具有rnaseⅲ活性的多肽的制作方法

專利名稱：具有rnase ⅲ活性的多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及最近分離出的多聚核苷酸以及由此核苷酸編碼的具有RNA酶(RNase)III活性的多肽和該多聚核苷酸以及該多肽的應用以及生產。
背景技術：
RNase III是能夠特異性地作用于雙鏈RNA(dsRNA)以生成在5’末端具有磷酸基團的平均起來15個核苷酸的寡聚核苷酸的酶。例如，該酶存在于Escherichia coli 30S提取物中。同樣，存在于牛胸腺以及雞胚胎中的相似的酶已被報道。在大多數情況下，該酶被用于區別RNA-RNA與單鏈RNA等的二級結構的方法中(參看，例如，非專利文件1)。
最近，名為RNA干擾(RNA interference)的技術已被報道。該技術基于如下現象，其中mRNA利用dsRNA以序列特異性的方式被降解，導致基因表達的抑制。dsRNA可以被用于基因沉默的發現的開始是一項研究，其中反義(antisense)被用在Caenorhabditis elegans中。1995年，Guo和Kemphues執行了使用反義RNA來抑制名為Par-1基因的實驗。當反義RNA被加入之后，par-1的表達如預想的被抑制了。令人吃驚地，被用作對照的正義RNA同樣抑制par-1的表達，導致par-1突變體的顯型(參看，例如，非專利文件2)。
這個矛盾被Fire等在1998年解決了。當使用RNA聚合酶合成反義RNA或正義RNA時，少量反向(inverse)RNA以非特異的方式非有意地被生成。已被證實，由于該污染生成的dsRNA是用于基因沉默的必需實體，反義RNA或正義RNA不能抑制基因的表達，并且通過將反義RNA退火到正義RNA上形成的dsRNA可以有效抑制基因表達(參看，例如，非專利文件3，專利文件1)。
在RNA干擾中，名為Dicer的酶由dsRNA生成小RNA(短的干擾RNA(siRNA))(參看，例如，非專利文件4，專利文件2)。
認為由該酶的作用產生的該siRNA被整合到名為RNA誘導沉默復合物(RNA induced silencing complex)(RISC)的復合物中，并且該復合物識別和降解目標mRNA。然而，在很多情況下，被猜測涉及RNA干擾的各個因子的確切功能還未知(參看，例如，非專利文件5) 來自微生物的RNase III同樣被用于siRNA的制備中(參看，非專利文件6)。例如，來自Escherichia coli的RNase III是作為這樣的RNase III從Epicenter或者Ambion處商業可得的并用于siRNA的制備中。該來自Escherichia coli的RNase III的反應性高。例如，即使500或者更多堿基對的長的dsRNA被作為模板使用，它迅速被降解成大約10堿基對的小分子。在這種情況下，為了制備大約21堿基對的被認為適用于RNA干擾的siRNA，該長dsRNA的部分降解必須通過改變條件(例如，通過降低反應溫度，或者通過縮短反應時間)來進行。然而，如上文描述的，因為該來自Escherichia coli的RNaseIII的反應性高，該酶具有難控制反應條件的缺點，并且即使在用于部分降解的條件下小分子趨向于被生成。
如上文描述的，當由雙鏈RNA制備一定長度的siRNA時，其反應條件可以容易地被控制，并且不趨向于生成RNA干擾效果差的小分子的RNase III是令人期望的，其中所述一定長度的siRNA在RNA干擾中的效果可被預期。
專利文件1US 6506559專利文件2WO 01/68836非專利文件1酶術語(http//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)，EC 3.1.26.3非專利文件2Guo，S.et al.，Cell，1995，vol.81，p.611-620非專利文件3Fire，A.et al.，Nature，1998，vol.39，p.806-811非專利文件4Bernstein，E.et al.，Nature，2001，vol.409，p.363-366非專利文件5Tabara，H.et al.，Cell，2002，vol.109，p.861-871
非專利文件6Zhang，H.et al.，The EMBO Journal，2002，vol.21，No.21，p.5875-588
發明內容
發明將要解決的問題 本發明的主要目的是提供具有RNase III活性的新穎多肽，使用其通過反應條件一定長度的dsRNA降解產物可以容易地被控制，并且其在能夠在RNA干擾中作為siRNA起作用的一定長度的dsRNA的制備上，不趨向生成RNA干擾效應低的小分子。本發明的另一個目的是提供使用該多肽制備siRNA的有效方法，其與傳統的方法不同。
解決問題的手段 為了容易地控制反應條件，本發明者已深入地檢測了具有RNase III活性的可以在比來自嗜溫生物的RNase III低的溫度下熱失活的多肽，并且使用它可以利用熱敏性設置溫和降解條件。因此，本發明者已發現來自冷適應(cold-adapted)微生物的具有RNase III活性的多肽具有RNase III活性，使用該多肽通過反應條件一定長度的dsRNA的降解產物可以容易地被控制，并且在能夠在RNA干擾中作為siRNA起作用的一定長度的siRNA的制備上，它不趨向于生成RNA干擾效應低的小分子。本發明者已嘗試克隆編碼具有RNase III活性的多肽的多聚核苷酸，該多肽來自能夠在4℃生長的冷適應微生物Shewanella sp.Ac10，成功地表達了具有RNase III活性的感興趣多肽，并且發現該RNase III的活性對于siRNA的制備是優選的。因此，本發明已經完成。
本發明的第一方面涉及具有RNase III活性的多肽，其來自微生物，并且使用該多肽，在完全降解后，對于RNA干擾有效的長度在特定范圍內的dsRNA的降解產物可以被獲得。
本發明的第二方面涉及具有RNase III活性的多肽，其反應條件可以容易地被控制，并且使用它長度在特定范圍內大于使用來自Escherichia coli的RNase III處理dsRNA獲得的最終降解產物的dsRNA降解產物可以被獲得。
本發明的第三方面涉及具有RNase III活性的多肽，它的dsRNA降解速度慢于來自Escherichia coli的RNase III的dsRNA降解速度，并且它的反應條件可以容易地被控制。
本發明的第四方面涉及具有RNase III活性的多肽，它的dsRNA降解速度慢于來自Escherichia coli的RNase III的dsRNA降解速度，它的反應條件可以容易地被控制，并且它不趨向生成大約10堿基對的小的dsRNA降解產物。
根據第一到第四方面，該多肽優選來自冷適應微生物。盡管并不意在限制本發明，例如，它優選是Shewanella屬的微生物。
本發明第五方面涉及具有RNase III活性的多肽，使用它長度在特定范圍內、大于使用來自Escherichia coli的RNase III處理dsRNA獲得的最終降解產物的dsRNA降解產物可以被獲得，根據需要，取決于反應條件，并且它包含選自由以下構成的組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO4的氨基酸序列；(b)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO4氨基酸序列中一個或幾個氨基酸被取代、刪除、插入或者添加；和(c)由能夠在嚴格條件下與SEQ ID No1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
本發明的第六方面涉及第一至到四方面的多肽，它是與具有結合核酸活性的蛋白形成的融合蛋白。
本發明第七方面涉及用于降解dsRNA的方法，使用第一到第六方面的多肽。
根據第七方面，盡管并不意在限制本發明，例如，該dsRNA降解產物是作為siRNA能夠在RNA干擾中起作用的dsRNA。本發明的方法可以在具有結合核酸活性的蛋白的存在下進行。使用的多肽可以是具有結合核酸活性的蛋白與第一到第四方面的多肽的融合蛋白。盡管并不意在限制本發明，例如，具有結合核酸活性的蛋白是來自嗜熱細菌或者熱穩定細菌的冷激蛋白。盡管并不意在限制本發明，例如，該冷激蛋白是來自Thermotoga maritima的冷激蛋白B。
本發明第八方面涉及用于降解dsRNA的組合物，它被用于第七方面的方法，并且它包含第一到第六方面的多肽。
本發明第九方面涉及用于降解dsRNA的試劑盒，它被用于第七方面的方法，并且它包含第一到第六方面的多肽。
本發明第十方面涉及具有選自由以下構成的組的核苷酸序列的核酸(a)SEQ ID NO1的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其中在SEQ ID NO1的核苷酸序列中一個或幾個核苷酸被取代，刪除，插入或者添加；和(c)在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發明第十一方面涉及使用第十方面的核酸用于生成具有RNase III活性的多肽的方法。
發明效果 本發明提供了具有RNase III活性的多肽，其來源于冷適應微生物，并且其反應條件可以容易地被控制。另外，提供了使用本發明的多肽用于生成能夠作為siRNA在RNA干擾中起作用的一定長度的dsRNA的便利和有效的方法。
實現本發明的最佳方式 如此處用到的，具有RNase III活性的多肽指的是降解雙鏈RNA(dsRNA)的核酸內切酶。通常地，它完全消化dsRNA來生成大約10堿基對的小的dsRNA片斷。該多肽可以降解作為底物的dsRNA(或天然發生或人工修飾)。盡管并不意在限制本發明，例如，用氟-CMP w2′-氟-UMP取代的dsRNA可以被使用。
如此處用到的，dsRNA指的是形成雙鏈結構的RNA。盡管并不意在限制本發明，例如，它指的是形成雙鏈結構的RNA，其由待經受RNA干擾的mRNA和具有與該mRNA互補的核苷酸序列的RNA組成。
該dsRNA包括保留雙鏈結構的RNA降解產物，包括適用于RNA干擾的短的干擾RNAs(siRNAs)。該dsRNA或其降解產物可以在3’和/或5’端具有單鏈部分。
