專利名稱：：免疫毒素的表達和純化方法本申請要求2003年8月1日提交的美國臨時申請60/491,923的權益。美國政府對該申請擁有一定權利。發明
背景技術：
：領域本發明一般而言涉及蛋白表達和純化方法，更具體地說，涉及免疫毒素的表達和純化方法。
背景技術：
：美國每年進行的器官移植手術約有24,000例，主要包括腎臟移植(14,000例)、肝臟移植(5,000例)、心臟移植(2,200例)，以及少量的胰、肺、心-肺和腸移植(2002年OPTN/SRTR年度報告)。移植耐受仍然是患者和醫生難以企及的目標，他們期望成功地實現異源器官移植而無需堅持使用無限期的、非特異性的免疫抑制劑，并免除其帶來的副作用。許多此類患者使用環孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)和潑尼松(prednisone)，以及多種其他免疫抑制劑治療，以誘導或維持免疫抑制。在美國，維持免疫抑制療法的年均花費約$11,000(ImmunosuppressiveDrugsCoverageAct，NationalKidneyFoundation，參見http//www.kidney.org/general/pubpol/immufact.cfm)。雖然這些藥物可有效防止排斥反應，但免疫抑制療法的副作用是相當大的。免疫抑制療法誘導免疫系統的非特異性無應答。移植接受者易于感染，并有患惡性腫瘤的風險，如以移植后淋巴增生性障礙的形式。移植免疫生物學的主要目標是開發對器官移植的特異性免疫耐受，而使患者從持續藥理免疫抑制的副作用及其帶來的并發癥和費用中解脫出來。開發了二價抗T細胞免疫毒素，A-dmDT390-bisFv(G4S)，用于對移植、T細胞白血病和自體免疫疾病進行耐受誘導。該免疫毒素由白喉毒素的前390個氨基酸殘基(DT390)和來自抗CD3抗體UCHT1的兩個成串的抗原結合結構域(sFv)構成，后者負責將該免疫毒素結合至T細胞受體復合物的CD3εγ亞基。抗CD3ε抗體部分使得該免疫毒素能夠靶向特定細胞，而白喉毒素部分可殺死靶細胞。該免疫毒素可用于使至少部分T細胞耗盡，以治療或防止T細胞介導的免疫系統疾病或病癥。施用抗T細胞免疫毒素提供了一種實現特異性免疫耐受的方法。它可應用于接受者體內具有穩定移植物功能的新器官移植物，也可用于已經存在的移植物。該免疫毒素可提供高度特異性免疫抑制，在靈長類中實現移植耐受，而沒有非特異性免疫抑制藥物、抗淋巴細胞血清或放射的副作用。將排斥應答抑制到不會減短移植接受者平均壽命的程度，是本領域的一個目標。甲基營養酵母——巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)已成功用于表達不同來源的異源蛋白(Gellissen2000)。作為真核生物，巴斯德畢赤酵母能夠進行多種翻譯后蛋白修飾，如蛋白酶解加工、折疊、二硫鍵形成和糖基化作用。像其他酵母一樣，巴斯德畢赤酵母具有勝過高等真核細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)或桿狀病毒感染的昆蟲細胞表達系統的顯著優點。它易于操控，生長速度快，所需培養基價格低廉。這大大減少了生產時間和費用，特別在商業規模上更是如此。與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不同，巴斯德畢赤酵母并非強發酵酵母，可很容易地培養至＞100g干細胞/升的極高細胞密度(Siegeletal.，1989)。再加上采用強AOX1啟動子驅使外源基因轉錄，使得巴斯德畢赤酵母成為高水平異源基因表達的優選系統。AOX1啟動子在表達對表達宿主有害的外源蛋白時也具有優勢，因為該啟動子在非甲醇生長條件下受到嚴格調控和高度抑制。可誘導的和嚴格調控的AOX1啟動子使得巴斯德畢赤酵母菌株(沒有任何導致對DT有抗性的突變)可成功地以分泌形式表達基于DT的免疫毒素(Wooetal.，2002)。然而，如果白喉毒素(DT)的催化區能夠進入胞質溶膠，它對所有的真核細胞來說都是很強的毒素。巴斯德畢赤酵母對這些毒素本性上是敏感的。現有技術教導了培養巴斯德畢赤酵母的方法。例如，巴斯德畢赤酵母可在發酵罐中培養。一種巴斯德畢赤酵母的發酵方法包括使用甘油作為最初的碳源，隨后進行短暫的碳饑餓，再使用甲醇作為碳源(PichiapastorisFermentationUsingaBioFlo110BenchtopFermentor，NewBrunswickScientific)。Woo等記載，當在巴斯德畢赤酵母中表達二價抗人抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)時，含1％酪蛋白氨基酸的pH7.0的緩沖復合物培養基可提供搖瓶培養的最高表達，加入1至3mM范圍的PMSF可提高表達水平。(25ProteinExpressionandPurification270-82(2002))。Sreekrishna記載，以搖瓶培養巴斯德畢赤酵母，當細胞通入大量空氣并在補充有酵母提取物和胨的pH6.0的緩沖培養基中培養時，可使分泌水平提高(Chapter16，IndustrialMicroorganismsBasicandAppliedMolecularGenetics(1993))。含酵母氮堿基以及硫酸銨、生物素和甘油的生長培養基，使用磷酸鉀以及酵母提取物和胨調節pH至6.0。誘導培養基含有甲醇代替甘油。與之相比，本發明提供了一種使用巴斯德畢赤酵母制備免疫毒素的改進的方法。本發明所表達和純化的免疫毒素可用于誘導免疫耐受的方法中。很有必要提供一種提高免疫毒素產量的表達和純化方法。本發明在下文中闡述了此問題以及其他一些問題。
發明內容本發明一方面涉及一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，誘導過程中添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培養基)的限量甲醇，且甲醇誘導的溫度在約17.5℃以下。本發明另一方面涉及一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；b)使用含甲醇和甘油的添加物對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride)和氨基酸源相接觸，且甲醇誘導的溫度在約17.5℃以下。本發明再一方面涉及一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液裝入疏水作用柱(hydrophobicinteractioncolumn)中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素裝入陰離子交換柱中；d)通過使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。應該理解，上文的一般性敘述和下文的詳細敘述均只起示例和解釋作用，并不限制由權利要求書限定的本發明范圍。附圖顯示一個或多個本發明的實施方案，并與文字敘述一起解釋本發明的原理。圖1(a)真核EF-2中白喉酰胺結構域的保守性以及DT抗性突變。(b)巴斯德畢赤酵母EF-2中可導致Arg替換Gly701的核苷酸序列突變。帶有下劃線的序列為由核苷酸突變導致的限制酶SacII位點。見SEQIDNO1-10。圖2巴斯德畢赤酵母EF-2的5′端序列，顯示短內含子(SEQIDNO11；mRNA)和(SEQIDNO12；gDNA)。5′剪接位點、分支位點以及3′剪接位點使用下劃線標出。EF-2編碼序列使用粗體標出。圖3(A)(B)(C)(D)巴斯德畢赤酵母EF-2(SEQIDNO13)的核苷酸序列和推得的氨基酸序列。核苷酸序列從起始密碼子的開端處開始編號。蛋白序列中共有的GTP結合基序為AHVDHGKST(SEQIDNO14)，據推測在體內被EF-2激酶磷酸化的蘇氨酸殘基用圓圈標出，在所有的延長因子中均保守的效應物結構域為DEQERGITIKSTA(SEQIDNO15)。白喉酰胺結構域中22個高度保守的殘基使用方框標出。圖4使用已經體外突變的EF-2的3′序列進行定向突變。突變質粒pBLURA-Δ5’mutEF-2包括四個重要元件β-內酰胺酶基因(Ampr)、尿嘧啶選擇標記(URA3)、3′AOX1轉錄終止序列(TT)和體外突變的FF-23′序列Δ5’mutEF-2。圖5對來自巴斯德畢赤酵母JC308菌株的所選Ura+克隆的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。(a)使用引物1和M的PCR產物；(b)使用引物2和w的PCR產物；(c)ScaII消化的使用引物2和3的PCR產物。圖6在突變型和野生型巴斯德畢赤酵母菌株中胞質溶膠表達的DT-A鏈的蛋白質印跡分析。(a)泳道1～6為使用pPIC3-DtA轉化的6個獨立mutEF2JC307-8克隆的細胞提取物，+C純化的A-dmDT390-bisFv。MSeeBlueplus2蛋白標記(Invitrogen)。(b)在兩個獨立菌落mut-3和mut-5(分別為mutEF2JC307-8(3)和(5))，C3和C4培養物中，胞質溶膠表達的DT-A鏈。蛋白樣本加于4～12％NuPAGE凝膠(Invitrogen)上。圖7細胞內表達DT-A對帶有突變型或野生型EF-2的巴斯德畢赤酵母菌株的存活的影響。Mut-3和Mut5分別為EF-2突變體mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)，Mut-3在胞質溶膠中表達DTA鏈，而mut-5并非如此。C3和C4是野生型EF-2菌株，在胞質溶膠中表達(C4)或不表達DTA鏈。每一類的第一個柱表示甲醇誘導前的菌落形成單位。每一類的第二個柱代表甲醇誘導后的菌落形成單位。圖8質粒構建示意圖。(a)pBLARG-A-dmDT390-bisFv；(b)pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv；(c)pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv。圖9A-dmDT390-bisFv表達情況的蛋白質印跡分析。培養基(a)和細胞提取物(b)樣本加于4～12％NuPAGE凝膠(Invitrogen)上。+c泳道為純化的A-dmDT390-bisFv。泳道1～9是使用2拷貝A-dmDT390-bisFv基因轉化的mutEF2JC303中，所選的9個克隆樣本。泳道10、11和12是單拷貝克隆樣本泳道12為非突變型EF-2克隆JHW#2，泳道10和11是兩個選出的mutEF2JC307-8(1)和mutEF2JC307-8(2)克隆，后者也稱為YYL#8-2。圖10比較不同巴斯德畢赤酵母菌株的甲醇消耗速率。所有這些菌株均為Mut+(甲醇利用增加)，除了pJHW#3為MutS(甲醇利用緩慢)。pJHW#2到5和EF-2突變體YYL#8-2均表達二價免疫毒素A-dmDT390-bisFv。X-33為不表達A-dmDT390-bisFv的野生型菌株，但使用表達載體轉化。圖11X-33和JW102之間，以及在指定溫度下對JW102添加不同營養物之間的甲醇消耗速率曲線的比較。YE和casa分別代表添加酵母提取物和酪蛋白氨基酸。圖12降低發酵中的攪拌速度減少免疫毒素聚集體。在高攪拌速度下進行發酵導致50％以上的分泌免疫毒素在上清液中以無活性的聚集體形式存在。另外，聚集體在誘導時間內累積。然而，將攪拌速度從800rpm降低到400rpm減少了免疫毒素聚集體。免疫毒素聚集體在誘導時間內水平保持不變。圖13在30℃、250rpm下，經20小時誘導之后，TWEEN20對純化免疫毒素聚集的影響。使用純化免疫毒素，通過攪拌，TWEEN20可防止聚集體的形成。通過在30℃、250rpm下誘導20小時，大約50％的純化免疫毒素聚集。然而，通過攪拌，0.01％～0.04％的TWEEN20可顯著減少純化免疫毒素的聚集。圖14甲醇誘導的前44小時內濕細胞密度收獲量的變化。MeOH，只有甲醇并加入酪蛋白氨基酸；M∶G＝4∶1，補充甲醇/甘油混合物并補充酪蛋白氨基酸；YE+MeOH，補充酵母提取物以及只有甲醇；YE+4∶1，補充酵母提取物并補充甲醇/甘油混合物。圖15根據誘導溫度不同，二價免疫毒素的表達水平及其最終純化產率。A誘導溫度不同表達水平的變化。B從甲醇誘導22、44和67小時時所取的1升上清液中所獲最終純化產率的變化。22小時、44小時和67小時代表甲醇誘導時間。C誘導溫度不同甲醇消耗量的變化。圖16優化的發酵批次的代表。在所示時間點取的樣本在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級，并且該凝膠使用考馬斯藍染色。箭頭表示二價免疫毒素的位置。使用Mark12標記(Invitrogen)。圖17通過butyl650M捕捉步驟獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳分析。泳道1～4，樣本流過組分#1～#4；泳道5，匯集的樣本流過組分；泳道6～8，洗滌組分#1～#3；泳道9，匯集的洗滌組分；泳道10、11、17，上清液；泳道12，Mark12蛋白標準樣本(Invitrogen)；泳道13～15，洗脫組分#1～#3；泳道16，匯集的洗脫組分。IT，免疫毒素。圖18通過Poros50HQ硼酸鹽陰離子交換步驟獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳分析。泳道1，Mark12蛋白標準樣本(Invitrogen)；泳道2，從Butyl650MHIC步驟獲得的樣本；泳道3～7，樣本流過組分#1～#5；泳道8，使用25mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#1；泳道9，使用50mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#2；泳道10，使用75mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#3；泳道11，使用100mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#4；泳道12，使用1M溶于緩沖液B的NaCl洗脫的組分#5；IT，免疫毒素。圖19純化免疫毒素的分析凝膠過濾和SDS-PAGE電泳分析。ASuperdex20010/300GL凝膠過濾色譜圖。B考馬斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠圖譜。圖20(a)(b)(c)Ala-dmDT390-bisFv(UCHT1)的氨基酸序列(SEQIDNO16)。圖21甲醇誘導過程中的細胞生長、甲醇消耗和免疫毒素分泌曲線比較。組AX-33菌株和產生免疫毒素的毒素抗性EF-2突變體mutEF2JC307-8(2)。這兩個菌株在甲醇誘導過程中具有相似的甲醇消耗速率和濕細胞密度增長曲線。組A中所示數據來自X-33。對于毒素抗性突變體，在甲醇誘導44h時，最大甲醇消耗速率和濕細胞密度增長分別為2.2ml/min和9.17％。組B-F菌株JW102。在所有組A-F中的恒定條件是在誘導之前的甘油分批階段，并繼之以甘油補料分批階段。對于誘導，僅使用純甲醇(MeOH)或者使用4∶1甲醇∶甘油(M/G)混合補料。誘導過程中持續注入溶于甲醇的10mM的PMSF。當不添加酵母提取物(YE)時則添加酪蛋白氨基酸。誘導條件組A，添加M/G，不添加YE；組B，添加甲醇，不添加YE；組C，添加甲醇，添加YE；組D，添加M/G，添加YE；組E，添加M/G，不添加YE；組F，添加M/G，添加YE。誘導溫度，A-E為23～25℃，F為15℃(注意組F的右側軸與其他組相比壓縮2倍)。甲醇消耗速率(ml/min)，虛線；濕細胞密度(％，w/v)，實線；分泌免疫毒素水平(mg/L)，短劃線。因為在10L生物反應器發酵中有大量的工作，所以重復組A-E的結果是不切實際的。優化方法組F進行了3次，點為平均值，當均值的標準差超過10％時在圖中表示出來。濕細胞密度和分泌免疫毒素水平的準確數據點顯示為方塊和圓圈。因為每分鐘測量一次甲醇消耗速率，所以省略了甲醇消耗速率的準確數據點。圖22蛋白降解和免疫毒素生產。A在補充甲醇和酵母提取物的培養物(圖21C)中，甲醇誘導過程中免疫毒素水平的時程。免疫毒素條帶使用IT和箭頭標出。B對等體積的純化免疫毒素(250μg/ml)與等體積的在甲醇誘導后所示時間收集的上清液，在培育(28℃，20h，250rpm搖動)后通過SDS-PAGE對殘留免疫毒素進行分析。等體積純化免疫毒素和PBS緩沖液的混合物，或者來自0h的上清液用作對照(CON)。10μl制備的樣本加于SDS-PAGE，并在非還原條件下在4～20％SDS-tri-甘氨酸凝膠上分級。凝膠使用考馬斯藍染料染色。使用Mark12標記(Invitrogen)作為蛋白標記。圖23溫度對生產免疫毒素的影響。在所示誘導時間點(44，50，67h)從不同誘導溫度(15～23℃)批次中取得的樣本，在非還原條件下在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級。對于所有批次，持續添加酵母提取物和甲醇-甘油補料。凝膠使用考馬斯藍染料染色。IT-dp表示二價免疫毒素的降解產物。這些降解產物通過蛋白質印跡使用抗DT抗體和抗(G4S)3接頭抗體識別。抗(G4S)3接頭抗體可檢測二價免疫毒素和降解產物，因為免疫毒素包含三個(G4S)3接頭。箭頭指向與二價免疫毒素無關的條帶。IT表示免疫毒素。使用Mark12標記(Invitrogen)作為蛋白標記。圖24在15℃下的甲醇誘導過程中，對于存在和不存在PMSF的上清液中的蛋白酶活性進行分析。上清液是在甲醇誘導0、22、44和67h時，從持續添加酵母提取物和甲醇-甘油補料處理的發酵批次中取得的。上清液與作為底物的無切口的CRM9一起培育。培育后，10μl樣本在還原條件下在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級。染色和干燥后，通過使用NIH成像軟件將凝膠數字化并分析無切口CRM9的條帶密度。在甲醇誘導中補充PMSF，實線；無PMSF，虛線。每個數據點為3個發酵批次的平均值，并帶有均值的標準差。具體實施例方式在公開和描述本發明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法之前，應該理解，除非另有說明，并不限于特定的合成方法或特定的重組生物技術方法，除非另有說明，并不限于特定試劑，因其毫無疑問地可有多種變化形式。還應理解，本文所用術語只是出于描述特定實施方案的目的，而非意在限制。如在說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式的“一”、“一種”和“該”包括復數指代對象，除非上下文中另外明確指出。因此，例如，提及“一種藥物載體”包括兩種或更多種這類載體的混合物等等。本文中范圍可以表示為從“大約”一個具體的數值，和/或至“大約”另一個具體的數值。當表示為這種范圍時，另一個實施方案包括從前述的一個具體的數值和/或至前述的另一個具體的數值。類似地，當通過在前面使用“大約”將數值表示為近似值時，應當理解的是，該具體的數值構成另一個實施方案。應當進一步理解的是，每個范圍的端點在與另一個端點相關和獨立于另一個端點時都是有意義的。還應當理解的是此處公開了許多數值，且除了數值本身外每一個數值在此還以“大約”該具體數值公開。例如，如果公開了數值“10”，那么也公開了“大約10”。還應當理解的是，當公開了一個數值時，也公開了“小于或等于該數值”，“大于或等于該數值”以及數值間可能的范圍，如本領域技術人員所恰當理解的。例如，如果公開了數值“10”，也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應理解，在整個本申請中，以多種不同格式提供數據，這些數據代表了端點和起點，以及這些數據點任何組合的范圍。例如，如果公開了特定數據點“10”和特定數據點15，應該理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之間的數值也認為已經公開。在本說明書及其后的權利要求書中，將會提及許多被界定為具有如下含義的術語“可選的”或“可選地”意即隨后所描述的事件或情況可以發生或不發生，以及該描述包括其中所述事件或情況發生的例子及其不發生的例子。“接觸”是指將一種物質置于可與另一種物質發生物理關聯的條件下。“非糖基化”是指沒有糖基化作用，或者使用本領域常規的測定糖基化的方法，檢測不到糖基化作用。因此，非糖基化包括已使糖基化位點發生突變使得糖基化作用不發生，在不發生糖基化作用的系統中表達，或者在野生狀態下不具有糖基化作用位點。“裝入”柱中是指將樣本放在某位置，以使至少一部分樣本最終進入柱中由樹脂占據的位置。“酶消化”是指使用一種或多種不同的酶將蛋白或肽在肽鍵處水解。此類酶包括但不限于胰島素、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或羧肽酶A。“酵母提取物”是指通過對酵母細胞內的蛋白進行蛋白酶解而獲得的肽和氨基酸的制備物。“誘導”是指為給定的啟動子提供信號，促使給定基因的表達。“添加”是指以一定速率提供新鮮培養基或營養物，以至少部分取代被消耗掉的培養基或營養物。“部分”是指可分為多個部分的分子或化合物的一個部分。在本發明中，部分可以指免疫毒素的毒素部分或抗體部分。本發明中，術語“二價”是指單個組合物能夠與兩個配體相結合。例如，A-dmDT390-bisFv(G4S)免疫毒素可結合兩個CD3分子。還應理解，術語“兩價”在本領域中具有相似的含義。在此，術語“二價”和“兩價”指相同的性質，可互換使用。本發明提供了一種在巴斯德畢赤酵母變體中表達和純化變體ADP核糖基化毒素和毒素融合蛋白的系統。本發明方法具有遵循優質生產規范(GoodManufacturingPractices)的優點。正如廣泛使用的情況一樣，免疫毒素可選為融合蛋白。免疫毒素可包括白喉毒素部分。應該理解且涵蓋于本文之中的是，本方法可使用其他ADP核糖基化免疫毒素。例如，特別考慮的是免疫毒素包含綠膿桿菌外毒素A(PsuedomonasexotoxinA)部分的融合蛋白。