從煙草克隆細胞色素p450基因的制作方法

專利名稱：從煙草克隆細胞色素p450基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及在煙草(Nicotiana)植物中編碼細胞色素P450酶(下文稱為P450和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列來改變植物表型的方法。
背景技術：
細胞色素P450催化各種化學上不同的底物的酶反應，包括內源性和異源底物的氧化、過氧化和還原性代謝。在植物中，p450參與包括植物產物合成在內的生化途徑，所述產物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物堿、萜類、脂質、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)和葡糖異硫氰酸鹽(glucosinolates)(Chappel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.198，49311-343)。細胞色素p450也稱為血紅素-硫醇鹽蛋白(heme-thiolateprotein)，通常用作多組分電子轉移鏈(稱為含p450的單加氧酶系統)中的末端氧化酶。所催化的特定反應包括脫甲基化、羥基化、環氧化、N-氧化、磺基氧化(sulfooxidation)、N-、S-和O-脫烷基化、脫硫作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團的還原。
煙草植物p450酶的各種作用涉及產生各種植物代謝物，例如苯丙素、生物堿、萜類、脂質、生氰糖苷、葡糖異硫氰酸鹽和其它化學物質的宿主。近年來，人們開始了解一些p450酶影響植物中植物代謝物的組成。例如，長期以來人們希望通過育種改變植物的所選脂肪酸的特性來改善特定植物的風味和香味；然而涉及控制這些葉子組成的水平的機理知之甚少。下調與改變脂肪酸有關的p450酶可有助于積累提供更適宜的葉子表型質量的所需脂肪酸。p450酶的功能及其在植物組成中廣泛的作用仍有待發現。例如，特定類型的p450酶發現可催化脂肪酸分解為揮發性C6-和C9-醛和醇，而主要是這些物質導致水果和蔬菜具有“新鮮翠綠”的氣味。可改變其它作為新目標的p450酶的水平，通過改變煙草葉子中的脂質組成和相關的降解代謝物來提高葉子組成的質量。葉子中的幾種這些成分受老化的影響，而老化刺激葉子質量特性的成熟。其它人也報道p450酶在改變涉及植物病原體相互作用和疾病抗性的脂肪酸中起作用。
在其它例子中，已提示p450酶涉及生物堿的生物合成。降煙堿是在煙草(Nicotiana tabaceum)中發現的少量生物堿。推測它是這樣產生的p450介導的尼古丁脫甲基化，然后在N位酰化和亞硝基化，從而產生一系列N-酰基降煙堿(N-acylnonicotine)和N-亞硝基降煙堿。推測的p450脫甲基酶催化的N-脫甲基化被認為是煙草中降煙堿生物合成的主要來源。盡管認為該酶是微粒體酶，但是迄今為止未能成功地純化尼古丁脫甲基化酶，也未能分離到有關基因。
此外，有假說認為(但未證實)p450酶的活性受遺傳控制并且也強烈地受環境因素的影響。例如，當植物達到成熟階段后，認為煙草中尼古丁的脫甲基化作用大大增加。另外，有假說認為(還未證實)脫甲基化基因含有當存在時能抑制RNA翻譯的轉座元件。
在本發明之前，p450酶形式的多樣性、其結構和功能的不同使得對煙草p450酶的研究十分困難。此外，對p450酶的克隆至少部分由于這些膜定位的蛋白通常存在量低且經常在純化中不穩定而受阻。因此，需要在植物中鑒定p450酶和與那些p450酶相關的核酸序列。特別是，在煙草中僅有少許細胞色素p450蛋白已見報道。本文所述的發明發現了許多細胞色素p450片段，這些片段基于它們的序列同一性而對應于幾組p450種類。
概述本發明針對植物p450酶。本發明還涉及來自煙草的植物p450酶。本發明也涉及其表達由乙烯和/和植物老化誘導的植物中的p450酶。本發明還涉及植物中具有酶活性的核酸序列，例如可分類為氧化酶、脫甲基酶等和其它酶，以及使用那些序列來使這些酶的表達降低和沉默和過度表達。本發明也涉及在含有較高降煙堿水平的植物而非顯示較低降煙堿水平的植物中發現的p450酶。
本發明一方面涉及以下所示的核酸序列SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在第2個相關的方面，根據它們在細胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應區域的同一性，對那些含有大于75％的核酸序列同一性的片段進行分組。代表性的核酸組和各自的種類示于表I。
在第3方面，本發明涉及如以下所示的氨基酸序列SEQ.ID.NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296和298。
在第4個相關的方面，根據它們在細胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應區域的同一性，對那些含有大于71％的核酸序列同一性的片段進行分組。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表II。
在第5個方面，本發明涉及如以下所示全長基因的氨基酸序列SEQ.ID.NO.150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296和298。
在第6個相關的方面，根據彼此的同一性對那些含有大于85％和更高的氨基酸序列同一性的全長基因進行分組。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表III。
在第7個方面，本發明涉及如SEQ.ID.NO.299-357所示片段的氨基酸序列。
在第8個相關的方面，根據它們在第一細胞色素p450結構域UXXRXXZ到第3細胞色素結構域GXRXO的對應區域的互相同一性，對那些含有大于90％和更高的氨基酸序列同一性的片段進行分組，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是R、T、S或M。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表IV。
在第9個相關的方面，p450酶在煙草植物中的減少或消除或過度表達可使用RNA病毒系統瞬時實現。
評價得到的轉化或感染的植物的表型改變，包括(但不限于)使用本領域普通技術人員常規可用的技術來分析內源性p450RNA轉錄物、p450表達肽和植物代謝物的濃度。
在第10個方面，本發明也涉及產生具有改變的p450酶活性水平的轉基因煙草譜系。根據本發明，這些轉基因譜系含有有效地特定酶表達減少、沉默或增加，從而在煙草中導致表型效應的核酸序列。這種核酸序列包括SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在本發明非常重要的第11方面，與對照植物相比，含有本發明核酸的植物栽培品系在使用全長基因或其片段的下調能力或使用全長基因或其片段的過度表達能力上具有改變的代謝物特性。
在本發明的第12方面，含有本發明核酸的植物栽培品系具有對特定外源性化學物質或植物害蟲耐受的用途，所述植物使用全長基因或其片段以更改來源于植物或植物以外的代謝物的生物合成或降解。這種核酸序列包括SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在第13個方面，本發明涉及篩選含有與所述核酸序列具有實質核酸同一性的基因的植物，優選煙草。使用本發明有利于鑒定和選擇含有精確的或實質同一性的核酸序列的植物，其中這種植物是傳統或轉基因品種的育種程序、誘變程序或天然存在的不同植物種群的一部分。可使用核酸探針結合核酸檢測方法，包括(但不限于)核酸雜交和PCR分析，通過評價植物的核酸物質來篩選實質核酸同一性的植物。核酸探針可由對應于以下SEQ ID的所述核酸序列或其片段構成SEQ ID 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在第14個方面，本發明涉及鑒定與所述核酸序列具有實質性氨基酸同一性的植物基因，優選煙草。可使用核酸探針結合核酸檢測方法，包括(但不限于)核酸雜交和PCR分析，通過篩選植物cDNA文庫來鑒定植物基因，包括cDNA和基因組克隆，優選煙草的cDNA和基因組克隆。核酸探針可由對應于以下SEQ ID的核酸序列或其片段構成1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145和147。
在其它第15個方面，可使用針對部分或全部所述氨基酸序列的抗體來篩選表達肽的cDNA表達文庫。這種氨基酸序列包括SEQ ID 2、4、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148。
在第16個重要的方面，本發明也涉及產生過度表達p450酶活性水平的轉基因煙草譜系。根據本發明，這些轉基因譜系包括編碼全長基因的氨基酸序列的所有核酸序列，所述基因有效地增加特定酶的表達從而導致煙草中的表型效應。這種氨基酸序列包括SEQ.ID.150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296和298。
也提供了含有降煙堿含量降低的煙葉(葉片和/或莖)的煙草產品。該煙草產品包括煙草(含有葉片和/或莖的煙葉)，該煙草來自含有本文所述序列或消除或抑制了編碼煙草特異性亞硝基胺的基因的植物。與用未消除或抑制編碼煙草特異性亞硝基胺的基因的煙草植物制備的煙草產品相比，消除或抑制編碼煙草特異性亞硝基胺的基因有效地降低了煙草產品中約5-10％、或者約10-20％、或者約20-30％、或者30％以上的煙草特異性亞硝基胺。本文使用的煙草產品可包括香煙、雪茄、煙絲、鼻煙、口嚼煙(chewing tobacco)、混合了煙草產品的產品和它們的混合物。
附圖簡述

圖1顯示核酸SEQ.ID.No.1和氨基酸SEQ.ID.No.2。
圖2顯示核酸SEQ.ID.No.3和氨基酸SEQ.ID.No.4。
圖3顯示核酸SEQ.ID.No.5和氨基酸SEQ.ID.No.6。
圖4顯示核酸SEQ.ID.No.7和氨基酸SEQ.ID.No.8。
圖5顯示核酸SEQ.ID.No.9和氨基酸SEQ.ID.No.10。
圖6顯示核酸SEQ.ID.No.11和氨基酸SEQ.ID.No.12。
圖7顯示核酸SEQ.ID.No.13和氨基酸SEQ.ID.No.14。
圖8顯示核酸SEQ.ID.No.15和氨基酸SEQ.ID.No.16。
圖9顯示核酸SEQ.ID.No.17和氨基酸SEQ.ID.No.18。
圖10顯示核酸SEQ.ID.No.19和氨基酸SEQ.ID.No.20。
圖11顯示核酸SEQ.ID.No.21和氨基酸SEQ.ID.No.22。
圖12顯示核酸SEQ.ID.No.23和氨基酸SEQ.ID.No.24。
圖13顯示核酸SEQ.ID.No.25和氨基酸SEQ.ID.No.26。
圖14顯示核酸SEQ.ID.No.27和氨基酸SEQ.ID.No.28。
圖15顯示核酸SEQ.ID.No.29和氨基酸SEQ.ID.No.30。
圖16顯示核酸SEQ.ID.No.31和氨基酸SEQ.ID.No.32。
圖17顯示核酸SEQ.ID.No.33和氨基酸SEQ.ID.No.34。
圖18顯示核酸SEQ.ID.No.35和氨基酸SEQ.ID.No.36。
圖19顯示核酸SEQ.ID.No.37和氨基酸SEQ.ID.No.38。
圖20顯示核酸SEQ.ID.No.39和氨基酸SEQ.ID.No.40。
圖21顯示核酸SEQ.ID.No.41和氨基酸SEQ.ID.No.42。
圖22顯示核酸SEQ.ID.No.43和氨基酸SEQ.ID.No.44。
圖23顯示核酸SEQ.ID.No.45和氨基酸SEQ.ID.No.46。
圖24顯示核酸SEQ.ID.No.47和氨基酸SEQ.ID.No.48。
圖25顯示核酸SEQ.ID.No.49和氨基酸SEQ.ID.No.50。
圖26顯示核酸SEQ.ID.No.51和氨基酸SEQ.ID.No.52。
圖27顯示核酸SEQ.ID.No.53和氨基酸SEQ.ID.No.54。
圖28顯示核酸SEQ.ID.No.55和氨基酸SEQ.ID.No.56。
圖29顯示核酸SEQ.ID.No.57和氨基酸SEQ.ID.No.58。
圖30顯示核酸SEQ.ID.No.59和氨基酸SEQ.ID.No.60。
圖31顯示核酸SEQ.ID.No.61和氨基酸SEQ.ID.No.62。
圖32顯示核酸SEQ.ID.No.63和氨基酸SEQ.ID.No.64。
圖33顯示核酸SEQ.ID.No.65和氨基酸SEQ.ID.No.66。
圖34顯示核酸SEQ.ID.No.67和氨基酸SEQ.ID.No.68。
圖35顯示核酸SEQ.ID.No.69和氨基酸SEQ.ID.No.70。
圖36顯示核酸SEQ.ID.No.71和氨基酸SEQ.ID.No.72。
圖37顯示核酸SEQ.ID.No.73和氨基酸SEQ.ID.No.74。
圖38顯示核酸SEQ.ID.No.75和氨基酸SEQ.ID.No.76。
圖39顯示核酸SEQ.ID.No.77和氨基酸SEQ.ID.No.78。
圖40顯示核酸SEQ.ID.No.79和氨基酸SEQ.ID.No.80。
圖41顯示核酸SEQ.ID.No.81和氨基酸SEQ.ID.No.82。
