
            
表7中的數值單位為μg/ml。
            
化合物3在大鼠和人體內的代謝通過將該化合物與大鼠或人肝臟微粒體一起培養5分鐘至1小時，通過HPLC分出經處理的微粒體提取物，并對分出的部分進行MS分析，分析化合物3的代謝。結果如圖10A和10B所示。兩種體系中均觀察到幾種代謝產物(如M1、M2、M3)。
            
化合物3、化合物4和化合物5的生物利用率研究在小鼠和大鼠體內研究化合物3、化合物4和化合物5的生物利用率。這些化合物的結構如圖1A所示。使用相同的運載體(即20％吐溫80)將所有化合物給藥(靜脈內和口服，10mg/kg)。化合物3、4和5在小鼠體內的生物利用率分別為低于2％、低于2％和幾乎為0％。化合物3在大鼠體內的生物利用率為大約24％。
            
討論大量有力的證據表明對β-聯蛋白途徑的誤調節與癌癥的發生和發展有關(Morin，PJ.，“Beta-catenin signaling and cancer”，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，“The promise and perils of Wnt signalingthrough beta-catenin”，Science 2961644-46(2002)；Oving等人，“Molecular causes of colon cancer”，Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002))。在本文中，我們說明了結構式(I)的化合物抑制β-聯蛋白/TCF轉錄亞型這一發現。利用二級結構模板化合物庫篩選SW480結腸癌細胞中的報道基因，對這些低分子量抑制劑的生物活性進行表征，所述結腸癌細胞在APC基因中具有導致β-聯蛋白/TCF轉錄組成性提高的突變。利用生物素化類似物(化合物2)的親和力色譜，使人們將輔激活物蛋白CBP鑒別為化合物1的分子靶底。
            
已經顯示CBP而不是β-聯蛋白的轉染顯著增加14C-標記的化合物1與SW480核溶解產物的結合。為了確認CBP為化合物1的分子靶底，已經顯示CBP表達載體的轉染能夠超控β-聯蛋白/TCF報道基因構造被化合物1抑制。而且，化合物1在不干擾β-聯蛋白與緊密相關的輔激活物p300的相互作用的情況下，選擇性地阻斷β-聯蛋白與CBP的相互作用。而且，化合物1導致SW480細胞中β-聯蛋白從核到胞質的重新分布。最后，化合物1介導的對細胞周期蛋白D1表達的抑制，導致G1/S細胞周期停滯，延長處理導致SW480(或HCT116)細胞中而不是正常結腸細胞中胱天蛋白酶的激活，導致轉移的結腸癌細胞系的凋亡。因此，化合物1是β-聯蛋白途徑的抑制劑，CBP是它的分子靶底。
            
為了進一步研究化合物1的選擇性，使用Clontech Atlas HumanCancer 1.2Array(#7851-1)進行cDNA微點陣分析。數據表明化合物1對總體基因轉錄具有良好的選擇性效應(表2-5)。用25μM化合物1對SW480細胞處理8小時之后，分析得到～2％的基因被增量調節大于2倍，而～0.3％的基因被減量調節大于50％(表2-3)。
            
依賴啟動子的輔激活物選擇性地增加β-聯蛋白/TCF途徑的復雜性。如預期的那樣，化合物1抑制細胞周期蛋白D1、hnkd和軸蛋白2基因的表達(Yan等人，“Elevated expression of axin2 and hnkd mRNAprovides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in humancolon tumors”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814973-78(2001))。與之相反，c-myc(He等人，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway”，Science 2811509-12(1998))和c-jun(Mann等人，“Targetgenes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling inhuman colorectal carcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))的表達由于分化輔激活物在β-聯蛋白/TCF途徑中的應用而得以增加(表1和圖7B)。利用ChIP化驗，表明化合物1選擇性地抑制CBP與內源c-myc和細胞周期蛋白D1啟動子的聯合，而且在處理過的細胞中，對于c-myc啟動子而不是細胞周期蛋白D1啟動子，啟動子被p300占有得以增加。這一結果與β-聯蛋白co-IP實驗和細胞周期蛋白D1的實時RT-PCR中得到的數據非常一致。選擇性抑制β-聯蛋白/CBP相互作用的化合物1、和對β-聯蛋白/p300有選擇性的相關類似物(Kahn等人，未發表數據)，提供新型化學基因組工具，以提出β-聯蛋白/TCF復合體以依賴啟動子并具有輔激活物特異性的方式激活基因轉錄的機制(圖7B)。
            
