專利名稱：持久力增強劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對包括運動和勞動在內(nèi)的廣義運動的持久力增強劑、抗疲勞劑。
背景技術：
在進行以需要持久力的運動或需要肌肉反復做功的勞動等為代表的廣義運動時，強烈需要增強運動或勞動中的持久力并抑制疲勞。
為此，人們對具有增強持久力、抑制疲勞的作用的成分進行了各種探索。例如，已知有將靈芝成分(專利文獻1)或野山楂提取物(Crataegus cuneata Sieb.et Zucc.)(專利文獻2)等用作增強持久力的成分的方案。還有將生物素(專利文獻3)、某種氨基酸組合物(專利文獻4)、2-氧代戊二酸(專利文獻5)等用作抗疲勞劑的方案。
此外，有報告表明，綠茶、葡萄、可可豆等中所含的兒茶素類具有抑制膽固醇上升的作用(專利文獻6)、抑制α-淀粉酶活性的作用(專利文獻7)、抑制血糖升高的作用(專利文獻8)、預防動脈硬化的作用(專利文獻9)、抗氧化作用(專利文獻10)、抗菌作用(專利文獻11)、抑制血壓升高及抑制酶活性的作用(專利文獻12)、抗?jié)冏饔?專利文獻13)以及抑制突變的作用等生理益處。但人們并不知曉兒茶素類在運動時的持久力、疲勞方面有何種影響。
專利文獻1日本特開平5-123135號公報專利文獻2日本特開平8-47381號公報專利文獻3日本特開平6-305963號公報專利文獻4日本特開平7-25838號公報專利文獻5日本特開平10-175855號公報專利文獻6日本特開昭60-156614號公報專利文獻7日本特開平3-133928號公報專利文獻8日本特開平4-253918號公報專利文獻9日本特開平4-352726號公報專利文獻10日本特公平1-44234號公報專利文獻11日本特開平2-276562號公報專利文獻12日本特開平3-133928號公報專利文獻13日本特開昭63-277628號公報發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及以兒茶素類為有效成分的持久力增強劑和抗疲勞劑。
本發(fā)明還涉及兒茶素類在制備持久力增強劑和抗疲勞劑中的應用。
本發(fā)明還涉及服用有效劑量的兒茶素類增強持久力的方法和緩解疲勞的方法。
本發(fā)明還涉及以兒茶素類為有效成分的AMPK活化劑。
本發(fā)明還涉及兒茶素類在制備AMPK活化劑中的應用。
本發(fā)明還涉及服用有效劑量的兒茶素類的AMPK活化方法。
具體實施例方式
本發(fā)明人在研究兒茶素類的生理作用時，意外發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)異的持久力增強作用和抗疲勞作用，以及AMPK(AMP-activated proteinkinase活化蛋白激酶)的活化作用。
本發(fā)明提供藥物及食品，其對以需要持久力的運動或需要肌肉反復做功的勞動為代表的廣義運動具有增強持久力的作用、抑制疲勞的作用、AMPK活化的作用，作為瘦蛋白(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)的替代物起作用。
通常，兒茶素類是指兒茶素、沒食子兒茶素(gallocatechin)、沒食子酸兒茶素(catechingallate)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechingallate)、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子酸兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯的總稱。在本發(fā)明中，可含有上述化合物中的一種或兩種以上。