如此處用到的，能夠作為siRNA在RNA干擾中起作用的dsRNA指的是，例如，在10到100堿基對范圍內的特定長度的dsRNA，盡管并不意在限制本發明。此外，例如，能夠作為siRNA在RNA干擾中起作用的一定長度的siRNA可以是長度在15到30堿基對范圍內的dsRNA，特別是20到25堿基對。
如此處用到的，長度在特定范圍內的dsRNA指的是能夠作為siRNA在RNA干擾中起作用的dsRNA，其特征為低多度(abundance)的大約10堿基對的小dsRNA降解產物。盡管并不意在限制本發明，它可以是長度在10到100堿基對范圍內的dsRNA，優選地是15到30堿基對，更優選地是20到25堿基對。
如此處用到的，其反應條件可以容易地被控制指的是，例如對于dsRNA降解反應，由于降解反應中的慢的反應速度，使用得到的小的產物作為指標(使用dsRNA降解產物的長度作為指標)，其部分降解的條件可以容易地被確定，盡管并不意在限制本發明。換句話說，不趨向生成小的產物的是優選的。盡管并不意在限制本發明，例如，如下面描述的來源于冷適應微生物的可以優選地被用作酶，該酶的反應條件可以容易地被控制。
如此處用到的，完全降解意味著使用足夠量的酶，經過對于由于底物降解反應的進展而產生的降解產物的量達到穩定期(底物和降解產物的量不改變的平衡態)來說足夠的時間后的降解反應。部分降解意味著達到完全降解之前的降解。
微生物通常根據其可以生長的溫度的范圍被劃分為嗜熱微生物，嗜溫微生物以及冷適應微生物。在低溫下可以生長的微生物根據最佳生長溫度以及當超過時它們不再生長的最高溫度進一步再分為嗜冷(psychrotrophic)微生物以及嗜寒(psychrophilic)生物。具有20℃或者更低的最高生長溫度以及15℃或者更低的最佳生長溫度的微生物通常被稱為嗜寒微生物，而具有20℃或者更高的最高生長溫度的微生物通常被稱為嗜冷生物。如此處用到的，冷適應微生物指的是上述提到的冷適應微生物。根據本發明，關于可以用作基因的來源的微生物的屬、物種或者菌株沒有特別的限制。例如，被劃分為Shewanella屬的冷適應微生物可以被使用。這樣的微生物可以很容易地從公共微生物保藏機構獲得。Shewanella屬微生物的例子包括Shewanella putrefaciensSCRC-2874(FERM BP-1625)和Shewanella sp.Ac10。然而，不言而喻，多種冷適應微生物可以同樣地被用作如上文中描述的基因的來源。
在下文中，本發明將被詳細的描述。
(1)本發明的具有RNase III活性的多肽以及編碼該多肽的多聚核苷酸。
本發明的具有RNase III活性的多肽是其反應條件可以容易地被控制的多肽。盡管并不意在限制本發明，它的一個例子是具有RNase III活性的其反應條件可以容易地被控制的多肽，并且使用它長度在一特定范圍內大于使用來自Escherichia coli的RNase III處理dsRNA得到的最終降解產物的dsRNA降解產物可以被獲得。
本發明的多肽可以是其dsRNA降解速度慢于來自Escherichia coli的RNase III的dsRNA的降解速度，其反應條件可以容易地被控制，并且其不趨向生成約10堿基對的小的dsRNA降解產物的多肽。
因此，通過根據需要設置反應條件(溫度，時間，酶濃度，等等)本發明的多肽可以被用來容易地獲得使用來自Escherichia coli的傳統RNase III難于獲得的長度在特定范圍內的dsRNA。此外，它優選是一種多肽，利用該多肽，在不必向酶緩沖液中添加特殊試劑(比如錳離子)的情況下，長度在一特定范圍內的dsRNA可以容易地被獲得。
具有RNase III活性的，其dsRNA降解速度慢于來自Escherichiacoli RNase III的dsRNA的降解速度，并且其反應條件可以容易地被控制的多肽例證了本發明的多肽的另一個實施方案。
盡管并不意在限制本發明，例如，根據本發明，其dsRNA的降解速度慢于來自Escherichia coli的RNase III的dsRNA的降解速度，并且其在該反應速度下即使在反應一個小時后也不趨向生成大約10堿基對的片段的是優選的。
因為本發明的具有RNase III活性的多肽的dsRNA的降解速度慢于來自Escherichia coli的RNase III的dsRNA的降解速度，通過適當地選擇反應時間、反應溫度等，任意特定長度的dsRNA可以被制備。使用來自Escherichia coli的傳統RNase III很困難的dsRNA的部分降解通過利用這個特性可以被進行。此外，本發明具有RNase III活性的多肽相比于來自Escherichia coli的RNase III是不趨向生成作為siRNA在RNA干擾中幾乎不起作用的小的dsRNA的多肽。換句話說，使用該多肽可以便利和有效地制備作為siRNA能夠在RNA干擾中起作用的dsRNA，這是由于相比于來自Escherichia coli的RNase III，該多肽降解長的dsRNA(大約500到1000堿基對)的速度是慢的，并且該多肽不趨向生成大約10堿基對的小的降解產物。
本發明的多肽可以用于制備作能夠為siRNA在RNA干擾中起作用的dsRNA。盡管并不意在限制本發明，它的一個例子是具有SEQ IDNO4氨基酸序列的多肽。編碼本發明的具有RNase III活性的多肽的多聚核苷酸通過具有SEQ ID NO1核苷酸序列的多聚核苷酸例證。本發明的具有RNase III活性的多肽，或者編碼該多肽的多聚核苷酸，包括其中在氨基酸序列中，或者核苷酸序列中，一個或多個氨基酸或者核苷酸，被取代、刪除、插入或者添加，只要它具有上面提到的功能。盡管并不意在限制本發明，它的例子包括具有SEQ ID NO5氨基酸序列的多肽。
此外，由與本申請公開的氨基酸序列(SEQ ID NO4)有至少70％，優選的80％，更優選的90％，還要優選的95％的同源性的氨基酸序列編碼的多肽，只要它具有RNase III活性，就是在本發明范圍內的。
此外，包括在嚴格條件下與SEQ ID NO1多聚核苷酸雜交并且編碼具有相當于由SEQ ID NO1的多聚核苷酸編碼的多肽的dsRNA降解活性的多肽的多聚核苷酸。“嚴格雜交條件”的例子包括，但不限于，如著作比如Sambrook et al.，Molecular cloning，A laboratory manual3rd edition，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述的條件，例如，在含有6XSSC(1x SSC0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉pH 7.0)，0.5％SDS，5x Denhardt′s(0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％Ficoll 400)以及100μg/ml鮭魚精DNA的溶液中，在溫度為(“待使用探針的Tm”-25℃)下過夜培養。
本發明同樣包含在嚴格性更低的雜交條件下與本發明的多聚核苷酸雜交的核酸分子。雜交嚴格性和信號檢測主要通過操作甲酰胺的濃度(更低百分比的甲酰胺導致減低的嚴格性)，鹽濃度或者溫度而被改變。嚴格性更低的條件的例子包括，在含有6x SSPE(20x SSPE＝3M氯化鈉；0.2M磷酸二氫鈉；0.02M EDTA，pH 7.4)，0.5％SDS，30％甲酰胺以及100μg/ml鮭魚精阻斷DNA(blocking DNA)的溶液中在37℃下培養過夜，然后于50℃用1×SSPE，0.1％SDS進行洗滌。為了實現還要低的嚴格性，在嚴格雜交之后，可能在更高鹽濃度(例如，5×SSC)下執行洗脫。
上文中提到的條件可以通過用于抑制雜交實驗中的背景的備選阻斷試劑的添加和/或替換而被改變。代表性的阻斷試劑包括Denhardt′s試劑，BLOTTO，肝素，變性的鮭魚精子DNA以及商業可得制劑。在一些情況下，可能需要改變雜交條件的其它因素，取決于所述改變。

此外，與本發明公開的核苷酸序列(SEQ ID NO1)具有至少60％，優選70％，更優選80％，還要優選90％的同源性的核酸是在本發明范圍內的。
使用，例如，計算機程序DNASIS-Mac(Takara Bio)，計算機算法FASTA(version 3.0；Pearson，W.R.et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.，852444-2448，1988)或者計算機算法BLAST(version 2.0；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)，同源性可以被確定。
本發明的多聚核苷酸可以由任意多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸組成，并且可以是未修飾的RNA或者未修飾的DNA，或修飾的RNA或者修飾的DNA。例如，多聚核苷酸可以由以下組成單鏈或者雙鏈DNA；為單鏈區域和雙鏈區域的混合物的DNA；單鏈或者雙鏈RNA；為單鏈區域和雙鏈區域的混合物的RNA；或者含有可以是單鏈的，更通常地是雙鏈的DNA和RNA的雜交分子，或者單鏈區域和雙鏈區域的混合物。該多聚核苷酸可以包含出于穩定性或其它原因被修飾的一個或多個核苷酸，或DNA或RNA骨架。“修飾的”核苷酸的例子包括三苯甲基化(tritylated)核苷酸以及不常見核苷酸，比如肌苷。對于DNAs和RNAs，多種修飾可以被執行。因此“多聚核苷酸”包括化學的，酶的或代謝的修飾形式。
通過其中宿主細胞在RNase III可以被表達的條件下培養，并且從培養液中收集RNase III的方法來例證使用基因工程技術生成酶或多肽的方法。宿主細胞可以用質粒轉化，在該質粒內，編碼RNase III的DNA序列與適當的啟動子，操縱子和終止子序列一起被插入到在宿主生物中復制的載體中，其具有在該宿主生物中表達該酶的功能。或者，宿主細胞可以通過將編碼該蛋白酶的DNA序列連同適當的啟動子，操縱子(operator)和終止子序列整合入宿主細胞的DNA中而被轉化，其具有在該宿主生物中表達該酶的功能。
本發明的RNase III可以使用基因工程技術生成，其中傳統的RNase III-編碼DNA以關于RNase III的氨基酸序列的知識為基礎而被修飾，上述RNase III的氨基酸序列是基于編碼所述RNase III等的多聚核苷酸獲得的。