毒素部分可為截短型(truncated)部分和/或可包含相對于野生型毒素的變異。免疫毒素可進一步包括CD3抗體部分或其他抗體部分。還應理解，免疫毒素可包括除CD3抗體以外的靶向抗體部分。本領域技術人員可根據靶細胞，知道在免疫毒素中使用何種部分。例如，CD22抗體可用于將免疫毒素融合蛋白引導至B細胞。本發明提供了一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達免疫毒素的方法，包括在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；在低于約17.5℃的溫度下進行甲醇誘導。本發明一方面提供了一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達免疫毒素的方法，包括在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，誘導過程中添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培養基)的限量甲醇，且甲醇誘導的溫度在約17.5℃以下。本發明另一方面提供了一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括在包含蛋白(如大豆蛋白)的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；使用含甲醇和甘油的添加物(如甲醇和甘油的比例為約4∶1)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源(如酵母提取物)相接觸，且甲醇誘導的溫度在約17.5℃以下。在該表達方法中，將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接觸的操作包括，將這些細胞與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接觸至少2小時，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的小時數，或者介于其中的任何量。優選地，苯甲烷磺酰氟溶于4∶1的甲醇甘油誘導添加物中，濃度不超過10mM。甲醇誘導溫度優選低于約17.5℃，更優選約15℃。本方法實踐中適于發生甲醇誘導的其他溫度包括17.0、16.5、16.0、15.5、14.5、14.0、13.5、13、12.5、12℃或者介于其中的任何量。生長培養基是指所選有機體生長所需的任何物質。生長所需的物質包括但不限于碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鈉、鐵、微量元素和有機生長因子。生長培養基中可包括多種原料以提供所需物質。這些物質包括但不限于單糖，提取物如胨、大豆胨(soytone)、胰胨(tryptone)、酵母提取物，二氧化碳，維生素，氨基酸，嘌呤和嘧啶。本發明方法的一個實例利用了DIFCO公司生產的大豆的酶消化產物的存在。本發明方法的另一個實例利用了DIFCO公司生產的酵母提取物的存在。應該理解，可使用生產此類產品的任何廠商(如NewEnglandBiosciences)生產的酵母提取物和酶消化產物。在本方法的一個具體的非限制性實例中，生長培養基的組成為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液。生長培養基可選進一步包括消泡劑。更具體地，消泡劑的濃度為約0.01％或更高。例如，消泡劑濃度可為0.07％，或者約0.01％至約0.07％之間的任何量。消泡劑的最佳水平可選擇為使液體-空氣界面之上的泡沫層減少至1/2英寸或更薄所需的最小量。因此，生長培養基的組成可為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，約0.43％PTM1溶液，以及約0.02％消泡劑。應該理解，本領域技術人員知道可以改變生長培養基的組成以利于最佳生長。特別考慮的變化是高于或低于生長培養基中組分百分比最多20％。因此本文公開了一種生長培養基，其中該生長培養基的組成為約3.2-4.8％甘油，約1.6-2.4％酵母提取物，約1.6-2.4％大豆蛋白的酶消化產物，約1.07-1.61％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約.34-.52％PTM1溶液。例如，特別公開了一種培養基，其中該生長培養基的組成為約3.6％甘油，約2.4％酵母提取物，約1.9％大豆蛋白的酶消化產物，約1.43％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液。在本發明的表達方法中，可選地，生長培養基中溶解氧濃度保持在40％或更高(如45％、50％、55％、60％或65％)的數值。例如，在本發明中，甲醇誘導開始之前采用添加甘油批料階段(glycerol-fedbatchphase)以獲得高細胞密度。當溶解氧濃度上升到40％以上時開始添加甘油批料階段。每當溶解氧上升至40％以上時即添加甘油，直至該水平降至40％以下。停止添加甘油后溶解氧再次升高時，添加物換為甲醇。溶解氧(DO)水平升高或達到尖峰說明已耗盡碳源。通常DO尖峰用于顯示生長所用的甘油已耗盡，說明應該轉為甲醇誘導階段。另外，生長階段可選pH值為約3.0-4.0，甲醇誘導階段pH值為約6.7-7.4。例如，生長階段pH值為3.5，甲醇誘導階段pH值為7.0。可增加甲醇誘導時間以提高產量。通常的誘導時間包括22h、44h、67h和163h。誘導可長達12天(288h)。因此，特別考慮的甲醇誘導持續約22h至約12天(288h)。例如，應該理解，甲醇誘導可持續163h。因而本發明的一個實施方案為一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中所述甲醇誘導包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導進行的溫度低于17.5℃，補充消泡劑至0.07％，攪拌減慢至400RPM，且其中誘導步驟進行約22至288h之間。更具體地，本發明的一個實施方案包括一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括a)在生長培養基中培養可表達免疫毒素的巴斯德畢赤酵母，所述生長培養基包括約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液，其中生長期間pH值約為3.5，且生長培養基中溶解氧濃度保持在40％或更高的數值；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中所述甲醇誘導包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導進行的溫度為15℃，pH值約7.0，補充消泡劑0.02％，攪拌減慢至400RPM，且誘導階段約163h。已經開發了可選擇性殺傷人T細胞的二價抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)，用以治療T細胞白血病、自體免疫病和移植耐受誘導(美國專利申請09/573,797，通過引用納入本文)。二價抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)，由白喉毒素(DT)的前390個氨基酸殘基(DT390)和來自抗CD3抗體UCHT1的兩個成串的抗原結合結構域(sFv)構成。通過引入兩個突變已將DT390免疫毒素中的兩個N糖基化位點除去(Liuetal.，2000)，導致生成分子量96.5kDa的非糖蛋白。免疫毒素還可包括接頭分子，用以連接抗體部分與毒素部分。接頭(L)可為Gly-Ser接頭。Gly-Ser接頭可以是但不限于(Gly4Ser)n或(Gly3Ser)n。更具體地說，接頭可為(Gly4Ser)3接頭(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQIDNO17)，本文也稱為(G4S)，或者(Gly3Ser)4接頭(GGGSGGGSGGGSGGGS)(SEQIDNO18)，本文也稱為(G3S)。在一個優選的實施方案中，免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。免疫毒素對6.0以下的pH水平敏感，這與低pH可誘導DT390部分的易位結構域(translocationdomain)的不可逆構象改變相一致。易位結構域介導DT390的A鏈以質子依賴方式從內體或質膜到胞質溶膠的易位。催化型A鏈在胞質溶膠中通過延長因子2(EF-2)的ADP核糖基化負責蛋白合成抑制。這種蛋白合成抑制作用對許多真核細胞具有毒性。由于陽離子交換色譜法和親和色譜法需用低pH緩沖液洗脫，所以免疫毒素的pH敏感性限制了這兩種技術的使用。使用毒素抗性真核細胞可克服免疫毒素的毒性問題。然而，篩選和鑒定毒素抗性真核細胞是一項煩瑣、費力、費時的工作。而且，在EF-2突變體CHO細胞表達系統中生產二價免疫毒素被限制在5mg/L，無法通過選擇多基因插入提高其產量。由于這種限制，除三個例外(12，20，25)，所有治療用途的重組免疫毒素的生產均限于使用大腸桿菌(E.coli)制備，迫使包含體(6)變性再重新折疊。然而，來自大腸桿菌的二價免疫毒素的多結構域結構的重新折疊不能有效完成，無法恢復其全部生物活性(25)。還有，二價免疫毒素的多結構域結構妨礙大腸桿菌的高效生產。因此，現有生產系統的缺點驅使我們試圖開發有效的二價免疫毒素的巴斯德畢赤酵母生產系統。對于二價抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv來說，巴斯德畢赤酵母是良好的表達系統，這是因為，與原核表達系統相比，它可提供最佳的蛋白折疊，而與哺乳動物細胞表達相比(CHO細胞)，它可提供更高的產量。抗體融合蛋白需要正確的二硫鍵，酵母的內質網提供了與真核的抗體制造細胞相似的氧化環境。二價免疫毒素的多結構域結構需要真核表達系統來正確地折疊這種復雜的蛋白。而免疫毒素一旦表達，多數真核生物對其蛋白合成抑制作用敏感。然而，一種芽殖酵母——巴斯德畢赤酵母對DT具有一定程度的耐受性(Nevilleetal.，1992；Wooetal.，2002)，在發酵罐培養中免疫毒素的產量可達40mg/L。通過遺傳工程改造的巴斯德畢赤酵母(JW102，從pJHW#2重新命名(Wooetal.，2002))的發酵，由分泌途徑制備免疫毒素。如實施例41所示，本方法在163h的誘導階段之后可提供120mg/l的產量，純化后的產量為90.8mg/L(見表6)。在經過基因優化，減少DNA序列中的AT含量之后，在生物反應器內經過24-44小時的誘導，受AOX1啟動子控制的分泌表達水平可達25-30mg/L。巴斯德畢赤酵母對在胞質溶膠中表達的白喉毒素A鏈的毒性作用敏感，該鏈使延長因子2(EF-2)ADP核糖基化導致蛋白合成停止。通過分泌途徑表達的A-dmDT390-bisFv的毒性可通過誘導后甲醇消耗水平的不斷降低來說明。給細胞提供甘油和甲醇的混合添加物。在胞質溶膠中表達DT的催化結構域(A鏈)對巴斯德畢赤酵母來說是致命的。當使用甲醇誘導帶有構建體A-dmDT390-bisFv(UCHT1)的細胞以表達免疫毒素時，24小時后近50％被殺死(Wooetal.，2002)。與之相比，當在具有DT抗性突變的CHO細胞中表達相同的免疫毒素時，沒有觀察到毒性作用(Liu，etal.，2000；Thompson，etal.，2001)。在真核細胞的胞質溶膠中，DT的催化結構域催化延長因子2(EF-2)的ADP核糖基化，導致蛋白合成抑制和細胞死亡(byproteinstarvationandorapoptosis，VanNessetal.，1980；Houchins，2000)。真核EF-2對這些毒素所致的ADP核糖基化的敏感性在于該蛋白的結構。EF-2是約850個氨基酸的單條多肽鏈，由兩個結構域組成。N末端G結構域負責結合和水解可促進翻譯的GTP，C末端R(或白喉酰胺)結構域被認為與核糖體相互作用(Kohnoetal.，1986；Perentesisetal.，1992)。白喉酰胺結構域(圖1a)在22殘基的區域中包括一個在所有真核生物EF-2中高度保守的組氨酸殘基。該保守性組氨酸經過特別的翻譯后修飾變為衍生物白喉酰胺，白喉酰胺為DT所致ADP核糖基化時的獨特靶標(VanNessetal.，1880)。在釀酒酵母中，可使該保守性組氨酸發生突變并使用某些其他2個氨基酸替換，可產生對ADP核糖基化具有抗性的功能性EF-2(Phanetal.，1993；KimataandKohno1994)。然而，其EF-2在白喉酰胺位置發生突變的細胞比表達野生型EF-2的細胞生長緩慢。在CHO細胞中，位于白喉酰胺C末端一側第3位置的另一個高度保守的甘氨酸若被精氨酸單一替換，也可阻止白喉酰胺的形成(Kohno&Uchida，1987；Foleyetal.，1992)，生成不可ADP核糖基化的EF-2。該突變對釀酒酵母EF-2具有相同的效果(Kimataetal.，1993)。與白喉酰胺的突變相比，EF-2中Gly到Arg的突變不會影響CHO和釀酒酵母的細胞生長(Foleyetal.，1992；KimataandKohno1994；Kimataetal.，1993)。為了確定可否通過使巴斯德畢赤酵母對毒素不敏感來實現進一步提高A-dmDT390-bisFv的表達水平，使巴斯德畢赤酵母的EF-2基因產生突變，701位的Gly變為Arg，該突變在其他生物體內已經顯示可阻止EF-2的ADP核糖基化。EF-2誘變需要克隆該基因，將帶有選擇標記URA3的體外突變序列引入基因組中，以及對突變的克隆進行PCR鑒定。巴斯德畢赤酵母的整個EF-2基因已被克隆和測序。巴斯德畢赤酵母EF-2的編碼序列為2526個核苷酸，編碼842個氨基酸。巴斯德畢赤酵母EF-2與釀酒酵母和裂變酵母(S.pombe)的EF-2長度相同，并分別與兩者在氨基酸序列上具有88％和78％的相同性(identity)。與這兩種酵母相比，巴斯德畢赤酵母只有一個含較短內含子的EF-2基因拷貝。在弄清EF-2的完整序列之前，曾使用各種方法使巴斯德畢赤酵母發生突變，以獲得DT抗性株。由于缺少有效的篩選方法，所有這些努力都以失敗而告終。基于獲得的EF-2序列，構建了靶向巴斯德畢赤酵母EF-2基因的pBLURA-Δ5’mutEF-2，通過同源重組在該基因中引入Gly701到Arg的突變。該構建體包括EF-2的3’端1028個核苷酸和營養缺陷標記URA3，其中EF-2已經體外誘變含有上述的氨基酸替換。還開發了PCR檢測方法，以便在尿嘧啶篩選之后快速準確地分辨突變克隆。使用構建體pBLURA-Δ5’mutEF-2進行的定向克隆手段使得在巴斯德畢赤酵母EF-2基因的突變體中，約40％的尿嘧啶陽性克隆被發現含有引入的突變。使用不同的營養缺陷標記培育EF-2突變體，(特別是mutEF2JC308(adelarg4his4)，mutEF2JC303(arg4his4)和mutEF2JC307(his4))，證實了EF-2中Gly701至Arg的突變使之對胞質溶膠中表達的DTA鏈產生抗性。當EF-2突變體在AOX1啟動子的調控之下用于表達A-dmDT390-bisFv時，與未突變的表達株JW102相比，在搖瓶中制備該蛋白時并未顯示出優勢。然而，若在JW102的最適條件下進行大規模發酵培養，突變株YYL#8-2[MUT2JC307-8(2)]的產量在96小時內持續提高，達到高于未突變JW102株1.46倍的水平。至于細胞生長和甲醇消耗速度，表達A-dmDT390-bisFv的突變株和不表達的野生株是相等的。因此，似乎表達A-dmDT390-bisFv對突變株沒有毒性。EF-2突變體允許在組成型GAP啟動子(PGAP)的調控下表達A-dmDT390-bisFv。在搖瓶培養中，由PGAP調控表達A-dmDT390-bisFv的產量比由PAOX1調控表達要高出約30％。若采用發酵培養，由PGAP調控表達的產量可更為顯著地提高，這是由于發酵可使細胞生長至極高的密度。在巴斯德畢赤酵母表達系統中，使用簡單的合成培養基(definedmedium)已成功表達和/或分泌了多種異源蛋白，如疫苗用肉毒菌神經毒素片段(Potteretal.，2000)、乙型肝炎病毒表面抗原(Hardyetal.，2000)、明膠(Wertenetal.，1999)、膠原(Nokelainenetal.，2001)和胰島素(Wangetal.，2001)。胞質溶膠中表達DT的催化結構域導致蛋白合成抑制，使合成培養基中所有細胞死亡，但在天然培養基中不會如此(Liuetal.，2003)。該發現表明，天然培養基在減弱由EF-2的ADP核糖基化導致的蛋白合成抑制方面起著重要作用。使用搖瓶培養時，在合成培養基中觀察到極少量二價免疫毒素生成，但在天然培養基中沒有。已經開發了基于合成培養基的巴斯德畢赤酵母發酵方法，用以表達異源蛋白，但使用天然培養基以分泌形式表達二價免疫毒素會提高產量。在當前利用巴斯德畢赤酵母大規模制備二價免疫毒素過程中，將誘導溫度降至15℃會顯著提高生物活性免疫毒素的分泌量，因而可補償巴斯德畢赤酵母分泌能力的限制。另外，使用含酵母提取物的天然培養基明顯減弱了免疫毒素對巴斯德畢赤酵母宿主的毒性作用，進一步提高了免疫毒素的分泌量。通過按如下方式優化巴斯德畢赤酵母的發酵條件，生物反應器培養時的二價免疫毒素表達水平可比搖瓶培養提高4倍(1)使用基于大豆蛋白胨(SoytonePeptone)和酵母提取物的天然培養基，(2)甲醇誘導過程中，使用甲醇/甘油混合添加物(4∶1)補充能源，(3)誘導過程中繼續添加PMSF和酵母提取物，(4)甲醇誘導過程中將溫度降至15℃。甲醇誘導過程中降低溫度可導致分泌量相比23℃時提高2倍。如上所述，生產二價免疫毒素的主要問題是在甲醇誘導階段甲醇利用量減少。甲醇利用量減少是由限速酶醇氧化酶(AOX1)的活性降低所致。這相對于從分泌區泄漏或者從輕度酸性分泌區通過質子依賴的易位，而到達胞質溶膠區的二價免疫毒素所導致的蛋白合成抑制來說，還是次要的(Arataetal.，2002)。在EF-2基因中具有毒素抗性突變的巴斯德畢赤酵母菌株中，甲醇利用量不受產生免疫毒素的影響(Liuetal.，2003)，這一事實說明在菌株JW102中，毒素誘導的ADP核糖基化是AOX1活性降低的原因。然而，AOX1水平是由合成和降解兩方面的平衡來控制的，降解機制可因毒素介導的ADP核糖基化而加強。出于未知原因，酵母提取物可提高甲醇利用量，但對野生型水平不起作用。另外，低甲醇利用量會負面影響巴斯德畢赤酵母細胞的生長。這在本方法中，通過在甲醇誘導過程中加入另一種碳源——甘油，以及持續添加酵母提取物來解決。這兩項措施將甲醇利用量提高到非表達菌株的80％。為了進一步補償由表達的免疫毒素所致的巴斯德畢赤酵母蛋白合成抑制，采用使甲醇代謝限速酶——醇氧化酶I(AOX1)具有最大活性的發酵條件(Veenhuisetal.，1983)。既然免疫毒素基因和AOX1基因處于同一強啟動子的調控之下，免疫毒素應該被高水平表達。然而，先前曾觀察到，在異源蛋白的分泌中，各種蛋白似乎分別具有最佳分泌水平。在哺乳動物、昆蟲和酵母細胞中，分泌型異源蛋白的超過最佳水平的表達(過表達)可導致分泌型蛋白產量減少(BannisterandWittrup，2000；Liebmanetal.，1999；Liuetal.，2003；Pendseetal.，1992)。為了確定二價免疫毒素在巴斯德畢赤酵母中是否過表達，在甲醇誘導過程中降低誘導溫度。由于在低溫下包括蛋白合成在內的大部分細胞活性均降低，所以降低誘導溫度應該降低二價免疫毒素的合成速率。對所導致的任何分泌變化均作出判斷。在較低的誘導溫度下，二價免疫毒素的表達水平提高，在17.5℃時達到最大值，生物活性的免疫毒素的分泌在15℃時達到最大值，盡管存在甲醇消耗率在15℃時下降至23℃時的75％這一事實。因為在誘導過程中持續添加PMSF和酵母提取物可有效抑制上清液中的蛋白酶活性，所以似乎不能用較低誘導溫度下蛋白酶活性降低來解釋15℃下二價免疫毒素的分泌水平增加了近2倍。前述的巴斯德畢赤酵母分泌二價免疫毒素的限制可能實際上反映了在23℃時過表達，在15℃時表達減少，從而實現分泌區內輸入和輸出的較好平衡。簡單地說，使用巴斯德畢赤酵母(JW102)，在發酵罐中以甲醇作為碳源，在AOX1啟動子的調控下以分泌途徑制備免疫毒素。高效制備免疫毒素主要有兩大障礙，免疫毒素對巴斯德畢赤酵母的毒性和巴斯德畢赤酵母分泌免疫毒素的能力限制。對巴斯德畢赤酵母的毒性導致在合成培養基中進行甲醇誘導的過程中，出現甲醇消耗代謝率下降、細胞生長速率減緩以及產量極低等。這些問題通過以下手段克服(1)使用基于大豆蛋白的酶消化產物(如大豆蛋白胨)和酵母提取物的天然培養基，(2)在甲醇誘導過程中使用甲醇/甘油混合添加物(4∶1)補充能源，(3)甲醇誘導過程中持續添加PMSF和酵母提取物。將誘導溫度降至15℃，與誘導溫度23℃時的分泌相比，分泌的免疫毒素產量提高幾乎2倍，達40mg/L(誘導67小時)，盡管此時甲醇消耗量下降。另外，使用本方法，以無生物活性的寡聚體形式存在的免疫毒素部分減少。本發明還提供了一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液裝入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素裝入陰離子交換柱中；d)通過使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。可選地，本方法進一步包括在使用硼酸鈉溶液洗脫之前，先使用約25mM硼酸鈉溶液洗滌陰離子交換柱。被純化的非糖基化免疫毒素優選通過本文教導的方法表達。純化方法的步驟(d)中，硼酸鈉溶液濃度在約25mM至約200mM之間，優選在約75mM至約100mM之間。例如，步驟(e)中硼酸鈉濃度為約20mM。從巴斯德畢赤酵母上清液中大規模純化二價抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)時所遇到的主要問題，是存在具有相似電荷、大小和疏水特性的宿主糖蛋白。這個問題通過采用硼酸鹽陰離子色譜來解決。硼酸鹽陰離子對碳水化合物具有親和性，可使這些結構帶有負電荷。