本發(fā)明所用成分之一的兒茶素類可通過以取自Camellia屬——例如C.sinensis、C.assamica和藪北種或它們的雜種的茶葉經(jīng)制茶工藝而得的茶葉為原料，向其中添加水或熱水，以及根據(jù)情況而添加提取助劑等提取而得。上述精制茶包括(1)煎茶、番茶、玉露、甜茶、釜炒茶(roasted tea)等綠茶類；(2)總稱為烏龍茶的鐵觀音、色種、黃金桂、武夷巖茶等半發(fā)酵茶；(3)稱為紅茶的大吉嶺茶、烏沃(Ceylon Uva)茶、祁門紅茶(Chinese Keemun)等發(fā)酵茶。提取茶的方法可采用攪拌提取等現(xiàn)有方法。還可預先在提取時的水中添加抗壞血酸鈉等有機酸或有機酸鹽類。此外，也可同時采用在煮沸脫氣或通入氮氣等不活潑氣體以除去溶解氧等的情況下，即，在非氧化環(huán)境下進行提取的方法。此外，也可不采用直接從茶葉中提取的方法，而是采用配合茶葉提取物的濃縮物或精制物的方法。
本發(fā)明的茶葉提取物的濃縮物是指，以茶葉為原料，將利用熱水或水溶性有機溶劑提取出的提取物濃縮而得的產(chǎn)物；茶提取物的精制物是指，采用溶劑或柱等精制而得的產(chǎn)物。例如，可舉出采用日本特開昭59-219384號、日本特開平4-20589號、日本特開平5-260907號、日本特開平5-306279號公報等舉例詳細說明的方法調(diào)制得到的產(chǎn)物。作為市售品可舉出Tokyo Food Techno Co.，Ltd.的“POLYPHENON”ItoEN，LTD.的“TEAFURAN”、Taiyo Kagaku Co.，Ltd.的“SUNPHENON”、Suntory Limited的“SUN OOLONG”等。此外，還可使用來自例如葡萄、葡萄酒、葡萄汁等以葡萄為原料的加工制品；來自可可豆及以此為原料的加工制品等來自其它原料的兒茶素類，甚至也可使用化學合成品。茶提取物的濃縮物及茶提取物的精制物的形態(tài)可舉出固體、水溶液、漿料等各種形態(tài)。用于溶解、稀釋茶提取物的濃縮物或茶提取物的精制物的液體可舉出水、碳酸水、被提取出的普通茶類提取液等。
作為兒茶素類，通?？墒褂貌杼崛∥锏臐饪s物或茶提取物的精制物，但特別優(yōu)選使用綠茶提取物的濃縮物或綠茶提取物的精制物。
兒茶素類如后述實施例所述，具有例如延長極限行進時間(maximal running time)等持久力增強作用，因此，發(fā)揮著預防、緩解肌肉疲勞、肉體疲勞等效果。
此外，兒茶素類如后述實施例所示，具有優(yōu)異的AMPK活化作用。
AMPK在運動等細胞內(nèi)ATP水平降低之類的情況下，活性增強，結(jié)果就發(fā)揮出促進代謝、促進ATP合成的“代謝傳感器”(metabolicsensor)的功能。
已知，AMPK通過控制乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的活性來影響線粒體中的脂肪酸氧化。將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運入線粒體內(nèi)的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)不僅是線粒體中的脂肪酸氧化的限速酶，而且受到作為ACC產(chǎn)物的丙二酸單酰輔酶A很強的抑制。發(fā)明人認為，由此使AMPK通過對ACC施加磷酸化作用(Ser79)來抑制ACC的活性，降低丙二酸單酰輔酶A的含量，結(jié)果就使得CPT-1的活性亢進，促進脂肪酸氧化。這樣，AMPK不僅在細胞內(nèi)能量不足時被活性化，且在生物體的能量代謝及營養(yǎng)代謝方面也發(fā)揮重要作用。
根據(jù)最近的研究，有報告表明AMPK也可被瘦蛋白(Nature，Vol.415，pp339-343，2002)或脂聯(lián)素等來自脂肪細胞的激素(Nature，Vol.423，pp762-769，2003)等活化，在醫(yī)學領域，也嘗試通過服用這些蛋白質(zhì)來治療各種疾病。
此外，由于AMPK的活性化促進能量產(chǎn)生，在運動時等需要能量的情況下，或在日常生活中，當攝取本發(fā)明的兒茶素類時，就能通過促進能量的產(chǎn)生而提高運動能力、減輕疲勞。
因此，作為AMPK活化劑、持久力增強劑、疲勞預防/緩解劑，兒茶素類可制成人類或動物用食品或醫(yī)藥品的成分。
本發(fā)明的持久力增強劑等除用于人類或動物服用之外，也可配合到各種飲食品、醫(yī)藥品、寵物飼料等中攝取。可應用在針對持久力增強、預防及緩解疲勞等生理機能起作用的飲食品、患者用食品、特定保健用食品中。用作醫(yī)藥品時，可制成例如片劑、顆粒等口服固體制劑，以及內(nèi)服液體、糖漿等口服液體制劑。