盡管并不意在限制本發明，本發明具有RNase III活性的多肽包括將下列對象加入到蛋白中的多肽來自表達載體的序列，比如表達或翻譯增強序列(例如，Perfect DB序列)，或者氨基酸序列，例如用于純化表達的蛋白的標簽(tag)序列(例如組氨酸標簽序列(His tagsequence))，或者用來去除表達的蛋白的N-末端額外序列的序列(例如，因子Xa序列)。這樣的多肽的例子包括，但不限于，具有SEQ IDNO5氨基酸序列的具有Rnase III活性的多肽。
此外，本發明的具有Rnase III活性的多肽可以是與具有結合核酸活性的蛋白(例如，具有合成RNA活性的蛋白)的融合蛋白的形式。
關于用于生成本發明具有RNase III活性的多肽的載體沒有特別的限制。可以使用任意商業可得的載體或者表達系統。特別地，可以使用pET系統(Novagen)，例如，盡管并不意在限制本發明。另外，可以優選使用具有能夠在低溫下起作用的啟動子的載體。其例子包括在WO99/27117中描述的pCold系列載體。
使用如在WO 99/27117中描述的pCold系列載體的生產方法例證了本發明生產方法的一個實施方案。
根據本發明的生產方法可以優選使用任意載體，只要該載體可以用來表達多肽，該多肽可以保留功能，通過該功能siRNA可以被生成。
此外，可以包括一種載體，該載體在多肽表達時，能夠表達包涵體形式的多肽，但其功能可以通過后來的再折疊過程恢復，前提是獲得最終能夠保留其功能的多肽是可能的，通過所述功能可以生產siRNA。
本發明的RNase III可以根據收集Escherichia coli重組酶的常見的方法而被收集。特別地，當Escherichia coli重組體被培養后，可以采用傳統的分離方法，比如離心或過濾，從培養液中分離細胞。破壞該細胞來制備在接下來的純化過程中作為粗酶溶液使用的無細胞提取物。如果該酶分泌在細胞外面，已除掉細胞的培養上清液可以作為粗酶溶液使用。盡管粗酶溶液本身可以被使用，它也可以在使用如超濾或沉淀作用的手段回收，以及采用適當方法粉碎之后被使用，如果需要的話。純化酶的常見方法，比如采用適當陽離子交換樹脂，陰離子交換樹脂，羥基磷灰石，親和層析，疏水層析，凝膠過濾等的層析，的組合可以用于純化中。
如果將使用基因工程技術生成多肽或該產物將被使用，那么該多肽的來源生物大大地影響生產的效率或使用的效果。于是，本發明的多肽相比于人類Dicer可以低成本大數量的被生成。此外，相比于Dicer，它適用于大量底物的處理，因為未被切割的底物的量很少以及反應時間短。
(2)使用本發明的多肽降解dsRNA的方法本發明降解dsRNA的方法的特征在于使用如上文(1)中描述的多肽。例如，根據本發明的方法使用上文中提到的多肽，通過控制反應條件(時間，溫度，酶濃度，等)可以制備長度在特定范圍內的siRNA。盡管并不意在限制本發明，例如，因為與Escherichia coli RNase III的反應條件(30℃的反應溫度)相比，反應可以在溫和的反應條件下進行，因此便利和有效地制備其在RNA干擾中的效果可以預期的一定長度的siRNA是可能的。
此外，本發明的方法的特征在于它是在具有結合核酸活性的蛋白的存在下執行的。關于具有結合核酸活性的蛋白沒有特別的限制，只要它能夠導致dsRNA降解活性的提高。例如，上文中提到的具有結合RNA活性的蛋白可以優選被使用。
具有結合RNA活性的蛋白的例子包括，但不限于，冷激蛋白(Csp)。特別地，優先使用可以在正常溫度范圍內行使功能的冷激蛋白。優選來自嗜熱細菌或者熱穩定細菌的冷激蛋白。盡管并不意在限制本發明，例如，如Protein Science，8394-403(1999)中描述的具有SEQ IDNO12的氨基酸序列(由核苷酸序列SEQ ID NO13編碼的氨基酸序列)的來自Thermotoga maritima的冷激蛋白B(CspB)，如Mol.Microbiol.，11(5)833-839(1994)中描述的來自Escherichia coii的CspB蛋白，或者如J.Bacteriol.，174(20)6326-6335(1992)中描述的來自Bacillus subtilis的CspB蛋白可以優選的被使用。
通過組合使用CspB蛋白與如上文(1)中描述的多肽來提高降解dsRNA的活性是可能的。根據本發明的方法，具有結合核酸活性的蛋白(例如，具有合成RNA活性的蛋白)可以是與本發明的具有RNaseIII活性的多肽形成的融合蛋白的形式。
(3)用于本發明的方法的組合物本發明的組合物是用于有效執行降解成特定長度dsRNA的反應的組合物。例如，它是用于高效制備其在RNA干擾中的效果可以被預期的一定長度siRNA的組合物。該組合物是包含(1)中描述的具有RNaseIII活性的多肽的組合物。
具有RNaseIII活性的多肽可以是下列對象被加入到該蛋白中的多肽來自表達載體的序列比如表達或翻譯增強序列(例如，Perfect DB序列)，或者氨基酸序列，比如用于純化表達的蛋白的標簽序列(例如，組氨酸標簽序列)，或者用于除掉表達的蛋白N端額外序列的序列(例如，因子Xa序列)。這樣的多肽的例子包括，但不限于，具有RNase III活性的具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的多肽。此外，本發明的組合物可以包含用來穩定該多肽的緩沖液。
該組合物可以包含具有結合核酸活性的蛋白。可以優選使用冷激蛋白，因為該蛋白具有結合核酸的活性，盡管并不意在限制本發明。例如，可以優選使用來自嗜熱細菌或熱穩定細菌的冷激蛋白(Csp)。來自Thermotoga maritima的具有SEQ ID NO12氨基酸序列(由SEQID NO13的核甘酸序列編碼的氨基酸序列)的CspB蛋白是優選的。
在本發明的組合物的另一個實施方案中，該組合物可以包含上文中提到的具有結合核酸活性的蛋白與本發明的具有RNase III活性的多肽的融合蛋白。
(4)用于本發明的方法的試劑盒用于本發明的方法的試劑盒是用來有效進行降解成特定長度dsRNA的反應的試劑盒。例如，它是用來有效制備在RNA干擾中的效果可以預期的一定長度siRNA的試劑盒。
本發明的試劑盒可以包含具有RNase III活性的多肽。如上文(1)中描述的可以優選地被用作具有RNase III活性的多肽。此外，本發明的試劑盒可以包含用來穩定該多肽的緩沖液。
該試劑盒可以包含具有結合核酸活性的蛋白。冷激蛋白可以優選地被用作該具有結合核酸的活性的蛋白，盡管并不意在限制本發明。例如，可以優選使用來自嗜熱細菌或熱穩定細菌的冷激蛋白(Csp)。優選來自Thermotoga maritima的具有SEQ ID NO12氨基酸序列(由SEQID NO13核苷酸序列編碼的氨基酸序列)的CspB蛋白。
在本發明的試劑盒的另一個實施方案中，該試劑盒可以包含上文中提到的具有結合核酸活性的蛋白和本發明的具有RNase III活性的多肽的融合蛋白。
本發明的試劑盒可以包含不同于上文中描述的那些的組分，比如作為底物用于合成dsRNA的試劑，用于純化由反應產生的特定長度dsRNA的試劑，或者用于將它轉變成生物學樣品的試劑。盡管并不意在限制本發明，例如，它可以包含用于純化作為降解產物的siRNA的試劑，用于將它轉變成生物學樣品等的試劑。
使用本發明的試劑盒，便利和有效地制備在RNA干擾中其效果可以預期的一定長度的siRNA是可能的。
實施例 如下實施例更詳細的闡釋了本發明，但不是被解釋為限制其范圍的。
實施例1散彈槍文庫(shotgun library)的制備(1)基因組DNA的制備Shewanella sp.Ac10被接種于5ml的含有0.15g/ml胰蛋白胨，0.01g/ml酵母提取物，0.3g/ml氯化鈉，0.01g/ml葡萄糖，11.5mM磷酸氫二鉀，7.4mM磷酸二氫鉀以及4mM硫酸鎂的培養基中，并在15℃培養40小時。培養物在5000rpm離心1分鐘。作為沉淀獲得的細胞被懸浮在500μL的包含25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)，50mM葡萄糖以及10mM EDTA的溶液中。將50μL的10％SDS加于懸液中并充分混合該混合物。將5μL的20mg/ml的蛋白酶K(Takara Bio)加入其中。混合物在50℃培養3小時。將500μL的氯仿另外加入其中。混合物輕微振蕩30分鐘并在10000×g下離心10分鐘獲得上清液。將1.5ml的乙醇加于上清液中。通過使用細棒(tip)纏繞收集似棉花形式的基因組DNA，用70％的乙醇沖洗兩次，在50℃干燥并溶解在100μL的含有1mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)和0.1mM EDTA的溶液中來獲得基因組DNA溶液。
(2)文庫的構建將實施例1-(1)中獲得的基因組DNA溶液的濃度調整到2μg/200μL。使用Hydrosher(Gene Machines)在循環20和速度4的條件下基因組切割DNA，導致平均鏈長為1.0Kbp。將2μL的Pellet paint(Novagen)，20μl的3M醋酸鈉(pH5.2)以及600μl的乙醇加于被切割DNA溶液中用于乙醇沉淀。沉淀物被干燥并溶解在20μL的TE緩沖液中(10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)及1mM EDTA)。使用TaKaRa BKL試劑盒(Takara Bio)根據附上的說明將5μL的溶液用于平端化反應，kination反應以及連接反應中。對于連接反應，pUC18SmaI/BAP(Amersham Pharmacia)或者pUC118HincII/BAP(TakaraBio)被用作載體。使用該試劑盒獲得的溶液的體積用TE緩沖液調整到100μL。對它進行苯酚/氯仿提取以及乙醇沉淀，并且將沉淀溶解在20μL的TE緩沖液中。50μL的DH10B electro細胞(Gibco BRL)作為Escherichia coli感受態細胞加入到連接混合物中，并且使用GenePulser(Bio-Rad)在1.5kV，200Ω和25μF的條件下執行電穿孔。將1ml的SOC培養基加于該溶液中，在37℃將混合物振蕩1小時，并且在含有100μg/ml氨芐青霉素，100μg/ml IPTG以及40μg/ml X-gal的LB瓊脂培養基中進行培養。結果，大約1000克隆出現。對于部分克隆，通過PCR反應檢測插入。于是，由4百萬克隆組成的散彈槍文庫被制備。