關于在β-聯蛋白與輔激活物蛋白CBP和p300之間相互作用的特異性接觸部位的文獻中存在顯著的差異。這一點可能涉及CBP和p300與β-聯蛋白到多種靶蛋白之間混雜的、通常低到中度的結合親和力。我們預計我們可以使用化合物1對CBP的結合特異性來澄清這一局面。化合物1與CBP片段的結合研究導致發現了CBPNH2-端處的最小相互作用區(氨基酸1-111)。而且，化合物1不結合p300中的同源序列。化合物1在不干擾p300(1-111)/β-聯蛋白相互作用的情況下，選擇性地阻斷細胞中CBP(1-111)與β-聯蛋白的相互作用。該區域的序列排比顯示出與先前發表的發現于TCF、APC和E-鈣黏著蛋白中的β-聯蛋白結合基序的驚人相似性(圖5A)(Huber等人，“The structure ofthe beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverseligand recognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。CBP(1-111)和p300(1-111)二者均含有對與β-聯蛋白的相互作用至關重要的帶負電荷的扣狀體(DELIXXXXE)(Graham等人，“Tcf4 canspecifically recognize beta-catenin using alternative conformations，”Nat.Struct.Biol.81048-52(2001))。發現于APC和E-鈣黏著蛋白中的SXSSXS基序(其中X是具有非極性脂肪族R基團的氨基酸)同樣存在于CBP、SASSP(氨基酸89-93)中，但是未見于p300中。盡管SW480細胞中化合物1與CBP(1-111)和p300(1-111)的不同結合可以主要歸因于磷酸化不同，使用已知的GSK-3β(Nikoulina等人，“Inhibitionof glycogen synthase kinase 3 imporves insulin action and glucosemetabolism in human skeletal muscle”，Diabetes 512190-98(2002))或PKC(Bollag等人，“Effects of the selective protein kinase C inhibitor，Ro31-7549，on the proliferation of cultured mouse epidermal keratinocytes”，J.Invest.Dermatol.100240-46(1993))抑制劑對化合物1的結合沒有明顯的效果(數據未顯示)。而且，大腸桿菌中表達的純化重組CBP(1-111)能夠與化合物1結合，進一步反駁了依賴輔激活物的磷酸化是區分因素這一觀點。因此，使用化合物1作為工具，我們具體將CBP與β-聯蛋白相互作用的最小區定位于CBP的前111個氨基酸。
            
對我們的定位研究的進一步支持源白CBP上存在視黃酸(RA)受體RXR/RAR的結合位點，其與CBP上的β-聯蛋白結合基序非常接近(圖3F)。之前，已經顯示RA處理抑制β-聯蛋白/TCF信號傳導(Earswaran等人，“Cross-regulation of beta-catenin-LEF/TCF andretionoid signaling pathways”，Curr.Biol.91415-18(1999))。共有區(LXXLL)(SEQ ID NO46)RXR/RAR結合部位(LSELL)位于氨基酸殘基70-74，其在我們提出的CBP和p300上的β-聯蛋白結合位點以內(Minucci等人，“Retinoid receptors in health and diseaseco-regulators and the chromatin connection.Semin”，Cell Dev.Biol.10215-25(1999))。
            
化合物1也使我們可以解決β-聯蛋白信號傳到途徑依賴于啟動子的輔激活物選擇性問題。化合物1處理并不抑制p300與β-聯蛋白的相互作用(圖3D)，實際上它增加了β-聯蛋白/p300復合體在處理過的細胞中的形成(圖3B)。如序列排比中所示，盡管定位出的β-聯蛋白結合基序相似，這兩種輔激活物之間存在的差異能夠解釋觀察到的化合物1對CBP而不是p300的特異性。基于這些研究，看起來β-聯蛋白/TCF轉錄的激活需要CBP/p300的N-端111個氨基酸與β-聯蛋白之間的相互作用。
            