圖42顯示核酸SEQ.ID.No.83和氨基酸SEQ.ID.No.84。
圖43顯示核酸SEQ.ID.No.85和氨基酸SEQ.ID.No.86。
圖44顯示核酸SEQ.ID.No.87和氨基酸SEQ.ID.No.88。
圖45顯示核酸SEQ.ID.No.89和氨基酸SEQ.ID.No.90。
圖46顯示核酸SEQ.ID.No.91和氨基酸SEQ.ID.No.92。
圖48顯示核酸SEQ.ID.No.95和氨基酸SEQ.ID.No.96。
圖49顯示核酸SEQ.ID.No.97和氨基酸SEQ.ID.No.98。
圖50顯示核酸SEQ.ID.No.99和氨基酸SEQ.ID.No.100。
圖51顯示核酸SEQ.ID.No.101和氨基酸SEQ.ID.No.102。
圖52顯示核酸SEQ.ID.No.103和氨基酸SEQ.ID.No.104。
圖53顯示核酸SEQ.ID.No.105和氨基酸SEQ.ID.No.106。
圖54顯示核酸SEQ.ID.No.107和氨基酸SEQ.ID.No.108。
圖55顯示核酸SEQ.ID.No.109和氨基酸SEQ.ID.No.110。
圖56顯示核酸SEQ.ID.No.111和氨基酸SEQ.ID.No.112。
圖57顯示核酸SEQ.ID.No.113和氨基酸SEQ.ID.No.114。
圖58顯示核酸SEQ.ID.No.115和氨基酸SEQ.ID.No.116。
圖59顯示核酸SEQ.ID.No.117和氨基酸SEQ.ID.No.118。
圖60顯示核酸SEQ.ID.No.119和氨基酸SEQ.ID.No.120。
圖61顯示核酸SEQ.ID.No.121和氨基酸SEQ.ID.No.122。
圖62顯示核酸SEQ.ID.No.123和氨基酸SEQ.ID.No.124。
圖63顯示核酸SEQ.ID.No.125和氨基酸SEQ.ID.No.126。
圖64顯示核酸SEQ.ID.No.127和氨基酸SEQ.ID.No.128。
圖65顯示核酸SEQ.ID.No.129和氨基酸SEQ.ID.No.130。
圖66顯示核酸SEQ.ID.No.131和氨基酸SEQ.ID.No.132。
圖67顯示核酸SEQ.ID.No.133和氨基酸SEQ.ID.No.134。
圖68顯示核酸SEQ.ID.No.135和氨基酸SEQ.ID.No.136。
圖69顯示核酸SEQ.ID.No.137和氨基酸SEQ.ID.No.138。
圖70顯示核酸SEQ.ID.No.139和氨基酸SEQ.ID.No.140。
圖72顯示核酸SEQ.ID.No.143和氨基酸SEQ.ID.No.144。
圖73顯示核酸SEQ.ID.No.145和氨基酸SEQ.ID.No.146。
圖74顯示核酸SEQ.ID.No.147和氨基酸SEQ.ID.No.148。
圖75顯示核酸SEQ.ID.No.149和氨基酸SEQ.ID.No.150。
圖76顯示核酸SEQ.ID.No.151和氨基酸SEQ.ID.No.152。
圖77顯示核酸SEQ.ID.No.153和氨基酸SEQ.ID.No.154。
圖78顯示核酸SEQ.ID.No.155和氨基酸SEQ.ID.No.156。
圖79顯示核酸SEQ.ID.No.157和氨基酸SEQ.ID.No.158。
圖80顯示核酸SEQ.ID.No.159和氨基酸SEQ.ID.No.160。
圖81顯示核酸SEQ.ID.No.161和氨基酸SEQ.ID.No.162。
圖82顯示核酸SEQ.ID.No.163和氨基酸SEQ.ID.No.164。
圖83顯示核酸SEQ.ID.No.165和氨基酸SEQ.ID.No.166。
圖84顯示核酸SEQ.ID.No.167和氨基酸SEQ.ID.No.168。
圖85顯示核酸SEQ.ID.No.169和氨基酸SEQ.ID.No.170。
圖86顯示核酸SEQ.ID.No.171和氨基酸SEQ.ID.No.172。
圖87顯示核酸SEQ.ID.No.173和氨基酸SEQ.ID.No.174。
圖88顯示核酸SEQ.ID.No.175和氨基酸SEQ.ID.No.176。
圖89顯示核酸SEQ.ID.No.177和氨基酸SEQ.ID.No.178。
圖90顯示核酸SEQ.ID.No.179和氨基酸SEQ.ID.No.180。
圖91顯示核酸SEQ.ID.No.181和氨基酸SEQ.ID.No.182。
圖92顯示核酸SEQ.ID.No.183和氨基酸SEQ.ID.No.184。
圖93顯示核酸SEQ.ID.No.185和氨基酸SEQ.ID.No.186。
圖94顯示核酸SEQ.ID.No.187和氨基酸SEQ.ID.No.188。
圖95顯示核酸SEQ.ID.No.189和氨基酸SEQ.ID.No.190。
圖96顯示核酸SEQ.ID.No.191和氨基酸SEQ.ID.No.192。
圖97顯示核酸SEQ.ID.No.193和氨基酸SEQ.ID.No.194。
圖98顯示核酸SEQ.ID.No.195和氨基酸SEQ.ID.No.196。
圖99顯示核酸SEQ.ID.No.197和氨基酸SEQ.ID.No.198。
圖100顯示核酸SEQ.ID.No.199和氨基酸SEQ.ID.No.200。
圖101顯示核酸SEQ.ID.No.201和氨基酸SEQ.ID.No.202。
圖102顯示核酸SEQ.ID.No.203和氨基酸SEQ.ID.No.204。
圖103顯示核酸SEQ.ID.No.205和氨基酸SEQ.ID.No.206。
圖104顯示核酸SEQ.ID.No.207和氨基酸SEQ.ID.No.208。
圖105顯示核酸SEQ.ID.No.209和氨基酸SEQ.ID.No.210。
圖106顯示核酸SEQ.ID.No.211和氨基酸SEQ.ID.No.212。
圖107顯示核酸SEQ.ID.No.213和氨基酸SEQ.ID.No.214。
圖108顯示核酸SEQ.ID.No.215和氨基酸SEQ.ID.No.216。
圖109顯示核酸SEQ.ID.No.217和氨基酸SEQ.ID.No.218。
圖110顯示核酸SEQ.ID.No.219和氨基酸SEQ.ID.No.220。
圖111顯示核酸SEQ.ID.No.221和氨基酸SEQ.ID.No.222。
圖112顯示核酸SEQ.ID.No.223和氨基酸SEQ.ID.No.224。
圖113顯示核酸SEQ.ID.No.225和氨基酸SEQ.ID.No.226。
圖114顯示核酸SEQ.ID.No.227和氨基酸SEQ.ID.No.228。
圖115顯示核酸SEQ.ID.No.229和氨基酸SEQ.ID.No.230。
圖116顯示核酸SEQ.ID.No.231和氨基酸SEQ.ID.No.232。
圖117顯示核酸SEQ.ID.No.233和氨基酸SEQ.ID.No.234。
圖118顯示核酸SEQ.ID.No.235和氨基酸SEQ.ID.No.236。
圖119顯示核酸SEQ.ID.No.237和氨基酸SEQ.ID.No.238。
圖120顯示核酸SEQ.ID.No.239和氨基酸SEQ.ID.No.240。
圖121顯示核酸SEQ.ID.No.241和氨基酸SEQ.ID.No.242。
圖122顯示核酸SEQ.ID.No.243和氨基酸SEQ.ID.No.244。
圖123顯示核酸SEQ.ID.No.245和氨基酸SEQ.ID.No.246。
圖124顯示核酸SEQ.ID.No.247和氨基酸SEQ.ID.No.248。
圖125顯示核酸SEQ.ID.No.249和氨基酸SEQ.ID.No.250。
圖126顯示核酸SEQ.ID.No.251和氨基酸SEQ.ID.No.252。
圖127顯示核酸SEQ.ID.No.253和氨基酸SEQ.ID.No.254。
圖128顯示核酸SEQ.ID.No.255和氨基酸SEQ.ID.No.256。
圖129顯示核酸SEQ.ID.No.257和氨基酸SEQ.ID.No.258。
圖130顯示核酸SEQ.ID.No.259和氨基酸SEQ.ID.No.260。
圖131顯示核酸SEQ.ID.No.261和氨基酸SEQ.ID.No.262。
圖132顯示核酸SEQ.ID.No.263和氨基酸SEQ.ID.No.264。
圖133顯示核酸SEQ.ID.No.265和氨基酸SEQ.ID.No.266。
圖134顯示核酸SEQ.ID.No.267和氨基酸SEQ.ID.No.268。
圖135顯示核酸SEQ.ID.No.269和氨基酸SEQ.ID.No.270。
圖136顯示核酸SEQ.ID.No.271和氨基酸SEQ.ID.No.272。
圖137顯示核酸SEQ.ID.No.273和氨基酸SEQ.ID.No.274。
圖138顯示核酸SEQ.ID.No.275和氨基酸SEQ.ID.No.276。
圖139顯示核酸SEQ.ID.No.277和氨基酸SEQ.ID.No.278。
圖140顯示核酸SEQ.ID.No.279和氨基酸SEQ.ID.No.280。
圖141顯示核酸SEQ.ID.No.281和氨基酸SEQ.ID.No.282。
圖142顯示核酸SEQ.ID.No.283和氨基酸SEQ.ID.No.284。
圖143顯示核酸SEQ.ID.No.285和氨基酸SEQ.ID.No.286。
圖144顯示核酸SEQ.ID.No.287和氨基酸SEQ.ID.No.288。
圖145顯示核酸SEQ.ID.No.289和氨基酸SEQ.ID.No.290。
圖146顯示核酸SEQ.ID.No.291和氨基酸SEQ.ID.No.292。
圖147顯示核酸SEQ.ID.No.293和氨基酸SEQ.ID.No.294。
圖148顯示核酸SEQ.ID.No.295和氨基酸SEQ.ID.No.296。
圖149顯示核酸SEQ.ID.No.297和氨基酸SEQ.ID.No.298。
圖151顯示序列組的比較。
圖152顯示了全長克隆的對比。
圖153顯示通過PCR克隆細胞色素p450cDNA片段的方法。
發明詳述定義除非另有定義，本文使用的所有技術和科技術語均與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的具有相同的意義。Singleton等，(1994)《微生物和分子生物學字典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第二版，John Wiley and Sons(紐約)為技術人員提供了許多關于本發明所用術語的通用字典。本文所提及的所有專利和出版物均納入本文作為參考。出于本發明的目的，下列術語如下定義。
“酶活性”包括脫甲基化、羥基化、環氧化、N-氧化、磺基氧化、N-、S-和O-脫烷基化、脫硫作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團的還原。術語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的，或有義或反義的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，并且除非另有限制，該術語包括能以類似于天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有指出，特定的核酸序列包括其互補序列。
術語“可操作性連接”、“可操作性結合”和“以可操作性順序”指核酸表達控制序列(例如啟動子、信號序列或轉錄因子結合位點的陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列影響對應于第二序列的核酸的轉錄和/或翻譯。
當術語“重組體”用于指細胞時，它指該細胞復制異源核酸，表達所述核酸或表達異源核酸編碼的肽、異源肽或蛋白質。重組細胞可以有義或反義形式表達在細胞的天然形式(非重組)中未發現的基因或基因片段。重組細胞也可表達在細胞的天然形式中發現的基因，但其中該基因通過人工方式被改變并重新引入細胞。
“結構基因”是含有編碼蛋白質、多肽或其部分的DNA片段的基因的一部分，并且不包括啟動轉錄的5’序列。或者結構基因可編碼不可翻譯的產物。結構基因可是在細胞中正常發現的基因，或者它是引入的而非在細胞或細胞位置中正常發現的基因，在這種情況下稱為“異源基因”。異源基因可全部或部分來源于本領域已知的任何來源，包括細菌基因組或附加體、真核生物的、核的或質粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學合成的DNA。結構基因可含有一種或多種修飾，這些修飾可影響生物活性或其特性、表達產物的生物活性或化學結構、表達速率或表達控制的方式。這種修飾包括(但不限于)一個或多個核苷酸的突變、插入、刪除和取代。結構基因可構成不間斷的編碼序列或可包括一個或多個與合適的剪接接頭結合的內含子。結構基因可以是可翻譯或不可翻譯的，包括反義方向(antisense orientation)。結構基因可以是來源于多種來源和多種基因序列的復合物(天然存在的或合成的，其中合成的指化學合成的DNA)。
“來源于”用來指從某種來源(化學和/或生物的)取得、獲得、接受得、追溯、復制或傳下的。可通過對原始來源的化學或生物學操作(包括，但不限于取代、添加、插入、刪除、提取、分離、突變和復制)產生衍生物。
涉及DNA序列的術語“化學合成的”指部分核苷酸組分在體外裝配。可使用已良好建立的方法(Caruthers，《DNA和RNA測序的方法》(Methodologyof DNA and RNA Secquencing)，(1983)，Weissman編，Praeger Publishers，New York，第1章)實現DNA的手工化學合成；可使用許多市售可得的機器的一種進行自動化學合成。