實施例2基因組序列的分析(1)基因組序列的確定如下文所述，由實施例1中獲得的散彈槍文庫中的43，200Escherichia coli克隆制備質粒DNAs。Escherichia coli克隆在200μL的含有1g/ml胰蛋白胨，0.5g/ml酵母提取物和1g/ml氯化鈉的培養基中37℃培養14小時。培養物在5000rpm被離心1分鐘。使用質粒提取機器人(plasmid extraction robot)(Beckman)將作為沉淀獲得的細胞懸浮在80μL的含有25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，50mM葡萄糖以及10mM EDTA的溶液中。將80μL的含有0.2N氫氧化鈉以及1％SDS的溶液加入其中，并且另外加入80μL的3M醋酸鉀溶液(pH5.2)。懸液被轉移到NA板(Millipore)上，細胞殘渣通過抽吸除掉。澄清溶液轉移到已加入150μL的8M胍溶液的FB板(Millipore)上。通過抽吸質粒DNA被吸附到FB板上。用80％的乙醇溶液沖洗3次后，用70μL的含有10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)及1mM EDTA的溶液洗脫質粒DNA。
將0.875μL無菌水，各0.125μL的引物M13-47和RV-M(10pmol/μl，均來自Takara Bio)以及2μL的DynamicET加于2μL的質粒DNA中。該混合物用于如下PCR中40循環的95℃30秒，50℃20秒以及60℃1分20秒。采用測序儀MegaBACE 1000(AmershamPharmacia)對該反應混合物進行核苷酸序列分析。采用計算機程序CAP4(Pracel)，對如此獲得的核苷酸序列數據進行裝配(assembly)、比對以及分析，以構建單一基因組序列。
(2)基因的分析應用計算機程序Genmark v.2.4c(Gene Probe，Inc.)對在實施例2-(1)中獲得的基因組序列進行ORF分析。結果，推斷出4935ORFs。使用計算機算法BLAST(Ver2.0)針對基因數據庫GenBank對所述開放閱讀框進行同源性搜索。然后，評估了3057所述ORFs的功能。通過BLAST搜索獲得各個ORFs與酶的同源性信息。從它們中獲得了來自冷適應微生物Shewanella sp.Ac10的被推測為編碼RNase III并且具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的興趣基因。
實施例3RNase III的克隆及表達(1)表達載體的構建如下構建表達載體。
首先，基于在實施例2-(2)中獲得的RNase III的核苷酸序列，使用DNA合成儀合成分別具有核苷酸序列SEQ ID NOS2和3的合成引物1和2，并且根據傳統的方法純化。合成引物1是在核苷酸11-16處具有對限制性酶EcoRI的識別序列并且在核苷酸18-37處具有對應于RNase III氨基酸序列(SEQ ID NO4)中1-7位氨基酸的核苷酸序列的合成DNA。合成引物2在11-16位核苷酸處具有對限制性酶BamHI的識別序列并且在20-37位核苷酸處具有對應于RNase III氨基酸序列(SEQ ID NO4)中221-226位氨基酸的核苷酸序列。
采用上文中提到的合成引物執行PCR。該PCR的反應條件如下。
簡而言之，通過添加1μL實施例1-(1)中制備的基因組DNA，10μL的10×Pyrobest緩沖液(Takara Bio)，8μL的dNTP混合物(TakaraBio)，各20pmol的合成引物1和2，5U的Pyrobest DNA聚合酶(TakaraBio)以及無菌水來制備總體積為100μL的反應混合物。該反應混合物置于TaKaRa PCR熱循環儀MP(Takara Bio)中并如下用于反應30循環的94℃30秒，55℃30秒和72℃2分鐘。
反應后，將5μL的反應混合物在1.0％的瓊脂糖膠上進行電泳。觀察到的大約680bp的感興趣DNA片斷從電泳膠中回收并純化并經受乙醇沉淀。乙醇沉淀后，回收的DNA懸浮在64μL的無菌水中，使用限制性酶EcoRI(Takara Bio)和BamHI(Takara Bio)雙酶切。EcoRI-BamHI酶切產物在1.0％的瓊脂糖膠上電泳后被提取和純化以獲得EcoRI-BamHI-酶切的DNA片斷。
接下來，用質粒載體pMM047轉化的Escherichia coli JM109被培養。將該菌株指定和顯示為Escherichia coli JM109/pMM047并在1997年10月31日(原始保藏日期)以編號FERM P-16496保藏在國際專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，國家高級科學和技術協會(National Institute of Advanced Science andTechnology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，并以編號FERM BP-6523保藏在國際專利生物保藏中心，國家高級科學和技術協會(要求傳送至國際保藏機構的日期1998年9月24日)。根據傳統的方法純化質粒載體pMM047。基于這個載體根據WO99/27117中的實施例1-6描述的方法制備pCold08NC2載體。
采用與EcoRI-BamHI酶切的DNA片斷的制備中相同的限制性酶切割pCold08載體，并且末端被去磷酸化。然后，使用DNA連接試劑盒Ver.1(Takara Bio)將該載體與EcoRI-BamHI酶切的DNA片斷混合和連接。20μL的連接混合物用于轉化Escherichia coli JM109，并且轉化體在含有濃度為1.5％(w/v)瓊脂的LB培養基上(含有50μg/ml的氨芐青霉素)生長。
感興趣的DNA片斷被插入其中的質粒通過測序來確定。該重組質粒指定為pCold08SH-RNIII。這個質粒指定和顯示為pCold08 SHE-RNIII并在2003年9月22日以編號FERM P-19526保藏在國際專利生物保藏中心，國家高級科學和技術協會(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，并以編號FERMBP-10075保藏在國際專利生物保藏中心，國家高級科學和技術協會(要求傳送至國際保藏機構的日期2004年7月28日)。
(2)表達和純化在實施例3-(1)中制備的pCold08 SHE-RNIII用于轉化Escherichiacoli BL21。轉化體在含有濃度為1.5％(w/v)瓊脂的LB培養基上(含有50μg/ml的氨芐青霉素)生長。長大的克隆接種于2.5ml的LB液態培養基(含有50μg/ml的氨芐青霉素)中并在37℃培養過夜。部分培養物接種于100mi的LB培養基中并在37℃培養至對數生長期。培養后，培養物在15℃的培養箱中振蕩10分鐘，將IPTG加入至最終濃度為1.0mM，并繼續在15℃培養24小時用于誘導表達。通過離心收集細胞，并被懸浮在5ml的細胞破碎溶液(50mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，100mM氯化鈉，0.5mM EDTA，1％Triton X-100，1mM二硫蘇糖醇，2mM苯甲基磺酰氟)中。通過超聲處理破碎的細胞用于離心(11,000rpm，20分鐘)以分開上清液提取物和沉淀。
如下，使用鎳柱進一步純化大約5ml的上清液提取物。
將10ml的緩沖液A(20mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，100mM氯化鈉，1mM二硫蘇糖醇，0.1％Triton X-100)添加到對應于1ml樹脂體積的Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)中并與之相混合。該混合物在1,500rpm下離心幾分鐘。棄掉上清液并收集大約1ml的樹脂。將大約5ml的由裂解細胞制備的上清液加于該樹脂中，在4℃使用旋轉振動儀輕微混合約1小時。接著，其中已經吸附上感興趣蛋白的樹脂填充在15mm的柱子中，并用5ml的緩沖液A沖洗兩遍。該樹脂接著用5ml的緩沖液B(20mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，100mM氯化鈉，1mM二硫蘇糖醇，0.1％Triton X-100，40mM咪唑)沖洗。用5ml緩沖液C(20mMtris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，800mM氯化鈉，1mM二硫蘇糖醇，0.1％Triton X-100，40mM咪唑)進一步沖洗該樹脂，然后是5ml緩沖液B，以除掉不同于感興趣蛋白的非必要蛋白。
沖洗后，使用3ml的緩沖液D(20mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，100mM氯化鈉，1mM二硫蘇糖醇，0.1％Triton X-100，100mM咪唑)執行洗脫。洗脫物針對500ml的緩沖液E(50mM tris-鹽酸緩沖液(pH 8.5)，100mM 氯化鈉，0.5mM EDTA，0.1％Triton X-100，1mM二硫蘇糖醇)透析并且使用Centricon(Amicon)濃縮大約10倍(大約300μL)。當將純化和濃縮后的樣品的一部分用于10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，在相應于大約27,500分子量的位置處觀察到感興趣蛋白的帶。該蛋白濃度大約是4mg/ml。當使用Anti His HRP Conjugate(Qiagen)根據附上的說明，使用抗-his tag抗體對該樣品執行Western blotting檢測時，在顯色后檢測到感興趣蛋白的帶。
該蛋白是具有RNase III活性的多肽，它具有添加的氨基酸序列，包括Perfect DB序列，His tag序列和因子Xa序列，以及SEQ ID NO5的氨基酸序列。
實施例4RNaseIII活性的測量(1)降解dsRNA的活性測量了實施例3-(2)中制備的RNase III樣品降解dsRNA的活性。如下測量該活性。