盡管對于β-聯蛋白/TCF轉錄的選擇性小分子抑制劑有著強烈的興趣，據我們所知，化合物1代表著對這一途徑的直接小分子抑制劑的第一個例子。盡管對β-聯蛋白和TCF之間的相互作用進行了精細的結構研究(Graham等人，“Crystal structure of a beta-catenin/Tcfcomplex”，Cell 103885-96(2000)；Graham等人，“Tcf4 can specificallyrecognize beta-catenin using alternative conformations”，Nat.Struct.Biol.81048-52(2001)；Poy等人，“Structure of a human Tcf4-beta-catenincomplex”，Nat.Struct.Biol.81053-57(2001))，抑制這一途徑的吸引人的先驗模式，由于TCF以外(如APC和E-鈣黏著蛋白)同樣結合在β-聯蛋白中央臂重復單元(central Arm repeat)上的不同配對物，關于特異性抑制劑開發的興趣增加(Huber等人，“The structure of thebeta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligandrecognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。化合物1精致選擇性，通過相對于高度同源的輔激活物p300(其在氨基酸水平上與CBP享有多達96％的一致性)而對β-聯蛋白/CBP相互作用的特異性抑制，為研究β-聯蛋白/TCF介導的轉錄提供了獨特的化學基因組工具。化合物1的特異性、其在轉移的而不是正常的結腸細胞中選擇性地激活凋亡的胱天蛋白酶的能力、以及其在軟瓊脂集落形成化驗中的效力，對于其在結腸癌中的潛在治療應用來說均為非常有希望的跡象。而且，化合物1的類似物已經在鼠癌癥模型中顯示出體內效力且毒性有限(注射有SW480細胞的裸小鼠和Min小鼠模型；Moser等人，“ApcMina mouse model for intestinal and mammary tumorigenesis”，Eur.J.Cancer A1061-64(1995)；Kahn等人，未發表數據)，進一步確認了使用β-聯蛋白/TCF/CBP轉錄的選擇性抑制劑，從而潛在地應用于癌癥的化學治療及其它過度增殖性疾病。
            
在此結合上文中所有本說明書引用的和/或申請數據頁中所列的美國專利、美國專利申請公開物、美國專利申請、他國專利、他國專利公開物和非專利出版物的全部內容作為參考。
            
從上文中應當理解到，盡管本文為了闡述起見描述了本發明具體的實施方式，但可以在不偏離本發明主旨和范圍的前體下進行各種修改。因此，除所附權利要求外，本發明不受限制。
            
序列表<110>(株)中外制藥M.卡恩吳世雄金大訓河鐘烈<120>β-聯蛋白/TCF激活轉錄的調節<130>200146.404PC<140>PCT<141>2004-08-27<150>60/498,451<151>2003-08-28<160>55<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>330<212>DNA<213>智人<400>1tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcg gacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac  60tcggccccgc cggtcccggg ccccacaacc gcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg  120gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctc gccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt  180tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaac ttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga  240gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcg aatgacagca cagattttgg atcattgttt  300gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg   330<210>2<211>111<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys1   5   10  15Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Ser Thr Asp Phe Gly Ser20  25  30Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly35 40   45Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala50  55  60Ser Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser65  70  75   80Ser Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln85  90  95Gln Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser Ala Asn100 105 110  
            
<210>3<211>340<212>DNA<213>智人<400>3ccttgtttgt gtgctaggct gggggggaga gagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc  60aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgc gggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg  120tcggagagag gcggcagggg ccagaacagt ggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg  180cgacccccag ccccctcccg tccgcacaca cccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc  240gtcgacgcta ggggggacca ttacataacc cgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc  300ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgct ccagcactgg340<210>4<211>117<212>PRT<213>智人<400>4Met Ala Glu Asn Val Val Glu Pro Gly Pro Pro Ser Ala Lys Arg Pro1   5   10  15Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Asp Gly Thr Asp20  25  30Phe Gly Ser Leu Phe Asp Leu Glu His Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile35  40  45Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Gly Gly Asp Ile Asn Gln Leu50  55  60Gln Thr Ser Leu Gly Met Val Gln Asp Ala Ala Ser Lys His Lys Gln65  70  75  80Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Pro Asn Leu Asn Met Gly85  90  95Val Gly Gly Pro Gly Gln Val Met Ala Ser Gln Ala Gln Gln Ser Ser100 105 110Pro Gly Leu Gly Leu115<210>5<211>108<212>PRT<213>小家鼠<400>5Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys1   5   10  15Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Asn Thr Asp Phe Gly Ser20  25  30Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly35  40  45Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala Ser50  55  60Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser Ser65  70  75  80Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln Gln85  90  95Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser100 105  
            