硼酸鈉濃度在50至100mM之間時，非糖基化免疫毒素不與Poros50HQ陰離子交換樹脂結合，但是糖蛋白，包括與免疫毒素相關的聚集體卻可以結合。通過利用硼酸鈉存在時的免疫毒素的這種特性，開發了3步純化過程(1)Butyl650M疏水作用色譜，(2)硼酸鹽存在下的Poros50HQ陰離子交換色譜，(3)Q陰離子交換色譜。該方法具有以下幾個優點(1)相對簡單，無滲析或滲濾步驟；(2)重復性好；(3)最終產率超過50％；(4)最終純度超過98％。以前，硼酸樹脂一直用于從蛋白質中分離糖蛋白。然而，將硼酸鹽陰離子與常規陰離子交換樹脂結合可實現從糖蛋白中分離免疫毒素，沒有必要根據優質生產規范準則評估非標準樹脂。因此，將硼酸鹽陰離子交換色譜用于從巴斯德畢赤酵母糖蛋白中分離免疫毒素。免疫毒素只有單體形式具有功能活性。然而，從發酵過程中收獲的上清液包含免疫毒素的單體、二聚體和更高的寡聚體形式，以及巴斯德畢赤酵母蛋白。在這些巴斯德畢赤酵母蛋白之中，一種約45kDa的糖蛋白以二聚體形式(～90kDa)存在。二聚體和更高的寡聚體形式的免疫毒素可相對容易地使用常規疏水作用色譜和陰離子交換色譜分離。然而，分離純單體免疫毒素非常困難，因為45kDa的糖蛋白與單體免疫毒素的大小、疏水性和等電點非常相似。以前，一直使用固定的苯硼酸樹脂從蛋白質中分離糖蛋白(Myohanenetal.，1981；Bouritisetal.，1981；Williamsetal.，1981；Zanetteetal.，2003)。根據pH值、糖的存在與否、糖的類型、糖的濃度和緩沖液類型，這些固定樹脂可結合并選擇性阻礙糖蛋白。將免疫毒素與45kDa的糖蛋白分離時使用硼酸鹽陰離子交換色譜，而不使用固定苯硼酸親和色譜，因為苯硼酸樹脂的分離能力太差。硼酸鹽與具有鄰近順式羥基的糖殘基形成復合物(Boeseken，1949)，并且這些復合物可逆(Weigel，1963)。硼酸鹽與糖蛋白上的碳水化合物形成可逆復合物，導致糖蛋白的負電荷增加。該性質使得非糖蛋白和糖蛋白的分離可以在陰離子交換色譜上進行(Nomotoetal.，1982；NomotoandInoue，1983)。在分離免疫毒素與糖蛋白的過程中，硼酸鹽陰離子交換色譜和苯硼酸親和色譜具有不同的結合特性。在苯硼酸親和色譜中，糖蛋白以及免疫毒素在低離子強度條件下結合，它們可使用0-100mM硼酸鈉梯度或0-50mM山梨糖醇梯度共洗脫，說明免疫毒素通過另一種機制與至少一種結合的糖蛋白發生物理相互作用，或者與苯硼酸柱發生相互作用。純化的二價免疫毒素也可與苯硼酸柱結合，這一事實說明結合通過另一種機制進行。在以前的使用搖瓶培養的純化方法中，采用包括DEAE陰離子交換色譜和蛋白L親和色譜的2步操作過程來純化免疫毒素(Wooetal.，2002)。然而，在巴斯德畢赤酵母的高密度發酵罐培養上清液中，含有嚴重影響陰離子交換樹脂能力的物質。另外，蛋白L親和步驟需要超大型柱，費用較高，且沒有優質生產規范(GMP)認證。因而，需要開發其他方法。利用Butyl650M的疏水作用色譜可順利進行捕捉步驟，但同樣，濃縮的巴斯德畢赤酵母糖蛋白與免疫毒素具有相似的電荷、大小和疏水性。刀豆素A(concanavalinA)親和樹脂有望可除去糖蛋白，但具有潛在毒性的刀豆素A從樹脂上流下，造成對最終產品的不可接受的污染。陰離子交換柱可以是但不限于陰離子丙烯酸、陰離子瓊脂糖、陰離子纖維素、陰離子葡聚糖或陰離子聚苯乙烯。陰離子交換柱優選PorosHQ50和Q陰離子交換柱。在本發明中，通過使用Poros50HQ硼酸鹽交換色譜，可實現免疫毒素單體形式的基本純化，盡管洗脫部分的免疫毒素被稀釋。因此，隨后通過Q陰離子交換色譜進行濃縮步驟。疏水作用柱可以是但不限于Phenyl-SEPHAROSECL-4B，OctylAgarose，Phenyl-Sepharose6FastFlow，Phenyl-Agarose，Phenyl-Sepharose6FastFlow，Octyl-Sepharose4FastFlow，ButylSepharoseTM4FastFlow，OctylAgarose，Phenyl-Agarose，Hydrophobicchromatographymedia-monoaminoMAA-8，Hexyl-Agarose，Dodecyl-Agarose，Hexyl-Agarose，4-Phenylbutylamine-Agarose，Ethyl-Agarose，Matrix，Butyl-Agarose，PropylAgarose，AffinitychromatographymediaAAF-8，OctylAgarose，Butyl-Agarose，Decyl-Agarose，Phenyl-Agarose，MethylMatrixCeramicHyperDFHydrogelComposite，OctylAgarose，Trityl-Agarose，QSepharose，Ether650，Phenyl650，Butyl650或Hexyl650。疏水作用柱優選Butyl650M疏水作用柱。這里的硼酸鹽陰離子交換色譜可用于純化巴斯德畢赤酵母表達的其他蛋白。巴斯德畢赤酵母正越來越多地用作治療用重組蛋白的表達系統(Cereghinoetal.，2002)。由于巴斯德畢赤酵母和人類的糖基化作用模式具有顯著差異，許多這些重組蛋白已經去掉了其糖基化作用位點。然后這些重組蛋白可使用硼酸鹽陰離子交換色譜來純化。可考慮使用任何緩沖液、流速和柱大小，只要與裝在柱上的免疫毒素相比，其可以成功影響免疫毒素的洗脫，使之處于更加純凈的狀態。本發明中使用的免疫毒素包括與抗體部分(靶向部分)相連的突變型毒素部分(如DT毒素)。可使用的毒素包括但不限于白喉毒素、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素。抗體部分優選單鏈(sc)可變區。除非另有說明，本發明實施時將采用分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白質化學和免疫學領域內的常規技術。這些技術在參考文獻中給出詳細解釋，包括Sambrook，etal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)；DNACLONING，第I和II卷，D.NGlover編著(IRLPress，1985)；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS，M.J.Gait編著(IRLPress，1984)；NUCLEICACIDHYBRIDIZATION，B.D.Hames和S.J.Higgins編著(IRLPress，1984)；TRANSCRIPTIONANDTRANSLATION，B.D.Hames和S.J.Higgins編著，(IRLPress，1984)；ANIMALCELLCULTURE，R.I.Freshney編著(IRLPress，1986)；IMMOBILIZEDCELLSANDENZYMES，K.Mosbach(IRLPress，1986)；B.Perbal，APRACTICALGUIDETOMOLECULARCLONING，Wiley(1984)；系列METHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，Inc.；GENETRANSFERVECTORSFORMAMMALIANCELLS，J.H.Miller和M.P.Calos編著(ColdSpringHarborLaboratory，1987)；METHODSINENZYMOLOGY，第154和155卷，分別由Wu和Grossman編著，以及Wu編著，(AcademicPress，1987)，IMMUNOCHEMICALMETHODSINCELLANDMOLECULARBIOLOGY，R.J.Mayer和J.H.Walker編著(AcademicPressLondon，HarcourtBraceU.S.，1987)，PROTEINPURIFICATIONPRINCIPLESANDPRACTICE，第2版(Springer-Verlag，N.Y.(1987)，和HANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY，第I-IV卷，D.M.Weiretal.，(BlackwellScientificPublications，1986)；Kittsetal.，Biotechniques14810-817(1993)；Munemitsuetal.，Mol.andCell.Biol.105977-5982(1990)。本發明利用了編碼含白喉毒素的融合蛋白的核酸，其中該核酸可由酵母細胞表達。可由酵母表達的核酸包括修飾的天然白喉編碼序列。為了促進本發明的核酸由酵母細胞的表達，對富含A和T核苷酸的核酸區進行修飾，以使其編碼的免疫毒素融合蛋白可由酵母表達。例如，這種修飾使之可由巴斯德畢赤酵母表達。這種修飾設計為可抑制聚腺苷酸化信號和/或減少RNA轉錄的提前終止。更具體地說，對天然白喉編碼序列的一個或多個富含AT區進行修飾，減少AT含量。富含AT區包括AT含量至少60％的至少150個連續核苷酸的區域，或者AT含量至少65％的至少90個連續核苷酸的區域，富含AT區的AT含量優選降至55％或更低。富含AT區還包括AT含量至少63％的至少150個連續核苷酸的區域，或者AT含量至少68％的至少90個連續核苷酸的區域，富含AT區的AT含量降至55％或更低。優選將天然白喉編碼序列進一步修飾以編碼C末端截短的白喉毒素。而且，優選將天然白喉編碼序列進一步修飾，以在天然白喉毒素氨基末端甘氨酸殘基之前編碼一個或多個氨基酸。而且，優選將天然白喉編碼序列進一步修飾，以編碼α-交配因子信號肽或其一部分。本發明的免疫毒素可在多種生物體內表達和純化。這些生物體包括酵母如巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母，細菌如大腸桿菌，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞或桿狀病毒感染的昆蟲細胞。使用酵母表達系統(包括，例如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母)有以下幾個優點。首先，有證據表明，由酵母分泌系統產生的蛋白顯示正確的二硫配對(disulfidepairing)。其次，使用酵母表達系統，可進行高效的大規模生產。釀酒酵母前-原-α交配因子前導區可用于指導酵母的蛋白分泌(Brake，etal.(82))。前-原-α交配因子的前導區包括信號肽和原-片段，其中原-片段又包括由KEX2基因編碼的酵母蛋白酶的識別序列該酶在Lys-Arg二肽切割信號序列的羧基一側將前體蛋白切除。核酸編碼序列與前-原-α交配因子前導區發生框內(in-frame)融合。該構建體可放置于強轉錄啟動子的調控之下，如醇脫氫酶I啟動子、醇氧化酶I啟動子、糖分解啟動子(glycolyticpromoter)或者半乳糖利用途徑啟動子。核酸編碼序列隨后是翻譯終止密碼子，再后是轉錄終止信號。或者，核酸編碼序列可與另一條蛋白編碼序列(如Sj26或β-半乳糖苷酶)融合，以有利于融合蛋白通過親和色譜法純化。可在用于酵母表達的構建體內插入蛋白酶切割位點，以便將該融合蛋白的各部分分開。當白喉毒素A鏈在胞質溶膠區合成而沒有分泌信號時，該毒素對酵母是有毒性的(Parentesisetal.，1988)。該毒素催化活性對EF-2具有特異性，發生于第699位的獨特的翻譯后組氨酸殘基，該殘基在所有真核生物EF-2的保守性氨基酸序列中均有發現。酵母EF-2中的第701位甘氨酸變為精氨酸殘基，可導致對DT產生抗性。在另一個純化方法中，(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)在畢赤酵母(Pichia)培養基中生產，產量在5mg/ml水平，不論是否存在突變型EF-2基因。在以下兩方面之間存在極緊耦合一方面是α-交配因子信號序列的存在，另一方面是(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)區室化，進入分泌途徑而遠離胞質溶膠區中的EF-2毒素底物，因為胞質溶膠中的一個毒素分子在24小時內就可以使99％的EF-2失活。利用α-交配因子信號序列在畢赤酵母中生產(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)，而非使畢赤酵母產生毒素抗性的突變，已經提供了成功的結果。另外，酵母產生的毒素(蓖麻毒素A鏈)和信號序列Kar2的結合可導致生產細胞的死亡(Simpsonetal.，1999(80))。在畢赤酵母中的免疫毒素融合蛋白的基因劑量較高的情況下，mEF-2有可能對生產具有益處。對生產免疫毒素融合蛋白來說，酵母相對于哺乳動物細胞的另一個優勢為，未經任何處理的酵母即對存在于外部培養基中的水平高達3.3×10-6M的白喉毒素具有極高的抗性。顯然，酵母莢膜阻止了毒素被逆行運輸回胞質溶膠區，而在哺乳動物細胞和酵母原生質球中會發生此類現象(Chenetal.，1985)。本發明可利用包含編碼免疫毒素融合蛋白的核酸的細胞。該細胞可為原核細胞，包括，例如細菌細胞。更具體地說，細菌細胞可為大腸桿菌細胞。或者，該細胞可為真核細胞，包括，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括，例如，如Moehring和Moehring所選擇的DT抗性CHO-K1RE1.22c細胞系)、骨髓瘤細胞、畢赤酵母細胞或昆蟲細胞。可將免疫毒素融合蛋白編碼序列引入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，例如通過氨甲喋呤抗性編碼載體，或者使用適當的選擇標記引入其他細胞系。可通過DNA印跡分析來確定轉化細胞中是否存在載體DNA。可通過RNA印跡分析來確定是否有相應于插入編碼序列的RNA產生。已經開發了許多其他適合的宿主細胞系，包括骨髓瘤細胞系、成纖維細胞系，以及多種腫瘤細胞系如黑色素瘤細胞系。這些細胞的表達載體可包括表達控制序列，如復制起點、啟動子、增強子，以及必需的信息處理位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。表達控制序列優選來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動子。含有所研究的核酸片段的載體可通過公知的方法轉入宿主細胞中，且這些方法可根據細胞宿主類型而變化。例如，氯化鈣轉化通常用于原核細胞，而磷酸鈣、DEAE葡聚糖或脂質體(lipofectin)介導的轉染或者電穿孔可用于其他細胞宿主。用于本發明的核酸可與一個或多個可指導和調控插入核酸的轉錄的功能元件有效連接，并且該核酸可被表達。例如，核酸可與細菌或噬菌體啟動子有效連接，用于指導核酸的體外轉錄。提供了巴斯德畢赤酵母的突變株。該突變株包括在至少一個編碼延長因子2(EF2)的基因中發生突變。該突變包括在修飾的組氨酸殘基白喉酰胺的羧基一側的兩個殘基位置發生Gly到Arg的替換。籍此，可使該突變株產生對于白喉毒素ADP核糖基化毒性作用的抗性。提供了一種表達白喉毒素蛋白部分的方法。本發明的此方法包括，在可使細胞中蛋白編碼核酸表達的條件下，使用包括毒素蛋白編碼核酸的載體轉染本發明的突變巴斯德畢赤酵母細胞。所述條件為用于巴斯德畢赤酵母細胞的條件，且可根據該特定系統優化。抗體部分優選經由抗CD3途徑或其他T細胞表位途徑。免疫毒素可為單價，但目前來講優選二價抗體部分，因為已經發現二價抗體可增強細胞殺傷能力約15倍。可考慮將任何數量的化學耦合或重組DNA方法用于生成本發明的免疫毒素。因此，提到融合毒素或耦合毒素，未必是限制性的。免疫毒素可為重組法制備的融合蛋白。可在重組產生的二價抗體(靶向部分)和重組產生的突變型毒素部分的特殊位點，通過化學硫醚鍵連接制備免疫毒素。免疫毒素的靶向部分可包括人μCH2、μCH3和μCH4區，以及來自鼠Ig抗體的VL和VH區。這些區可來自抗體UCHT1，以使該抗體部分為scUCHT1，它是具有人μCH2、μCH3和μCH4區和如圖所示的小鼠可變區的單鏈CD3抗體。可考慮多種DT突變型毒素部分，包括例如DT390和DT389，帶有多個突變或者以野生型毒素部分的形式。毒素部分保留其毒性功能，以及全部膜易位至胞質溶膠的功能。位于該蛋白的受體結合區域的結合功能的喪失，可通過減少與非靶細胞的結合來實現減小全身毒性。因此，該免疫毒素可安全施用。通常由毒素結合功能提供的尋路(routing)功能由靶向抗體抗CD3來提供。重要的尋路途徑有(1)定位于有被小窩進行胞吞作用，(2)從溶酶體尋路中逃逸，(3)返回質膜。任何以此方式尋路的抗體均可與毒素部分一起發揮作用，而不論該抗體所針對的表位，只要毒素沿該途徑可實現足夠的蛋白酶解加工。足夠的加工可通過細胞殺傷水平來確定。作為核內體酸化的結果，受體構型受特定受體的誘導而變化，可導致抗體與其受體的脫離，這時抗體進入溶酶體途徑。這可以通過以下方式避免或控制在最小水平將抗體導向質膜附近的相同受體上的外功能區表位(Ruud，etal.(1989)Scand.J.Immunol.29299；Herzetal.(1990)J.Biol.Chem.26521355)。突變型DT毒素部分可為具有和沒有點突變或置換的截短型突變體，如DT390、DT389或DT383，或其他的截短型突變體，以及具有點突變的全長毒素，如DTM1或CRM9(在潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)中克隆)，與DTM1和DT483的scUCHT1融合蛋白，DT390和DT389，并且已經在大腸桿菌中克隆和表達。抗體部分可為具有本文所詳細敘述的尋路和其他特性的scUCHT1或其他抗CD3或抗T細胞抗體。因此，用于本發明方法的免疫毒素的一個實例包括融合蛋白免疫毒素UCHT1(或其片段)-DT390。有一條糖基化作用的共有序列(NXS/T(SEQIDNO19))，可將其去除或插入以控制糖基化作用。糖基化作用存在于所有真核生物中，如巴斯德畢赤酵母。有多種免疫毒素的變體。蛋白變體和衍生物為本領域技術人員所公知，可包括氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾通常可歸入三類中的一類或多類置換、插入或缺失變體。插入包括氨基和/或羧基末端融合，以及在序列內部插入單個或多個氨基酸殘基。插入通常為比氨基或羧基末端融合小的插入，例如大約一至四個殘基。具免疫原性的融合蛋白衍生物，例如實施例中所述的，是通過體外交聯或者使用編碼該融合蛋白的DNA轉化的重組細胞培養，以使足夠大的可產生免疫原性的多肽與靶序列融合來制備。缺失的特征是一個或多個氨基酸殘基從蛋白序列中去除。通常在蛋白分子內的任何位點，不超過大約從2至6個殘基缺失。這些變體一般通過將編碼該蛋白的DNA中的核苷酸進行定點誘變制備，由此產生編碼該變體的DNA，然后在重組細胞培養中表達。在具有已知序列的DNA中的預定點造成置換突變的技術已為公知，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換通常為單個殘基，但可以同時在多個不同位置發生；插入通常為大約1至10個氨基酸殘基；缺失的范圍為大約1至30個殘基。缺失或插入優選在相鄰的一對中發生，即2殘基缺失或2殘基插入。置換、缺失、插入或其任意形式的結合可一起實現最終的構建體。突變不可將序列置于讀框之外，優選不產生可導致二級mRNA結構的互補區。置換變體是去掉至少一個殘基并在該位置插入另一個殘基形成的變體。該置換一般按照下表進行，被稱為保守性置換。氨基酸縮寫氨基酸置換初始殘基示例性保守性置換，其他為本領域所公知。可通過下列方法使功能或免疫同一性發生較大變化選擇與氨基酸置換表中的置換相比，保守性較低的置換，即選擇對維持以下方面的效果有顯著差異的殘基(a)置換區的多肽骨架結構，例如折疊或螺旋構象，(b)靶位點的分子電荷或疏水性，或者(c)側鏈大小。通常會使蛋白性質發生最大變化的置換是(a)親水性殘基(如絲氨酰基或蘇氨酰基)置換疏水性殘基(如亮氨酰基、異亮氨酰基、苯丙氨酰基、纈氨酰基或丙氨酰基)(或者前者被后者置換)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置換任何其他殘基(或者被任何其他殘基置換)；(c)具有正電側鏈的殘基(如賴氨酰基、精氨酰基或組氨酰基)置換負電殘基(如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或者前者被后者置換)；或者(d)具有較大側鏈的殘基(如苯丙氨酸)置換沒有側鏈的殘基(如甘氨酸)(或者前者被后者置換)，在這種情況下，(e)增加硫酸化和/或糖基化位點的數目。例如，一個氨基酸殘基被另一個生物或者化學上相似的氨基酸殘基替換，這作為保守性置換已為本領域技術人員所熟知。例如，保守性置換可使用一個疏水性殘基置換另一個疏水性殘基，或者使用一個極性殘基置換另一個極性殘基。這種置換所包括的組合例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。各條明確公開的序列的此類保守性置換變異形式均包含于本發明提供的嵌合體多肽之中。置換或缺失誘變可用于插入N糖基化作用位點(Asn-X-Thr/Ser)或O糖基化作用位點(Ser或Thr)。可能還需要使半胱氨酸或其他不穩定殘基發生缺失。潛在的蛋白酶解位點(如Arg)的缺失和置換，可通過例如使一個堿性殘基缺失或者使一個殘基被谷氨酰胺酰基或組氨酰基殘基置換來實現。一定的翻譯后衍生作用是重組宿主細胞對所表達的多肽作用的結果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基殘基常在翻譯后脫去酰胺，變成相應的谷氨酰基和天冬氨酰基殘基。或者，這些殘基在溫和的酸性條件下脫去酰胺。其他的翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰基或蘇氨酰基殘基的羥基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的o-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFranciscopp79-86)，N末端胺的乙酰化，以及在某些情況下，C末端羧基的酰胺化。