使用TurboScript T7轉錄試劑盒(GTS)根據附上的說明書合成作為底物用于活性測量的dsRNA。
特別地，通過將來自質粒pQBI125(Wako Pure Chemical Industries)的編碼紅移綠色熒光蛋白(以下稱為rsGFP)(SEQ ID NO6)的基因插入到質粒pDON-AI(Takara Bio)中來構建pDON-rsGFP。使用pDON-rsGFP作為模板同時使用具有T7啟動子序列的引物dsr-1(SEQID NO7)以及引物dsr-2(SEQ ID NO8)執行PCR以獲得擴增產物。使用得到的雙鏈DNA作為模板以及T7RNA聚合酶，通過RNA合成反應來制備大約700-bp的dsRNA(以下稱為rsGFP-dsRNA) 通過添加5μg的如上文所述制備的rsGFP-dsRNA，1μL在實施例3-(2)中制備的蛋白樣品，1μL 30mM的氯化鎂溶液，2μL的5×反應緩沖液(250 mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，1.25M氯化鈉，0.5％Triton X-100，5mM二硫蘇糖醇)和無核酸酶的水來制備總體積為10μL的反應混合物。
對于作為對照的商業可得的來自Escherichia coli(Epicentre)的RNase III，通過將1μL的該酶溶液以及5μg的作為底物的rsGFP-dsRNA添加至含有33mM的tris-醋酸(PH7.8)，66mM的醋酸鉀，10mM的醋酸美以及0.5mM的二硫蘇糖醇的緩沖液中來制備總體積為10μL的反應混合物。
在上文提到的反應混合物被制備并在給定的時間段內在30℃(對于來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽)或者在37℃(對于來自Escherichia coli的RNase III)反應之后，5μL的各反應混合物在15％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，并用溴化乙錠染色用來觀察切割產物。

結果，使用來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽切割30分鐘后，觀察到100堿基對或更長的切割產物，其是部分降解階段的指示。即使切割1小時后，大于20堿基對的切割片斷也被觀察到。切割過夜后(大約18小時)觀察到與切割1小時幾乎相同的切割模式。主要的降解產物在對應于大約20堿基對長度的位置處被觀察到。另一方面，對于來自Escherichia coli的RNase III，經證實，切割30分鐘后主要的產物是大約10堿基對的小的降解產物。
基于以上，經證實，本發明的來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽不趨向于生成大約10堿基對的小的降解產物，并且通過部分降解可以容易地制備降解產物。
(2)溫度敏感性的檢測使用實施例3-(2)中制備的RNase III樣品來檢測降解dsRNA的活性的溫度敏感性。來自Escherichia coli(Epicentre)的RNase III被用作對照。如下測量該活性。
通過添加1μL實施例3-(2)中制備的蛋白樣品，1μL的30mM的氯化鎂溶液，2μL的5×反應緩沖液(250mM tris-鹽酸緩沖液(pH 8.5)，1.25M氯化鈉，0.5％Triton X-100，5mM二硫蘇糖醇)和無核酸酶的水來制備總體積為5μL的酶溶液。它在30℃，40℃，50℃或者60℃被處理10分鐘或20分鐘。將5μg實施例4-(1)中使用的rsGFP-dsRNA加入其中。該總體積為10μL的得到的混合物在30℃反應1小時。
對于作為對照的來自Escherichia coli(Epicentre)的RNase III，通過將1μL的該酶溶液添加至含有33mM的tris-醋酸(PH7.8)，66mM的醋酸鉀，10mM的醋酸鎂以及0.5mM的二硫蘇糖醇的緩沖液中來制備總體積為5μL的反應混合物。它在40℃，50℃，60℃或者70℃被處理10分鐘或20分鐘。將5μg的rsGFP-dsRNA加入其中。總體積為10μL的所得混合物在37℃反應1小時。
反應后，5μL的各反應混合物在15％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳中并用溴化乙錠染色來觀察切割產物。
結果，對于來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽，在50℃處理20分鐘后沒有觀察到降解dsRNA的活性。另一方面，對于來自Escherichia coli的RNase III，在60℃處理20分鐘后沒有觀察到該活性。
于是，證實了，來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽是更溫度敏感的并且可以在比來自Escherichia coli的RNase III更低的溫度下失活。
實施例5使用本發明來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽制備的dsRNA降解產物的RNA干擾效果被檢測了。商業可得的來自Escherichia coli的RNase III用作對照。根據實施4-(1)中描述的方法制備dsRNA降解產物。特別地，通過在30℃切割60分鐘(對于來自冷適應微生物的RNase III)，37℃切割60分鐘(對于利用來自Escherichiacoli的RNase III的完全降解)，或者37℃切割10分鐘(對于利用來自Escherichia coli的RNase III的部分降解)15μg的rsGFP-dsRNA來制備dsRNA降解產物。切割產物使用RNA純化柱1，2(Gene TherapySystems)純化并被用于如下的評估。
RNA干擾中評估如下執行。
簡而言之，在轉移dsRNA降解產物之前24小時，適當數量(5×104細胞)的293細胞接種于含有補充10％的FBS和1％的青霉素/鏈霉素的D-MEM培養基(Sigma)的24孔板中，并在CO2培養箱中培養過夜。細胞培養至大約80％匯合。3μL的TransIT 293轉染試劑(TransfectionReagent)(Takara Bio)添加到50μL的無血清培養基中。混合物被劇烈攪拌并允許在室溫放置5分鐘。0.3μg的pQBI25(Wako PureChemical Industries)加入其中，并且該混合物輕微地被混合并允許在室溫放置5分鐘。4μL的TransIT-TKO試劑加入其中，并且該混合物輕微地被混合并允許在室溫放置5分鐘。500ng的上文制備的dsRNA降解產物加入其中，混合物輕微混合并允許在室溫放置5分鐘以獲得DNA/dsRNA降解產物溶液。將DNA/dsRNA降解溶液逐滴加于每孔中250μL的無血清培養基中，并且該混合物輕微地被混合以便使孔內的溶液成為均一的。將0.3μg的pQBI25或無菌水單獨加入對照中。細胞在CO2培養箱中培養24小時。使用FACS Vantage(Becton-Dickinson)對細胞進行流式細胞術以確定與只有載體(DNA)的對照相比轉移的DNA/dsRNA降解產物溶液對rsGFP的表達的抑制效果。結果示于表1中。
表1
與對照(單獨載體)相比，較小的平均熒光值，如表1中示出的，代表更多的RNA干擾。已證實，使用來自Shewanella sp.Ac10的RNaseIII的降解產物比來自E.coli的RNase III的完全或部分降解產物顯示了更強的RNA干擾效果。
基于以上，已證實，本發明的來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽適用于用于RNA干擾的siRNA的制備。
實施例6對另一種dsRNA底物的RNase III活性使用由熒光素酶基因制備的dsRNA作為底物，評估了實施例3-(2)中制備的RNase III樣品的dsRNA降解活性。使用TurboScript T7轉錄試劑盒(GTS)根據附上的說明以與實施例4-(1)中相似的方式來合成dsRNA。
特別地，使用質粒pGL3-基本載體(Basic vector)(Promega)作為模板，和具有T7啟動子序列的引物dsl-1(SEQ ID NO9)以及引物dsl-2(SEQ ID NO10)(擴增片斷的長度大約500堿基對)，或者引物dsl-1以及引物dsl-3(SEQ ID NO11)(擴增片斷的長度大約1000堿基對)來執行PCR，以從插入到質粒pGL3-基本載體(Promega)中的熒光素酶-編碼基因中獲得兩段擴增產物。使用得到的雙鏈DNAs之一作為模板以及T7RNA聚合酶，通過RNA合成反應來制備大約500bp或者大約1000bp的dsRNA。
通過添加5μg如上文描述制備的dsRNA，1μL實施例3-(2)中制備的蛋白樣品，1μL 30mM的氯化鎂溶液，2μL 5×反應緩沖液(250mMtris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，1.25M氯化鈉，0.5％Triton X-100，5mM二硫蘇糖醇)和無核酸酶水來制備總體積為10μL的反應混合物。
上文提到的反應混合物被制備并在給定的時間段內于30℃反應后，5μL的反應混合物在15％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并用溴化乙錠染色來觀察切割產物。
結果，即使切割1小時之后作為切割產物的大于20堿基對的切割片斷被觀察到。切割過夜后(大約18小時)與切割1小時幾乎相同的切割模式被觀察到。
基于以上，已證實，本發明的來自冷適應微生物的具有RNase III活性的多肽不趨向生成大約10堿基對的小的降解產物，并且即使模板被改變或者作為底物的dsRNA的長度被改變，通過部分降解仍然可以容易地制備降解產物。
實施例7對dsRNA的產生和降解有貢獻的因子的檢測(1)為了檢測對dsRNA的產生和降解有貢獻的因子，在正常溫度范圍內具有結合核酸活性的蛋白被檢測。
獲得這樣的具有結合核酸活性的蛋白是困難的。于是，來自Thermotoga maritima的具有SEQ ID NO12氨基酸序列的CspB蛋白被用作模型蛋白。根據如Protein Science，8394-403(1999)中描述的方法制備該蛋白。