<210>6<211>330<212>DNA<213>小家鼠<400>6atggccgaga acttgctgga cggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc  60ggcttctccg cgaatgacaa cacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt  120cctgatgagc tgatccccaa tggagaatta agccttttaa acagtgggaa ccttgttcca  180gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttctta gaggaggcag cggctctagc  240atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctg tgcaacaggg ccttggtggc  300caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac   330<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的正向引物<400>7gatatctgag ctcgtggatc cgatggccga gaacttgctg40<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>8cgtgtataca gctgtgcggc cgcgtttgta ctgttcggct g   41<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>9cgtgtataca gctgtgcggc cgctccattc atgacttgag c   41<210>10<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>10cgtgtataca gctgtgcggc cgcgcgtttt tcagggtctg c   41<210>11<211>41  
            
<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>11cgtgtataca gctgtgcggc cgcagctggt aaagctggct g 41<210>12<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>12cgtgtataca gctgtgcggc cgcatgttgg agagagggca t 41<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>13cgtgtataca gctgtgcggc cgcagaacct tgtaaatcct c 41<210>14<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于克隆CBP的C-端切除構造的反向引物<400>14cgtgtataca gctgtgcggc cgcgctgtag taggctgcat c 41<210>15<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于產生CBP的N-端切除構造的反向引物<400>15gtatacagct gtgcgcgccgc caaaccctcc acaaactttt c41<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>CBP-C8的正向引物<400>16gatatctgag ctcgtggatc cggaagctgg ggaggttttt 40<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>CBP-C9的正向引物<400>17gatatctgag ctcgtggatc cgaagaagat gctggacaag 40<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>CBP-C10的正向引物<400>18gatatctgag ctcgtggatc cgtccaaatg gtccactctg 40<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>CBP-C11的正向引物<400>19gatatctgag ctcgtggatc cgtctcctac ctcagcacca 40<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>CBP-C12的正向引物<400>20gatatctgag ctcgtggatc cgaacatcct taaatcaaac 40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>CBP-C13的正向引物<400>21gatatctgag ctcgtggatc cgcagcagca acgcatgcaa 40  
            
<210>22<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于產生CBP的正向引物<400>22atctgagctc gtggatccgg gaccgcccaa ccccaaacga gccaaactcc agccgaacag60tacaaacatg gccagctta 79<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>C-端切除的p-300構造的正向引物<400>23gacggtaccg gttcgaagct tatggccgag aatgtggtg   39<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>C-端切除的p-300構造的反向引物<400>24cgtgtataca gctgtgcggc cgccaaacct aatccaggac t41<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>C-端切除的p-300構造的反向引物<400>25cgtgtataca gctgtgcggc cgcgttgcca gcacttccca t41<210>26<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>C-端切除的p-300構造的反向引物<400>26cgtgtataca gctgtgcggc cgcggcctgt tcccggcgct g41<210>27<211>102  
            
<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于產生β-聯蛋白/TCF報道質粒的四個串聯TCF4結合位點<400>27ccaacctttg atcttacccc ctttgatctt accccctttg atcaggaatt cggttggaaa  60ctagaatggg ggaaactaga atgggggaaa ctagtcctta ag 102<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于c-myc啟動子PCR的正向引物<400>28tggtaggcgc gcgtagtta   19<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于c-myc啟動子PCR的反向引物<400>29gggcggagat tagcgagag   19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于細胞周期蛋白D1啟動子PCR的正向引物<400>30tgcttaacaa cagtaacgt   19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>用于細胞周期蛋白D1啟動子PCR的反向引物<400>31ggggctcttc ctgggcagc19<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列  
            
<220>  
            
<223>細胞周期蛋白D1正向引物<400>32agatcgaagc cctgctg 17<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>細胞周期蛋白D1反向引物<400>33agggggaaag agcaaagg18<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>軸蛋白2正向引物<400>34gtgtgaggtc cacggaaact  20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>軸蛋白2反向引物<400>35ctcgggaaat gaggtagaga  20<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>hnkd正向引物<400>36ctggctgctg ctaccaccat tgcgt25<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>hnkd反向引物  
            
<400>37ccaggcccaa attgggacgt  20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>c-myc正向引物<400>38gaagaaattc gagctgctgc  20<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>c-myc反向引物<400>39cacatacagt cctggatgat g21<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>c-jun正向引物<400>40agatgcccgg cgagacaccg  20<210>41<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>c-jun反向引物<400>41agcccccgac ggtctcttt   19<210>42<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>fra-1正向引物<400>42accccggcca ggagtcatcc gggccc   26  
            