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或有核細胞)的表達載體還可包括可影響mRNA表達的、轉錄終止必需的序列。這些區域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中，轉錄為聚腺苷酸片段。3′非翻譯區還包括轉錄終止位點。轉錄單位優選還包括聚腺苷酸區。該區的一個作用是增加了轉錄單位像mRNA一樣被處理和轉運的可能性。表達構建體中聚腺苷酸信號的識別和利用方法已經較好地建立起來。優選將同源聚腺苷酸信號用于轉基因構建體。在某些轉錄單位中，聚腺苷酸區來自SV40早期聚腺苷酸信號，并且包括大約400個堿基。轉錄單位還優選包括其他標準序列，單獨或與以上序列相結合，以提高構建體的表達水平或穩定性。實施例提出以下實施例，以便為本領域普通技術人員提供本發明所要求保護的化合物、組合物、產品、裝置和/或方法的制備和評估手段的完全公開和描述，僅僅出于示例性目的，并非意在限制本公開的范圍。已經努力確保有關數字(如數量、溫度等)的準確性，但應該考慮到會存在一些誤差和偏差。除非另有說明，份數為重量份數，溫度以℃為單位或者為環境溫度，壓力等于或接近大氣壓。實施例1使用經誘變處理的寡核苷酸轉化56個核苷酸的寡聚體(見引物列表)包含兩點突變，將氨基酸701從甘氨酸換為精氨酸。經誘變處理的寡聚體(56聚體，100μg)與ARG4DNA片段共轉化進入GS200(Mut+，His-，Arg-)菌株。帶有啟動子的ARG4基因通過SphI和EcoRV取自質粒PMY30(由Prof.JimCregg，KeckGraduateInstituteofAppliedLifiSciences，Claremont，CA91711提供)。共獲得大約1000個轉化體。為了篩選具有正確突變的突變型克隆，采用使用引物mdb1EF-2和2253EF-2C的診斷PCR。突變檢測引物(mdb1EF-2)可以區分正常基因和氨基酸701突變的基因的DNA序列。對于正常基因來說，得不到PCR產物，因為3′端的2個核苷酸與正常基因的DNA序列不匹配，Taq聚合酶阻止了其延伸。對于突變基因，引物可完美退火，所以Taq聚合酶可產生PCR產物。用這種PCR方法篩選了1000多個菌落，但沒有發現突變型菌落。(在以上的PCR檢測中，來自釀酒酵母的氨基酸701突變的EF-2用作陽性對照。該突變基因已經事先制備出來，意在將其引入巴斯德畢赤酵母中。然而，以此轉化的巴斯德畢赤酵母生長速率極低，產生所需蛋白的水平也很低。)使用包含EF-2基因保守區和氨基酸701突變的部分DNA片段進行轉化。巴斯德畢赤酵母EF-2的部分序列(位置1717至2289，圖3(a)(b)(c)(d))在體外發生突變，將氨基酸701從甘氨酸變為精氨酸(圖1b)，然后與ARG4基因片段共轉化進入GS200菌株。共獲得2000多個Arg4陽性轉化體，再通過診斷PCR使用引物mdb2EF-2和2253EF-2C從中篩選EF-2突變。未觀察到突變。引物列表來自釀酒酵母EF-2的引物5′引物TTGGTTATTGACCAAACTAAGGCTGTCCAA(SEQIDNO20)3′引物ACCTCTCTTCTTGTTTAAGACGGAGTAGAT(SEQIDNO21)在巴斯德畢赤酵母EF-2的克隆和突變中使用的引物dT22-Not5’-CTTGCTTTTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQIDNO22)EF-2C25’-GATAAGAATGCGGCCGCCATTTCTTGGTCTTTGGGTTGAAG(SEQIDNO23)EF-2C15’-GATAAGAATGCGGCCGCCAACTTAGTTGTTGACCAGTCTAAG(SEQIDNO24)5’EF-25’-ATAGCTAGCACTTTGAAGTTCTTAATTTTGTTCCTC(SEQIDNO25)3’EF-2C5’-ATAAGAATGCGGCCGCAAGTTAATGAAACATTAAGCTTACAAC(SEQIDNO26)wEF-25’-GAATGACTTGTCCTCCACC(SEQIDNO27)mEF-25’-GAATGACTTGTCCTCCGCGG(SEQIDNO28)EF-14265’-CAACTAGCTAGCGCTCACAACATGAAGGTCATGAAATTC(SEQIDNO29)EF-13185’-AGAACCGTCGAGCCTATTGACGAT(SEQIDNO30)經誘變處理的寡核苷酸5’-CCCTGCACGCCGATGCTATCCACAGAAGAGGAGGACAAGTCATTCCAACCATGAAG(SEQIDNO31)mdb1EF-25’-GCCGATGCTATCCACAGAAGA(SEQIDNO32)mbb2EF-2GCCGATGCTATCCACCGCCGC(SEQIDNO33)2253EF-2CTCTCTTCTTGTTCAAAACAGAGTAGATACC(SEQIDNO34)實施例2使用突變型EF-2部分片段和ARG4片段進行原生質球轉化。在實施例1的方法中，沒有針對野生型DT的篩選步驟。因而采用雙轉化。首先，突變型EF-2片段通過電穿孔法轉化進入GS200菌株。然后，將電穿孔細胞過夜培養，使其在細胞內表達突變型EF-2。培養的細胞用于制備原生質球。生成的原生質球使用野生型DT(200μg/ml)和ARG4片段(10μg)處理1小時，并且通過CaCl2和PEG轉化。只獲得少量正常菌落大小的轉化體，沒有突變菌株。另外，還獲得100個或更多的微小菌落。對這其中100個進行篩選，沒有檢測到突變菌株。實施例3巴斯德畢赤酵母EF-2基因的克隆和測序在克隆巴斯德畢赤酵母EF-2基因的全序列之前，已經獲得其部分序列。最開始，從基因組DNA中擴增巴斯德畢赤酵母EF-2的保守性R結構域，該過程使用來自釀酒酵母EF-2的相同結構域的兩個引物(Perentesisetal.，1992)。5′引物包括釀酒酵母EF-2中從位置1933至1962的序列，而3′引物與2227至2256區域互補。然后在巴斯德畢赤酵母EF-2基因的編碼區內，這條324個核苷酸的序列在5′端延伸至位置284，在3′端延伸至位置2289。后來發現這條延伸的序列包含幾處錯誤。為了克隆整個巴斯德畢赤酵母EF-2基因，首先使用兩條不同的引物從EF-2mRNA分別合成了兩種cDNA。引物dT22-Not包括與mRNA的3′polyA尾巴互補的一串22個T殘基，以及限制酶Not1的識別序列。引物EF-2C2有25個核苷酸，它與巴斯德畢赤酵母EF-2編碼序列的位置747至771的核苷酸(圖3(a)(b)(c)(d))互補。cDNA合成后，一串同聚物A殘基通過同聚物加尾反應加至由引物C2延伸的cDNA的3′端(Sambrooketal.，1989)。EF-2的5′端序列通過PCR從經過修飾的、使用EF-2C2和dT22-Not引物合成的cDNA擴增，而3′端序列從使用引物dT22-Not和EF-2C1合成的cDNA擴增，后者包括對應于位置1927至1953的27個核苷酸。然后將代表巴斯德畢赤酵母EF-2的5′端和3′端序列的PCR產物分別克隆進入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)。選出5個包含巴斯德畢赤酵母EF-2的5′序列的獨立的克隆用來測序。它們首先使用位于載體內分別靠近插入物上游和下游的M13反向引物和M13正向引物來測序，然后使用與EF-2編碼序列的位置349至384互補的內引物(internalprime)來測序。在5個克隆中，三個具有相同的序列，一個在兩個不同的內部位置具有兩個不同的核苷酸，另一個在一個不同的位置具有另一個不同的內核苷酸(internalmucleotide)。這些不同的核苷酸有可能是在克隆過程中產生的，因為這些不同的核苷酸在來自基因組DNA的克隆中均沒有出現。在5′端，所有五個克隆在第一個ATG密碼子之前都還有57到69個相同序列的核苷酸。5′端序列的最大的開放讀碼框(ORF)開始于第一個AUG，有747個核苷酸，其推得的氨基酸序列(249個氨基酸)與釀酒酵母EF-2的N末端的前249個氨基酸具有90％的相同性。所有包括EF-2序列的3′端序列的四個克隆都具有相同的675個核苷酸的序列，隨后是同聚物A串(homopolymericAtrack)。最大的ORF有603個核苷酸，結束于終止密碼子TAA，該密碼子位于poly-A串的上游72個核苷酸處。推得的氨基酸序列(201個氨基酸)與釀酒酵母EF-2的C末端的后201個氨基酸具有85％的相同性。已經獲得巴斯德畢赤酵母EF-2的5′和3′端序列之后，設計兩個引物用來從巴斯德畢赤酵母基因組DNA中擴增整個EF-2基因。引物5′EF-2來自5′非編碼區，包括相對于ATG起始密碼子的位置28至54的序列。引物3′EF-2C包括與3′端的位置2523至2549互補的27個核苷酸。使用Pfu聚合酶(Stratagene)進行PCR擴增之后，EF-2基因的PCR產物使用Taq聚合酶處理，以使其加上3′A突出端(overhanging)(InstructionmanualfororiginalTAcloningkit，Invitogen)，然后將其插入TA克隆載體pCR2.1-TOPO。選出十個克隆，從這些克隆分離質粒DNA，對其進行限制酶分析表明它們均具有相同的插入物。首先使用M13反向引物和M13正向引物進行DNA測序，然后使用來自前一步所獲序列的引物，一步步地朝相對一端進行測序。八個克隆被完全測序，結果序列相同。從基因組DNA獲得的3′端序列與來自mRNA的序列相同。然而，與mRNA的5′序列相比，來自基因組DNA的序列在緊接EF-2ORF起始位點的密碼子中具有77個核苷酸的插入物(圖2)。該插入物具有序列GTATGT...CACTAAC...TAG(SEQIDNO35)，即釀酒酵母的短內含子的保守模式(Davisetal.，200；Rymond&Rosbash，1992)。盡管內含子在釀酒酵母中很常見，但在巴斯德畢赤酵母中卻極少出現(Gregg，personalcommunication)。巴斯德畢赤酵母EF-2的編碼序列顯示于圖3(a)(b)(c)(d)。它包括2526個核苷酸，編碼842個氨基酸。巴斯德畢赤酵母EF-2與釀酒酵母和裂變酵母EF-2的長度相同，并且其氨基酸序列與釀酒酵母有88％的相同性(Perentesisetal.，1992)，與裂變酵母有78％的相同性(Mitaetal.，1997)。釀酒酵母和裂變酵母在每一單倍體基因組中均有兩個功能性EF-2基因(EFT1和EFT2)。這兩個EF-2基因拷貝編碼相同的氨基酸序列，但在編碼區中有少數核苷酸不同(釀酒酵母有4個，裂變酵母有13個)，側翼序列也不同。然而，來自mRNA和基因組DNA的獨立克隆的測序數據顯示，所有不同的克隆均具有相同的5′和3′端側翼序列以及相同的編碼序列。這再加上限制酶消化的基因組DNA的DNA印跡證據，說明巴斯德畢赤酵母只有一個EF-2基因拷貝。實施例4構建突變質粒pBLURA-Δ5’mutEF-2。為了制備DT抗性的巴斯德畢赤酵母菌株，使EF-2基因發生突變，將711位的Gly變為Arg。將突變引入基因組中所采用的手段是根據Shortleetal.(1984)的敘述，并顯示于圖4中。在該方法中，使用靶基因的截短型(只在一端)，通過同源重組將突變引入基因組中的基因中。整合帶有突變的截短型基因片段將導致下述情形基因組包括一個帶有突變的該基因的完整拷貝，以及一個截短型拷貝。因為靶位點位于3′端附近，所以使用5′截短型EF-2(Δ5’EF-2)作為突變序列。Δ5’EF-2包括來自EF-2的3′端的1127個核苷酸，從位置1432至2549(圖3)，通過PCR使用Pfu聚合酶產生。在克隆進入pCR2.1-TOPO載體之后，通過寡核苷酸指導的誘變，使Δ5’EF-2在體外發生突變。然后通過使用限制酶Nhe1和Not1分別切5′和3′端，使突變的Δ5’EF-2(Δ5’mutEF-2)從pCR2.1-TOPO上釋放，然后克隆進入已經被Nhe1和Not1消化的載體pBLURA-SX(由Cregg教授提供，記載于Geoffreyetal.(2001))中。該載體包括營養缺陷標記URA3。從細菌中純化的質粒DNApBLURA-Δ5’mutEF-2被線性化，再由電穿孔轉入巴斯德畢赤酵母菌株中。該質粒DNA包括一個獨特的AatII位點，位于EF-2序列中突變位點之前大約220個核苷酸處。在該位點切割可使質粒整合靶向于EF-2基因座，并且有利于使突變的序列轉移至EF-2的完整拷貝中。使用該質粒DNA轉化三個巴斯德畢赤酵母尿嘧啶營養缺陷菌株。它們是JC308(ade1arg4his4ura3)、JC303(arg4his4ura3)和JC307(his4ura3)，全部由Cregg教授提供并記載于Geoffreyetal.(2001)。先轉化JC308，然后轉化JO303和JC307。實施例5識別含突變型EF-2的克隆。在使用線性化的pBLURA-Δ5’mutEF-2DNA電穿孔之后，將細胞涂布在含有缺少尿嘧啶的合成完全酵母培養基的平板上(K.DMedical，Maryland)。然后通過“菌落PCR”分析Ura+克隆，以確定在完整的EF-2拷貝中是否含有正確的突變。在該方法中，使用牙簽從菌落中選取酵母細胞，重新懸浮于20μl的PCR混合液(PCRmix)中。在第一個PCR步驟(94℃，5分鐘)中將細胞裂解，從中釋放的DNA作為PCR擴增的模板。在PCR檢測程序中使用五個引物引物5′EF-2和3′EF-2C在前面的第4部分中已經敘述；EF-2(1318)具有從位置1318至1341的EF-2序列；引物wEF-2與位置2100至2119互補，而引物mEF-2具有相同位置的互補序列，但對該突變有特異性。如圖1b所示設計的核苷酸突變可產生新的SacII限制酶位點，可用于確定基因組中含有正確的突變。首先使用引物5′EF-2和mEF-2檢測Ura+轉化體中的突變。圖6a顯示，所選的12個JC308Ura+克隆之中，有9個(克隆1、2、3、12、13、14、33、40和41)為mEF-2引物陽性，它們具有預期大小(大約2.2kbp)的PCR產物，而克隆25、38和47為陰性。如圖6b所示，當使用引物EF-2(1318)和wEF-2分析相同的克隆以確定是否存在野生型序列時，所有三個mEF-2-克隆均為wEF-2引物陽性。產生了0.8kbp的PCR片段。所有的mEF-2+克隆，除克隆33和41也為wEF-2+外，其余均為wEF-2-。最后當使用引物EF-2(1318)和3′EF-2C時，選擇的所有克隆均產生如預期的約1.2kbp大小的PCR產物(圖6c)。來自mEF-2+且wEF-2-克隆的PCR產物被SacII完全消化，而來自mEF-2.但wEF-2+的克隆25、38和47的PCR產物不能被該酶切割。同時為mEF-2+且wEF-2+的情況下，克隆33和41既生成可被SacII切割(clearable)的PCR產物，也生成不能被其切割的產物。為了研究為何克隆33和41既有突變型也有野生型EF-2，將這些克隆劃線接種于新的選擇板，使這些細胞生長形成菌落。從每個克隆中選取十個完全分離的菌落，使用引物EF-2(1318)加引物3′EF-2C進行PCR，并進行SacII消化步驟。所有克隆均未得到與原來相同的混合PCR產物。來自克隆33的4個菌落、來自克隆41的7個菌落的PCR產物可被SacII完全消化，而來自克隆33和41的其他菌落完全不能被切割。該實驗說明，克隆33和44最初每一個都是由兩個不同的細胞形成的，一個具有帶突變的完整EF-2，另一個具有完整野生型EF-2。然后重復該實驗，檢測一些具有只能被SacII裂解的EF-2的克隆(克隆1、2、3、12、13、14和40)，證明它們只含有突變型完整EF-2。成功獲得JC308的EF-2突變體克隆之后，使用相同的選擇步驟識別JC303和JC307的EF-2突變體克隆。在選出來要進行分析的Ura+陽性克隆中，35％只包含突變型完整EF-2。如此高的完全突變頻率的原因可能是巴斯德畢赤酵母的每個單倍體基因組只有一個EF-2拷貝。如CHO細胞和釀酒酵母所表現的一樣，巴斯德畢赤酵母中Arg置換EF-2的Gly711在正常條件下不會影響細胞生長。實施例6在EF-2突變體中表達DTA鏈。為了驗證所獲得的EF-2突變體是否對DT表達具有抗性，使用質粒DNApPIC3-DtA轉化mutEF2JC307-8，即JC307的一個EF-2突變體克隆(克隆8)。構建pPIC3-DtA的方法已有記載(Wooetal.，2002)。簡單地說，在5′端使用BamHI，在3′端使用NotI，通過PCR擴增DTA鏈基因，將其插入巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC3(Invitrogen)中，并使用這兩種酶消化。整合pPIC3-DtA能夠使其一經甲醇誘導即可在胞質溶膠中表達DT。該質粒DNA先前已經用于轉化巴斯德畢赤酵母GS200菌株(Invitrogen)，所得的兩個克隆(C3和C4)已用于研究巴斯德畢赤酵母對DT的耐受性(Wooatal.，2002)。C3已被鑒定為不表達DTA的克隆，而C4為表達DTA的克隆。在使用pPIC3-DtA轉化之后，隨機挑選六種mutEF2JC307-8克隆，即mutEF2JC307-8-DtA(1)至(6)，用于分析其在胞質溶膠中表達DTA鏈的情況，以及甲醇誘導后的存活能力。來自單一菌落mutEF2JC307-8-DtA(1)至(6)、C3和C4的細胞，在2mlYPD(酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖)培養基中30℃過夜培養，然后離心沉淀。來自各培養物的細胞重新懸浮于YP培養基，使密度達到OD600nm±0.5。通過加入甲醇至1％來誘導細胞懸液(2ml)，并在劇烈搖動中30℃下培養。甲醇誘導24小時后，各培養物均取100μl，使其細胞沉淀，并用PBS緩沖液沖洗。然后，細胞重新懸浮于PBS中，并混以蛋白樣本緩沖液。最后，樣本經過兩個煮沸和干冰冷卻循環，使用DT特異性抗體通過SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析。mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)、C3和C4的培養物也用于生存力測試。這通過下述步驟進行使用PBS緩沖液將各培養物稀釋104至107倍，將100μl的等分鋪于YPD板上，30℃下培育3天，統計出現于板上的菌落數。SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析結果顯示，除了mutEF2JC307-8-DtA(5)，所有的mutEF2JC307-8-DtA克隆均表達DTA鏈(圖7a)。mutEF2JC307-8-DtA(3)的表達水平粗略估計為20μg/ml細胞培養物。跟預期一樣，C3不表達DTA。盡管C4不表達DTA，蛋白質譜帶卻隱約可見(圖7b)。甲醇誘導前，mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)、C3和C4每毫升細胞的菌落形成單位(CFU)數量幾乎相同。甲醇誘導24小時后，mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)以及C3的CFU數量都增長了大約103倍，而C4的CFU數量下降了大約102(圖8)。該結果說明，帶有突變型EF-2的細胞在胞質溶膠中表達DTA鏈不會對細胞造成毒害。實施例7搖瓶培養小規模表達首先使用mutEF2JC307-8表達二價免疫毒素。由于該EF-2突變體為組氨酸營養缺陷型，使用含有二價免疫毒素——Wooetal.(2002)中記載的A-dmDT390-bisFv的修飾基因最終版本的質粒pPIC9K轉化。二價指兩個重復的sFv抗體片段。用于轉化、轉化體選擇以及蛋白表達和分析的方法均已有記載(Wooetal.，2002，其中教導的方法通過引用全部納入本說明書)。轉化后，隨機選取12個菌落分析其蛋白表達。SDS-PAGE電泳分析顯示，所選克隆全部表達二價免疫毒素，但是有些克隆，如克隆編號2[mutEF2JC307-8(2)]，其表達水平比其他略高。當它們在相同條件下培養和表達相同時間時，mutEF2JC307-8(2)表達二價免疫毒素的水平與pJHW#2相同，后者為已使用pPIC9K-A-dmDT390-bisFv轉化的GS115克隆(帶有野生型EF-2)。在搖瓶培養中，mutEF2JC307-8(2)和pJHW#2的表達水平約為5至10μg/ml培養上清液。mutEF2JC307-8(2)的表達水平并非相對較高的事實說明，除了EF-2ADP核糖基化，還有其他因素限制二價免疫毒素的產生。再次嘗試在突變型巴斯德畢赤酵母中表達二價免疫毒素，將A-dmDT390-bisFv基因的兩個拷貝引入mutEF2JC303-5，即JC303的EF-2突變克隆(克隆5)，其為組氨酸和精氨酸營養缺陷型。為了構建帶有ARG4選擇標記的表達載體，將A-dmDT390-bisFv基因(見圖20)克隆進入表達載體pBLARG-SX3中，該表達載體由Cregg教授提供，并記載于Geoffreyetal.(2001)。這通過以下步驟完成將A-dmDT390-bisFv基因最終版，加上經由HindIII和NotI消化從pPICZα(Wooetal.，2002)釋放的α-因子信號序列，插入已經使用這兩種限制酶切割的pBLARG-SX3中。產生的構建體pBLARG-A-dmDT390-bisFv(圖9a)，與pPIC9K-A-dmDT390-bisFv一起經電穿孔同時引入mutEF2JC303(5)中。在含有缺少精氨酸和組氨酸的合成完全培養基的平板上(K.DMedical，Maryland)，篩選表達這兩種標記基因的轉化體。從篩選板上挑選18個菌落，分析其免疫毒素蛋白的表達情況。SDS-PAGE電泳顯示，它們分泌進入誘導培養基中的完整免疫毒素蛋白的量大致相等。這個量與單一拷貝克隆mutEF2JC307-8(2)和pJHW#2分泌的量接近。如圖10a所示，所選的三個克隆(克隆3、6、8)還表達一種更小的、但量非常多的可與抗DT抗體反應的蛋白，它與單價免疫毒素的大小相同(Liuetal.，2000)。