另外，在調(diào)制口服固體制劑時，可在兒茶素類中添加賦形劑，以及根據(jù)需要添加粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、嗅覺矯正劑等，并利用常規(guī)方法制成片劑、糖衣片劑、顆粒劑、散劑、膠囊等。而在調(diào)制口服液體制劑時，可添加矯味劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、正味劑等，利用常規(guī)方法制成內(nèi)服液體、糖漿、酏劑等。
上述各制劑中的兒茶素類配合量因其使用形態(tài)而異。在飲料食品、寵物飼料等中，通常優(yōu)選為0.01～5重量％、更優(yōu)選為0.05～5重量％、特別優(yōu)選為0.1～1重量％。而在上述之外的例如片劑、顆粒、膠囊等口服固體制劑，內(nèi)服液體、糖漿等口服液體制劑等醫(yī)藥品中，通常優(yōu)選為0.01～95重量％、更優(yōu)選為5～95重量％、特別優(yōu)選為10～95重量％。
本發(fā)明的持久力增強劑等的劑量(有效攝取量)，通常優(yōu)選為每天100～3000mg/60kg體重、更優(yōu)選為250～2000mg/60kg體重、特別優(yōu)選為250～1000mg/60kg體重。
實施例試驗例1(兒茶素類對大鼠的持久力的增強作用和抗疲勞作用)兒茶素類使用由Tokyo Food Techno Co.，Ltd.購得的普通市售品“POLYPHENON 70S”，用于實驗。
用兩星期的時間訓練大鼠(SD系，雄性，6周)習慣沿踏旋器行進后，測定極限行進時間。在使大鼠可安靜地呆在踏旋器內(nèi)，適應了環(huán)境之后開始測定。以12m/min為傳送帶起始速度，在12、15、18m/min的速度下各運轉(zhuǎn)10分鐘，然后在21m/min的速度下運轉(zhuǎn)30分鐘、在22.5m/min的速度下運轉(zhuǎn)1小時，此后在24m/min的速度下運轉(zhuǎn)。以大鼠在踏旋器上再也走不動的時刻為極限行進時間，并記錄該時間。為避免極限行進時間在不同組之間的差異，以10只大鼠為一組，分成兩組。用按照表1所示配方調(diào)制的餌料喂養(yǎng)。在喂養(yǎng)兩周后，測定各組的極限行進時間。此時的大鼠極限行進時間如表2所示。
表1餌料配方 (重量％)
表2 喂養(yǎng)兩星期前后的大鼠極限行進時間
*實驗餌料相對于對照餌料的統(tǒng)計差異顯著性(統(tǒng)計差異顯著性statistical significance of difference)由表2的結(jié)果可知，攝取了配有兒茶素類的餌料的大鼠與攝取了對照餌料的大鼠相比，可顯著延長喂養(yǎng)兩周后的極限行進時間，確認存在持久力增強效果和疲勞抑制效果。
試驗例2(兒茶素類對小鼠的持久力的增強作用和抗疲勞作用)兒茶素類使用由Tokyo Food Techno Co.，Ltd.購得的普通市售品“POLYPHENON 70S”，用于試驗。
用一星期的時間預備飼養(yǎng)小鼠(BALB/c系，雄性，6周)，然后測定兩次極限游泳時間。使小鼠在7L/min的流量下游泳，以其再也不能逆流游動的時刻為極限游泳時間，記錄該時間。為避免極限游泳時間在不同組之間的差異，以10只小鼠為一組，分成兩組。用按照表1所示配方調(diào)制的餌料喂養(yǎng)。在喂養(yǎng)5周后，測定一次各組的極限游泳時間。此時的小鼠極限游泳時間如表3所示。
表3喂養(yǎng)四周前后的小鼠極限游泳時間
*實驗餌料相對于對照餌料的統(tǒng)計差異顯著性由表3的結(jié)果可知，攝取了配有兒茶素類的餌料的小鼠與攝取了對照餌料的小鼠相比，喂養(yǎng)四周后，可顯著延長極限游泳時間，確認存在持久力增強效果和抗疲勞效果。
試驗例3(兒茶素類的AMPK活化效果)AMPK的活化使用小鼠肝細胞株(Hepal-6)，以AMPK及ACC(乙酰輔酶A羧化酶，acetyl-CoA carboxylase)的磷酸化為指標進行評價。