<210>43<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>fra-1反向引物<400>43aggcgcctca caaagcgagg agggtt  26<210>44<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>β-肌動蛋白正向引物<400>44atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg   32<210>45<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>β-肌動蛋白反向引物<400>45cgtcatactc ctccttgcyg atccacatct gc   32<210>46<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>一致RXR/RAR結合位點<221>變量<222>2，3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>46Leu Xaa Xaa Leu Leu1   5<210>47<211>15<212>PRT<213>智人<400>47Asn Asp Glu Leu Ile Arg Phe Lys Asp Glu Gly Glu Gln Glu Glu1   5   10  15  
            
<210>48<211>21<212>PRT<213>智人<400>48Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Ala Alal   5   10  15Ser Leu Ser Ser Leu20<210>49<211>20<212>PRT<213>智人<400>49Ala Asp Thr Leu Leu His Phe Ala Thr Glu Ser Ser Cys Ser Ser Serl   5   10  15Leu Ser Ala Leu20<210>50<211>15<212>PRT<213>智人<400>50Leu Asp Thr Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Lys Tyr Ser Asp Glu Gln1   5   10  15<210>51<211>16<212>PRT<213>智人<400>51Glu Asp Thr Pro Ile Cys Phe Ser Arg Cys Ser Ser Leu Ser Ser Leu1   5   10  15<210>52<211>15<212>PRT<213>智人<400>52Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg1   5   10  15<210>53<211>24<212>PRT<213>智人  
            
<400>53Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser1   5   10  15Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro20<210>54<211>23<212>PRT<213>小家鼠<400>54Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Ser1   5   10  15Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro20<210>55<211>23<212>PRT<213>智人<400>55Pro Asp Glu Leu Ile Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Ser Ser1   5   10  15Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gln20
            
權利要求
            
1.一種調節β-聯蛋白誘發的靶基因表達的方法，所述方法包括使組合物與試劑接觸，其中所述的組合物包含β-聯蛋白、CBP和p300，所述的β-聯蛋白具有結合到CBP與p300的可能性，而且將所述試劑以有效改變β-聯蛋白結合到CBP與p300的可能性的量與所述組合物接觸。
            
2.根據權利要求1的方法，其中所述的試劑增加CBP與β-聯蛋白的結合。
            
3.根據權利要求2的方法，其中所述的試劑降低p300與β-聯蛋白的結合。
            
4.根據權利要求1的方法，其中所述的試劑增加p300與β-聯蛋白的結合。
            
5.根據權利要求4的方法，其中所述的試劑降低CBP與β-聯蛋白的結合。
            
6.根據權利要求1的方法，其中所述的組合物是先體外后體內。
            
7.根據權利要求6的方法，其中所述的組合物包含干細胞。
            
8.根據權利要求1的方法，其中所述的組合物是細胞或哺乳動物。
            
9.根據權利要求8的方法，其中所述的哺乳動物罹患癌癥，并且所述的量對于治療癌癥有效。
            
10.根據權利要求9的方法，其中所述的癌癥是結腸癌。
            
11.根據權利要求9的方法，其中所述的癌癥選自前列腺癌和乳腺癌。
            
12.根據權利要求1的方法，其中所述的組合物是細胞，所述的試劑增加細胞分化而不是增殖的可能性。
            
13.根據權利要求1的方法，其中所述的組合物是細胞，所述的試劑增加細胞增殖而不是分化的可能性。
            
14.根據權利要求1的方法，其中所述的試劑具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
15.根據權利要求14的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環己基C0-2烷基。
            
16.根據權利要求14的方法，其中A為-(CHR3)-，B為-(C＝O)-，D為-(CHR5)-，E為-(C＝O)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(II) 其中，R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如權利要求1中所定義。
            
17.根據權利要求14的方法，其中A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(C＝O)-(XR9)-，并且化合物具有如下通式(III) 其中，R1、R2、R4、R6、R9、W和X如權利要求1中所定義，Z為氮或CH(當Z為CH時，X為氮)。
            
18.根據權利要求14的化合物，其中A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(IV) 其中，R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如權利要求1中所定義，Z為氮或CH，附帶條件為當Z為氮時，n為0，當Z為CH時，X為氮并且n不是0。
            
19.根據權利要求18的方法，其中所述的化合物具有如下通式(VI) 其中，Ra為具有8至11個環成員的二環芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子，Rb為5至7元單環芳基，其可以具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，而且化合物中的芳環可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基。
            