(2)來自Thermotoga maritima的CspB蛋白對dsRNA降解的效果如下測量CspB添加后降解dsRNA的活性。
簡而言之，當RNase III被用作酶時，通過添加1μL實施例3-(2)中制備的蛋白樣品(酶溶液)，1μL上文(1)中制備的CspB溶液，1μg作為底物的dsRNA，1μL 30mM的氯化鎂溶液，2μL 5×反應緩沖液(250mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，1.25M氯化鈉，0.5％ Triton X-100，5mM二硫蘇糖醇)和無核酸酶水來制備總體積為10μL的反應混合物。
該CspB蛋白添加至終濃度為9.2ng/μl，18.4ng/μl或者92ng/μl。1μL10mM的磷酸鉀緩沖液(PH7.5)作為CspB的shape buffer添加至對照(無添加物)中。
當上文提到的反應混合物被制備并在30℃反應1小時后，5μL的各反應混合物在15％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并用溴化乙錠染色來觀察切割產物。
結果，在每一量下，由于CspB的添加導致的dsRNA降解的提高被觀察到。
實施例8由rsGFP-dsRNA制備的dsRNA降解樣品的評估測定了使用本發明的來自冷適應微生物的RNase III制備的dsRNA降解產物的RNA干擾效果。商業可得的E.coli RNase III(Epicentre)被用作對照。基本上根據實施例4-(1)中描述的方法制備dsRNA降解產物。特別地，使用2μL的如實施例3-(2)中描述的來自Shewanella的RNase III在30℃切割實施例4-(1)中制備的10μg的rsGFP-dsRNA 1小時。對于商業可得的E.coli RNase III(1U/μL)，使用2μL的該RNase III在37℃切割10分鐘(部分降解)或切割(60分鐘(完全降解)10μg的dsRNA。切割產物使用RNA純化柱1，2(Gene TherapySystems)純化并如下用于RNA干擾中的評估。
簡而言之，在轉移siRNA之前24小時，適當數量(1.5×105細胞)的293細胞接種于含有補充10％的FBS和1％的青霉素/鏈霉素的D-MEM培養基(Sigma)的24孔板中，并在CO2培養箱中培養過夜。細胞培養至大約80％匯合。將1μL的Genejuice轉染試劑(Takara Bio)添加到49μL的無血清培養基中。混合物被劇烈攪拌并允許在室溫放置5分鐘。0.3μg的pQBI25(Wako Pure Chemical Industries)加入其中，混合物輕微被混合并允許在室溫放置5分鐘。
平行的，3μL的Ribojuice轉染試劑(Takara Bio)添加至另一只試管中的47μL的無血清培養基中，并將混合物劇烈攪拌。允許在室溫放置5分鐘后，55.6ng的dsRNA降解產物被加入其中，混合物被輕微混合并允許在室溫放置5分鐘。
如上文所述制備的兩種類型溶液中的一種逐滴加入到每孔中250μL的補充10％FBS的D-MEM培養基中，并且輕微混合混合物以便使孔內的溶液成為均一的。載體(DNA)或無菌水單獨加入對照中。細胞在CO2培養箱中培養24小時。采用FACS Vantage(Becton-Dickinson)將細胞用于流式細胞術以確定轉移的DNA/dsRNA降解產物溶液與只有載體(DNA)的對照相比對rsGFP的表達的抑制效果。結果示于表2中。
表2
相比于對照(單獨載體)，更小的平均熒光強度值，如表2中示出的，代表更強的RNA干擾。已證實，使用來自Shewanella sp.Ac10的RNase III獲得的降解產物顯示了RNA干擾效果，如同使用商業可得E.coli的RNase III獲得的，并且該顯示的RNA干擾效果強于使用商業可得E.coli的RNase III獲得的降解產物的效果。
基于以上，已證實，本發明的RNase III適用于RNA干擾的制備。
從實施例6中制備的細胞樣品中提取的總RNAs用于實時RT-PCR中以量化rsGFP的mRNAs，用于RNA干擾評估。
特別地，使用trizole(Invitrogen)根據附上的說明，在siRNA轉移后在37℃CO2培養箱中24小時培養的細胞中提取和純化總RNA。通過添加80ng的該總RNA，4μL的5xM-MLV緩沖液(Takara Bio)，1μL 10mM的dNTPs(Takara Bio)，100pmol的隨機六聚體(randomhexamer)，20U的RNase抑制劑(Takara Bio)，100U的M-MLV逆轉錄酶和無菌水，制備總體積為20μL的反應混合物。該反應混合物置于TaKaRa PCR熱循環儀SP(Takara Bio)中并進行42℃10分鐘的反應，然后95℃2分鐘。20μL的反應稀釋液(1xM-MLV緩沖液，0.5mMdNTP混合物)添加至反應混合物中。所得混合物的10μL等分被分配。2.5μl的10xR-PCR緩沖液(Takara Bio)，0.3μl 250mM的Mg2+，0.75μl 10mM的dNTPs，1.25U的TakaRa Ex Taq R-PCR(TakaraBio)，2.5μl的SYBR Green(Takara Bio)的3000倍稀釋于無菌水中的溶液以及1.25μL 100％的DMSO添加至10μL的該反應混合物中。另外添加各5pmol的用于檢測β-肌動蛋白(Takara Bio)，GAPDH(TakaraBio)，rsGFP(rsGFP-F(SEQ ID NO14)，rsGFP-R(SEQ ID NO15))或者Neo(Neo-F(SEQ ID NO16)，Neo-R(SEQ ID NO17))的合成引物以及無菌水使總體積為25μL。該反應混合物置于Smart Cycler II Unit(Takara Bio)中，95℃下熱變性10秒，并如下進行反應45循環的95℃5秒和60℃20秒。分析獲得的數據以量化人β-肌動蛋白和GAPDH以及rsGFP和Neo的來自轉化質粒的mRNAs。結果示于表3中。
表3
相比與對照(單獨載體)，更少量的rsGFP mRNA，如表3中示出的，被認為是代表更強的RNA干擾。已證實，使用來自Shewanellasp.Ac10的RNase III獲得的降解產物顯示了效果，如同使用商業可得E.coli的RNase III獲得的，并且該顯示的RNA干擾效果強于使用商業可得E.coli的RNase III所獲得的。
基于以上，已證實，本發明的RNase III適用于用于RNA干擾的siRNA的制備。
實施例9由來自熒光素酶的dsRNA制備的dsRNA降解產物的評估使用實施例3-(2)中制備的樣品以及來自熒光素酶的dsRNA作為底物，執行如實施例8中描述的步驟。檢測了該dsRNA降解產物的RNA干擾效果。實施例6中制備的500-bp的被用作來自熒光素酶的dsRNA。
基本上根據實施例4-(1)中描述的方法制備dsRNA降解產物。特別地，使用2μL的實施例3-(2)中的Shewanella RNase III在30℃切割10μg的該dsRNA 1小時，或者使用2μL的商業可得的E.coli RNase III(1U/μL)在37℃切割10分鐘(部分降解)或60分鐘(完全降解)。切割產物使用RNA純化柱1，2(Gene Therapy Systems)純化并如下用于RNA干擾評估中。使用E.coli RNase III在37℃10分鐘切割的產物用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中，并且對應于大約21bp長度的條帶被切除。將TE緩沖液添加至該被切除的膠條中，混合物在室溫振蕩16小時，并將洗出液用于乙醇沉淀以回收被用作凝膠回收樣品的切割產物。
RNA干擾評估如下進行。簡而言之，在dsRNA降解產物轉移之前24小時，適當數量(1.5×105細胞)的293細胞接種于含有補充10％FBS和1％青霉素/鏈霉素的D-MEM培養基(Sigma)的24孔板中，并在CO2培養箱中培養過夜。細胞培養至大約80％匯合。1μL的Genejuice轉染試劑(Takara Bio)添加至49μL的無血清培養基中。混合物被劇烈攪拌并允許在室溫放置5分鐘。0.5μg的pGL3-對照(Promega)以及0.1μg的pRL-TK(Promega)被加入其中，并且該混合物被輕微混合并允許在室溫放置5分鐘。
平行的，將3μL的Ribojuice轉染試劑(Takara Bio)添加至另一只試管中的47μL的無血清培養基中，并且該混合物被劇烈攪拌。允許在室溫放置5分鐘后，500ng，166.7ng，或55.6ng的siRNA加入其中，并且該混合物被輕微混合并允許在室溫放置5分鐘。
將如上文描述制備的兩種類型溶液中的一種逐滴加入到每孔中250μL的補充10％FBS的D-MEM培養基中，并且該混合物被輕微混合以便使孔內的溶液成為均一的。載體(DNA)或無菌水單獨加入對照中。細胞在CO2培養箱中培養24小時。采用雙熒光素酶報道分子檢測試劑盒(Dual Luciferase Reporter assay kit)(Promega)根據附上的指示說明書對細胞進行檢測，以確定dsRNA降解產物的添加與只有載體(DNA)的對照相比，對GL3蛋白表達的抑制效果。結果示于表4中。

基于以上，已證實，本發明的RNase III適用于用于RNA干擾的siRNA的制備。
實施例10Shewanella RNase III與來自人的Dicer的比較比較了使用來自Shewanella RNase III制備的dsRNA的RNA干擾效果與使用來自人的Dicer制備的dsRNA的RNA干擾效果。實施例9中描述的使用熒光素酶的評估系統被利用。
商業可得Dicer(GTS)被用作來自人的Dicer。實際步驟遵循實施例9中描述的方法，除了待經受dsRNA降解產物轉移的293細胞在CO2培養箱中培養至95％匯合以外。結果示于表5中。
表5
相比與對照(單獨載體)，更少的GL3mRNA量，如表5中示出的，被認為代表更多的RNA干擾。經證實，使用Shewanella.RNase III獲得的siRNA顯示了相當于使用商業可得Dicer獲得的siRNA的RNA干擾效果。
基于以上，已證實，本發明的RNase III適用于用于RNA干擾的siRNA的制備。