將小鼠肝細胞株(Hepal-6)撒在25cm2燒瓶內(nèi)，在DMEM(+10％FBS，+抗菌劑)中，在37℃下培養(yǎng)1～2天。在未融合的狀態(tài)(whenthe culture become subconfluen)，除去培養(yǎng)液，然后用PBS(-)洗凈，然后更換為DMEM(-FBS)再培養(yǎng)一天。在除去培養(yǎng)液后，添加含有規(guī)定濃度兒茶素類或茶提取物的DMEM(-FBS)并培養(yǎng)60分鐘。然后，除去培養(yǎng)液，用PBS(-)洗凈，再添加200μL細胞溶解液(10mMTris(三羧甲基氨基甲烷)(pH7.4)，50mM NaCl，30mM焦磷酸鈉，0.5％Triton X-100，蛋白酶抑制劑混合物(SIGMA P2714)，磷酸酶抑制劑混合物-1(SIGMA P2850)，磷酸酶抑制劑混合物-2(SIGMA P5726))，使用細胞刮刀回收細胞溶解液。使回收所得細胞溶解液通過23G的帶針頭注射器三次，充分均化，然后在冰上放置30分鐘。在15000rpm、4℃下離心分離15分鐘，將其上清蛋白用于下述實驗。
在測量了上清蛋白的濃度后，將樣品之間的蛋白濃度調(diào)至一定。加入為其四分之一量的SDS緩沖液(250mM Tris，12.5％SDS，20％甘油)，然后，再加入2-巰基乙醇及溴酚藍，在95℃下熱改性，在4℃下驟冷，調(diào)制電泳用樣品。
將一定量(約20～40μg)的上述電泳用樣品供給SDS-PAGE(4或12％的凝膠)，復制到膜上之后，將anti-phospho-AMPKα(Thr72)抗體(Cell Signaling公司制)、anti-phospho-AMPKβ(Ser108)抗體(CellSignaling公司制)或anti-phospho-ACC(Ser79)抗體(Cell Signaling公司制)用作一次抗體，將anti-rabbit-HRP抗體(AMERSHAM公司制)用作二次抗體，將phototope-HRP Western Detection System(CellSignaling公司制)用作檢測試劑，檢測出phospho-AMPKα、phospho-AMPKβ和phospho-ACC。AMPK的活性程度根據(jù)對檢測出的色帶的強度圖像分析(EDAS 290圖像分析系統(tǒng)KODAK)數(shù)值(像素)化，以對照品(未添加兒茶素類的組)為100，以相對其的值表示。此外，兒茶素標準品使用SIGMA公司或和光純藥株式會社制產(chǎn)品。茶提取物(茶兒茶素)使用伊藤園株式會社制TEAFURAN 90S。
表4
表5
表6
由表4～6的結(jié)果可知，兒茶素類具有優(yōu)異的AMPK活化作用，特別是沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素具有優(yōu)異的AMPK活化效果。此外，還可知，含有兒茶素類的茶提取物也發(fā)揮出優(yōu)異的AMPK活化效果。
權利要求
1.一種持久力增強劑，其特征在于，以兒茶素類為有效成分。
2.一種抗疲勞劑，其特征在于，以兒茶素類為有效成分。
3.兒茶素類在制備持久力增強劑中的應用。
4.兒茶素類在制備抗疲勞劑中的應用。
5.一種持久力增強方法，其特征在于，服用有效劑量的兒茶素類。
6.一種緩解疲勞的方法，其特征在于，服用有效劑量的兒茶素類。
7.一種AMPK活化劑，其特征在于，以兒茶素類為有效成分。
8.兒茶素類在制備AMPK活化劑中的應用。
9.一種AMPK的活化方法，其特征在于，服用有效劑量的兒茶素類。
全文摘要
本發(fā)明涉及可有效作用于以需要持久力的運動或需要肌肉反復做功的勞動等為代表的廣義的運動的持久力增強劑和抗疲勞劑。本發(fā)明還涉及以兒茶素類為有效成分的持久力增強劑、抗疲勞劑和AMPK活化劑。
文檔編號A23L1/30GK1852904SQ20048002662
公開日2006年10月25日 申請日期2004年9月17日 優(yōu)先權日2003年9月18日
發(fā)明者下豐留玲, 原水聰史, 原田潮, 村瀬孝利, 時光一郎 申請人:花王株式會社