20.根據權利要求19的方法，其中Ra為萘基、喹啉基或異喹啉基，Rb為苯基、吡啶基或哌啶基，所有這些基團均可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
            
21.根據權利要求20的方法，其中Ra為萘基，Rb為苯基，其可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
            
22.根據權利要求14的方法，其中所述的試劑是化合物1。
            
23.一種組合物，其包含試劑、β-聯蛋白、CBP和p300，其中β-聯蛋白具有結合到CBP與p300的可能性，而且所述試劑以有效改變β-聯蛋白結合到CBP與p300的可能性的量存在于所述組合物中。
            
24.根據權利要求23的組合物，其中所述的試劑增加CBP與β-聯蛋白的結合。
            
25.根據權利要求24的組合物，其中所述的試劑降低p300與β-聯蛋白的結合。
            
26.根據權利要求23的組合物，其中所述的試劑增加p300與β-聯蛋白的結合。
            
27.根據權利要求26的組合物，其中所述的試劑降低CBP與β-聯蛋白的結合。
            
28.根據權利要求23的組合物，其處于先體外后體內的狀態下。
            
29.根據權利要求28的組合物，其進一步包含干細胞。
            
30.根據權利要求29的組合物，其中所述的試劑增加細胞分化而不是增殖的可能性。
            
31.根據權利要求29的組合物，其中所述的試劑增加細胞增殖而不是分化的可能性。
            
32.根據權利要求23的組合物，其中所述的試劑具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
33.根據權利要求32的化合物，其中所述的試劑是化合物1。
            
34.一種調節Wnt途徑活性的方法，所述的方法包括(a)使(i)含有Wnt途徑組分的組合物與(ii)激活Wnt途徑的化合物相接觸，以提供激活的Wnt途徑；以及(b)用完全或基本上干擾p300與β-聯蛋白之間結合但是極少或者不干擾CBP與β-聯蛋白之間結合的化學試劑調節Wnt途徑的活性。
            
35.根據權利要求34的方法，其中所述的組合物是細胞。
            
36.根據權利要求34的方法，其先體外后體內進行。
            
37.根據權利要求34的方法，其中所述的化合物是LiCl或GSK3抑制劑。
            
38.根據權利要求34的方法，其中所述的化學試劑具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
39.一種調節細胞增殖的方法，所述的方法包括(a)在一定比例的群體增殖且一定比例的群體分化的條件下提供細胞群體；以及(b)向所述的群體中加入化學試劑，其中所述的試劑導致增殖細胞的比例相對于分化細胞的比例增加。
            
40.根據權利要求39的方法，其中所述的化合物干擾p300與β-聯蛋白之間的結合。
            
41.根據權利要求39的方法，其進一步包括向所述群體中加入激活Wnt途徑的試劑。
            
42.根據權利要求39的方法，其中所述的細胞群體是干細胞群體。
            
43.根據權利要求39的方法，其先體外后體內進行。
            
44.根據權利要求39的方法，其進一步包括加入導致細胞群體分化的試劑。
            
45.根據權利要求44的方法，其中群體中的細胞分化形成血細胞。
            
46.根據權利要求44的方法，其中群體中的細胞分化形成神經元細胞、肌肉細胞、骨細胞、或胰β-細胞。
            
47.根據權利要求44的方法，其中所述的化學試劑具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
48.一種相對于β-聯蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/CBP相互作用的方法，所述方法包括向組合物中加入化合物，其中所述的組合物包括β-聯蛋白、CBP和p300，并且所述化合物相對于β-聯蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/CBP相互作用。
            
49.根據權利要求48的方法，其中所述的化合物具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的剩余部分、及其立體異構體。
            
50.一種相對于β-聯蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用的方法，所述方法包括向組合物中加入化合物，其中所述的組合物包括β-聯蛋白、CBP和p300，并且所述化合物相對于β-聯蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用。
            
51.根據權利要求50的方法，其中所述的化合物具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
52.一種促進β-聯蛋白從核易位至胞液的方法，所述方法包括向細胞中加入化合物，其中所述的細胞包括核和胞液，所述的核含有β-聯蛋白，并且所述化合物導致β-聯蛋白從核易位至胞液。
            