較小的蛋白比完整蛋白更加穩定，而不管該蛋白是由A-dmDT390-bisFv基因的截短型拷貝產生，還是完整蛋白的蛋白酶解切割產物。該圖還顯示在培養上清液中有許多其他更小的蛋白可與抗DT抗體反應。它們最有可能是完整蛋白的蛋白酶解切割產物。最小且量最多的一種被鑒定為DT的A鏈，它非常穩定(Collier1975)，可看作完整蛋白的蛋白酶解降解的最終產物。該降解也發生于細胞內部(圖10b)。因為A鏈只有完整蛋白的約1/4大小，蛋白質印跡顯示的A鏈數量表明，其實際表達水平可能要高出存在于誘導培養基中的完整蛋白水平的數倍。合成的多數蛋白可能在分泌進入培養基之前或之后降解。盡管雙拷貝克隆與單拷貝克隆在培養基中積累等量的完整蛋白，但雙拷貝克隆產生更多的降解產物，說明已經合成更多的基因產物。已經采用多種措施控制蛋白降解，但完整蛋白的產量并沒有提高。因此，細胞內或細胞外的蛋白降解是提高二價免疫毒素產量的限制因素。實施例8使用PMSF發酵培養的另一種大規模表達方法為了進行大規模培養，使用BioFlo4500發酵罐(NewBrunswickScientificCompany)，它安裝有甲醇傳感器(RavenBiotechnologyCompany)，以便精確控制培養物中的甲醇濃度。起始發酵培養基(10L)包含1％酵母提取物，2％蛋白胨或2％大豆胨，4％甘油，1％酪蛋白氨基酸，1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，0.43％PTM1鹽溶液，以及0.01％消泡劑289(SigmaCo.)或消泡劑204的混合物，0.01％以及Stuktol0.01％。根據培養條件，甲醇誘導前使用含1.8％PTM1鹽溶液的75％(v/v)甘油溶液以獲得所需細胞密度，和/或補充另外的碳源或能源以利于甲醇誘導。誘導采用含20mMPMSF和/或1.2％PTM1鹽溶液的100％甲醇溶液。或者，誘導通過持續添加含73mMPMSF的4∶1的甲醇/甘油進行，并且誘導前加入PMSF至終濃度為1mM。為了制備發酵罐所用的種子培養物(seedculture)，使用1mlYYL#8-2的冷凍原液接種50mlYPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)，然后在劇烈搖動中30℃下培養2天。50ml培養物中的30ml用作第一種子培養物，用以接種大約600ml第二種子培養物。在整個發酵過程中，發酵罐中的DO水平維持在25％以上。發酵罐中的pH值在生長階段控制在3.5，甲醇誘導階段控制在7.0。溫度在生長階段設置為28℃，在甲醇誘導階段設置為15～25℃。在甲醇誘導過程中，酪蛋白氨基酸溶液(20％)以20ml/h的流速持續添加，或者在甲醇誘導的前2個小時內，以泵的最大流速添加。在甲醇誘導溫度為23℃時，二價免疫毒素的表達水平高于其他4批發酵。然而，其表達水平與當前表達菌株pJHW#2相近。表1總結了5批發酵的結果。表1各批發酵結果1甲醇誘導開始時，根據培養物中的甲醇濃度，添加50mlPMSF溶液(每50ml甲醇3.484g)。添加PMSF溶液結束后，每1升甲醇含12mlPTM1鹽溶液的甲醇溶液被替換。2甲醇誘導開始時，注入15mlPMSF溶液(每15ml甲醇1.742g)。根據甲醇濃度添加甲醇溶液(20mMPMSF和12mlPTM1鹽溶液/升甲醇)。3甲醇誘導開始時，以泵的最大流速添加10％酪蛋白氨基酸溶液。4以20ml/小時的泵流速持續添加20％酪蛋白氨基酸溶液。5以20ml/小時的泵流速持續添加15％酪蛋白氨基酸溶液。6未測量在這些條件下，在42小時的甲醇誘導中，二價免疫毒素的野生型表達菌株pJHW#2的最大產量為27.5mg/L，總產量為286.0mg。誘導時間在42小時以上，該水平也不會隨之提高。然而，在pJHW#2所采用的條件下，甲醇誘導后EF-2突變菌株YYL8-2的產量持續增長達94小時，盡管最初的10L培養基被甲醇和10％酪蛋白氨基酸溶液逐漸稀釋成13.4L(見第5批)。第5批二價免疫毒素總量為435.5mg(32mg/L)。這要高出pJHW#2的最大產量的1.46倍。這兩個菌株二價免疫毒素產量的差異反映在如圖11所示的甲醇消耗率上。實施例9現有的二價免疫毒素的純化方法。巴斯德畢赤酵母上清液中含有與A-dmDT390-bisFv競爭結合陰離子交換樹脂的物質。另外，若將毒素部分暴露于6.5以下的pH值環境，疏水殘基一定會展開。因而采用使用Butyl-650M(TosoHaas)的疏水作用色譜步驟。該樹脂優先結合單聚體A-dmDT390-bisFv而非二聚體形式，后者的生物活性大大降低。該捕捉步驟同時濃縮了巴斯德畢赤酵母糖蛋白，這些糖蛋白在SDS凝膠上顯示為～40kD的擴散帶，但在分子排阻色譜條件下與A-dmDT390-bisFv具有相同的流動性。該物質可通過優先結合ConA瓊脂糖(Pharmacia)而除去。Superdex(Pharmacia)分子排阻步驟可除去前面捕捉步驟中未濾掉的任何A-dmDT390-bisFv二聚體。當發酵條件使得A-dmDT390-bisFv單體含量為85％時，總產率為45％。純化A-dmDT390-bisFv的過程如下所述1.Butyl-650M疏水作用色譜●柱床體積600ml(柱直徑10cm)●流速50～70cm/小時●樣本制備加入固體硫酸鈉和1M的Tris緩沖液(pH8.0)，至終濃度分別為0.5M和20mM。●樣本體積通常10L●結合緩沖液500mMNa2SO4，1mMEDTA，20mMTris緩沖液(pH8.0)●洗脫緩沖液5％甘油，1mMEDTA，20mMTris緩沖液(pH8.0)●過程○使用結合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上○使用5倍柱床體積的結合緩沖液洗滌○使用6倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫○根據廠商說明書使柱再生●洗脫組分體積3600ml2.滲濾●膜超過濾螺旋纏繞(Amiconspiral-wound)膜(30Kd)型號(model)S3Y30(0.23m2)●樣本從捕捉步驟中洗脫的組分●滲濾緩沖液5％甘油，1mMEDTA，20mMTris緩沖液(pH8.0)●用于滲濾的緩沖液體積6倍樣本體積●壓力7psi●終體積大約2L3.Poros50HQ離子交換色譜●柱床體積40ml(柱直徑2.6cm)●流速1ml/min●樣本經滲濾的樣本(通常為2L)●結合緩沖液5％甘油，20mMTris緩沖液(pH8.0)●洗脫結合緩沖液中的0～500mMNaCl梯度(10倍的柱床體積)●過程○使用結合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上○使用3倍柱床體積的結合緩沖液洗滌，并開始收集每個組分20ml○使用10倍柱床體積的0～500mMNaCl梯度洗脫○根據廠商說明書使柱再生●組分大小20ml4.ConA親和色譜●樣本來自PorosIEX的、含有A-dmDT390-bisFv的洗脫組分90～120ml●柱床體積裝于2.5cm×20cm柱中的60ml樹脂●結合緩沖液5％甘油，20mMTris緩沖液(pH8.0)●流速重力作用下●過程○使用結合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上，并開始收集每個組分10ml○每個組分中加0.5MEDTA至終濃度為1mM○使用5倍柱床體積結合緩沖液洗柱○根據廠商說明書使柱再生5.Superdex200prep分級凝膠過濾●樣本來自ConA親和步驟的、含A-dmDT390-bisFv的50ml匯集的組分●樣本制備加入5MNaCl至終濃度為200mM●柱床體積970mlSuperdex200樹脂，裝于5cm×60cm柱中●緩沖液200mMNaCl，1mMEDTA，20mMTris-Cl(pH8.0)以及5％甘油●流速1ml/min●過程○使用結合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上，并開始收集每個組分20ml○使用1倍柱床體積的緩沖液洗脫柱○根據廠商說明書使柱再生該方法從調節觀點來看很困難，因為ConA有毒，可從柱基質中浸出。與之相比，本發明方法(見實施例16和實施例38〔Gibson重新編號？〕)使用硼酸鹽除去糖蛋白。硼酸鹽與糖蛋白的vicyl羥基結合，使之帶有負電荷，因而使糖蛋白與陰離子交換柱緊密結合。然而，由于rIT沒有糖類基團，可被硼酸鹽洗脫。實施例10構建表達載體pPGAP-Arg和pPGAP-His。已經鑒別出巴斯德畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子(PGAP)，并用于在巴斯德畢赤酵母中進行異源蛋白的表達(Waterhametal.，1997)。PGAP是強組成型啟動子。據報道，葡萄糖培養的巴斯德畢赤酵母在PGAP調控下的蛋白表達水平比通常的甲醇培養的細胞利用PAOX1調控下的要高(Waterhametal.，1997；Dringetal.，1998)。在異源蛋白表達中使用組成型啟動子的缺點是它們不適于對表達宿主有毒的蛋白。既然巴斯德畢赤酵母EF-2突變體具有胞質溶膠表達DTA的抗性，這些突變體應該可以在其細胞中組成型表達基于DT或PE的免疫毒素。因而，使用PGAP在巴斯德畢赤酵母中驅動A-dmDT390-bisFv的表達，以期PGAP可提高蛋白的表達水平。通過使用PGAP替換pBLARG-A-dmDT390-bisFv中的AOX1啟動子來制備pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv構建體(圖9b)。首先，使用含PGAP5′和3′端序列的引物，通過PCR從表達載體pGAPZA(Invitrogen)中擴增PGAP。5′和3′端引物分別加上NheI和HindIII。使用NheI和HindIII消化后，將PGAP的PCR產物插入pBLARG-A-dmDT390-bisFv中，該載體已經使用這兩種限制酶切割除去了AOX1啟動子。通過將來自質粒pPIC9K(Invitrogen)和pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv的DNA片段連接，制備出構建體pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv(圖9c)。質粒pPIC9K通過NotI使用Klenow片段填充后，首先使用SfuI切割，然后使用瓊脂糖凝膠電泳分離這些DNA片段。分離出含卡那霉素抗性基因、HIS4基因和3′AOX1轉錄終止(TT)的5.1kbp的片段，并將其與質粒DNApPGAPArg-A-dmDT390-bisFv連接，后者已經使用Not1和ScaI消化除去了3′AOX1TT和ARG4基因。實施例11在PGAP的調控下表達二價免疫毒素。如同在AOX1啟動子調控下表達進行的操作一樣，通過使用構建體pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv轉化mutEF2JC307-8來獲得單拷貝克隆；通過使用pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv和pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv轉化mutEF2JC303-5來獲得雙拷貝克隆。這次雙拷貝克隆通過兩步構建。首先，在篩選和蛋白表達分析之后，使用pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv轉化mutEF2JC303-5。然后使用pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv轉化表達完整免疫毒素水平最高的克隆。小規模蛋白表達通過以下步驟進行將單一菌落接種至2mlYPD，過夜生長后，細胞接種于2ml表達培養基，并使其OD600nm＝0.5，然后在28℃下培育24小時，取培養上清液分析表達免疫毒素的情況。該表達培養基與在PAOX1調控下表達免疫毒素所用的BMMYC相似，只是它不含0.5％甲醇，而是含有2％葡萄糖。SDS-PAGE電泳分析表明，在2拷貝克隆培養上清液中，所積累的完整蛋白略高于1拷貝克隆。2拷貝克隆之一(Pgap2-9)始終可產生每ml培養基10至15μg的完整蛋白。對培養上清液和提取細胞沉淀(extractcellpellet)的蛋白質印跡分析的結果，與PAOX1調控下的表達一致。在搖瓶培養中，PGAP調控下的二價免疫毒素的產量略高于PAOX1調控下的產量。由于發酵可使細胞生長至極高密度，所以當使用發酵罐生產時，PGAP調控下的產量提高可能會更加顯著。PGAP調控表達的另一個優點是生產過程簡化，時間縮短。它無需在表達培養基中添加和保持一定水平的甲醇。整個生產過程大約40小時，而PAOX1調控下的表達需要72小時以上。實施例12酵母菌株和菌株保持為了優化發酵條件，使用基因工程改造的巴斯德畢赤酵母菌株JW102(原名為pJHW#2)，它是為了生產二價免疫毒素而產生于宿主菌株GS115(Invitrogen，Carlsbad，CA)(Wooetal.，2002)。AOX1(醇氧化酶1)啟動子在甲醇誘導過程中調控免疫毒素的表達。該基因產物由α-前原前導序列分泌。為了比較發酵罐中的生長曲線和發酵參數，使用X-33和JW103(MutS)或mutEF2JC307-8(2)，以及其他地方。表2本研究中所用巴斯德畢赤酵母菌株*JW102和JW103分別重命名自pJHW#2和pJHW#3(Wooetal.，2002)可表達二價免疫毒素的菌株JW102遺傳上非常穩定。在YPD板(1％酵母提取物，2％細菌用蛋白胨，2％葡萄糖和2％瓊脂)上傳代培養該菌株60代以上，該菌株仍然可以表達二價免疫毒素。將極早期分離的菌落分散于YPD液體培養基(1％酵母提取物，2％細菌用蛋白胨，2％葡萄糖)中，然后在-80℃下保存為冷凍原液。冷凍原液通過將培育2天的培養物與等體積的25％(v/v)甘油混合來制備，并將1ml這種混合物裝入2ml的冷凍瓶(Cryovial)中。實施例13發酵。使用帶有甲醇傳感器和控制器(RavenBiotechnologyCompany，Canada)的BioFlo4500發酵罐(NewBrunswickScientificCompany，Esison，NJ)，其中傳感器和控制器可在誘導過程中維持甲醇含量在0.15％(v/v)。該發酵罐連接有運行基于AFS-BioCommandWindows的軟件(NewBrunswickScientificCompany)的計算機，它可使所有參數均由程序化過程控制。基礎起始發酵培養基(10升)包括2％(20g/L)酵母提取物，2％(20g/L)大豆蛋白胨(Difco)，4％(40g/L)甘油，1.34％(13.4g/L)含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，0.43％(4.3ml/L)PTM1鹽溶液以及0.02％(v/v)消泡劑289(SigmaCo.)。PTM1鹽溶液(Invitrogen)包括24.0mM(6g/L)藍礬(CuSO4·5H2O)、0.534mM(80mg/L)碘化鈉(NaI)、17.8mM(338.6mg/L)硫酸錳(MnSO4·5H2O)、0.827mM(200mg/L)鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)、0.323mM(20mg/L)硼酸(H3BO3)、2.1mM(500mg/L)氯化鈷(CoCl2·6H2O)、過過濾器循環約10分鐘之后顯現為透明的，將樣品取出和檢查肥皂(參見表11)。將濾液收集入5-加侖容器并貯存用于進一步的分析。表11用MAGNESOLR60處理大豆生物柴油黃油脂甲酯為確定適當的處理水平，在實驗室采用2wt％(4g)MAGNESOLR60在160下處理200g生物柴油樣品。在處理之前和之后測試肥皂和閃點(參見下表12)。表12初始黃油脂生物柴油實驗室測試將15加侖從黃油脂原料制備的甲酯(未水洗滌的)泵送入混合罐以由MAGNESOLR60處理。收集一加侖樣品。將剩余14加侖采用MAGNESOL在170下處理10分鐘并隨后開始過濾和再循環約20分鐘(表13)。將生物柴油收集入5-加侖容器用于進一步的分析。表13用MAGNESOLR60處理黃油脂生物柴油IV生物柴油樣品的分析測試將收集的生物柴油樣品標記如下S1＝未洗滌、未處理的大豆生物柴油S2＝洗滌和干燥的大豆生物柴油S3＝1％MAGNESOLR60處理的大豆生物柴油Y1＝未洗滌、未處理的黃油脂生物柴油Y2＝洗滌和干燥的黃油脂生物柴油Y3＝2％MAGNESOLR60處理的黃油脂生物柴油實施例14測定濕細胞密度(％，w/v)以監測細胞生長。將1ml培養物樣本放入配衡的(tared)1.5毫升微量離心管中，在20,800×g、25℃下離心30分鐘。使用吸量管除去上清液，使用濾紙吸干管內殘留液體。稱量含細胞沉淀物的管，計算濕細胞密度(％，w/v)。實施例15純化。已經開發了可調整規模的3步純化二價免疫毒素的方法，該方法利用硼酸鹽陰離子交換色譜除去宿主糖蛋白雜質。純化過程使用1L離心上清液進行。無需采用滲析或滲濾步驟。簡單地說，1L上清液與28.4g固體Na2SO4混合，加于100mlbutyl-650M的柱床上，在使用200mlNa2SO4洗滌之后，使用5％甘油、20mMtris和1mMEDTA，pH8.0洗脫。600ml洗脫劑使用4.2LTE緩沖液(20mMtris，1mMEDTA，pH8.0)稀釋，并加于40mlPoros50HQ的柱床上。二價免疫毒素在25～100mM的硼酸鈉緩沖液步驟中洗脫，然后糖蛋白和一些高度聚集的免疫毒素使用1MNaCl洗脫。1.2L硼酸鹽洗脫劑使用3.6LTE緩沖液稀釋，并加于5ml預先裝好的Hi-trapQ柱床上。洗滌后，二價免疫毒素使用0～400mMNaCl梯度洗脫。Butyl-650M疏水作用色譜(HIC)將大約100mlButyl-650M樹脂(TosohBiosepLLC)裝于5cm×20cm的XK柱(AmershamPharmaciaBiotech)中，該柱使用含200mMNa2SO4、1mMEDTA、20mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)的緩沖液A平衡。將固體硫酸鈉和1MTris-Cl緩沖液(pH8.0)加入1升上清液中，至終濃度分別為200mM和20mM。在裝載樣本前，將樣本使用802槽狀濾紙(＞15um粒子駐留WhatmanInc.；Clifton，NJ，USA)過濾。流速為44cm/小時(14.4ml/min)。平衡柱之后，將1L制備的樣本加于柱上，然后使用6倍柱體積的結合緩沖液A洗滌。與Butyl-650M樹脂相結合的蛋白使用6倍柱體積的含5％甘油、1mMEDTA、20mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)的緩沖液B洗脫。將洗脫的含有免疫毒素的組分匯集以備下一步使用(體積～600ml)。每輪操作之后，根據廠商說明書使柱再生。除了第一步在室溫下進行外，所有步驟均在冷室中進行。Poros50HQ陰離子交換色譜(AEX)，使用硼酸鈉緩沖液逐步洗脫大約40mlPoros50HQ樹脂(PerSeptiveBiosystems)裝于2.6cm×20cm的XK柱(AmershamPharmaciaBiotech)中，然后將柱使用緩沖液B平衡。前面步驟中匯集的樣本使用4.2LTE緩沖液(20mMtris-Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗脫。洗脫的樣本以80.2cm/小時(7.08ml/min)的流速加于柱上，該柱然后使用6倍柱體積的緩沖液B洗滌。結合的蛋白使用溶于緩沖液B中的硼酸鈉25mM、50mM、75mM和100mM幾步洗脫(每步中使用10倍柱體積)。將這些洗脫的組分匯集以備下一步使用。與樹脂相結合的殘余蛋白使用6倍柱體積的溶于緩沖液B中的1MNaCl溶液除去。每輪操作之后，柱使用0.5MNaOH溶液洗滌，然后使用不含5％甘油的緩沖液B重新平衡以備下次使用。Hi-trapQ陰離子交換色譜從AmershamPharmaciaBiotech購得預先填充的Hi-trapQ陰離子交換柱(5ml)。上一步中匯集的樣本使用3.6LTE緩沖液稀釋。樣本以221.5cm/小時(7.08ml/min)的流速加于用緩沖液B平衡過的柱上。該柱使用5倍柱體積的緩沖液B洗滌。結合的免疫毒素使用溶于緩沖液B的0～400mMNaCl線性梯度洗脫(20倍柱體積)。洗滌和洗脫步驟中的流速為2ml/min，組分大小為5ml。實施例16測定上清液中的蛋白酶活性。將無切口的(unnicked)CRM9(白喉毒素(7)的識別結構域中有單點突變)用作測量絲氨酸蛋白酶活性的底物，其在上清液中的終濃度為225μg/ml。上清液在28℃、250rpm(軌道直徑1.9cm)的搖動下培育20h，然后在還原劑(100mM二硫蘇糖醇)的存在下加于4-20％tris-甘氨酸預制的SDS-PAGE凝膠中。CRM9包含完全暴露的furin/Kex-2切割位點，該位點位于由二硫鍵連接的A片段(22kDa)和B片段(40kDa)之間。培養基中的蛋白酶活性通過在還原條件下無切口的CRM9的減少來測定，無切口的CRM9的譜帶強度通過在考馬斯染色的凝膠上進行密度測定(densitometry)來定量測定。實施例17SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析。培養上清液中的蛋白在非還原性和/或還原性條件下，使用tris-甘氨酸4～20％預制凝膠(Invitrogen)進行SDS-PAGE電泳。為進行蛋白質印跡分析，將分離的蛋白通過電印跡轉移至硝酸纖維素膜上。使用溶于TBST緩沖液(50mMTris-HCl、pH7.5、150mMNaCl和0.1％TWEEN20)的5％脫脂牛奶阻斷非特異性結合。針對白喉毒素的羊多克隆抗體(Thompsonetal.，1995)以1∶2000稀釋后用作一次抗體，堿性磷酸酶綴合的兔抗羊IgG(RocheMolecularBiochemicals)以1∶5000稀釋后用作二次抗體。使用一步NBT/BCIP底物(PierceChemicalCompany)使免疫毒素完全可見。