可通過以下方法進行序列的最佳對比Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2482(1981))的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443(1970))的同源性算法、Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988))的相似性檢索方法、這些算法的計算機化的工具(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通過檢驗。
可從幾種來源(包括生物信息國家中心(NCBI，Bethesda，Md.)和因特網)獲得NCBI基礎局部序列比對檢索工具(BLAST)(Altschul等，1990)與序列分析程序blast、blastn、blastx、tblastn和tblastx聯合使用。該工具可在htp//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/獲得。如何使用該程序檢測序列同一性描述于http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html。
本文使用并應用于氨基酸序列的術語“實質氨基酸同一性”或“實質氨基酸序列同一性”表示多肽的一種特性，其中與參考組在所翻譯肽的細胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一氨基酸到終止密碼子的對應區域相比，所述肽含有至少70％的序列同一性、優選80％氨基酸序列同一性、更優選90％氨基酸序列同一性、最優選至少99-100％序列同一性的序列。
本文使用并應用于核酸序列的術語“實質核酸同一性”或“實質核酸序列同一性”表示多核苷酸序列的一種特性，其中與參考組在所翻譯肽的細胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應區域相比，所述多核苷酸含有至少75％的序列同一性、優選81％序列同一性、更優選91％序列同一性、最優選至少99-100％序列同一性的序列。
核苷酸序列實質相同的另一個指標是兩個分子在嚴格條件下是否可雜交。嚴格條件視序列而定，在不同情況下是不同的。嚴格條件一般選擇比給定離子強度和pH時特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-20℃，通常是約10-15℃。Tm是在給定離子強度和pH時50％靶序列與匹配的探針雜交的溫度。嚴格條件通常是鹽濃度為約0.02摩爾，pH是7，溫度是至少約60℃。例如，在標準的Southern雜交方法中，嚴格條件包括于42℃在6×SSC中初次洗滌，然后于至少約55℃(通常是約60℃，更常見是約65℃)在0.2×SSC進行一次或多次額外洗滌。
出于本發明的目的，當核苷酸序列編碼的多肽和/或蛋白質實質性相同時，核苷酸序列也實質性相同。因此，當一條核酸序列與第二條核酸序列編碼的多肽實質性相同時，這兩條核酸序列是實質性相同的，即使由于遺傳密碼所允許的簡并性造成它們在嚴格條件下不會雜交(對密碼子簡并性和遺傳密碼的解釋參見Darnell等，(1990)《分子生物學》(Molecular Cell Biology)，第二版，Scientific American Books W.H.Freeman and Company，New York)。可通過許多本領域熟知的方式，例如蛋白質樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后基于染色通過目測來表征蛋白質純度或均一性。出于特定的目的，可能需要高分辨率并可利用HPLC或類似的裝置。
本文使用的術語“載體”指將DNA片段轉移入細胞的核酸分子。載體可由于復制DNA并可在宿主細胞中獨立地復制。術語“運載體”有時可與“載體”互換使用。本文使用的術語“表達載體”指重組DNA分子，該分子含有所需的編碼序列和用于在特定宿主生物體中表達操作性相連的編碼序列所需合適的核酸序列。通常，原核生物中表達所需的核酸序列通常含有啟動子、操縱子(任選)與核糖體結合位點，以及其它序列。已知真核細胞可利用啟動子、增強子以及終止和聚腺苷酸化信號。
為再生完全經遺傳工程改造的具有根的植物，可在植物細胞中插入核酸，例如通過諸如體內接種的任何技術或通過任何已知的體外組織培養技術來產生可再生為完整植物的轉化植物細胞。因此，例如可通過病原性或非病原性根瘤土壤桿菌(A.tumefacien)的體外接種來插入植物細胞。也可使用其它這樣的組織培養技術。
“植物組織”包括分化或未分化的植物組織，包括，但不限于根、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織以及培養物中細胞的各種形式，例如單細胞、原生質體、胚和愈傷組織。植物組織可在植物中(in planta)或器官中，組織或細胞培養物中。
本文使用的“植物細胞”包括植物中的植物細胞和培養物中的植物細胞和原生質體。
“cDNA”或“互補DNA”一般指核苷酸序列與RNA分子互補的單鏈DNA分子。cDNA是通過逆轉錄酶在RNA模板作用形成的。
獲得核酸序列的方案根據本發明，從轉化體和非轉化體煙草譜系的煙草組織中提取RNA。提取的RNA然后用于產生cDNA。然后使用兩種方案產生本發明的核酸序列。
在第一方案中，從植物組織中提取富含polyA的RNA并通過逆轉錄PCR制備cDNA。然后使用簡并引物加上寡聚d(T)反向引物，用單鏈cDNA產生p450特異性PCR群。以高度保守的p450基序為基礎設計引物。特定的簡并引物的例子示于圖1。進一步分析含有合適大小插入物的質粒的序列片段。這些插入物的大小一般是約300-800個核苷酸，視采用何種引物而定。
在第二方案中，首先構建cDNA文庫。使用簡并引物加上在質粒上作為反向引物的T7引物，使用質粒中的cDNA產生p450特異的PCR群。如第一方案中一樣，進一步分析含有合適大小插入物的質粒的序列片段。
已知產生高水平降煙堿的煙草植物譜系(轉化體)和降煙堿水平檢測不到的植物譜系可用作起始材料。
然后可從植物上取下葉子并用乙烯處理以激活本文所定義的p450酶活性。示于本領域已知的技術提取總RNA。然后使用如圖153所述的寡聚d(T)引物經PCR(RT-PCR)產生cDNA片段。然后可完全地構建本文實施例所述的cDNA文庫。
p450型酶的保守區域可用作簡并引物(圖75)的模板。可通過PCR使用簡并引物擴增p450特異性條帶。表示p450樣酶的區帶可通過DNA測序鑒定。可使用鑒定合適的候選對象的BLAST檢索、算法或其它工具來表征PCR片段的特性。
已鑒定片段的序列信息可用于開發PCR引物。這些引物與cDNA文庫中的質粒引物聯合用于克隆全長p450基因。進行大規模Sourthern反向分析來檢測所有獲得的片段克隆以及在一些情況中全長克隆的差別表達。在本發明的這個方面，為篩選所有克隆的插入物，可用不同組織的標記的總cDNA作為探針來與克隆的DNA片段雜交，進行大規模反向Sourthern測定。
也用非放射性和放射性(P32)Northern印跡測定來鑒定克隆p450片段和全長克隆。
通過衍生它們的氨基酸序列與選擇抗原性和對其它克隆獨特的肽區域來制造針對幾種全長克隆的肽特異性抗體。制造了針對偶聯于運載體蛋白的合成肽的家兔抗體。使用這些抗體對植物組織進行Western印跡分析或其它免疫學方法。
可使用病毒誘導的基因沉默技術(VIGS，Baulcombe，Current Opinions inPlant Biology，1999，2109-113)檢測以上鑒定的核酸序列。
通過衍生它們的氨基酸序列與選擇可能的抗原性和對其它克隆獨特的肽區域來制造針對幾種全長克隆的肽特異性抗體。制造了針對偶聯于運載體蛋白的合成肽的家兔抗體。使用這些抗體進行Western印跡分析。
在本發明的另一方面，使用干擾RNA(RNAi)技術在本發明的煙草植物中進一步鑒定細胞色素p450酶活性。描述該技術的以下參考文獻納入本文作為參考，Smith等，Nature，2000，407319-320；Fire等，Nature，1998，391306-311；Waterhouse等，PNAS，1998，9513959-13964；Stalberg等，Plant Molecular Biology，1993，23671-683；Baulcombe，Current Opinions inPlant Biology，1999，2109-113和Brigneti等，EMBO Journal，1998，17(22)6739-6746。可使用RNAi技術、反義技術或所述的各種其它方法來轉化植物。
有幾種技術將外來遺傳物質引入植物細胞并獲得穩定地維持和表達所引入基因的植物。這種技術包括加速包裹在微粒上的遺傳物質進入細胞(授予Cornell的美國專利4,945,050和授予DowElanco的美國專利5,141,131)。可使用土壤桿菌技術來轉化植物，參見授予University of Toledo的美國專利5,177,010；授予Texas A &M的5,104,310；Schilperoot的歐洲專利申請0131624B1、歐洲專利申請120516、159418B1、歐洲專利申請120516、159418B1和176,112；授予Schilperoot美國專利5,149,645；5,469,976；5,464,763；4,940,838和4,693,976；MaxPlanck的歐洲專利申請116718、290799、320500；Japan Nicotiana的歐洲專利申請604662和627752；CibaGeigy的歐洲專利申請0267159、0292435和美國專利5,23l,019；授予Calgene的美國專利5,463,174和4,762,785；授予Agracetus的美國專利5,004,863和5,159,135。其它轉化技術包括whiskers技術，參見，例如授予Zeneca的美國專利5,302,523和5,464,765。電穿孔技術也用于轉化植物，參見，Boyce Thompson Institute的WO 87/06614、Dekalb的5,472,869和5,384,253；PGS的WO9209696和WO9321335。所有這些轉化專利和出版物引作參考。除了許多轉化植物的技術以外，與外來基因接觸的組織的類型也可變。這種組織包括，但不限于胚胎發生組織、I和II型愈傷組織、下胚軸、分生組織等。使用技術人員已知的合適的技術幾乎可轉化所有分化過程中的植物組織。
引入植物的外來遺傳物質可包含選擇標記。具體的標記可由技術人員判斷，但以下選擇標記可與任何其它可用作選擇標記的本文未列出的基因一起使用。這種選擇標記包括，但不限于編碼抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的轉座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸轉移酶基因，以及編碼對N-膦酰甲基甘氨酸、潮霉素、氨甲喋呤、草銨膦(phosphinothricin)(bar)、咪唑啉酮、磺酰脲和三唑并嘧啶除草劑，例如chlorosulfuron、溴苯腈、茅草枯等具抗性或耐受性的那些基因。
除了選擇標記以外，可能需要使用報道基因。在一些例子中，可使用報道基因而無需選擇標記。報道基因是通常不存在于或不表達于受者生物體或組織中的基因。報道基因通常編碼提供一些表型改變或酶性能的蛋白質。這種基因的例子見納入本文作為參考的K.Weising等，Ann.Rev.Genetics，22，421(1988)。優選的報道基因包括，但不限于葡糖醛酸酶(GUS)基因和GFP基因。
一旦引入植物組織后，可通過任何本領域已知的方法來評價結構基因的表達，可以mRNA轉錄、蛋白質合成或發生沉默基因的量來檢測表達(參見納入本文作為參考的美國專利號5,583,021)。用于體外培養植物細胞和在許多情況中，用于再生完整植物的技術是已知的(歐洲申請號88810309.0)。本領域的技術人員已知將引入的表達復合物變為商業有用品種的方法。
一旦獲得表達所需水平的p450酶的植物細胞，可使用本領域熟知的方法和技術再生植物組織和完整的植物。再生的植物可通過常規方法繁殖，引入的基因可通過常規植物育種技術轉入其它品系或品種。
以下實施例描述了實施本發明的方法并且應理解為是說明性的，而非基于此來限制本發明在權利要求中所定義的范圍。
實施例實施例1植物組織的發育和乙烯處理植物生長將植物種在盆中，在溫室中生長4周。將4周齡的幼苗移到單獨的盆中，溫室中生長2個月。生長過程中，每天給植物澆水2次，水中含有150ppm的NPK肥料。將展開的綠葉與植物分離，以進行下面所述的乙烯處理。
細胞系78379由肯塔基大學發放的煙草品系78379用作植物材料的來源，它是一種白肋(burley)煙草品系。用本領域種植煙草的標準方法培養100株植物，移植，并且用不同的數字(1-100)給它們貼注標簽。用推薦的方法施肥和進行田間管理。
100株植物中的3/4將20-100％的煙堿轉化為降煙堿。100株中的1/4將小于5％的煙堿轉化為降煙堿。植株87轉化率最低(2％)，而植株21的轉化率為100％。將轉化率小于3％的植株分類為非轉化株。對植株87和21自花授粉的種子以及雜交(21×87和87×21)的種子進行遺傳差異和表型差異的研究。來自植株21自花授粉種子的植物是轉化株，99％的來自植株87自花授粉種子的植物是非轉化株。剩余1％的來自植株87自花授粉種子的植物有較低的轉化率(5-15％)。雜交種均為轉化株。