53.根據權利要求52的方法，其中所述的化合物具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝O或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
54.一種選擇性地抑制WNT/β-聯蛋白途徑靶向基因的表達的方法，所述方法包括向組合物中加入化合物，所述的組合物含有WNT/β-聯蛋白途徑靶向的基因，所述化合物導致WNT/β-聯蛋白途徑靶向基因的表達的變化。
            
55.根據權利要求54的方法，其中所述的化合物具有選自結構式(I)的結構 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側鏈部分、氨基酸側鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構體。
            
56.一種將干細胞保持在未分化狀態下的方法，所述方法包括使干細胞與抑制細胞分化或促進細胞增殖的試劑相接觸，所述試劑的量對于將干細胞保持在未分化狀態下是有效的。
            
57.根據權利要求56的方法，其中所述的試劑相對于β-聯蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯蛋白/p300相互作用。
            
58.一種鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含CBP 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的β-聯蛋白的部分與含步驟(a)的CBP 1-111的部分相結合；以及(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制含CBP 1-111的所述部分與含β-聯蛋白的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。
            
59.根據權利要求58的方法，其進一步包括如下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分與β-聯蛋白的結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
60.一種鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含β-聯蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含CBP 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的CBP 1-111的部分與含步驟(a)的β-聯蛋白的部分相結合；(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯蛋白的所述部分與含CBP 1-111的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。
            
61.根據權利要求60的方法，其進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
62.一種鑒別β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含有(1)與CBP 1-111相結合的β-聯蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使CBP 1-110從β-聯蛋白上分離；以及(c)當確定步驟(a)的所述小分子使β-聯蛋白與CBP 1-111的結合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白CBP相互作用的抑制劑。
            
63.根據權利要求62的方法，其進一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(f)當確定步驟(d)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
            
64.一種鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白CBP小分子抑制劑與含p300 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯蛋白的部分與步驟(a)的含p300 1-111的部分相結合；以及(d)當確定所述步驟(a)的小分子抑制含p300 1-111的所述部分與含β-聯蛋白的部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。
            
65.根據權利要求64的方法，其進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
66.一種鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含β-聯蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含p300 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含p300 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯蛋白的部分相結合；(d)當確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯蛋白的所述部分與含p300 1-111部分相結合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。
            
67.根據權利要求66的方法，其進一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(g)當確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
68.一種鑒別β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯蛋白p300小分子抑制劑與含有(1)與p3001-111結合的β-聯蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使p300 1-111從β-聯蛋白上分離；以及(c)當確定步驟(a)的所述小分子使β-聯蛋白與p300 1-111的結合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯蛋白p300相互作用的抑制劑。
            
69-根據權利要求68的方法，其進一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分與β-聯蛋白相結合；以及(f)當確定步驟(c)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯蛋白相結合時，確認所述的小分子是β-聯蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
            
70.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長CBP蛋白。
            
71.根據權利要求70的核酸分子，其包含與SEQ ID NO1的同源性至少為90％的核苷酸序列。
            
72.根據權利要求70的核酸分子，其編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
73.根據權利要求70的核酸分子，其編碼含有CBP蛋白內存在的不多于200個連續氨基酸殘基的肽。
            
74.根據權利要求70的核酸分子，其編碼含有CBP蛋白內存在的不多于150個連續氨基酸殘基的肽。
            
75.根據權利要求74的核酸分子，其中所述的肽含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
            
76.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長CBP蛋白。
            
77.根據權利要求76的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核酸。
            
78.根據權利要求76的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
79.根據權利要求76的核酸分子，其中所述的片段編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
80.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白。
            
81.根據權利要求80的肽，其與SEQ ID NO2的同源性至少為90％。
            
82.根據權利要求80的肽，其結合β-聯蛋白。
            
83.根據權利要求80的肽，其含有CBP蛋白內存在的不多于200個連續氨基酸殘基。
            
84.根據權利要求80的肽，其含有CBP蛋白內存在的不多于150個連續氨基酸殘基。
            
85.根據權利要求84的肽，其含有SEQ ID NO2或4。
            
86.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白。
            
87.根據權利要求86的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
            
88.根據權利要求86的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
89.根據權利要求86的肽，其中所述的肽結合β-聯蛋白。
            
90.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼全長CBP蛋白。
            
91.根據權利要求90的核酸分子，其與SEQ ID NO1的同源性至少為90％。
            
92.根據權利要求90的核酸分子，其編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
93.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
94.根據權利要求93的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
            
95.根據權利要求93的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
96.根據權利要求93的核酸分子，其中所述的片段編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
97.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成。
            