工業實用性 本發明提供了具有RNase III活性的多肽，使用該多肽，通過反應條件可以容易地控制一定長度的dsRNA降解產物。該多肽可以用于制備對于RNA干擾最佳的siRNA。此外，根據本發明的方法，用于制備適用于RNA干擾等的siRNA的方法被提供。另外，本發明提供了組合物和試劑盒，使用其本發明的方法可以便利地被執行。
序列列表自由文本 SEQ ID NO2；用來擴增編碼Shewanella sp.AC10 RNase III的基因的合成引物1SEQ ID NO3；用來擴增編碼Shewanella sp.AC10 RNase III的基因的合成引物2SEQ ID NO5；Shewanella sp.AC10 RNase III的表達肽序列SEQ ID NO7；用來擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成引物dsr-1SEQ ID NO8；用來擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成引物dsr-2SEQ ID NO9；用來擴增編碼熒光素酶的基因的合成引物dsl-1SEQ ID NO10；用來擴增編碼熒光素酶的基因的合成引物dsl-2SEQ ID NO11；用來擴增編碼熒光素酶的基因的合成引物dsl-3SEQ ID NO14；用來擴增編碼rsGFP的基因的合成引物rsGFP-FSEQ ID NO15；用來擴增編碼rsGFP的基因的合成引物rsGFP-RSEQ ID NO16；用來擴增編碼Neo的基因的合成引物Neo-FSEQ ID NO17；用來擴增編碼Neo的基因的合成引物Neo-R
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>具有RNase III活性的多肽<130>664746<150>JP 2003-342260<151>2003-09-30<150>JP 2003-409638<151>2003-12-08<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>678<212>DNA<213>Shewanella sp.Ac10<400>1atggaaccca ttaaaaattt gccgcgtttg tgccgtactt taggttatga gttcaataat60attgaattac ttattcaggc cttaacacat cgtagcgcag caaataaaca taatgagcgt 120ttagagtttt taggtgattc gattttatcg atagccattt cagatgcctt atatcatcag 180tttccaaagg cgactgaagg tgatttaagc cgaatgcgcg ccactttagt caaaggtgac 240acgctgacaa tcatagctaa agagttcaag ctaggtgatt atttgtattt aggtcctggt 300gaactcaaaa gtggtggctt tagacgcgaa tctattttag ctgatgctgt agaggctatt 360attggtgctg tctatcttga tgctgatatt gaagtgtgcc gcaagctatt attatcatgg 420tatcaagagc gtttagctga gattaaaccg ggtattaatc aaaaagatcc gaagacaata 480ttgcaagaat acctgcaagg ttttaaaaag ccattgcctg attaccaagt tgttgcagta 540gaaggtgaag cccatgatca aaccttcacc gtagaatgta aaattagtga attagataaa 600
gttgtcaccg gtgtggcaag ttcaagaaga aaagctgaac agcttgccgc tgctcaggta 660ttggagctac tgaataaa 678<210>2<211>39<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼Shewanella sp.AC10 RNase III的基因的合成引物1<400>2cagattccac gaattcgatg gaacccatta aaaatttgc 39<210>3<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼Shewanella sp.AC10 RNase III的基因的合成引物2<400>3ggagaggtct ggatccttat ttattcagta gctcctt 37<210>4<211>226<212>PRT<213>Shewanella sp.Ac10<400>4Met Glu Pro Ile Lys Asn Leu Pro Arg Leu Cys Arg Thr Leu Gly Tyr1 5 10 15Glu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Ile Gln Ala Leu Thr His Arg Ser20 25 30
Ala Ala Asn Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile35 40 45Leu Ser Ile Ala Ile Ser Asp Ala Leu Tyr His Gln Phe Pro Lys Ala50 55 60Thr Glu Gly Asp Leu Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Lys Gly Asp65 70 75 80Thr Leu Thr Ile Ile Ala Lys Glu Phe Lys Leu Gly Asp Tyr Leu Tyr85 90 95Leu Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile100 105 110Leu Ala Asp Ala Val Glu Ala Ile Ile Gly Ala Val Tyr Leu Asp Ala115 120 125Asp Ile Glu Val Cys Arg Lys Leu Leu Leu Ser Trp Tyr Gln Glu Arg130 135 140Leu Ala Glu Ile Lys Pro Gly Ile Asn Gln Lys Asp Pro Lys Thr Ile145 150 155 160Leu Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Phe Lys Lys Pro Leu Pro Asp Tyr Gln165 170 175Val Val Ala Val Glu Gly Glu Ala His Asp Gln Thr Phe Thr Val Glu180 185 190Cys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Lys Val Val Thr Gly Val Ala Ser Ser195 200 205
Arg Arg Lys Ala Glu Gln Leu Ala Ala Ala Gln Val Leu Glu Leu Leu210 215 220Asn Lys225<210>5<211>243<212>PRT<213>人工<220>
<223>Shewanella sp.AC10 RNase III的表達肽序列<400>5Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg Asn1 5 10 15Ser Met Glu Pro Ile Lys Asn Leu Pro Arg Leu Cys Arg Thr Leu Gly20 25 30Tyr Glu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Ile Gln Ala Leu Thr His Arg35 40 45Ser Ala Ala Asn Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser50 55 60Ile Leu Ser Ile Ala Ile Ser Asp Ala Leu Tyr His Gln Phe Pro Lys65 70 75 80Ala Thr Glu Gly Asp Leu Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Lys Gly85 90 95Asp Thr Leu Thr Ile Ile Ala Lys Glu Phe Lys Leu Gly Asp Tyr Leu100 105 110
Tyr Leu Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser115 120 125Ile Leu Ala Asp Ala Val Glu Ala Ile Ile Gly Ala Val Tyr Leu Asp130 135 140Ala Asp Ile Glu Val Cys Arg Lys Leu Leu Leu Ser Trp Tyr Gln Glu145 150 155 160Arg Leu Ala Glu Ile Lys Pro Gly Ile Asn Gln Lys Asp Pro Lys Thr165 170 175Ile Leu Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Phe Lys Lys Pro Leu Pro Asp Tyr180 185 190Gln Val Val Ala Val Glu Gly Glu Ala His Asp Gln Thr Phe Thr Val195 200 205Glu Cys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Lys Val Val Thr Gly Val Ala Ser210 215 220Ser Arg Arg Lys Ala Glu Gln Leu Ala Ala Ala Gln Val Leu Glu Leu225 230 235 240Leu Asn Lys<210>6<211>720<212>DNA<213>人工<220>