細胞系4407煙草品系4407用作植物材料來源，它是一種白肋品系。選擇均一的并且具代表性的植物(100)并貼上標簽。在這100株植物中，97株是非轉化株，3株是轉化株。植株56的轉化率最低(1.2％)，植株58的轉化水平最高(96％)。將這兩株植物進行自花授粉和雜交。
來自植株58自花授粉種子的植株產生3∶1的分離比(轉化株∶非轉化株＝3∶1)。植株58-33和58-25分別被鑒定為純合轉化株和非轉化株植物品系。植株58-33下一代后裔中的分析確證了該植株的穩定轉化率。
細胞系PBLB01PBLB01是由ProfiGen，Inc.研究開發的一種白肋品系，用作植物材料的來源。從PBLB01的第一代(foundation)種子中選擇轉化株植株。
乙烯處理方法將綠色葉片從溫室生長2-3個月的植物分離，噴施0.3％的乙烯溶液(商品名Ethephon(Rhone-Poulenc))。將每片經噴施的葉子懸掛在配有加濕器的養護架(curing rack)上，覆蓋塑料膜。在處理期間，用乙烯溶液定期噴施樣品葉片。乙烯處理后約24-48小時，收集葉子提取RNA。取同一組樣品的另外一份(sup-sample)用于代謝成分分析以測定葉片代謝物的濃度以及感興趣的更具體的成分如多種生物堿的分析。
例如，可如下進行生物堿分析。樣品(0.1克)和0.5毫升2N NaOH以及含有喹啉(作為內標)和甲基叔丁基乙醚的5毫升提取液在150rpm振蕩。在配有FID檢測器的HP6890GC上分析樣品。250℃的溫度用于檢測器和上樣器(injector)。使用含有與5％苯酚和95％甲基硅酮(methyl silicon)交聯的熔融硅石的HP柱(30m-0.32nm-1m)，溫度梯度為每分鐘10℃，110-185℃。該柱在100℃工作，用氦氣作為運載氣體，流速為1.7cm3min-1，分流比為40∶1，上樣體積為2·1。
實施例2分離RNA對于RNA的提取，如上所述用乙烯處理2月齡溫室植物的中等大小的葉片。0和24-48小時的樣品用于RNA提取。在有些情況下，從打頂(flower-head removal)后10天的植物取處于衰老過程的葉片樣品。這些樣品也用于提取。用Rneasy Plant Mini Kit(Qiagen，Inc.，Valencia，California)按照生產商的方法分離總RNA。
用DEPC處理過的研缽和杵在液氮中將組織樣品研磨為細粉。將約100毫克磨碎的組織轉移到滅菌的1.5毫升eppendorf管中。將樣品管置于液氮中，直到收集完所有樣品。然后，將試劑盒中提供的450μl RLT緩沖液加入各管中。劇烈振蕩樣品，然后在56℃溫育3分鐘。將裂解物加在放于2毫升收集管中的QIAshredderTM旋轉柱上，最大速度離心2分鐘。收集流出液，加0.5體積的乙醇到澄清的裂解液中。充分混合樣品，轉移到放在2毫升收集管中的小旋轉柱中。10,000rpm離心樣品1分鐘。然后，吸取700μl RW1緩沖液到Rneasy柱上，10,000rpm離心1分鐘。吸取RPE緩沖液到置于新收集管中的Rneasy柱上，10,000rpm離心1分鐘。再將RPE緩沖液加到Rneasy旋轉柱上，以最大速度離心2分鐘以使膜干燥。為了除掉殘留的乙醇，將膜置于一空收集管上，再以最大速度離心1分鐘。將Rneasy柱轉移到一個新的1.5毫升收集管中，將40μl不含RNA酶的水直接吸到Rneasy膜上。該最終洗脫物在10,000rpm離心1分鐘。用變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質量和數量。
按照生產商的方法用OligotexTMpoly A+RNA純化試劑盒(Qiagen Inc.)分離Poly(A)RNA。使用溶于最大為250μl體積的約200μg總RNA。將250μl OBB緩沖液和15μl OligotexTM懸浮液加到250μl總RNA中。通過吸打使這些物質徹底混合，在加熱器(heating block)上70℃保溫3分鐘。然后，將樣品置于室溫約20分鐘。最大速度離心2分鐘得到oligotexmRNA復合物團塊。從微離心管中除去全部上清液，僅剩約50μl。再用OBB緩沖液處理樣品。通過渦旋將oligotexmRNA團塊重新懸浮在400μl OW2緩沖液中。將該混合物轉移到置于新管中的小旋轉柱上，以最大速度離心1分鐘。將旋轉柱移到新管中，再往該柱中加入400μl OW2緩沖液。然后，以最大速度離心該管。將旋轉柱轉移到最終的1.5毫升微量離心管中。用60μl熱的(70℃)OEB緩沖液洗脫樣品。用變性甲醛凝膠和分光光度計分析Poly A產物。
實施例3反轉錄-PCR按照生產商的方法用SuperScript反轉錄酶(Invitrogen，Carlsbad，California)制備第一鏈cDNA。富集了poly A+RNA的寡聚dT引物混合物由少于5μg的總RNA、1μl 10mM dNTP混合物、1μl Oligo d(T)12-18(0.5μg/μl)和至多10μl的經DEPC處理的水組成。各樣品在65℃溫育5分鐘，然后置于冰上至少1分鐘。按順序加入下列各組分，以制備反應混合物2μl 10×RT緩沖液、4μl 25mM MgCl2、2μ10.1M DTT和1μl去除RNA酶的重組RNA酶抑制劑(Rnase OUT Recombinant RNaseInhibitor)。吸取9μl反應混合物到各RNA/引物混合物，輕柔混合。42℃溫育2分鐘，在各管中加入1μl Super Script IITMRT，42℃溫育50分鐘。在70℃終止反應15分鐘，冰上冷卻。離心收集樣品，在各管中加入1μlRNase H，37℃溫育20分鐘。用200pmoles正向引物(如圖75所示的變性引物，SEQ ID NO.149-156)和100pmoles反向引物(18堿基的寡聚d(T)，接一個隨機堿基)進行第二次PCR。
反應條件是94℃2分鐘；然后進行40個循環的PCR94℃1分鐘，45-60℃2分鐘，72℃3分鐘；最后72℃再延伸額外的10分鐘。
用1％的瓊脂糖凝膠電泳分析10微升的擴增樣品。將大小正確的條帶從瓊脂糖凝膠上純化出來。
實施例4PCR片段群體的產生按照生產商的方法將實施例3得到的PCR片段連接到pGEM-T EasyVector(Promega，Madison，Wisconsin)中。用連接產物轉化JM109感受態細胞，涂在LB培養基平板上，進行藍/白選擇。選擇克隆，置于96孔板上在1.2毫升LB培養基中37℃生長過夜。對于所有選出的集落保留凍存管。用Beckman′s Biomeck 2000小制備機器人技術(miniprep robotics)以WizardSVMiniprep試劑盒(Promega)從平板上純化質粒。用100μl水洗脫質粒DNA，存貯于96孔板中。用EcoR1消化質粒，并用1％瓊脂糖凝膠分析以確證DNA的量和插入片段的大小。用CEQ 2000測序儀(Beckman，Fullerton，California)測序含有400-600bp插入片段的質粒。用BLAST搜索將測得的序列與Genbank數據庫進行比對。鑒定與p450相關的片段并進一步分析。或者，將p450片段從差減文庫中分離出來。如上所述分析這些片段。
實施例5CDNA文庫的構建如下所述從乙烯處理的葉片中制備總RNA以構建cDNA文庫。首先，用改良的酸酚和氯仿提取方法從乙烯處理的煙草品系58-33葉片中提取總RNA。改良的方法是用1克組織進行研磨，隨后在5毫升加入了5毫升苯酚(pH5.5)和5毫升氯仿的提取緩沖液(100mMTris-HCl，pH 8.5；200mMNaCl；10mM EDTA；0.5％SDS)中渦旋。將提取的樣品離心，保留上清。該提取步驟再重復2-3次直到上清變得澄清。加入約5毫升氯仿以除去痕量的苯酚。加入3倍體積的ETOH和1/10體積的3M NaOAc(pH5.2)以從混合的上清組分中沉淀RNA，在-20℃存貯1小時。轉移到Corex玻璃容器中以后，在4℃9,000RPM離心RNA組分45分鐘。離心下來的團塊用70％乙醇洗滌，4℃9,000RPM離心5分鐘。團塊干燥以后，將RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。分別用變性甲醛和分光光度計分析總RNA的質量和數量。
以下述步驟用Oligo(dT)纖維素方法(Invitrogen)和微離心旋轉柱(Invitrogen)從得到的總RNA中分離poly A+RNA。約20mg總RNA進行兩次純化以獲得高質量的poly A+RNA。用變性甲醛和隨后的已知全長基因的RT-PCR(確保高質量的mRNA)來分析PolyA+RNA產物。
接著，以poly A+RNA作模板用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-cDNAGigapackIII金克隆試劑盒(gold cloning kit)(Stratagene，La Jolla，California)來產生cDNA文庫。其中的方法按照生產商規定的步驟來進行。用約8μg polyA+RNA來構建cDNA文庫。初級文庫的分析顯示約有2.5×106-1×107pfu。用IPTG和X-gal進行了互補分析，以檢測文庫的質量背景，其中重組噬菌斑的表達高出背景反應100倍以上。
用隨機PCR對文庫進行的更為定量的分析表明，插入的cDNA的平均大小約為1.2kb。該方法采用了如下所述的兩步法PCR。對于第一步，反向引物的設計是基于從p450片段獲得的初級序列信息。設計的反向引物和T3(正向)引物用于從cDNA文庫中擴增相應的基因。PCR反應物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割高分子量的相應條帶，純化、克隆并測序。在第二步中，用根據p450的5′UTR或翻譯起始區域設計的新引物作為正向引物，和反向引物一起(根據p450的3′UTR設計)用于下一步的PCR以獲得全長p450克隆。
如實施例3所述(反向引物除外)從構建的cDNA文庫中用PCR擴增獲得p450片段。用位于質粒上cDNA插入片段下游(見圖75)的T7引物作為反向引物。如實施例4所述分離、克隆和測序PCR片段。
從構建的cDNA文庫中用PCR方法分離全長p450基因。用基因特異性反向引物(根據p450片段的下游序列設計)和正向引物(位于文庫質粒上的T3)來克隆全長基因。分離、克隆并測序PCR片段。如果需要，可進行第二步PCR。在第二步PCR中，用根據克隆的p450的5′UTR設計的新正向引物和根據p450的3′UTR設計的反向引物來進行下一步的PCR反應，以獲得全長p450克隆。然后對克隆測序。
實施例6克隆片段的鑒定-反向SOUTHERN印跡分析在以上實施例中鑒定的所有p450克隆上進行非放射性大規模反向southern印跡試驗以檢測差異性表達。觀察到不同p450基因簇之間的表達水平非常不同。在高水平表達的克隆上又進行了實時檢測。
非放射性southern印跡方法按如下所述進行。
1)如實施例2所述用Qiagen Rnaeasy試劑盒從乙烯處理和未處理的轉化株(58-33)和非轉化株(58-25)葉片提取總RNA。
2)用生物素加尾標記從上述步驟產生的富含poly A+的RNA中衍生的單鏈cDNA來制備探針。該標記的單鏈cDNA是如實施例3所述用轉化株和非轉化株的總RNA(Invitrogen)進行RT-PCR產生的，但用了生物素化的寡聚dT作為引物(Promega)。這些用作探針與克隆的DNA雜交。
3)用限制性內切酶EcoR1消化質粒DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳。將這些凝膠同時干燥并轉到兩個尼龍膜上(BiodyneB)。一個膜與轉化株探針雜交，另一個膜與非轉化株探針雜交。在雜交之前將膜進行紫外線交聯(自動交聯設備，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
或者，用位于p-GEM兩臂上的序列，T3和SP6作為引物從各質粒中PCR擴增插入片段。PCR產物在96孔的即時(Ready-to-run)瓊脂糖凝膠上電泳以進行分析。經確證的插入片段點到兩個尼龍膜上。一個膜與轉化株探針雜交，另一個膜與非轉化株探針雜交。
4)按生產商的說明書將這些膜雜交并洗滌，其中對洗滌的嚴格性進行了改變(Enzo MaxSenceTM試劑盒，Enzo Diagnostics，Inc，Farmingdale，NY)。膜與雜交緩沖液(2×SSC緩沖的甲酰胺，含有去垢劑和雜交增強劑)在42℃預雜交30分鐘，與10μl變性的探針42℃雜交過夜。然后室溫用1X雜交洗滌緩沖液洗滌雜交膜一次，10分鐘；68℃洗滌15分鐘，4次。然后可以對雜交膜進行檢測。
5)按生產商提供的檢測方法(Enzo Diagnostics，Inc.)，經洗滌的膜用堿性磷酸酶標記，然后用NBT/BCIP顏色檢測方法進行檢測。用1X封閉液室溫封閉雜交膜1小時，用1X檢測試劑洗滌10分鐘(3次)，用1X預顯影反應緩沖液洗滌5分鐘(2次)，然后在顯影液中顯影直到出現點狀印跡。所有的試劑都由生產商提供(Enzo Diagnostics，Inc)。此外，還用KPL southern雜交和檢測試劑盒TM按生產商的方法(KPL，Gaithersburg，Maryland)進行了大規模反向Southern試驗。
實施例7克隆的鑒定-NORTHERN印跡分析除Southern印跡分析之外，如Northern印跡分析的實施例所述，一些膜進行了Northern雜交和檢測。如下所述，采用Northern雜交檢測煙草中差異表達的mRNA。