或者，由于二價免疫毒素包含三個(G4S)3接頭，將針對(G4S)3接頭的兔多克隆抗體用作一次抗體，檢測完整免疫毒素及降解產物。該抗體針對氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO17)的合成肽制備。實施例18細胞毒性測試。按所述方法(Nevilleetal.，1992)對巴斯德畢赤酵母表達的抗人抗CD3免疫毒素進行特異性細胞毒性測量實驗。簡單地說，將免疫毒素加于位于96孔板上不含亮氨酸的RPMI1640培養基中的Jurkat細胞中，即人CD3∈+T細胞白血病株(5×104細胞/孔)。20小時后，供給1小時脈沖(pulse)[3H]亮氨酸。然后使用細胞采集器將細胞收集到過濾器上。加入閃爍體后，在Beckman閃爍計數器中使用標準的液體閃爍計數技術對樣本進行計數。實施例19測定細胞存活力。為了測定采自發酵不同時間點的培養物的細胞存活力，對Ormerod的方法進行修改(Ormerod，2000)。使用醋酸熒光素(FDA)和碘化丙啶(PI)作為細胞存活力的活體染料。巴斯德畢赤酵母吸收的FDA被細胞內酯酶轉化成熒光素。如果細胞具有完整的質膜，就會保留熒光素而將PI排斥在外。簡單地說，溶于PBS緩沖液的106細胞/ml的巴斯德畢赤酵母細胞懸液500μl，與50μlFDA溶液(10μg/ml)和50μlPI溶液(100μg/ml)混合。室溫下培育10分鐘，通過流式細胞儀分析樣本的存活力。活細胞的門電極(gate)包括綠色熒光而沒有紅色熒光。實施例20二價免疫毒素濃度的定量測定。從AmershamPharmaciaBiotech購得Superdex20010/300GL預填充柱(尺寸1.0cm×30cm)。將該柱連接HPLC系統(GBCScientificEquipement；ArlingtonHeights，IL，USA)。凝膠過濾緩沖液由90mM硫酸鈉(Na2SO4)、10mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)和1mMEDTA(pH8.0)組成。流速為0.5ml/min，注入體積為500μl。已知濃度的純化免疫毒素基于UV吸光度(25)用作標準樣本。對上清液或液體樣本中的二價免疫毒素的定量測定，通過將考馬斯染色的4-20％預制SDS凝膠的強度與已知濃度的免疫毒素標準樣本的強度比較而確定。實施例21通過AOX1活性降低來證實巴斯德畢赤酵母表達過程中的免疫毒素毒性。二價免疫毒素在巴斯德畢赤酵母中通過分泌途徑表達。巴斯德畢赤酵母中這種分泌二價免疫毒素可顯著減弱免疫毒素的毒性(Wooetal.，2002)，但是在發酵培養的甲醇誘導過程中，二價免疫毒素的表達降低了甲醇利用的代謝能力，并導致生長減緩。在巴斯德畢赤酵母的甲醇代謝中，醇氧化酶(AOX1)催化的甲醇氧化是限速反應步驟(Veenhuisetal.，1983)，AOX1基因產物的量決定了甲醇代謝的速率。AOX1可占到利用甲醇的巴斯德畢赤酵母細胞中蛋白總量的30％。因而，甲醇誘導過程中甲醇消耗速率的量值反映出AOX1水平，并可顯示出二價免疫毒素的表達如何影響巴斯德畢赤酵母中AOX1的蛋白合成和降解。為此，比較野生型宿主菌株X-33和JW102菌株在發酵罐培養中的甲醇消耗速率曲線，其中JW102菌株通過分泌途徑表達二價免疫毒素。在甲醇誘導過程中使用酪蛋白氨基酸添加物的發酵條件下，X-33在25℃下甲醇消耗的最大值為1.95ml/min，并在整個甲醇誘導階段，消耗速率一直保持在最大速率的70％以上(圖11)。對于免疫毒素表達菌株JW102(Mut+)，在23℃時的甲醇最大消耗速率大約為1.10ml/min。甲醇誘導開始后7～8小時達到峰值，隨后消耗速率逐漸降到最大速率的20％。甲醇誘導的前18小時內，甲醇消耗速率降至甲醇最大消耗速率的50％以下(圖11)。這種低水平的甲醇消耗是與低水平的濕細胞密度增長(44小時時，JW102為2％，X-33為10.5％)相關聯的(圖14)。實施例22在甲醇誘導階段使用PMSF和酪蛋白氨基酸或酵母提取物發酵優化的第一步中，在甲醇誘導過程中補充PMSF和酪蛋白氨基酸對于提高發酵罐中的表達水平極為重要。甲醇誘導過程中如果缺少這兩種組分，二價免疫毒素的表達水平在甲醇誘導開始后7小時達到最大值，然后開始下降。然而，如果在甲醇誘導過程中補充這兩種組分，可將最佳誘導時間從甲醇誘導開始后的7～8小時延長至24～48小時。另外，表達水平提高至2倍。為了避免使用動物來源的材料，使用酵母提取物代替酪蛋白氨基酸。這種替換導致表達水平和濕細胞密度分別有30％和45％的較大增長。在甲醇誘導過程中，通過持續添加酵母提取物，所得JW102的濕細胞密度與X-33接近(圖14)。這些提高是由于甲醇消耗速率穩定保持在最大速率的80％以上(圖11)。本文所公開的最終表達方法的一個實例(見實施例41)，使用毒素抗性EF-2突變體，誘導過程中甲醇添加量限制為0.5至0.75ml/min(每10L初始培養基)而不另加碳源，誘導時間延長至163h，溫度15℃，持續注入酵母提取物，攪拌速度限制為400RPM，添加消泡劑至0.07％，以及DO水平降至40％以下時補充氧氣。在此條件下無需PMSF和酪蛋白氨基酸。酪蛋白氨基酸為動物產物，會影響FDA的效果。PMSF是有助于防止產物降解的蛋白酶抑制劑，它有毒，需要提供另外的證明文件以證明它不存在于最終產品中，因而這些變換有助于獲得管理部門的批準。使用該方法的產量是120mg/L(見實施例41)。實施例23在甲醇誘導過程中使用甲醇/甘油混合添加物。二價免疫毒素的表達水平與甲醇誘導前44小時內獲得的濕細胞密度呈正相關。在低產量培養物中，所獲得的濕細胞密度小于6.0％。然而，在二價免疫毒素的產量高于25mg/L的發酵批次中，在甲醇誘導前44小時內所獲得的濕細胞密度(％)平均為9.26％(圖14)。如果不持續添加甘油作為另外的碳源，則在甲醇誘導過程中很難獲得較高的濕細胞密度。因而在甲醇誘導過程中，使用甲醇/甘油(4∶1)混合添加物支持細胞生長。野生型菌株X-33不產生免疫毒素(圖21A)，用作監控甲醇消耗和細胞生長的對照。該菌株在25℃時具有1.95ml/min的最大甲醇消耗量。在整個甲醇誘導階段，消耗速率保持在最大速率的＞70％(圖21A)。在44h的甲醇誘導過程中，濕細胞密度持續增長。DT抗性、產生免疫毒素的EF-2突變型菌株mutEF2JC307-8(2)用作另一個對照，以比較分泌免疫毒素時的甲醇消耗和細胞生長。在誘導過程中，該EF-2突變型菌株具有與野生型菌株X-33相似的甲醇消耗和濕細胞生長曲線(圖21A)。在44h的甲醇誘導過程中，甲醇最大消耗速率和濕細胞收獲物分別為2.2ml/min和9.17％。然而，在JW102菌株可產生免疫毒素的發酵條件下，使用EF-2突變體不會提高免疫毒素的分泌量。對于菌株JW102來說，25℃時的甲醇最大消耗速率為1.30ml/min。甲醇誘導開始后7～8小時達到高峰，此后在甲醇誘導44h時消耗速率降到最大速率的15％。在甲醇誘導的前22h內，甲醇消耗速率降至甲醇最大消耗速率的＜50％(圖21B)。這種低水平的甲醇消耗量導致JW012的濕細胞密度(2.0％)比X-33(10.5％)增長緩慢(圖21A和21B)。在甲醇誘導的前22h后濕細胞密度增長很少或沒有增長，免疫毒素的分泌水平從15mg/L降至10mg/L。免疫毒素分解產物在用于監測產物穩定性的SDS凝膠上檢測不到。實施例24添加酵母提取物，甲醇消耗和免疫毒素生產。與免疫毒素的產生相關的甲醇消耗量減少和細胞生長速率變慢，可能是由于免疫毒素對巴斯德畢赤酵母的毒性作用。如果持續添加酵母提取物至生物反應器中，并且使用甲醇作為唯一碳源(圖21C)，則甲醇消耗峰值低于野生型菌株和EF-2突變型菌株(圖21A)，但在10h后停止下降，細胞生長在整個誘導階段保持增長。這種增長反應與8h后培養基中缺少免疫毒素相耦合，顯示了蛋白酶活性。誘導后4h即存在免疫毒素片段，一直到誘導后19h均檢測不到完整免疫毒素(圖22A)。如果從不同時間點收集培養基，并與純化的免疫毒素一起培育，那么形成的免疫毒素片段的量要取決于培養基的時間長短(圖22B)。例如，在誘導后49h，與較早時間點的樣本相比，完整免疫毒素譜帶大大減小，代表降解片段的36.5kDa的譜帶顯著增加。通過添加酵母提取物所改善的甲醇利用量的減少(圖21C)，其效果顯然次于隨著EF-2的ADP核糖基化由免疫毒素導致的蛋白合成抑制。這可由以下事實說明可產生免疫毒素且其EF-2基因(13)被改造成毒素抗性的巴斯德畢赤酵母菌株，與野生型菌株消耗甲醇的速率相等(圖21和圖21圖例)。在毒素敏感型菌株中，如果免疫毒素能夠進入EF-2所在的胞質溶膠區室，就會發生蛋白合成抑制。兩種不同的機制可產生這種效果。一種機制是翻譯后易位，這種情況下，整個免疫毒素在翻譯后進入Sec61易位子(16)。這將為EF-2的ADP核糖基化提供短暫的時機。當信號肽為α-交配因子時，通常會發生翻譯后易位，這里正是這種情況(24)。另一機制為資料較多的質子介導的催化結構域跨內膜區室(2)易位。這在輕度酸性的高爾基區室或較強酸性的液泡中均可發生。無論哪種免疫毒素易位機制占主導，酵母提取物添加物要么干擾此步驟，要么干擾隨后的EF-2ADP核糖基化，后者直接進行或者通過減弱易位的毒素A鏈的催化活性進行。實施例25向帶有酵母提取物添加物的甲醇添加物中加入甘油。當甲醇為唯一碳源時所觀察到的蛋白酶活性可能是從死亡或受傷細胞中泄漏所致。當使用4∶1甲醇∶甘油添加物(圖21D)代替純甲醇(圖21C)時，培養基中的免疫毒素水平在44h時上升至20mg/L。此時在SDS凝膠中只檢測到微量的培養基中的蛋白的降解產物(圖23，最右側一組)。沒有酵母提取物的甲醇-甘油混合添加物不能維持甲醇消耗或細胞質量的持續增長，最終免疫毒素產量達15mg/L(圖21E)。盡管持續添加酵母提取物可較好地改善甲醇代謝降低的情況，但免疫毒素產量較低，出現較多的蛋白酶解(圖21C和22)。這種較多的蛋白酶解可通過補充4∶1甲醇∶甘油混合添加物形式的碳來逆轉(圖21D和圖23，23℃組)，這樣可提高免疫毒素產量至20mg/L。據報道，在巴斯德畢赤酵母甲醇投料培養過程中，有最理想的最大特定生長速率，當超過此速率時反而會抑制異源蛋白的產生(27)。以最適速率添加甲醇，并且以最大甘油生長速率的20％的速率添加甘油，可使異源蛋白的產量提高50％(27)。這種增長可能由甲醛和H2O2的代謝增加，以及過氧化氫酶和AOX的活性提高所致。在分泌型蛋白的情況下，這些代謝變化還可減少分泌的蛋白酶的量，以及減少泄漏蛋白酶解酶的死亡或受傷細胞的數量。實施例26低溫與二價免疫毒素的分泌。通過增強在ER中的蛋白折疊和/或通過減弱培養基蛋白酶活性，低溫可提高巴斯德畢赤酵母中異源蛋白表達的產量(9)。在15℃下44h時，甲醛消耗減少25％，然而細胞生長保持不變(圖15C)。免疫毒素產量在44h時提高50％(30±0mg/L，n＝3)在67h時提高幾乎100％(37±2.9mg/L，n＝3)。免疫毒素分泌量提高多數發生于20～15℃之間。在17.5℃觀察到最高表達水平(圖15A)，但經過免疫毒素的3步純化步驟所獲得的最終產量在15℃時最高(圖15B)，在44和67h時分別為平均13.8±1mg/L(n＝3)和16.0±1mg/L(n＝3)。在15℃時產生的純化免疫毒素具有完全功能，這通過在蛋白合成分析中測定特異性T細胞的細胞毒性來確定，該實驗中三個單獨的生產批次的IC50值為1.2(±0.1)×10-13M，與之相比，搖瓶培養的三個批次平均為2×10-13M。從生物反應器上清液(全部持續加入10mMPMSF添加物)中在SDS凝膠上觀察到的降解的免疫毒素譜帶的量，從23℃時的中等水平減少到15℃時的不可檢測水平(圖23)。采用突變型白喉毒素(CRM9)底物對絲氨酸Kex-2樣蛋白酶進行敏感性測試，蛋白酶活性在15℃下67h時不可檢測，但是當不加入PMSF時在67h時可檢測到活性(圖24)。在15℃下不論是否加入PMSF，凝膠譜帶和免疫毒素產量均相同。來自甲醇-甘油混合添加物加上酵母提取物培養基的15℃生物反應器樣本使用流式細胞儀分析細胞存活力，具有低水平的死亡細胞甘油投料階段0.7±0.22％(置信限99％)；甘油-甲醇混合添加物，在22h時為1.2±0.58％(置信限99％)，在44h時為1.7±0.61％(置信限99％)，在67h時為1.1±0.51％(置信限99％)(死亡細胞比例從一個發酵批次中測定)。在甲醇誘導的所有時間點，顯示細胞內酯酶活性的活細胞占細胞總數的96％以上。使誘導溫度從23～25℃降低到15℃，可將免疫毒素水平進一步提高到44h時的30mg/L和67h時的37mg/L(圖21F)。低誘導溫度與誘導過程中低且恒定的死亡細胞水平(＜2.0％)相聯系，并且減弱了蛋白酶對生物反應器內免疫毒素的活性，盡管通過靈敏的實驗可檢測到少量蛋白酶活性(圖23和24)。這些結果與利用限制溫度(12℃)投料技術的研究相一致(9)。在限制溫度投料技術中，與30℃下限制甲醇投料工藝相比，44h時死亡細胞從9％減少到＜1％。死亡細胞的減少與降解產物(脂肪酶)的顯著減少和最后時間點完整產物的2倍增加相聯系。這些變化有助于避免在高細胞密度下缺乏氧氣。在限制溫度投料技術中，在67h時AOX活性提高2倍以上。低誘導溫度下，通過減慢總蛋白合成速率，平衡通過分泌途徑的免疫毒素輸入和輸出，還可導致免疫毒素分泌增加。在異源蛋白的表達和分泌中，每種蛋白似乎都有最佳分泌水平。超過最佳水平的表達(過表達)可減少分泌蛋白的產量(1，11，13，15)。二價免疫毒素因為其多結構域的結構，還需要更長的正確折疊處理時間，它在大腸桿菌中表達后經過體外重新折疊具有低活性(25)。在從23℃變為15℃時，甲醇消耗速率只減少了25％，在44h時細胞生長速率保持不變。實施例27巴斯德畢赤酵母生產二價免疫毒素的天然培養基。為了在發酵罐中獲得合理范圍的二價免疫毒素表達水平，需要在初始發酵培養基中使用天然培養基。在初始發酵批次中，當使用標準合成培養基時，觀察到發酵罐中二價免疫毒素的產量極低。因此開發了基于大豆蛋白胨和酵母提取物的培養基，包括4％甘油，2％酵母提取物，2％大豆蛋白胨，1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，0.43％PTM1溶液，以及0.01％消泡劑289。實施例28Mut+與MutS表型測試來自于巴斯德畢赤酵母GS115(Mut+)和KM71(MutS)的不同Mut(甲醇利用)表型菌株，比較它們在發酵罐中的二價免疫毒素表達水平。在發酵罐中，MutS表型菌株具有優勢，如易于控制誘導溫度，無需供給純氧，以及對高濃度甲醇的抗性。盡管這兩種不同表型菌株在試管培養時表達水平沒有差異，但在發酵罐中Mut+菌株的表達水平要高出MutS菌株的5～7倍。實施例29pH變換工藝減少了上清液中的污染蛋白。搖瓶培養和發酵罐培養在表達二價免疫毒素方面有較大差別。在搖瓶培養中，可使用新鮮誘導培養基替換原培養基，可除去在生長階段細胞裂解產生的細胞膜片段、DNA和蛋白酶，以及巴斯德畢赤酵母分泌的蛋白。然而，這些分子在發酵的整個過程中不斷積累，在純化步驟中常會出現問題。為了在發酵罐中減少此類問題，采用pH變換工藝。巴斯德畢赤酵母可在pH3～7的范圍內正常生長。在甘油分批階段和甘油補料分批階段，巴斯德畢赤酵母在低pH值(如pH3.5)下培養，并且在pH7.0下誘導以產生二價免疫毒素。pH變換工藝使上清液中充滿大量二價免疫毒素，因為在低pH值下巴斯德畢赤酵母分泌蛋白的量顯著減少，而二價免疫毒素的表達水平卻不受影響。實施例30使用葡萄糖嚴格控制AOX1啟動子。一般來說，為了在宿主細胞中獲得毒素蛋白，需要嚴格的基因控制。表達二價免疫毒素對巴斯德畢赤酵母產生毒害。由于在使用甘油作為碳源的情況下AOX1啟動子不能嚴格控制基因表達，所以在甲醇誘導之前即可在考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠上觀察到二價免疫毒素。為進行嚴格的基因控制，將甘油補料分批階段替換為葡萄糖補料分批階段，因為葡萄糖抑制AOX1驅動的基因表達(Tschoppetal.，1987)。然而，在補料分批階段中使用葡萄糖替換甘油不會改變二價免疫毒素的最終表達水平。在補料分批階段使用甘油是因為葡萄糖在高濃度下溶解要花費一定時間。當與甘油補料分批階段結合時，pH變換工藝可阻止在甘油補料分批過程中在考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠上出現二價免疫毒素。實施例31表達二價免疫毒素的最適pH值為了測定表達二價免疫毒素的最適pH值，試管培養的表達菌株JW102在pH3.5到8.0的范圍內誘導24小時，使用考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質印跡分析比較上清液中的二價免疫毒素。使用檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5～5.5)、bis-tris緩沖液(pH6.0～7.0)和tris緩沖液(pH7.5～8.0)維持培養物在設定pH值。同時，在甲醇誘導結束時用前述方法(Wooetal.，2002)測定菌落形成單位。pH6.0以下時，使用蛋白質印跡檢測不到二價免疫毒素。盡管在pH6到8范圍內，蛋白質印跡顯示它們的表達水平相近，但使用考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠表明pH7.0是表達二價免疫毒素的最適pH水平。在pH3.5至7.0范圍內，巴斯德畢赤酵母具有相似的菌落形成單位，但在pH7.4以上時菌落形成單位急劇下降。既然pH7.4是最適pH值范圍的上限，于是又在發酵罐中測定了pH6.7時的表達水平。然而，pH6.7和7.4時的表達水平沒有差異。實施例32最適發酵批次的再現性和細胞存活力。在最適發酵條件下，二價免疫毒素的表達水平在甲醇誘導67小時時增加到40mg/L(圖16)。甲醇誘導44小時和67小時時上清液中的二價免疫毒素表達水平，以及經3步純化步驟獲得的最終產量均可再現。如表4所示，在最適條件下的3個獨立的發酵批次中，所獲二價免疫毒素水平極為相似。更重要的是，它們之間純化二價免疫毒素的最終產量極為接近，說明產生的上清液中二價免疫毒素的品質相似。在最適發酵條件下，在甲醇誘導階段的細胞存活力經流式細胞儀測定保持在95％以上。表4最適發酵條件1和純化2的再現性<p>隨機挑出4個新的超級MAR并分析AT和TA二核苷酸含量，并且與前面已知的雞lysMAR進行比較，考慮100個堿基對的窗口(表6)。令人驚奇的是，申請人已經表明在100個DNA堿基對的窗口中所有的超級MAR都具有占分析的總二核苷酸超過12％的AT二核苷酸頻率和超過10％的TA二核苷酸。最有效的MAR顯示了數值約為34％的二核苷酸對。表6實驗確認的MAR的％AT和TA二核苷酸頻率的匯總6.4人類和小鼠基因組直向同源(orthologous)基因間區域的分析為了得到對于S/MAR進化的知識，已經用SMARScan分析了人和小鼠基因組的直向同源基因間區域。所使用的數據組由87對來自人與小鼠基因組的全部直向同源基因間區域構成(ShabalinaSA，OgurtsovAY，KondrashovVA，KondrashovAS，Selectiveconstraintinintergenicregionsofhumanandmousegenomes，TrendsGenet，17(7)3736，2001)(平均長度為～12000bp)，其位于12個人染色體和12個小鼠染色體上，這些序列的同線性用配對的序列比對得到確認，并且考慮到側翼基因(實驗測試或預測的)的情況。按所述方法(Nevilleetal.，1992)進行純化的抗人抗CD3免疫毒素的特異性細胞毒性測試。簡單地說，將免疫毒素加于位于96孔板上不含亮氨酸的PRMI1640培養基中的Jurkat細胞中，即人CD3∈+T細胞白血病株(5×104細胞/孔)。20小時后，供給1小時脈沖[3H]亮氨酸。然后使用Skatron采集器將細胞收集到過濾器上。加入閃爍體后，在Beckman閃爍計數器中使用標準的LSC技術對樣本進行計數。實施例35Butyl650M疏水作用色譜(Butyl650MHIC)。如圖17所示，對上清液中的免疫毒素來說，Butyl650MHIC是有效的捕捉步驟。然而，在此步驟中糖蛋白與免疫毒素一起被純化。在這些糖蛋白之中，通過過碘酸-希夫氏(periodicacidSchiff)染色，大約45kDa的糖蛋白種類(圖17箭頭所示)影響了純免疫毒素的分離。通過諸如凝膠過濾和陰離子交換色譜等常規色譜法，這些糖蛋白無法與免疫毒素分離，說明這些45kDa的糖蛋白種類以二聚體形式存在，并且具有相似的等電點。因此，這些45kDa的糖蛋白與免疫毒素在大小和等電點，以及疏水性方面非常相似。評估了各種遵循GMP(優質生產規范)的疏水性樹脂。在這些樹脂之中，Butyl650M顯示出具有最好的免疫毒素結合和洗脫曲線。本發明中可使用其他疏水性樹脂。還發現200mM的硫酸鈉是將免疫毒素結合到butyl650M樹脂的適當濃度。在發酵批次結束時，發酵罐培養物通常具有約30％的濕細胞密度。在大規模生產中，上清液通過需要對高細胞密度培養物進行3倍稀釋的持續離心獲得。稀釋的樣本中的免疫毒素的處理過程與200mM硫酸鈉下有效結合至Butyl650M樹脂的上清液中的免疫毒素相同。實施例36使用硼酸鈉緩沖液分步洗脫的Poros50HQ陰離子交換色譜。通過采用硼酸鹽陰離子交換色譜，可成功地將免疫毒素與巴斯德畢赤酵母糖蛋白分離(圖18)。通過洗脫來自前一步驟中的樣本，可使免疫毒素結合至陰離子樹脂上，簡化了純化過程。在使用50mM、75mM和100mM溶于緩沖液B的硼酸鈉洗脫的組分中(圖18中泳道9、10、11)，多數免疫毒素以單體形式存在。匯集這3個組分以備下一步使用。為了除去來自上一步的樣本中的糖蛋白種類，采用硼酸鈉陰離子交換色譜，這是因為硼酸鈉通過結合至糖蛋白的糖殘基上而使糖蛋白的負電荷增加。免疫毒素在pH8.0下結合至陰離子交換樹脂上(Wooetal.，2002)。設計預備實驗以優化硼酸鈉存在下的免疫毒素結合條件。使用緩沖液B進行滲析的樣本等分與不同體積的200mM溶于緩沖液B的硼酸鈉混合，以獲得預定的硼酸鈉濃度。然后將制備的樣本加于Poros50HQ陰離子柱(40ml)上，該柱使用含有相應濃度硼酸鈉的緩沖液B平衡。在100mM硼酸鈉濃度下，免疫毒素不與Poros50HQ陰離子樹脂結合，但是多數糖蛋白仍然結合。在50mM以下的硼酸鈉濃度下，免疫毒素與Poros50HQ陰離子樹脂結合。