<223>紅移綠色熒光蛋白<400>6atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac120ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca180ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa240cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc300ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt360gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac420aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat480ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca540gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat600tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc660cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga720<210>7<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成引物dsr-1<400>7gggtaatacg actcactata gggagaatgg ctagcaaagg ag42<210>8<211>42<212>DNA<213>人工
<220>
<223>用來擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成引物dsr-2<400>8gggtaatacg actcactata gggagatcag ttgtacagtt ca 42<210>9<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼熒光素酶的基因的合成引物dsl-1<400>9gggtaatacg actcactata gggagaatgg aagacgccaa aa 42<210>10<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼熒光素酶的基因的合成引物dsl-2<400>10gggtaatacg actcactata gggagagaac gtgtacatcg ac 42<210>11<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼熒光素酶的基因的合成引物dsl-3<400>11gggtaatacg actcactata gggagaggca gatggaacct ct 42
<210>12<211>66<212>PRT<213>Thermotoga maritima<400>12Met Arg Gly Lys Val Lys Trp Phe Asp Ser Lys Lys Gly Tyr Gly Phe1 5 10 15Ile Thr Lys Asp Glu Gly Gly Asp Val Phe Val His Trp Ser Ala Ile20 25 30Glu Met Glu Gly Phe Lys Thr Leu Lys Glu Gly Gln Val Val Glu Phe35 40 45Glu Ile Gln Glu Gly Lys Lys Gly Pro Gln Ala Ala His Val Lys Val50 55 60Val Glu65<210>13<211>198<212>DNA<213>Thermotoga maritima<400>13atgagaggaa aggttaagtg gttcgattcc aagaagggct acggattcat cacaaaggac 60gaaggaggag acgtgttcgt acactggtca gccatcgaaa tggaaggttt caaaactctg120aaggaaggcc aggtcgtcga gttcgagatt caggaaggca agaaaggtcc acaggcagcg180cacgtgaaag tagttgag 198<210>14<211>20<212>DNA
<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼rsGFP的基因的合成引物rsGFP-F<400>14gccacaacat tgaagatgga20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼rsGFP的基因的合成引物rsGFP-R<400>15gaaagggcag attgtgtgga20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼Neo的基因的合成引物Neo-F<400>16atagcgttgg ctacccgtga20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用來擴增編碼Neo的基因的合成引物Neo-R<400>17gaaggcgata gaaggcgatg20
權利要求
1.具有RNase III活性的多肽，其來自微生物，并且利用該多肽，對RNA干擾有效的長度在特定范圍內的dsRNA降解產物在完全降解后能夠被獲得。
2.具有RNase III活性的多肽，其反應條件可以容易地被控制，并且利用該多肽，長度在特定范圍內、大于使用來自Escherichia coli的RNase III處理dsRNA獲得的最終降解產物的dsRNA降解產物可以被獲得。
3.具有RNase III活性的多肽，其dsRNA降解速度慢于來自Escherichia coli的RNase III的dsRNA降解速度，并且其反應條件可以容易地被控制。
4.具有RNase III活性的多肽，其dsRNA降解速度慢于來自Escherichia coli RNase III的dsRNA降解速度，其反應條件可以容易地被控制，并且其不趨向于生成大約10堿基對的小的dsRNA降解產物。
5.根據權利要求1至4中任一項的多肽，其來自冷適應微生物。
6.根據權利要求5的多肽，其中所述冷適應微生物是Shewanella屬的微生物。
7.具有RNase III活性的多肽，利用該多肽，長度在特定范圍內、大于通過用來自Escherichia coli的RNase III處理dsRNA獲得的最終降解產物的dsRNA降解產物可以被獲得，并且其包含選自由以下構成的組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO4的氨基酸序列；(b)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO4的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸被取代、刪除、插入或者添加；和(c)由在嚴格條件下能夠與SEQ ID No1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
8.根據權利要求1到7中任一項的多肽，其是與具有結合核酸活性的蛋白的融合蛋白。
9.用于降解dsRNA的方法，該方法包括允許由權利要求1到8中任一權利要求定義的多肽作用于dsRNA。
10.根據權利要求9的方法，其中所述dsRNA降解產物是能夠在RNA干擾中作為siRNA起作用的dsRNA。
11.根據權利要求9或10的方法，其在具有結合核酸活性的蛋白的存在下進行。
12.根據權利要求11的方法，其中所述具有結合核酸活性的蛋白是來自嗜熱細菌或熱穩定細菌的冷激蛋白。
13.根據權利要求12的方法，其中所述冷激蛋白是來自Thermotoga maritima的冷激蛋白B。
14.用于降解dsRNA的組合物，其用于權利要求9到13中任一權利要求定義的方法，并且其包含權利要求1到8中任一權利要求定義的具有RNase III活性的多肽。
15.用于降解dsRNA的試劑盒，其用于權利要求9到13中任一權利要求定義的方法，并且其包含權利要求1到8中任一權利要求定義的具有RNase III活性的多肽。
16.編碼具有RNase III活性的多肽的核酸，其具有選自由以下構成的組的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其中在SEQ ID NO1的核苷酸序列中一個或幾個核苷酸被取代，刪除，插入或者添加；和(c)在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
17.用于生成具有RNase III活性的多肽的方法，該方法包括培養含有權利要求16定義的核酸的宿主細胞，以及從該培養物中收集具有RNase III活性的多肽。
全文摘要
具有RNase III活性的多肽，使用其可以容易地控制dsRNA降解產物的長度，依賴于反應條件，并且在制備具有允許其在RNA干擾中作為siRNA起作用的長度的dsRNA中，具有很少RNA干擾效果的低分子量產物幾乎不形成；使用上面的多肽降解dsRNA的方法；用于以上方法的組合物和試劑盒。
文檔編號C12N15/55GK1860225SQ20048002842
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月29日 優先權日2003年9月30日
發明者友野潤, H·上野, 佐川裕章, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社