采用隨機引發方法從克隆的p450制備探針(MegaprimeTMDNA標記系統，Amersham Biosciences)。
混合下述組分25ng變性的DNA模板；未標記的dTTP、dGTP和dCTP各4μl；5ul反應緩沖液；p32標記的dATP和2ul Klenow I；以及水，使反應體系達到50μl。該混合物在37℃溫育1-4小時，然后以2ul 0.5M的EDTA終止。使用前，95℃溫育5分鐘使探針變性。
從幾對煙草品系經乙烯處理和未經處理的新鮮葉片中制備RNA樣品。在有些情況下，使用了富含poly A+的RNA。用DEPC水(5-10μl)使約15ug總RNA或1.8ug mRNA(RNA或mRNA提取方法如實施例5所述)的體積相同。加入等體積的上樣緩沖液(1xMOPS；18.5％甲醛；50％甲酰胺；4％Ficoll400；溴酚藍)和0.55μl EtBr(0.5μg/μl)。將樣品變性，準備用電泳分離RNA。
將樣品用1XMOP緩沖液(0.4M嗎啉丙磺酸；0.1M乙酸鈉-3×H2O；10mM EDTA；用NaOH調pH至7.2)在甲醛凝膠(1％瓊脂糖，1×MOPS，0.6M甲醛)上電泳。用毛細方法在10×SSC緩沖液(1.5M NaCl；0.15M檸檬酸鈉)中將RNA轉移到Hybond-N+上(Nylon，AmershamPharmaciaBiotech)24小時。在雜交前，將有RNA樣品的膜紫外交聯(自動交聯設備，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
膜和5-10毫升預雜交緩沖液(5×SSC；50％甲酰胺；5xDenhardt′s-溶液；1％SDS；100g/ml熱變性的平端非同源DNA)在42℃預雜交1-4小時。將舊的預雜交緩沖液棄去，加入新的預雜交緩沖液和探針。雜交在42℃過夜進行。用2×SSC室溫洗滌膜15分鐘，然后用2×SSC洗滌一次。
本發明的一個主要焦點是發現了可被乙烯處理誘導的新基因或者在煙草葉片的質量和成分中起主要作用的新基因。如下表所示，Northern印跡和反向Southern印跡可用于測定哪些基因受乙烯處理的誘導(相對于不受誘導的植株)。令人感興趣的是，在轉化株和非轉化株植株中并非所有的片段都受到相似的影響。對感興趣的細胞色素p450片段部分測序以確定它們的結構相關性。該信息被用于后續分離和鑒定感興趣的全長基因克隆。

用全長克隆在從乙烯處理誘導的轉化株和非轉化株白肋品系獲得的煙草組織上進行Northern分析。目的是鑒定在乙烯誘導的轉化株植株中(相對于乙烯誘導的轉化株品系相對于乙烯誘導的非轉化株白肋品系)表達有所提高的那些全長基因克隆。用這種Northern分析方法，可以通過比較轉化株和非轉化株品系之間葉片組成的生化差異來確定全長克隆的功能關系。如下表所示，6個克隆在乙烯處理的轉化株植物組織中(標記為++和+++)顯示出比在乙烯處理的非轉化株植物組織中(標記為+)表達顯著升高。在未經乙烯處理的轉化株和非轉化株品系中所有這些克隆顯示出很少的表達或不表達。

實施例8由克隆的基因編碼的p450S的免疫檢測選擇來自3個p450克隆的長度相應于20-22個氨基酸的肽區域，這些肽區域1)與其它克隆具有很低的同源性或沒有同源性，和2)具有很好的親水性和抗原性。下面列出了選自各個p450克隆的肽區域的氨基酸序列。將合成的肽與KHL偶聯，然后注射到家兔中。
第4次注射后2周和4周收集抗血清(Alpha Diagnostic Intl.Inc.SanAntonio，TX)。
D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILGD90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNYD89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY用Western印跡分析來檢測抗血清對煙草植物組織靶蛋白的交叉活性。
從乙烯處理的(0-40小時)轉化株和非轉化株品系的中等大小的葉片獲得蛋白粗提物。按生產商的方法用RC DC蛋白檢測試劑盒(BIO-RAD)測定該提取物的蛋白濃度。
將2微克蛋白加到各泳道中，用Laemmli SDS-PAGE體系在10％-20％梯度凝膠上分離蛋白。用Trans-Blot半干槽(Semi-Dry cell)(BIO-RAD)將蛋白從凝膠轉移到PROTRAN硝化纖維轉移膜(Schleicher &Schuell)上。用ECL AdvanceTMWestern印跡檢測試劑盒(Amersham Biosciences)檢測和顯影p450蛋白。在家兔中制備針對合成的KLH耦合物的一抗。針對兔IgG的二抗(與過氧化物酶偶聯)購自Sigma。一抗和二抗都以1∶1000稀釋液使用。抗體對Western印跡上的一條單一條帶顯示出很強的反應性，說明該抗血清對感興趣的靶肽是單一特異性的。抗血清對與KLH耦合的合成肽也具有交叉反應性。
實施例9分離的核酸片段的核酸同一性和結構相關性超過100個克隆的p450片段結合Northern印跡分析來測序，以確定它們的結構相關性。所用方法中使用的正向引物基于兩個共有的p450基序，這兩個基序鄰近p450基因的羧基末端。該正向引物對應于如圖1所示的細胞色素p450基序FXPERF或GRRXCP(A/G)。反向引物使用來自質粒的標準引物(位于pGEMTM質粒的兩臂)SP6或T7，或使用多聚A尾巴。所用方法如下所述。
按生產商(Beckman Coulter)的方法用分光光度法評價起始雙鏈DNA的濃度。將模板用水稀釋到合適的濃度，95℃2分鐘加熱變性，然后置于冰上。測序反應液在冰上制備，其包括0.5-10μl變性DNA模板，2μl 1.6pmole正向引物，8μl DTCS Quick Start Master Mix，用水調節總體積到20μl。溫度循環程序包括以下30個循環96℃20秒，50℃20秒，60℃4分鐘，然后4℃保溫。
加入5μl終止緩沖液(等體積的3M NaOAc、100mM EDTA和1μl20mg/ml肝糖)使測序終止。用60μl 95％的冷乙醇沉淀樣品，6000g離心6分鐘。棄去乙醇。團塊用200μl冷的70％乙醇洗滌2次。團塊干燥以后，加入40μl SLS溶液，使團塊重懸。在表面上加入一層礦物油。然后，將樣品置于CEQ 8000自動測序儀中進行進一步分析。
為了驗證核酸序列，用基于p450基因的FXPERF或GRRXCP(A/G)區域的正向引物或基于質粒或多聚A尾巴的反向引物對核酸序列在兩個方向進行重新測序。在兩個方向上所有的測序至少進行兩次。
將細胞色素p450片段的核酸序列彼此比較，從編碼區(與編碼GRRXCP(A/G)的區域之后的第一個核酸相對應)一直到終止子。選擇該區域作為p450蛋白遺傳多態性的一個指示參數。觀察到大量的(超過70種)遺傳上不同的p450基因，類似于其它植物物種中所觀察到的。在比較核酸序列時發現，這些基因根據其序列同一性可置于不同的序列組群中。發現p450成員的最好的唯一的(unique)分組確定為那些具有75％或更大核酸同一性的序列(見表1)。降低同一性百分數導致組群明顯變大。觀察到優選的分組是那些具有81％或更大核酸同一性的序列，更優選的分組是具有91％或更大核酸同一性的序列，最優選的分組是具有99％或更大核酸同一性的序列。大多數組群包括至少2個成員，經常為3個或更多個成員。沒有重復觀察到其它情況，說明所采用的方法既能夠在所用組織中分離低表達的mRNA又能夠分離高表達的mRNA。
基于75％或更大核酸同一性，發現兩個細胞色素p450組群與之前(發現)的遺傳上與這兩個組群不同的煙草細胞色素基因具有核酸序列同一性。第23組在表I所用的指數范圍內，顯示出與之前分別由Czernic等和Ralston等提交的GenBank序列GI1171579(CAA64635)和GI14423327(或AAK62346)具有核酸同一性。GI1171579與第23組成員的核酸同一性為96.9％-99.5％，而GI14423327與第23組成員的核酸同一性為95.4％-96.9％。第31組的成員與Ralston等提交的GenBank序列GI14423319(AAK62342)有76.7％-97.8％的核酸同一性。表1中沒有其它p450同一性組群在表1所用的參數范圍內與Ralston等、Czernic等、Wang等或LaRosa和Smigocki報道的煙草p450基因具有同一性。
如圖76所示，對于各組，可衍生合適的核酸變性探針的共有序列，以優先從煙草植物中鑒定和分離各組的其它成員。
表I煙草p450核酸序列同一性組群組群 片段1 D58-BG7(SEQ ID No.1)，D58-AB1(SEQ ID No.3)；D58-BE4(SEQ ID No.7)2 D56-AH7(SEQ ID No.9)；D13a-5(SEQID No.11)3 D56-AG10(SEQ ID No.13)；D35-33(SEQ ID No.15)；D34-62(SEQ ID No.17)4 D56-AA7(SEQ ID No.19)；D56-AE1(SEQ ID No.21)；185-BD3(SEQID No.143)5 D35-BB7(SEQ ID No.23)；D177-BA7(SEQ ID No.25)；D56A-AB6(SEQ ID No.27)；D144-AE2(SEQ ID No.29)6 D56-AG11(SEQ ID No.31)；D179-AA1(SEQ ID No.33)7 D56-AC7(SEQ ID No.35)；D144-AD1(SEQ ID No.37)8 D144-AB5(SEQ ID No.39)9 D181-AB5(SEQ ID No.41)；D73-Ac9(SEQ ID No.43)10 D56-AC12(SEQ ID No.45)11 D58-AB9(SEQID No.47)；D56-AG9(SEQ ID No.49)；D56-AG6(SEQ ID No.51)；D35-BG11(SEQID No.53)；D35-42(SEQID No.55)；D35-BA3(SEQ ID No.57)；D34-57(SEQ ID No.59)；D34-52(SEQ ID No.61)；D34-25(SEQID No.63)12 D56-AD10(SEQID No.65)13 56-AA11(SEQ ID No.67)14 D177-BD5(SEQ ID No.69)；D177-BD7(SEQ ID No.83)15 D56A-AG10(SEQ ID No.71)；D58-BC5(SEQ ID No.73)；D58-AD12(SEQ ID No.75)16 D56-AC11(SEQ ID No.77)；D35-39(SEQ ID No.79)；D58-BH4(SEQ ID No.81)；D56-AD6(SEQ ID No.87)17 D73A-AD6(SEQ ID No.89)；D70A-BA11(SEQ ID No.91)18 D70A-AB5(SEQ ID No.95)；D70A-AA8(SEQ ID No.97)19 D70A-AB8(SEQ ID No.99)；D70A-BH2(SEQ ID No.101)；D70A-AA4(SEQ ID No.103)20 D70A-BA1(SEQ ID No.105)；D70A-BA9(SEQ ID No.107)
21 D70A-BD4(SEQ ID No.109)22 D181-AC5(SEQ ID No.111)；D144-AH1(SEQ ID No.113)；D34-65(SEQ ID No.115)23 D35-BG2(SEQ ID No.117)24 D73A-AH7(SEQ ID No.119)25 D58-AA1(SEQ ID No.121)；D185-BC1(SEQ ID No.133)；D185-BG2(SEQ ID No.135)26 D73-AE10(SEQ ID No.123)27 D56-AC12(SEQ ID No.125)28 D177-BF7(SEQ ID No.127)；D185-BE1(SEQ ID No.137)；D185-BD2(SEQ ID No.139)29 D73A-AG3(SEQ ID No.129)30 D70A-AA12(SEQ ID No.131)；D176-BF2(SEQ ID No.85)31 D176-BC3(SEQ ID No.145)32 D176-BB3(SEQ ID No.147)33 D186-AH4(SEQ ID No.5)實施例10分離的核酸片段的相關氨基酸序列同一性推測實施例8中獲得的細胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序列。被推測的區域對應于緊跟在GXRXCP(A/G)序列基序之后的氨基酸到羧基末端，或終止子。在比較片段的序列同一性時，氨基酸同一性為70％或更大的那些序列觀察到唯一的分組(unique grouping)。氨基酸同一性為80％或更大的那些序列觀察到優選的分組，更優選為90％氨基酸同一性或更大，最優選的分組是氨基酸同一性為99％或更大的那些序列。組群和組群成員的相應氨基酸序列示于圖2。發現這些唯一的(unique)氨基酸序列中的幾個與其它序列具有完全的序列同一性，因此只報道了具有相同氨基酸的一個成員。
根據它們的核苷酸序列，表II第19組的氨基酸同一性對應于3個不同的組群。各組成員的氨基酸序列和它們的同一性示于圖77。相應標示了氨基酸差異。