98.根據權利要求97的肽，其與SEQ ID NO2的同源性至少為90％。
            
99.根據權利要求97的肽，其結合β-聯蛋白。
            
100.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
101.根據權利要求100的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
            
102.根據權利要求100的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
103.根據權利要求100的肽，其中所述的肽結合β-聯蛋白。
            
104.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列組成。
            
105.根據權利要求104的核酸分子，其與SEQ ID NO1的同源性至少為90％。
            
106.根據權利要求104的核酸分子，其編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
107.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
108.根據權利要求107的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
            
109.根據權利要求107的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
110.根據權利要求107的核酸分子，其中所述的片段編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
111.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2或者與SEQID NO2的同源性至少為80％的肽組成。
            
112.根據權利要求111的肽，其與SEQ ID NO2的同源性至少為90％。
            
113.根據權利要求111的肽，其結合β-聯蛋白。
            
114.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
115.根據權利要求114的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
            
116.根據權利要求114的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
117.根據權利要求114的肽，其中所述的肽結合β-聯蛋白。
            
118.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長p300蛋白。
            
119.根據權利要求118的核酸分子，其與SEQ ID NO3的同源性至少為90％。
            
120.根據權利要求118的核酸分子，其編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
121.根據權利要求118的核酸分子，其編碼含有p300蛋白內存在的不多于200個連續氨基酸殘基的肽。
            
122.根據權利要求118的核酸分子，其編碼含有p300蛋白內存在的不多于150個連續氨基酸殘基的肽。
            
123.根據權利要求122的核酸分子，其中所述的肽含有SEQ IDNO4。
            
124.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長p300蛋白。
            
125.根據權利要求124的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核酸。
            
126.根據權利要求124的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
127.根據權利要求124的核酸分子，其中所述的片段編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
128.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是全長p300蛋白。
            
129.根據權利要求128的肽，其與SEQ ID NO4的同源性至少為90％。
            
130.根據權利要求128的肽，其結合β-聯蛋白。
            
131.根據權利要求128的肽，其含有p300蛋白內存在的不多于200個連續氨基酸殘基。
            
132.根據權利要求128的肽，其含有p300蛋白內存在的不多于150個連續氨基酸殘基。
            
133.根據權利要求132的肽，其含有SEQ ID NO4。
            
134.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長p300蛋白。
            
135.根據權利要求134的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
            
136.根據權利要求134的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
137.根據權利要求134的肽，其中所述的肽結合β-聯蛋白。
            
138.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。
            
139.根據權利要求138的核酸分子，其與SEQ ID NO3的同源性至少為90％。
            
140.根據權利要求138的核酸分子，其編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
141.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
142.根據權利要求141的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
            
143.根據權利要求141的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
144.根據權利要求141的核酸分子，其中所述的片段編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
145.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽組成。
            
146.根據權利要求145的肽，其與SEQ ID NO4的同源性至少為90％。
            
147.根據權利要求145的肽，其結合β-聯蛋白。
            
148.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
149.根據權利要求148的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
            
150.根據權利要求148的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
151.根據權利要求148的肽，其中所述的肽結合β-聯蛋白。
            
152.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。
            
153.根據權利要求152的核酸分子，其與SEQ ID NO3的同源性至少為90％。
            
154.根據權利要求152的核酸分子，其編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
155.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
156.根據權利要求155的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
            
157.根據權利要求155的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
158.根據權利要求155的核酸分子，其中所述的片段編碼結合β-聯蛋白的肽。
            
159.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4或者與SEQID NO4的同源性至少為80％的肽組成。
            
160.根據權利要求159的肽，其與SEQ ID NO4的同源性至少為90％。
            
161.根據權利要求159的肽，其結合β-聯蛋白。
            
162.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
            
163.根據權利要求162的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
            
164.根據權利要求162的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
            
165.根據權利要求162的肽，其中所述的肽結合β-聯蛋白。
            
全文摘要
            
本發明提供調節由β－聯蛋白/TCF激活的轉錄的化合物和方法，例如，選擇性抑制Wnt/β－聯蛋白途徑靶向的基因。
            
文檔編號C12N5/08GK1871239SQ200480030688 
            
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月27日 優先權日2003年8月28日
            
發明者M·卡恩, 吳世雄, 金大訓, 河鐘烈, K·霍賈特－埃馬米 申請人:(株)中外制藥
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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