在將免疫毒素結合至陰離子交換柱之后，進一步使用硼酸鈉分析分步洗脫條件。首先，將使用緩沖液B滲析的樣本結合至陰離子柱，然后在濃度逐漸增加的硼酸鈉(100、120、140、200mM)和1MNaCl的步驟中洗脫。結合的免疫毒素主要在100mM硼酸鈉下洗脫，但是這些洗脫的組分還包括很多在下一步中無法分離的45kDa糖蛋白。多數糖蛋白在1MNaCl下洗脫。如第一次實驗所述裝入相同的樣本之后，結合的免疫毒素在50、75和100mM硼酸鈉和1MNaCl步驟中洗脫。多數結合的免疫毒素在75mM硼酸鈉下洗脫。然而，對應于21kDa的蛋白條帶包含于使用50mM硼酸鈉洗脫的組分之中。結合于柱上之后，結合的免疫毒素在溶于緩沖液B的25、50、75和100mM硼酸鈉和1MNaCl步驟中洗脫(圖18)。通過使用25mM硼酸鈉緩沖液洗滌，減少了對應于21kDa的蛋白條帶的量。實施例37與苯硼酸親和色譜對比。為了比較分離曲線，采用苯硼酸親和色譜法。來自butyl650MHIC捕捉步驟的洗脫劑使用低離子強度緩沖液(10mMHEPES，0.25mMEDTA和20mMMgCl2，pH8.2)滲析以備苯硼酸親和色譜使用。滲析的樣本加于5ml柱床體積的苯硼酸瓊脂糖柱(SigmaCo.)上，使用同一緩沖液洗滌，然后使用溶于相同緩沖液的0～100mM硼酸鈉梯度或0～50mM山梨糖醇梯度(20倍柱床體積)洗脫結合的蛋白。在低離子強度的結合條件下，糖蛋白和免疫毒素均可結合。糖蛋白和免疫毒素不能通過苯硼酸親和色譜分離。糖蛋白和免疫毒素被0～100mM硼酸鈉梯度或0～50mM山梨糖醇梯度共洗脫。實施例38Q陰離子交換色譜。使用Q陰離子交換色譜來濃縮從50HQ陰離子交換色譜獲得的洗脫樣本。在低于50mM的硼酸鈉濃度下，免疫毒素結合至陰離子交換樹脂上。因此，從前一步中匯集的樣本使用3倍樣本體積的TE緩沖液(20mMTris-Cl和1mMEDTA，pH8.0)稀釋，以使稀釋的樣本中的硼酸鈉在20mM以下。如預期效果一樣，免疫毒素有效結合至Q陰離子交換柱上。結合的免疫毒素使用0～400mMNaCl梯度(20倍柱體積)洗脫。匯集免疫毒素組分，然后通過SDS-PAGE電泳和蛋白合成實驗評價最終制備物的產量、純度和毒性。實施例39純化過程的蛋白產量、重復性，純化免疫毒素的純度和功能。表4總結了從3批3步純化批次中獲得的免疫毒素產率，方法是從在較為相似的發酵條件下進行的、具有相似免疫毒素表達水平的3個發酵批次中，在甲醇誘導44小時時取上清液。這批純化的平均產率為52.8％。通過使用3步純化步驟，從1升上清液中獲得大約16mg純化的物質。根據發酵批次過程中誘導時間的不同，起始上清液中含有不同水平的免疫毒素聚集體和單體免疫毒素。在這些免疫毒素聚集體之中，有一部分在Butyl650MHIC步驟中逆轉化為單體形式的免疫毒素。通過凝膠過濾和隨后的SDS-PAGE電泳分析對上清液進行分級表明，上清液中含有超過50％的免疫毒素聚集體。然而，經3步純化步驟，免疫毒素的終產率為52.8％，表明在純化過程中一部分聚集體離解為單體免疫毒素。將純化過程應用于上清液免疫毒素含量相近的3個獨立的發酵批次中，對其進行比較后證實該過程的產率有很好的重復性(表5)。純化免疫毒素的純度通過分析凝膠過濾來評估。最終制備物中的<p>表1(單位百分數)在表1中可以看出，在吸附了PEI800的表面上檢測到了N，在吸附了DNA的表面上檢測到了P。此外，在ITO中含有的In和Sn的原子組成隨著循環數的增加而降低。這些結果表明PEI800和DNA存在于ITO電極的表面上，被吸附的層的厚度隨著循環數而增加。圖13顯示了對其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO電極的表面所記錄的ATR-IR光譜。1065和1230cm-1處的兩個吸收帶被確定為DNA骨架中的磷酸基團。從圖13中可以看出，當吸附循環數增加時，這些吸收增加。在圖14中，使用這兩個吸收帶的峰面積對吸附循環數進行了作圖。峰面積隨著循環數的增加而線性增加。結果表明裝載于ITO表面上的DNA的量隨著吸附循環數的增加而增加。然后，測量了其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO表面的水接觸角度，以研究表面的潤濕性的變化。結果顯示在圖15中。當PEI800出現在最外表面時，水接觸角度大約為45度，而在最外層是DNA的情況下，水接觸角度大約是32度。從圖15中可以看出，接觸角度根據最外表面的類型而交替改變。這個結果表明由PEI800和DNA制成的交替吸附層在ITO電極的表面上形成。其上吸附了一層PEI800的表<p>本研究證實在使用甘油補充碳源和持續補充酵母提取物之間存在協同作用，該協同作用減弱了免疫毒素的毒性效果，提高了產量，特別是在15℃時。該項可靠的工藝具有37mg/L的產量，比先前報導的毒素抗性CHO細胞表達系統高出7倍(25)。實施例41最終方法使用毒素抗性EF-2突變體，誘導過程中甲醇添加量限制為0.5至0.75ml/min(每10L初始培養基)而不另加碳源，誘導時間延長至163h，溫度15℃，持續注入酵母提取物，攪拌速度限制為400RPM，添加消泡劑至0.07％，以及DO水平降至40％以下時補充氧氣。在此條件下無需PMSF和酪蛋白氨基酸。另外，通過降低攪拌速度減小剪切力，以及添加消泡劑可顯著減少免疫毒素聚集體。結果，純化產率從64％提高至76％。通過該優化的方法，在甲醇誘導163小時時的免疫毒素分泌水平為120mg/L。表6總結了通過解決這些主要問題，提高了多少免疫毒素分泌和純化產量。基因優化使IT分泌從不可檢測水平提高到10mg/L。通過使用DT抗性菌株和采用低溫，我們將免疫毒素分泌量提高到35mg/L。而且，采用甲醇限量添加提高了免疫毒素分泌量以及純化產率。最后，延長誘導時間以及添加消泡劑顯著提高了免疫毒素分泌量和純化產率。消泡劑是購自KaboChemical公司(Cheyennne，WY82007，USA)的KFOTM673。該方法可用于在毒素敏感的巴斯德畢赤酵母中生產其他重組免疫毒素和其他有毒蛋白。表6通過解決主要問題，免疫毒素分泌量和純化產率的提高在本申請中，引用了多種出版物。這些出版物按如下方式全文引用。所提及的出版物通過引用的方式全文納入本說明書中，以更加詳細地敘述本發明所屬
技術領域：
的狀況。對于本領域技術人員顯而易見的是，只要不背離本發明的范圍和精神，可對本發明進行各種修改和變動。通過考慮本發明所公開的說明書和實施情況，本發明的其他實施方案對本領域技術人員來說是顯而易見的。本說明書和實施例應僅看作示例性用途，本發明真正的范圍和精神在所附的權利要求書中說明。參考文獻Arata，Y.，T.Nishi，S.Kawasaki-Nishi，E.Shao，S.Wilkens，andM.Forgac.2002.Structure，subunitfunctionandregulationofthecoatedvesicleandyeastvacuolar(H(+))-ATPases.Biochim.Biophys.Acta155571-4.Bannister，S.J.，andK.D.Wittrup.2000.GlutathioneexcretioninresponsetoheterologousproteinsecretioninSaccharomycescerevisiae.Biotechnol.Bioeng.68389-95.Bennett，M.J.，andD.Eisenberg.1994.Refinedstructureofmonomericdiphtheriatoxinat2.3Aresolution.ProteinSeience31464-1475.Boeseken，J.1949.Theuseofboricacidforthedeterminationoftheconfigurationofcarbohydrates.Adv.Carbohydr.Chem.4189-210.Bouriotis，V.，Scott，J.，Galloway，A.，Bellingham，A.J.，andDean，P.D.1981.Measurementofglycosylatedhaemoglobinsusingaffinitychromatography.Diabetologia21579-580.Cereghino，G.P.，Cereghino，J.L.，Ilgen，C.andCregg，J.M..2002.ProductionofrecombinantproteinsinfermentorculturesoftheyeastPichiapastoris.Curr.Opin.Biotechnol.13329-332.Cereghino，G.P.，Cereghino，J.L.，Sunga，A.J.，Johnson，M.A.，Lim，M.，Gleeson，M.A.G.andCregg，J.M.(2001)Newselectablemarker/auxotrophichoststraincombinationsformoleculargeneticmanipulationofPichiapastoris.Gene263，159-169.Che，F.Y.，J.F.Song，X.X.Shao，K.Y.WangandQ.C.Xia.1999.Comparativestudyonthedistributionofovalbuminglycoformsbycapillaryelectrophoresis.J.Chromatogr.A849599-608.Chen，J.Y.C.，Bodley，J.W.andLivingston，D.W.(1985)Diphtheriatoxin-resistantmutantsofSaccharomycescerevisiae.Mol.Cell.Biol.5，3357-3360.Chen，S.R.，D.D.Dunigan，andM.B.Dickman.2003.Bcl-2familymembersinhibitoxidativestress-inducedprogrammedcelldeathinSaccharomycescerevisiae.FreeRadic.Biol.Med.341315-1325.Collier，J.(1975)Diphtheriatoxinmodeofactionandstructure.Bact.Rev.39，54-85.Conover，W.J.1999.Sometestsbasedonthebinomialdistribution，p.123-178.InB.Wiley(ed.)，Practicalnonparametricstatistics，3rded.JohnWileyandSons，Inc.，NewYork，NY.Couderc，R.，andJ.Baratti.1980.Oxidationofmethanolbytheyeast，PichiapastorisPurificationandpropertiesofthealcoholoxidase.Agric.Biol.Chem.442279-2289.Davis，C.A.，Grate，L.，Spingola，M.andAresJr.，M.(2000)Testofintronpredictionrevealsnovelsplicesites，alternativelysplicedmRNAsandnewintronsinmeioticall.regulatedgenesofyeast.NucleicAeidsResearch28，1700-1706.Desai，U.R.，H.Wang，S.A.AmpofoandR.J.Linhardt.1993.Oligosaccharidecompositionofheparinandlow-molecular-weightheparinsbycapillaryelectrophoresis.Anal.Bioehem.213120-127.Dring，F.，Klapper，M.，Theis，S.andDaniel，H.(1998)Useoftheglyceraldehyde-3phosphatedehydrogenasepromoterforproductionoffunctionalmammalianmembranetransportproteinsintheyeastPichiapastoris.Biochem.Biophys.Res.Commun.250，531-535.Foley，B.T.，Moehring，J.M.，andMoehring，T.J.(1992)Amutationincodon717oftheCho-K1elongationfactor2genepreventsthefirststepinthebiosynthesisofdiphthamide.Somat.CellMol.Genet.18，227-231Frankel，A.E.，D.M.Neville，T.A.Bugge，R.J.Kreitman，andS.H.Leppla.2003.Immunotoxintherapyofhematologicmalignancies.Semin.Oncol.30545-557.Gellissen，G.(2000)Heterologousproteinproductioninmethylotrophicyeasts.Hardy，E.，E.Martinez，D.Diago，R.Diaz，D.Gonzalez，andL.Herrera.2000.Large-scaleproductionofrecombinanthepatitisBsurfaceantigenfromPichiapastoris.J.Biotechnol.77157-67.Houchins，J.P.(2000)Immunotoxin-inducedapoptosis.StemCell18，384-385.Hu，V.W.，andR.K.Holmes.1987.SinglemutationintheAdomainofdiphtheriatoxinresultsinaproteinwithalteredmembraneinsertionbehavior.BiochimBiophysActa90224-30.Jahic，M.，F.Wallberg，M.Bollok，p.Garcia，andS.O.Enfors.2003.Temperaturelimitedfed-batchtechniqueforcontrolofproteolysisinPichiapastorisbioreactorcultures.Microb.CellFact.26.Jahic，M.，J.C.Rotticci-Mulder，M.Martinelle，K.Hult，andS.O.Enfors.2002.ModelingofgrowthandenergymetabolismofPichiapastorisproducingafusionprotein.BioprocessBiosyst.Eng.24385-393.Kimata，Y.andKohno，K.(1994)Elongationfactor2mutantsdeficientindiphthamideformationshowtemperature-sensitivecellgrowth.J.Biol.Chem.269，13497-13501.Kimata，Y.，Harashima，S.andKohno，K.(1993)Expressionofnon-ADP-ribosylatable，Diphtheriatoxin-resistantelongationfactor2inSaccharomycescerevisiae.Biochem.Biophys.Res.Commun.191，1145-1131.Kohno，KandUchida，T.(1987)Highlyfrequentsingleaminoacidsubstitutioninmammalianelongationfactor2(EF-2)resultsinexpressionofresistancetoEF-2-ADPribosylatingToxins.J.Biol.Chem.262，12298-12305.Kohno，K.，Uchida，T.，Ohkubo，H.，Nakanishi，S.，Nakanishi，T.，Fukui，T.，Ohtsuka，E.，Ikehara，M.andOkada，Y.(1986)AminoAcidSequenceofMammalianElongationFactor2DeducedfromthecDNASequenceHomologywithGTP-BindingProteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，4978-4982.Li，Z.，F.Xiong，Q.Lin，M.d′Anjou，A.J.Daugulis，D.S.Yang，andC.L.Hew.2001.Low-temperatureincreasestheyieldofbiologicallyactiveherringantifreezeproteininPichiapastoris.ProteinExpr.Purif21438-45.Liebman，J.M.，D.LaSala，W.Wang，andP.M.Steed.1999.Whenlessismoreenhancedbaculovirusproductionofrecombinantproteinsatverylowmultiplicitiesofinfection.Biotechniques2636-8，40，42.Liu，Y.Y.，Gordienko，I.，Mathias，A.，Ma，S.，Thompson，J.，Woo，J.H.，andNeville，D.M.，Jr.(2000)Expressionofananti-CD3single-chainimm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cgacgatgtcaaggagatcaagcagaagactgaaggtaacagtttccttatc300aacttaattgactccccaggtcacgttgacttctcttctgaggtcactgctgctctgcgt360gttactgacggtgctttggtcgtcgttgactgtgttgaaggtgtctgtgttcaaactgag420accgttttgcgtcaagctttgggtgaaagaatcaagccagttgttgtcattaacaaggtc480gaccgtgctcttttggagttgcaagttaccaaggaggacctgtaccagtctttcgctaga540accgtcgagtccgtaaacgtcgttatcgctacttacactgacaagaccattggtgacaac600caagtctacccagaacagggtaccgtcgctttcggttcaggtctgcacggatgggctttc660accgttagacagttcgccactagatactccaagaagttcggtgttgacagaatcaagatg720atggagcgtctgtggggagactcttacttcaacccaaagaccaagaaatggaccaacaag780gacaaggacgccgctggaaagcctttggagcgtgccttcaacatgttcgttttggaccct840atcttccgtctgtttgctgccatcatgaacttcaagaaggatgaaattccagttctgttg900gagaaattggagatcaacctgaagcgtgaggagaaggagttggagggtaaggctcttttg960aaggttgtcatgagaaagttcttgccagctgccgacgctttgttggagatgattgttctt1020cacctgccatctccagtcaccgctcaagcttacagagccgagactttgtacgaaggtcca1080tctgatgaccaattctgcattggtatcagagagtgtgaccctaaggctgagctgatggtt1140tacatttccaagatggtgccaacctccgacaaaggtagattctacgccttcggtcgtgtt1200ttctccggtactgttaagtccggtcaaaaggtcagaatccaaggtcctaactacgttcca1260ggtaagaaggaggacttgttcatcaaggctgttcaaagaactgttttgatgatgggaaga1320accgtcgagcctattgacgatgtcccagctggtaacattctgggtattgtgggtatcgac1380cagttcttgctgaagtctggtactcttactaccaacgaagccgctcacaacatgaaggtg1440atgaaattctctgtctctccagttgtgcaagttgccgttgaggtcaagaacgctaatgat1500ctgcccaagttggttgagggtctgaagcgtttgtccaagtctgacccatgtgttttaacc1560tacatctccgagtctggtgagcacattgttgctggtactggtgagctgcacttggaaatc1620tgtttgcaagatctgcaagacgaccacgctggtgtccctctgaagatttctcctccagtt1680gttacctaccgtgagactgtcactaacgaatcttccatgactgccctgtccaagtctcag1740aacaagcataacagaatttacctgaaggctcaaccaattgacgaggaattgtctttggct1800atcgaagaaggtaaggttcacccaagagacgactttaaagccagagccagaatcatggct1860gatgaatacggttgggacgtcactgatgccagaaagatctggtgtttcggtccagacggt1920actggtgccaacttagttgttgaccagtctaaggctgtccaatacttgcacgagatcaag1980gactctgttgttgccggtttccaattggctaccaaggaaggtccaattttgggagaaaac2040atgagatccgtcagagtcaacatcttggatgttaccctgcacgccgatgctatccacaga2100ggtggaggacaagtcattccaaccatgaagagagttacctacgccgccttcctgttggct2160gagccagctatccaggagcctatcttcttggtggagatccaatgtccagagaatgccatt2220ggtggtatctactctgttttgaacaagaagagaggtcaagttatctctgaggaacaaaga2280ccaggtaccccattgttcactgtcaaagcttacttgccagttaacgagtcattcggtttc2340accggtgaactgagacaagctaccgctggtcaagctttcccacagatggtgttcgaccac2400tgggccaacatgaatggtaacccattggacccagcctccaaggtcggtgagattgttctt2460gctgccagaaagagacagggtatgaaggagaacgttcctggttatgaagagtactacgac2520aagttgtaagcttaatgtttcattaacttatttgtgtcgttcgtatgtctatttacgtac2580ttaattcagtgtattgttgtt2601<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>14AlaHisValAspHisGlyLysSerThr15<210>15<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>15AspGluGlnGluArgGlyIleThrIleLysSerThrAla1510<210>16<211>896<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>16AlaGlyAlaAspAspValValAspSerSerLysSerPheValMetGlu151015AsnPheAlaSerTyrHisGlyThrLysProGlyTyrValAspSerIle202530GlnLysGlyIleGlnLysProLysSerGlyThrGlnGlyAsnTyrAsp354045AspAspTrpLysGlyPheTyrSerThrAspAsnLysTyrAspAlaAla505560GlyTyrSerValAspAsnGluAsnProLeuSerGlyLysAlaGlyGly65707580ValValLysValThrTyrProGlyLeuThrLysValLeuAlaLeuLys859095ValAspAsnAlaGluThrIleLysLysGluLeuGlyLeuSerLeuThr100105110GluProLeuMetGluGlnValGlyThrGluGluPheIleLysArgPhe115120125GlyAspGlyAlaSerArgValValLeuSerLeuProPheAlaGluGly130135140SerSerSerValGluTyrIleAsnAsnTrpGluGlnAlaLysAlaLeu145150155160SerValGluLeuGluIleAsnPheGluThrArgGlyLysArgGlyGln165170175AspAlaMetTyrGluTyrMetAlaGlnAlaCysAlaGlyAsnArgVal180185190ArgArgSerValGlySerSerLeuSerCysIleAsnLeuAspTrpAsp195200205ValIleArgAspLysThrLysThrLysIleGluSerLeuLysGluHis210215220GlyProIleLysAsnLysMetSerGluSerProAlaLysThrValSer225230235240GluGluLysAlaLysGlnTyrLeuGluGluPheHisGlnThrAlaLeu245250255GluHisProGluLeuSerGluLeuLysThrValThrGlyThrAsnPro260265270ValPheAlaGlyAlaAsnTyrAlaAlaTrpAlaValAsnValAlaGln275280285ValIleAspSerGluThrAlaAspAsnLeuGluLysThrThrAlaAla290295300LeuSerIleLeuProGlyIleGlySerValMetGlyIleAlaAspGly305310315320AlaValHisHisAsnThrGluGluIleValAlaGlnSerIleAlaLeu325330335SerSerLeuMetValAlaGlnAlaIleProLeuValGlyGluLeuVal340345350AspIleGlyPheAlaAlaTyrAsnPheValGluSerIleIleAsnLeu355360365PheGlnValValHisAsnSerTyrAsnArgProAlaTyrSerProGly370375380HisLysThrGlnProPheLeuProTrpAspIleGlnMetThrGlnThr385390395400ThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGlyAspArgValThrIleSerCys405410415ArgAlaSerGlnAspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLys420425430ProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuHis435440445SerGlyValProSerLysPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyr450455460SerLeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGluAspIleAlaThrTyrPhe465470475480CysGlnGlnGlyAsnThrLeuProTrpThrPheAlaGlyGlyThrLys485490495LeuGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly500505510GlyGlySerGluValGlnLeuGlnGlnSerGIyProGluLeuValLys515520525ProGlyAlaSerMetLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPhe530535540ThrGlyTyrThrMetAsnTrpValLysGlnSerHisGlyLysAsnLeu545550555560GluTrpMetGlyLeuIleAsnProTyrLysGlyValSerThrTyrAsn565570575GlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSer580585590ThrAlaTyrMetGluLeuLeuSerLeuThrSerGluAspSerAlaVal595600605TyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyrGlyAspSerAspTrpTyrPhe610615620AspValTrpGlyAlaGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGly625630635640GlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGlnMet645650655ThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGlyAspArgValThr660665670IleSerCysArgAlaSerGlnAspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyr675680685GlnGlnLysProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyrTyrThrSer690695700ArgLeuHisSerGlyValProSerLysPheSerGlySerGlySerGly705710715720ThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGluAspIleAla725730735ThrTyrPheCysGlnGlnGlyAsnThrLeuProTrpThrPheAlaGly740745750GlyThrLysLeuGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly755760765SerGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGlu770775780LeuValLysProGlyAlaSerMetLysIleSerCysLysAlaSerGly785790795800TyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValLysGlnSerHisGly805810815LysAsnLeuGluTrpMetGlyLeuIleAsnProTyrLysGlyValSer820825830ThrTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrValAspLys835840845SerSerSerThrAlaTyrMetGluLeuLeuSerLeuThrSerGluAsp850855860SerAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyrGlyAspSerAsp865870875880TrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValPheSer885890895<210>17<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<220><221>misc_feature<222>15<223>S＝G或C<400>17ggggsggggsggggs15<210>18<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<220><221>misc_feature<222>4，8，12，16<223>s＝g或c<400>18gggsgggsgggsgggs16<210>19<211>3<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<220><221>變體<222>2<223>Xaa＝任何氨基酸<220><221>變體<222>3<223>Xaa＝s或t<400>19AsnXaaXaa1<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>20ttggttattgaccaaactaaggctgtccaa30<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>21acctctcttcttgtttaagacggagtagat30<210>22<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>22cttgcttttgcggccgctttttttttttttttttttttt39<210>23<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>23gataagaatgcggccgccatttcttggtctttgggttgaag41<210>24<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>24gataagaatgcggccgccaacttagttgttgaccagtctaag42<210>25<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>25atagctagcactttgaagttcttaattttgttcctc36<210>26<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>26ataagaatgcggccgcaagttaatgaaacattaagcttacaac43<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>27gaatgacttgtcctccacc19<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>28gaatgacttgtcctccgcgg20<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>29caactagctagcgctcacaacatgaaggtcatgaaattc39<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>30agaaccgtcgagcctattgacgat24<210>31<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>31ccctgcacgccgatgctatccacagaagaggaggacaagtcattccaaccatgaag56<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>32gccgatgctatccacagaaga21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>33gccgatgctatccaccgccgc21<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<400>34tctcttcttgttcaaaacagagtagatacc30<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述；note＝合成構建體<220><221>miscfeature<222>7.15<223>n＝g，a，c或t(u)<400>35gtatgtncactaacntag18權利要求1.一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養可表達免疫毒素的巴斯德畢赤酵母；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中甲醇誘導的溫度在約17.5℃以下。2.根據權利要求1的方法，其中所述甲醇誘導是添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培養基)的限量甲醇。3.根據權利要求1的方法，其中所述甲醇誘導是含甲醇和甘油的補料。4.根據權利要求3的方法，其中在所述含甲醇和甘油的補料中，甲醇和甘油比例約為4∶1。5.根據權利要求1的方法，其中所述免疫毒素為融合蛋白。6.根據權利要求1的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。7.根據權利要求6的方法，其中所述白喉毒素部分為截短型。8.根據權利要求7的方法，進一步包括CD3抗體部分。9.根據權利要求8的方法，其中所述免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。10.根據權利要求1的方法，其中所述巴斯德畢赤酵母包括在編碼EF-2的氨基酸序列中具有突變。11.根據權利要求1的方法，其中所述蛋白的酶消化產物是大豆蛋白的酶消化產物。12.根據權利要求1的方法，進一步包括將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接觸。13.根據權利要求12的方法，其中將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接觸至少2小時。14.根據權利要求12的方法，其中苯甲烷磺酰氟溶于4∶1甲醇甘油誘導補料中，濃度不超過10mM。15.根據權利要求12的方法，其中所述氨基酸源為酵母提取物。16.根據權利要求1的方法，其中所述溫度選自17.5、17.0、16.5、16.0、15.5、15.0、14.5、14.0、13.5、13.0、12.5和12.0℃。17.根據權利要求1的方法，其中所述溫度約為15℃。18.根據權利要求1的方法，其中所述生長培養基的組成為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液。19.根據權利要求18的方法，其中所述生長培養基進一步包括消泡劑。20.根據權利要求19的方法，其中所述消泡劑的濃度為約0.01％或更高。21.根據權利要求20的方法，其中所述生長培養基的組成為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，約0.43％PTM1溶液以及約0.02％消泡劑。22.根據權利要求1的方法，其中在生長培養基中溶解氧的濃度保持在40％的數值或更高。23.根據權利要求1的方法，其中生長步驟的pH值約為3.5，甲醇誘導步驟的pH值約為7.0。24.根據權利要求1的方法，其中甲醇誘導步驟進行約22至288小時之間。25.一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中所述甲醇誘導包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導進行的溫度低于17.5℃，補充消泡劑至0.07％，攪拌速度保持在400RPM，且其中誘導步驟進行約22至288小時之間。26.一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括a)在生長培養基中培養可表達免疫毒素的巴斯德畢赤酵母，所述生長培養基包括約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液，其中生長期間pH值約為3.5，且生長培養基中溶解氧濃度保持在40％或更高的數值；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中所述甲醇誘導包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導進行的溫度為15℃，pH值約7.0，補充消泡劑0.02％，攪拌速度保持在約400RPM，且誘導步驟進行約163小時。27.一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液加入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素加于陰離子交換柱上；d)通過使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。28.根據權利要求27的方法，其中所述非糖基化免疫毒素在酵母中表達。29.根據權利要求28的方法，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母。30.根據權利要求27的方法，其中所述免疫毒素為融合蛋白。31.根據權利要求27的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。32.根據權利要求31的方法，其中所述白喉毒素部分為截短型。33.根據權利要求32的方法，進一步包括CD3抗體部分。34.根據權利要求33的方法，其中所述非糖基化免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。35.根據權利要求27的方法，進一步包括在使用硼酸鈉溶液洗脫之前，使用約25mM的硼酸鈉溶液洗滌陰離子交換柱。36.根據權利要求27的方法，其中步驟(d)中硼酸鈉溶液濃度在約50mM和約200mM之間。37.根據權利要求36的方法，其中步驟(d)中硼酸鈉溶液濃度在約75mM和約100mM之間。38.根據權利要求27的方法，其中步驟(e)中硼酸鈉濃度約20mM。全文摘要本發明一方面涉及一種在毒素抗性的突變型巴斯德畢赤酵母菌株中表達免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母，并保持溶解氧濃度在40％或以上；b)進行甲醇誘導，誘導過程中添加0.5－0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，持續注入酵母提取物，溫度低于17.5℃，補充消泡劑至0.07％，攪拌減慢至400RPM，且誘導階段延長至163小時。本發明另一方面涉及一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液加入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素加于陰離子交換柱上；d)通過使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。文檔編號C12N1/16GK1863921SQ200480028919公開日2006年11月15日申請日期2004年8月2日優先權日2003年8月1日發明者D·M·內維爾,J·H·禹,Y-Y·劉申請人:美國政府(由衛生和人類服務部、國立衛生研究院的部長所代表)