選擇了各氨基酸同一性組群中的至少一個成員用植物進行基因克隆和功能性研究。此外，經Northern和Southern分析評定為受乙烯處理的影響不同或具有其它生物學差異的組群成員也被選擇作基因克隆和功能研究。為有助于基因克隆，將基于序列同一性和差異序列進行表達研究和完整植物評價以及肽特異性抗體的制備。
表II煙草p450氨基酸序列同一性分組組群 片段1 D58-BG7(SEQ ID No.2)，D58-AB1(SEQ ID No.4)2 D58-BE4(SEQ ID No.8)3 D56-AH7(SEQ ID No.10)；D13a-5(SEQ ID No.12)4 D56-AG10(SEQ ID No.14)；D34-62(SEQ ID No.18)5 D56-AA7(SEQ ID No.20)；D56-AE1(SEQ ID No.22)；185-BD3(SEQ ID No.144)6 D35-BB7(SEQ ID No.24)；D177-BA7(SEQ ID No.26)；D56A-AB6(SEQ ID No.28)；D144-AE2(SEQ ID No.30)7 D56-AG11(SEQID No.32)；D179-AA1(SEQ ID No.34)8 D56-AC7(SEQ ID No.36)；D144-AD1(SEQ ID No.38)9 D144-AB5(SEQID No.40)10 D181-AB5(SEQ ID No.42)；D73-Ac9(SEQ ID No.44)11 D56-AC12(SEQ ID No.46)12 D58-AB9(SEQ ID No.48)；D56-AG9(SEQ ID No.50)；D56-AG6(SEQ ID No.52)；D35-BG11(SEQ ID No.54)；D35-42(SEQ IDNo.56)；D35-BA3(SEQ ID No.58)；D34-57(SEQ ID No.60)；D34-52(SEQ ID No.62)13 D56AD10(SEQ ID No.66)14 56-AA11(SEQ ID No.68)
15 D177-BD5(SEQ ID No.70)；D177-BD7(SEQ ID No.84)16 D56A-AG10(SEQ ID No.72)；D58-BC5(SEQ ID No.74)；D58-AD12(SEQ ID No.76)17 D56-AC11(SEQ ID No.78)；D56-AD6(SEQ ID No.88)18 D73A-AD6(SEQ ID No.90)19 D70A-AB5(SEQ ID No.96)；D70A-AB8(SEQ ID No.100)；D70A-BH2(SEQ ID No.102)；D70A-AA4(SEQ ID No.104)；D70A-BA1(SEQ ID No.106)；D70A-BA9(SEQ ID No.108)20 D70A-BD4(SEQ ID No.110)21 D181-AC5(SEQ ID No.112)；D144-AH1(SEQ ID No.114)；D34-65(SEQ ID No.116)22 D35-BG2(SEQ ID No.118)23 D73A-AH7(SEQ ID No.120)24 D58-AA1(SEQ ID No.122)；D185-BC1(SEQ ID No.134)；D185-BG2(SEQ ID No.136)25 D73-AE1O(SEQ ID No.124)26 D56-AC12(SEQ ID No.126)27 D177-BF7(SEQ ID No.128)；185-BD2(SEQ ID No.140)28 D73A-AG3(SEQ ID No.130)29 D70A-AA12(SEQ ID No.132)；D176-BF2(SEQ ID No.86)30 D176-BC3(SEQ ID No.146)31 D176-BB3(SEQ ID No.148)32 D186-AH4(SEQ ID No.6)實施例11全長克隆的相關氨基酸序列同一性推測實施例5中克隆的煙草全長基因核酸序列的完整氨基酸序列。通過3個保守p450結構域基序的存在來鑒定細胞色素p450基因，所述3個保守p450結構域基序對應于羧基末端的UXXRXXZ、PXRFXF或GXRXC，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是P、T、S或M。還注意到這些克隆中的兩個，D130-AA1和D101-BA2幾乎是完整的但缺少合適的終止子，然而它們都含有上述的3個p450細胞色素結構域。用BLAST程序鑒定所有p450具有的氨基酸同一性，把它們的全長序列彼此比較并且和已知的煙草基因比較。該程序使用了NCBI特定的BLAST工具(兩序列比對(Aligntwo sequences，b12seq)，http//www.ncbi.nlm.nih.oov/blast/b12sea7b12.html)。在沒有過濾器的情況下用BLASTN比對兩個核酸序列，用BLASTP比對氨基酸序列。基于它們的氨基酸同一性百分比，將各序列分到同一性組群中，其中各組群中包括的成員與另一個成員至少具有85％同一性。氨基酸同一性為90％或更大的那些序列觀察到優選的分組，更優選的分組具有95％氨基酸同一性或更大，最優選的分組具有氨基酸同一性為99％或更大的那些序列。采用這些標準，鑒定出25個不同的組群，示于表III。
在表III用于氨基酸同一性的參數范圍內，發現3個組群與已知煙草基因具有大于85％或更大的同一性。第5組的成員與先前Ralston等提交的GenBank序列GI14423327(或AAK62346)具有高達96％的全長序列氨基酸同一性。第23組與Ralston等提交的GI14423328(或AAK62347)有高達93％的氨基酸同一性。第24組與Ralston等提交的GI14423318(或AAK62343)有92％的氨基酸同一性。
表III煙草全長p450基因的氨基酸序列同一性組群1 D208-AD9(SEQ.ID.No.224)；D120-AH4(SEQ.ID.No.180)；D121-AA8(SEQ.ID.No.182)，D122-AF10(SEQ.ID.No.184)；D103-AH3(SEQ.ID.No.222)；D208-AC8(SEQ.ID.No.218)；D-235-ABI(SEQ.ID.No.246)2 D244-AD4(SEQ.ID.No.250)；D244-AB6(SEQ.ID.No.274)；D285-AA8；D285-AB9；D268-AE2(SEQ.ID.No.270)3 D100A-AC3(SEQ.ID.No.168)；D100A-BE24 D205-BE9(SEQ.ID.No.276)；D205-BG9(SEQ.ID.No.202)；D205-AH4(SEQ.ID.No.294)5 D259-AB9(SEQ.ID.No.260)；D257-AE4(SEQ.ID.No.268)；D147-AD3(SEQ.ID.No.194)6 D249-AE8(SEQ.ID.No.256)；D-248-AA6(SEQ.ID.No.254)7 D233-AG7(SEQ.ID.No.266；D224-BD11(SEQ.ID.No.240)；DAF108 D105-AD6(SEQ.ID.No.172)；D215-AB5(SEQ.ID.No.220)；D135-AE1(SEQ.ID.No.190)9 D87A-AF3(SEQ.ID.No.216)，D210-BD4(SEQ.ID.No.262)10 D89-AB1(SEQ.ID.No.150)；D89-AD2(SEQ.ID.No.152)；163-AG11(SEQ.ID.No.198)；163-AF12(SEQ.ID.No.196)11 D267-AF10(SEQ.ID.No.296)；D96-AC2(SEQ.ID.No.160)；D96-AB6(SEQ.ID.No.158)；D207-AA5(SEQ.ID.No.204)；D207-AB4(SEQ.ID.No.206)；D207-AC4(SEQ.ID.No.208)12 D98-AG1(SEQ.ID.No.164)；D98-AA1(SEQ.ID.No.162)13 D209-AA12(SEQ.ID.No.212)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ.ID.No.214)；D209-AH12(SEQ.ID.No.232)；D90a-BB3(SEQ.ID.No.154)14 D129-AD10(SEQ.ID.No.188)；D104A-AE8(SEQ.ID.No.170)15 D228-AH8(SEQ.ID.No.244)；D228-AD7(SEQ.ID.No.241)，D250-AC11(SEQ.ID.No.258)；D247-AH1(SEQ.ID.No.252)16 D128-AB7(SEQ.ID.No.186)；D243-AA2(SEQ.ID.No.248)；D125-AF11(SEQ.ID.No.228)17 D284-AH5(SEQ.ID.No.298)；D110-AF12(SEQ.ID.No.176)18 D221-BB8(SEQ.ID.No.234)19 D222-BH4(SEQ.ID.No.236)20 D134-AE11(SEQ.ID.No.230)21 D109-AH8(SEQ.ID.No.174)22 D136-AF4(SEQ.ID.No.278)23 D237-AD1(SEQ.ID.No.226)24 D112-AA5(SEQ.ID.No.178)25 D283-AC1(SEQ.ID.No.272)
根據靠近羧基末端的UXXRXXZ p450結構域和GXRXC p450結構域之間高度保守的氨基酸同源性進一步將這些全長基因分組。如圖3所示，比對各克隆保守結構域彼此之間的序列同源性，并將這些克隆分到不同的同源性組群中。在幾種情況下，雖然某克隆的核酸序列是不同的，但該區域的氨基酸序列是相同的。氨基酸同一性為90％或更大的那些序列觀察到優選的分組，更優選的分組具有95％氨基酸同一性或更大，最優選的分組具有氨基酸同一性為99％或更大的那些序列。最終的分組類似于根據這些克隆的完整氨基酸序列的同一性百分比而做的分組，第17組除外(表III)，它被分為2個不同的組。
在表IV用于氨基酸同一性的參數范圍內，發現3個組群與已知煙草基因具有90％或更大的同一性。第5組的成員與先前Ralston等提交的GenBank序列GI14423326(或AAK62346)具有高達93.4％的全長序列氨基酸同一性。第23組與Ralston等提交的GI14423328(或AAK62347)有高達91.8％的氨基酸同一性。第24組與Ralston等提交的GI14423318(或AAK62342)有98.8％的同一性。
表IV煙草p450基因保守結構域之間區域的氨基酸序列同一性組群1 1D208-AD9(SEQ.ID.No.224)；D120-AH4(SEQ.ID.No.180)；D121-AA8(SEQ.ID.No.182)，D122-AF10(SEQ.ID.No.184)；D103-AH3(SEQ.ID.No.222)；D208-AC8(SEQ.ID.No.218)；D-235-ABI(SEQ.ID.No.246)2 D244-AD4(SEQ.ID.No.250)；D244-AB6(SEQ.ID.No.274)；D285-AA8；D285-AB9；D268-AE2(SEQ.ID.No.270)3 D100A-AC3(SEQ.ID.No.168)；D100A-BE24 D205-BE9(SEQ.ID.No.276)；D205-BG9(SEQ.ID.No.202)；D205-AH4(SEQ.ID.No.294)5 D259-AB9(SEQ.ID.No.260)；D257-AE4(SEQ.ID.No.268)；D147-AD3(SEQ.ID.No.194)
6 D249-AE8(SEQ.ID.No.256)；D-248-AA6(SEQ.ID.No.254)7 D233-AG7(SEQ.ID.No.266；D224-BD11(SEQ.ID.No.240)；DAF108 D105-AD6(SEQ.ID.No.172)；D215-AB5(SEQ.ID.No.220)；D135-AE1(SEQ.ID.No.190)9 D87A-AF3(SEQ.ID.No.216)，D210-BD4(SEQ.ID.No.262)10 D89-AB1(SEQ.ID.No.150)；D89-AD2(SEQ.ID.No.152)；163-AG11(SEQ.ID.No.198)；163-AF12(SEQ.ID.No.196)11 D267-AF10(SEQ.ID.No.296)；D96-AC2(SEQ.ID.No.160)；D96-AB6(SEQ.ID.No.158)；D207-AA5(SEQ.ID.No.204)；D207-AB4(SEQ.ID.No.206)；D207-AC4(SEQ.ID.No.208)12 D98-AG1(SEQ.ID.No.164)；D98-AA1(SEQ.ID.No.162)13 D209-AA12(SEQ.ID.No.212)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ.ID.No.214)；D209-AH12(SEQ.ID.No.232)；D90a-BB3(SEQ.ID.No.154)14 D129-AD10(SEQ.ID.No.188)；D104A-AE8(SEQ.ID.No.170)15 D228-AH8(SEQ.ID.No.244)；D228-AD7(SEQ.ID.No.241)，D250-AC11(SEQ.ID.No.258)；D247-AH1(SEQ.ID.No.252)16 D128-AB7(SEQ.ID.No.186)；D243-AA2(SEQ.ID.No.248)；D125-AF11(SEQ.ID.No.228)17 D284-AH5(SEQ.ID.No.298)；D110-AF12(SEQ.ID.No.176)18 D221-BB8(SEQ.ID.No.234)19 D222-BH4(SEQ.ID.No.236)20 D134-AE11(SEQ.ID.No.230)21 D109-AH8(SEQ.ID.No.174)22 D136-AF4(SEQ.ID.No.278)23 D237-AD1(SEQ.ID.No.226)24 D112-AA5(SEQ.ID.No.178)25 D283-AC1(SEQ.ID.No.272)
26 D110-AF12(SEQ.ID.No.176)實施例12缺少一個或多個煙草細胞色素p450特異性結構域的煙草細胞色素p450克隆4個克隆與表III報道的其它煙草細胞色素基因具有高度的核酸同源性，核酸同源性介于90％至99％之間。這4個克隆包括D136-AD5、D138-AD12、D243-AB3和D250-AC11。然而，因為核苷酸移碼框的原因，這些基因不含有細胞色素p450C-末端的3個結構域中的一個或多個，因此排除在表III和IV所示的同一性組群之外。
有一個克隆，D95-AG1的氨基酸同一性不含有第3個結構域GXRXC，該結構域用來對表III或表IV中的p450煙草基因分組。該克隆的核酸同源性與其它煙草細胞色素基因的同源性低。該克隆代表了煙草中細胞色素p450基因的一個新的、不同的組群。
實施例13煙草細胞色素p450片段和克隆在改變煙草性質調控方面的應用煙草p450核酸片段或整個基因可用于鑒定和選擇煙草表型或組成有所改變的植株，更重要的是，可用于鑒定和選擇代謝物發生了變化的植株。用例如以反義方向(用于下調)或有義方向(用于上調)將摻入選自本文所述的核酸片段或全長基因的多種轉化系統來產生轉基因煙草植物。對于全長基因的過量表達，編碼本文所述全長基因的完整或功能性部分或氨基酸序列的任何核酸序列都是理想的，它們可有效增加某個酶的表達并因此在煙草中產生表型效果。通過一系列的回交獲得純合煙草品系，并評價其表型變化，包括但不限于，用本領域一般技術人員可獲得的常用技術來分析內源性p450RNA、轉錄物、p450表達的肽和植物代謝物的濃度。
煙草植物中表現出來的變化提供了感興趣的所選基因的功能性作用的信息，或者可用作優選的煙草植物品種。
實施例14鑒定乙烯處理的轉化株品系中誘導的基因采用高密度寡核苷酸陣列技術，Affymetrix基因芯片(GeneChip)(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA)陣列來進行基因表達的定量和高度平行性檢測。在使用該技術時，通過在固體表面上直接合成寡核苷酸來制作核酸陣列。這種固相化學能夠產生含有數十萬個寡核苷酸探針的陣列，這些寡核苷酸探針以極高的密度壓縮在芯片上，這種芯片稱為GeneChip。可由一個雜交同時篩選幾千個基因。每個基因通常由一組的11-25對探針來代表，這取決于基因的大小。設計探針以使其具有最大的敏感性、特異性和可重復性，從而使其總是可以分辨出特異性和背景信號以及密切相關的靶序列。
Affymetrix基因芯片雜交試驗包括下列步驟設計和制備陣列，從分離自生物樣品的RNA中制備熒光標記的靶，標記的靶與基因芯片雜交，篩選芯片，分析掃描的圖像，產生基因表達譜。
A.Affymetrix基因芯片的設計和定制定制Affymetrix Inc.(Santa Clara，CA)生產的GeneChip CustomExpressAdvantage Array。芯片的大小是18微米，芯片的格式是100-2187，可容納528組探針(11,628個探針)。除了來自GenBank的核酸序列之外，所有序列都選自我們之前鑒定出的煙草克隆，所有探針都是定制設計的。共選擇了400個煙草基因或片段包括在基因芯片中。所選擇的寡核苷酸的序列是基于基因3’末端的獨特區域。所選擇的核酸序列由如(本專利申請)所述從煙草中克隆的56個全長p450基因和71個p450片段組成。其它煙草序列包括270個煙草EST，用Clontech SSH試劑盒(BD Biosciences，PaloAlto，CA)從抑制差減文庫產生了這些EST。在這些基因中，一些寡核苷酸序列選自GenBank所列的細胞色素p450基因。多達25個探針用于每個全長基因，11個探針用于每個片段。因為缺乏獨特的、高質量的探針，有些克隆所用的探針數目要少。GeneChip中也包括了合適的對照序列。
探針陣列是25聚寡核苷酸，用基于半導體的光刻蝕法結合固相化學合成技術將這些寡核苷酸直接合成到玻璃片上。各陣列含有多達100,000個不同的寡核苷酸探針。因為寡核苷酸探針合成在陣列中已知的位置上，所以可用Affymetrix Microarray Suite軟件將雜交模式和信號強度解釋為基因同一性和相對表達水平。各探針對由一個完全配對的寡核苷酸和一個錯配的寡核苷酸組成。完全配對的探針具有與特定基因準確互補的序列，因此可檢測該基因的表達。錯配探針在其堿基的中心位置有一個堿基置換，因此區別于完全配對的探針，所述的一個堿基置換干擾了靶基因轉錄物的結合。錯配產生非特異性的雜交信號或背景信號，將該信號與完全配對的寡核苷酸檢測到的信號比較。
B.樣品制備雜交試驗由Genome Explorations，Inc.(Memphis，TN)進行，雜交中所用的RNA樣品由6對受乙烯誘導的非轉化株/轉化株等基因系組成。
這些樣品包括1對4407-25/4407-33未處理的白肋煙草樣品，3對乙烯處理的4407-25/4407-33樣品，1對乙烯處理的深色煙草NL Madole/181和1對乙烯處理的白肋變種PBLB01/178。乙烯處理如實施例1所述。
用改良的酸酚和氯仿方法從上述乙烯處理和未處理的葉片中提取總RNA。改良的方法是用1克組織進行研磨，隨后在5毫升加入了5毫升苯酚(pH5.5)和5毫升氯仿的提取緩沖液(100mMTris-HCl，pH 8.5；200mMNaCl；10mM EDTA；0.5％SDS)中渦旋。將提取的樣品離心，保留上清。該提取步驟再重復2-3次直到上清變得澄清。加入約5毫升氯仿以除去痕量的苯酚。加入3倍體積的ETOH和1/10體積的3M NaOAc(pH5.2)以從混合的上清組分中沉淀RNA，在-20℃存貯1小時。轉移到Corex玻璃容器中以后，在4℃9,000RPM離心RNA組分45分鐘。離心下米的團塊用70％乙醇洗滌，4℃9,000RPM離心5分鐘。團塊干燥以后，將RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。RNA團塊溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。分別用變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質量和數量。3-5μg/μl的總RNA樣品送至Genome explorations，inc.進行雜交試驗。
C.雜交、檢測和數據輸出如下所述制備標記的RNA材料。按生產商的方法用SuperScript雙鏈cDNA合成試劑盒(Gibco Life Technologies)和寡-dT24-T7(5′-GGC CAGTGA ATT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGG CGG-3′)引物從5-15μg總RNA中合成第一鏈和第二鏈cDNA。
T7啟動子連接的雙鏈cDNA作為模板，用T7RNA轉錄物標記試劑盒(ENZO Diagnostics Inc.)通過體外轉錄同時合成并用生物素化的UTP和CTP來標記cRNA。簡言之，用70％乙醇洗滌前述步驟中合成的雙鏈cDNA，重新懸浮在22μl不含RNA酶的水中。cDNA與下列物質一起37℃溫育5小時10X的反應緩沖液、生物素標記的核糖核苷酸、DTT、RNA酶抑制劑混合物各4μl，以及2μl 20X T7RNA多聚酶。經過CHROMA SPIN-100柱(Clontech)并在-20℃沉淀1小時至過夜，將標記上的RNA與未摻入的核糖核苷酸分離。
如下所述進行寡核苷酸陣列雜交和分析。將RNA團塊重新懸浮在10μl不含RNA酶的水中，10.0μg在200mM Tris-乙酸，pH 8.1，500mMKOAc，150mM MgOAc中95℃下用熱和離子介導的水解片段化35分鐘。片段化的cRNA與HG U95Av2寡核苷酸陣列(Affymetrix)45℃雜交16小時，該寡核苷酸陣列上含有約12,500個經注釋的全長基因以及設計用于代表EST序列的其它探針組。用6XSSPE(0.9M NaCl，60mMNaH2PO4，6mMEDTA+0.01％Tween 20)25℃下洗滌陣列，然后50℃下用100mM MES、0.1M[Na+]、0.01％Tween 20進行嚴格條件下的洗滌。以藻紅素(phycoerythrein)偶聯的鏈霉親和素(Molecular Probes)對陣列染色，用激光共聚焦掃描儀(Hewlett-Packard)來測定熒光強度。用Microarray軟件(Affymetrix)分析掃描的圖像。對于所用的所有陣列，通過將某陣列上所有基因的平均熒光強度校正(scaling)到恒定的目標強度(250)來使上樣和染色中的差異標準化。按用戶指南用Microarray Suite 5.0(Affymetrix)進行數據分析。各基因的信號強度計算為平均強度差異，以[∑(PM-MM)/(探針對的數目)]代表，其中PM和MM標示完全配對和錯配的探針。
D.數據分析和結果Genome Explorations的檢測儀器產生的表達報告證實，12組雜交是成功的。該報告上主要的參數包括噪音、校正因子、背景、總探針組、存在和不存在的探針組的數目和百分比、管家基因對照的信號強度。然后，用GCOS結合其它Microsoft的軟件來分析和表示數據。分析了處理的各對之間的信號對比。經過不同處理的基因和片段所對應的各探針的總體數據被編譯，分析編譯的表達數據，如變化呼叫(call of the changes)和信號LOG2比例變化。
基因芯片技術的一個常規用途是發現在不同組織中有差異性表達的基因。在本發明中，通過成對的轉化株和非轉化株煙草品系，包括4407-25/4407-33白肋變種、PBLB01/178白肋變種和NL Madole/181深色煙草變種，測定了乙烯處理引起的遺傳表達變化。這些分析只檢測由于生物學變化而使其表達發生了顯著改變的那些基因。這些分析采用了倍數(Fold)變化(信號比率)作為鑒定受誘導基因的重要標準。還考慮了其它參數，如信號密度、存在/不存在呼叫。
在分析了轉化株和非轉化株樣品對中約400個基因表達差異的數據之后，基于信號強度的結果說明，與非轉化株品系相比，只有兩個基因D121-AA8和D120-AH4在轉化株品系中可重復地被乙烯處理所誘導。如下所述表示這些數據，以說明這些基因的差異性表達。如表V所示，在轉化株品系，例如白肋煙草變種4407-33中，某基因的信號測定為與相關的非轉化株等基因品系4407-25的比率。在沒有乙烯誘導時，對于所有基因，轉化株與非轉化株信號的比率都接近于1。用3種獨立的分析方法對等基因白肋品系的分析證明，受乙烯誘導時，相對于非轉化株品系，兩個基因D121-AA8和D120-AH4在轉化株品系中受到誘導。這些基因是彼此高度同源的，約有99.8％或更大的核酸序列同源性。如表V所示，它們在轉化株品系中的相對雜交信號約比相應的非轉化株品系中高2-12倍。相比較的，根據兩個肌動蛋白樣對照克隆(內部對照)標準化的比例，沒有發現它們在轉化株品系中受誘導。此外，片段D35-BG11(其編碼區的序列完全包含在D121-AA8和D120-AH4基因中)在成對的等基因轉化株和非轉化株品系的相同樣品中被高水平誘導。白肋煙草變種的另一個等基因對，PBLB01和178顯示具有相同的基因D121-AA8和D120-AH4，乙烯處理時在轉化株中受誘導。此外，D121-AA8和D120-AH4基因優先在等基因深色煙草對NL Madole和181的轉化株品系中受誘導，證明這些基因在轉化株品系中的乙烯誘導不限于白肋煙草變種。在所有情況下，相對于相應的非轉化株品系，D35-BG11片段在轉化株品系中都是受誘導最高的一個。
表V乙烯處理的轉化株和非轉化株品系中克隆誘導的比較

*--標準化比率實施例15煙草轉化株品系中微粒體煙堿去甲基酶的乙烯誘導如下所述，對乙烯處理和非處理的成對的轉化株和非轉化株中富含微粒體的組分中去甲基酶的酶活進行生化分析。
A.微粒體的制備在4℃分離微粒體。在由50mM N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)，pH 7.5，3mM DL-二硫蘇糖醇(DTT)和蛋白酶抑制劑Cocktail(Roche)(1片/50毫升)組成的緩沖液中提取煙草葉片。粗提物通過4層粗棉布(cheesecloth)過濾以除去未打碎的組織，濾出液20,000xg離心20分鐘以除去細胞碎片。將上清以100,000xg超離心60分鐘，得到的上清即含有微粒體。將微粒體組分懸浮在提取緩沖液中，進行超離心步驟，其中提取緩沖液中采用0.5M的不連續蔗糖梯度。將純化的微粒體重新懸浮在添加了10％(w/v)甘油作為低溫保護劑的提取緩沖液中。將此微粒體制品存貯在液氮冷藏罐中直到使用。
B.蛋白濃度測定用溶解在丙酮中的10％三氯乙酸(TCA)(w/v)沉淀微粒體蛋白，用RCDC蛋白檢測試劑盒(BIO-RAD)按生產商的方法測定微粒體的蛋白濃度。
3)煙堿去甲基酶活性試驗DL-煙堿(吡咯烷-2-14C)獲得自Moravek Biochemicals，比活為54mCi/mmol。氯丙嗪(CPZ)和氧化的細胞色素(Cyt.C)(二者均為P450抑制劑)購自Sigma。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADPH)是細胞色素P450的典型電子供體，它通過NADPH細胞色素P450還原酶供應電子。在對照組的溫育中去掉了NADPH。常規的酶活試驗由微粒體蛋白(約2mg/ml)、6mM NADPH、55μM14C標記的煙堿組成。CPZ和Cyt.C的使用濃度分別是1mM和100μM。反應在25℃進行1小時，加入300μl甲醇到各25μl反應混合物中終止反應。離心后，用Inertsil ODS-33p(150×4.6mm)柱(Varian)以反相高效液相色譜(HPLC)系統(Agilent)分離20μl的甲醇提取物。等梯度(isocratic)流動相是甲醇、50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.25)的混合物，其中二者的比例為60∶40(v/v)，流速為1毫升/分鐘。通過與真正的未標記的降煙堿的峰進行比較，收集降煙堿的峰，用2900tri-carbLiquid Scintillation Counter(LSC)(Perkin Elmer)進行定量。基于1小時溫育中產生的14C標記的降煙堿來計算煙堿去甲基酶的活性。
從乙烯處理和未處理的成對的白肋轉化株(4407-33品系)和非轉化株(4407-25品系)煙草品系獲得樣品。所有未處理的樣品都沒有任何可檢測到的微粒體煙堿去甲基酶活性。相反，發現從乙烯處理的轉化株品系獲得的微粒體樣品中含有大量的煙堿去甲基酶活性。已顯示，煙堿去甲基酶受P450特異性抑制劑的抑制，證明該去甲基酶活性與P450微粒體來源的酶一致。表VI顯示了從白肋轉化株煙草品系中獲得的一組典型的酶活結果。相反的是，從乙烯處理的非轉化株煙草中獲得的樣品不含有任何煙堿去甲基酶活性。這些結果證明，在轉化株品系中煙堿去甲基酶受乙烯處理的誘導，但在相應的等基因非轉化株品系中不受誘導。對于成對的等基因深色煙草品系獲得了類似的結果，其中在轉化株品系中微粒體煙堿去甲基酶活性被誘導，但在相應的非轉化株品系中未檢測到該酶被誘導。這些結果都證明了，微粒體煙堿去甲基酶在轉化株品系中受乙烯處理的誘導，但在相應的等基因非轉化株品系中不受誘導。那些衍生自P450基因并且優先在轉化株品系(相對于相應的非轉化株品系)中被誘導的基因是編碼煙堿去甲基酶的候選基因。
表VI乙烯誘導的白肋轉化株和非轉化株品系中的去甲基酶活件

實施例16D121-AA8作為煙堿去甲基化酶的功能鑒定通過檢測在酵母細胞中異源表達的P450的酶活證實了候選克隆(D121-AA8)的功能是編碼煙堿去甲基酶。
1.酵母表達載體的構建將編碼P450的cDNA(121AA8)的推定蛋白編碼序列克隆到酵母表達載體pYeDP60中。在翻譯起始密碼子(ATG)上游或終止密碼子(TAA)下游通過含有BamHI和MfeI序列的PCR引物來引入合適的BamHI和MfeI位點。擴增的PCR產物的MfeI與載體上的EcoRI位點相容。用于擴增121AA8cDNA的引物是5′-TAGCTACGCGGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGC C-3′和5′-CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC-3′。將編碼該蛋白C-末端9個額外氨基酸(其中包括6個組氨酸)的序列區段摻入反向引物中。這有助于誘導后帶有六組氨酸(6XHis)標簽的P450的表達。酶切后將PCR產物在相對于GAL10-CYC1啟動子的正義反向上連接入pYeDP60載體。用酶切和DNA測序鑒定構建體。
2.酵母轉化用pYeDP60-P450cDNA質粒構建體轉化WAT11酵母細胞系，該細胞經改造可表達擬南芥NADPH-細胞色素P450還原酶ATR1。在電極間隙為0.2厘米的小管中混合約1μg質粒DNA和50微升WAT11酵母細胞。用Eppendorf電轉化儀(Model 2510)進行一次2.0kV的電脈沖。將細胞涂在SGI平板(5g/L細菌酪蛋白氨基酸(bactocasamino acid)、6.7g/L不含氨基酸的酵母含氮堿基(nitrogen base)、20g/L葡萄糖、40mg/L DL-色氨酸、20g/L瓊脂粉)上。直接用隨機挑選的克隆進行PCR分析來驗證轉化子。
3.轉化的酵母細胞中P450的表達單個的酵母集落接種在30mL SGI培養基(5g/L細菌酪蛋白氨基酸、6.7g/L不含氨基酸的酵母含氮堿基、20g/L葡萄糖、40mg/L DL-色氨酸)中30℃生長約24小時。取培養液以1∶50稀釋到1000mL YPGE培養基(10g/L酵母抽提物，20g/L細菌蛋白胨，5g/L葡萄糖，30ml/L乙醇)中直到葡萄糖被完全消耗(用Diastix尿分析試劑條(Bayer，Elkhart，IN)比色的變化來指示)。加入DL-半乳糖至終濃度2％，引發誘導克隆的P450。該培養物再培養20小時，直到用于體內活性檢測或用于微粒體制備。
用表達pYeDP60-CYP71D20(一種P450，在煙草中催化5-表-馬兜鈴堿(aristolochene)和1-脫氧辣椒二醇(deoxycapsidiol)的羥基化)的WAT11酵母細胞作為P450表達和酶活性分析的對照。
4.體內酶活性檢測在酵母培養物中加入DL-煙堿(吡咯烷-2-14C)檢測轉化的酵母細胞中煙堿去甲基酶的活性。在75μl半乳糖誘導的培養物中加入14C標記的煙堿(54mCi/mmol)至終濃度55μM。將測試的培養物在14ml的聚乙烯試管中搖動孵育6小時，用900μl甲醇提取。離心后，用rp-HPLC分離20μl甲醇提取物，用LSC定量降煙堿組分。
對照培養物WAT11(pYeDP60-CYP71D20)未將煙堿轉化為降煙堿，說明WAT11酵母細胞株不含有可將煙堿生物轉化為降煙堿的內源性酶活。相反，表達121AA8基因的酵母產生了可檢測量的降煙堿，說明了P450酶的煙堿去甲基化活性。
5.酵母微粒體制備用半乳糖誘導20小時后，離心收集酵母細胞，用TES-M緩沖液(50mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，0.6M山梨醇，10mM 2-巰基乙醇)洗滌2次。將團塊重新懸浮在提取緩沖液(50mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，0.6M山梨醇，2mM 2-巰基乙醇，1％牛血清白蛋白，1片/50ml的蛋白酶抑制劑Cocktail(Roche))中。然后用玻璃珠(直徑0.5mm，Sigma)破碎細胞。細胞提取物20,000xg離心20分鐘以除去細胞碎片。上清以100,000xg超離心60分鐘，產生的團塊即含有微粒體組分。將微粒體組分懸浮在TEG-M緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，20％甘油和1.5mM 2-巰基乙醇)中，蛋白濃度為1mg/mL。將微粒體制品存貯在液氮冷凍管中直到使用。
6.酵母微粒體中的酶活性檢測除了蛋白濃度恒定為1mg/mL之外，酵母微粒體制品中煙堿去甲基化酶活性的檢測與煙草葉片(實施例15)微粒體制品中的檢測方法相同。
表達CYP71D20的對照酵母細胞的微粒體制品不具有可檢測到的微粒體煙堿去甲基化酶活性。相反，表達121AA8基因的酵母細胞中獲得的微粒體樣品具有顯著水平的煙堿去甲基化酶活性。煙堿去甲基化酶活性需要NADPH并且已顯示它受P450特異性抑制劑的抑制，與已研究的P450一致。
表VII示出了從酵母細胞獲得的一組典型的酶活性試驗結果。
表VII表達121AA8和對照P450的酵母細胞微粒體中的去甲基化酶活件

*--3次重復的平均結果綜合起來，這些結果證明，克隆到的全長基因D121-AA8編碼細胞色素P450蛋白，該蛋白在酵母中表達時催化煙堿轉化為降煙堿。
考慮到本發明前面的詳細描述，預期在本發明的實施中本領域技術人員可進行很多改進和變化。因此，這些改進和變化都包括在下面權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種分離的煙草核酸分子，其中所述核酸分子是SEQ.ID.No.181。
2.一種分離的煙草核酸分子，其中所述核酸分子與SEQ.ID.No.181具有至少81％的序列同一性。
3.一種分離的煙草核酸分子，其中所述核酸分子與SEQ.ID.No.181具有至少91％的序列同一性。
4.一種分離的煙草蛋白質，其中所述蛋白質是SEQ.ID.No.182。
5.一種分離的煙草蛋白質，其中所述蛋白質與SEQ.ID.No.182具有至少80％的序列同一性。
6.一種分離的煙草蛋白質，其中所述蛋白質與SEQ.ID.No.182具有至少90％的序列同一性。
7.一種轉基因植物，其中所述轉基因植物含有如權利要求1、2或3所述的核酸分子。
8.如權利要求7所述的轉基因植物，其特征在于，所述植物是煙草植物。
9.一種產生轉基因植物的方法，其中所述方法包括以下步驟；(i)將如權利要求1、2或3所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產生植物轉化載體；(ii)用步驟(i)的所述植物轉化載體轉化所述植物；(iii)選擇用所述轉化載體轉化的植物細胞；和(iv)從所述轉化的植物細胞再生轉化植物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物的降煙堿水平降低。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。
13.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。
14.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達為雙鏈RNA分子。
15.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物是煙草植物。
16.一種選擇含有核酸分子的植物的方法，其中分析所述植物中是否存在如權利要求1、2或3所述的核酸序列。
17.如權利要求16所述選擇植物的方法，其特征在于，通過DNA雜交分析所述植物。
18.如權利要求17所述選擇植物的方法，其特征在于，通過所述DNA雜交是Southern印跡分析。
19.如權利要求17所述選擇植物的方法，其特征在于，所述DNA雜交是Northern印跡分析。
20.如權利要求16所述選擇植物的方法，其特征在于，通過PCR檢測分析所述植物。
21.如權利要求16所述選擇植物的方法，其特征在于，所述植物是煙草植物。
22.一種增加或降低植物中降煙堿水平的方法，其中所述方法包括以下步驟；(i)將如權利要求1、2或3所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產生植物轉化載體；(ii)用步驟(i)所述植物轉化載體轉化所述植物；(iii)選擇用所述轉化載體轉化的植物細胞；和(iv)從所述轉化的植物細胞再生轉化植物。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。
25.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。
26.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達為雙鏈RNA分子。
27.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物是煙草植物。
28.一種降煙堿水平的量降低的煙草產品，所述煙草產品含有如權利要求7所述植物的煙草。
29.如權利要求27所述的煙草產品，其特征在于，所述煙草產品選自卷煙、雪茄、煙斗絲、鼻煙、口嚼煙、混合有煙草產品的產品和它們的混合物。
30.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約5-10％。
31.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約10-20％。
32.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約20-30％。
33.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約30％。
34.一種降煙堿水平的量降低的煙葉，所述煙葉包括如權利要求7所述植物的煙葉。
31.如權利要求30所述的煙葉，其特征在于，所述煙葉形成一種煙草產品，而該煙草產品選自卷煙、雪茄、煙斗絲、鼻煙、口嚼煙、混合有煙草產品的產品和它們的混合物。
32.一種使用如權利要求1、2或3所述分離的核酸分子從植物分離基因的方法。
全文摘要
本發明涉及p450酶和在煙草中編碼p450酶的核酸序列，以及使用這些酶和序列來改變植物表型的方法。
文檔編號C12N15/82GK1926235SQ200480030387
公開日2007年3月7日 申請日期2004年10月15日 優先權日2003年10月16日
發明者D·徐 申請人:美國無煙煙草公司