Nadh依賴型l－木酮糖還原酶的制作方法

專利名稱：Nadh依賴型l－木酮糖還原酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及分離的DNA分子和被所述DNA分子轉化的微生物，所述DNA分子包含編碼能夠用于在體內和體外利用糖類例如蔗糖或其衍生物的酶的基因。本發明進一步涉及由所述DNA分子編碼的酶蛋白，及其用于蔗糖或其衍生物轉化的用途。
背景技術：
來自工業(包括農業)的生物學廢料包含例如碳水化合物，諸如糖類。長期以來，將這些廢料轉化成有用的產品一直是生物技術學領域的熱點和挑戰。
作為碳水化合物的特定示例，可提及L-阿拉伯糖，其是植物材料的主要成分。因此L-阿拉伯糖發酵也有潛在的生物工程學意義。
能夠利用L-阿拉伯糖的真菌不一定適合工業用途。許多利用戊糖的酵母品種例如具有較低的乙醇耐受性，使其不適合于乙醇生產。一個方法是提高這些生物體的工業特性。另一個方法是為合適的生物體提供利用L-阿拉伯糖的能力。
對于L-阿拉伯糖的分解代謝，已知存在兩個截然不同的途徑，即細菌途徑和真菌途徑(參見

圖1)。在細菌途徑中，三種酶，即L-阿拉伯糖異構酶、核酮糖激酶和5-磷酸L-核酮糖4差向酶，將L-阿拉伯糖轉化成5-磷酸D-木酮糖。Chiang和Knight在Biochem BiophysRes Commun，3，1960，554-559中第一次描述了真菌途徑霉菌Penicillium chrysogenum的“戊糖代謝新途徑”。其也將L-阿拉伯糖轉化成5磷酸D-木酮糖，但卻是通過L-阿拉伯糖還原酶、L-阿糖醇4-脫氫酶、L-木酮糖脫氫酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶。在該途徑中，L-阿拉伯糖還原酶和L-木酮糖還原酶使用NADPH作為輔因子，而L-阿糖醇4-脫氫酶和木糖醇脫氫酶使用NAD+作為輔因子。
在黑曲霉(Aspergillus niger)中描述了相同的途徑(Witteveen等人″L-arabinose and D-xylose catabolism in Aspergillusniger″，J Gen Microbiol，135，1989，2163-2171)。使用來自霉酵Hypocrea jecorina的基因在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達了所述途徑，并且顯示具有功能，即，所得的菌株可在L-阿拉伯糖中生長并使阿拉伯糖發酵，但發酵的速率非常低(Richard等人″Cloning and expression of a fungal L-arabinitol4-dehydrogenase gene″，J Biol Chem，276，2001，40631-7；Richard等人″The missing link in the fungal L-arabinose catabolicpathway，identification of the L-xylulose reductase gene″，Biochemistry，41，2002，6432-7；Richard等人″Production ofethanol from L-arabinose by Saccharomyces cerevisiaecontaining a fungal L-arabinose pathway″，FEMs Yeast Res，3，2003，185-9)。有關酵母中相應途徑的信息非常少。Shi等人“Characterization and complementation of a Pichia stipitismutant unable to grow on D-xylose or L-arabinose”，Appl BiochemBiotechnol，84-86，2000，201-16提供了酵母途徑需要木糖醇脫氫酶的證據。在Pichia stipitis的突變體中(所述突變體不能在L-阿拉伯糖中生長)，木糖醇脫氫酶的過表達可恢復其在L-阿拉伯糖上的生長。
Dien等人“Screening for L-arabinose fermenting yeasts”，Appl Biochem Biotechnol，57-58，1996，233-42就L-阿拉伯糖發酵檢驗了超過100個酵母品種。其大部分產生阿糖醇(arabinitol)和木糖醇，表明酵母途徑與霉菌途徑相似，但與細菌途徑不同。但對酵母途徑中催化步驟的輔因子特征知之甚少。
真菌L-阿拉伯糖途徑與真菌D木糖途徑具有相似性。在兩個途徑中，戊糖經歷還原和氧化反應，其中還原反應是NADPH偶聯的，而氧化反應是NAD+-偶聯的。D木糖經歷一對還原和氧化反應，而L-阿拉伯糖經歷兩對氧化還原反應。所述過程是氧化還原中性的，但具有不同的氧化還原輔因子，即使用了NADPH和NAD+，其必須分別地在其它代謝途徑中再生。在D木糖途徑中，NADPH偶聯的還原酶將D木糖轉化成木糖醇，然后所述木糖醇又被NAD+-偶聯的脫氫酶轉化為D木酮糖，接著被木酮糖激酶轉化為5磷酸D木酮糖。D木糖途徑的酶全部可用于L-阿拉伯糖途徑。兩個途徑中的第一種酶是醛糖還原酶(EC1.1.1.21)。已在不同的真菌中表征了所述酶并且克隆了相應的基因。具柄畢赤酵母(Pichia stipitis)酶比較特別，因為它可使用NADPH和NADH作為輔因子(Verduyn等人″Properties of theNAD(P)H-dependent xylose reductase from the xylose-fermentingyeast Pichia stipitis″，Biochem J，226，1985，669-77)。其對糖類也是非特異性的，并且可以大致相同的速率使用L-阿拉伯糖或D木糖，分別產生L-阿糖醇或木糖醇。還有，在真菌的D木糖和L-阿拉伯糖途徑中，木糖醇脫氫酶(也稱作D木酮糖還原酶EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶EC 2.7.1.17都相同。已知來自各種真菌的D木酮糖還原酶和木酮糖激酶的基因。近來在專利申請WO 02/066616中已描述了編碼L-阿糖醇4脫氫酶(EC1.1.1.12)或L-木酮糖還原酶(EC1.1.1.10)的基因。
使用真菌途徑的L-阿拉伯糖的分解代謝較慢。據信這是由于在所述途徑中使用不同輔因子之故。為轉化1摩爾L-阿拉伯糖，要將2摩爾NADPH和2摩爾NAD+分別轉化成NADP+和NADH，即，盡管所述途徑中總體反應是氧化還原中性的，但產生了氧化還原輔因子的不平衡。如果所述途徑只使用NAD+/NADH輔因子對，則可避免該狀況。
已描述了霉菌和高等動物的L-木酮糖還原酶。從倉鼠的肝中鑒定了編碼雙乙酰還原酶的基因，所述雙乙酰還原酶也具有L-木酮糖還原酶活性(Ishikura等人″Molecular cloning，expression andtissue distribution of hamster diacetyl reductase.Identitywith L-xylulose reductase″，Chem Biol Interact，130-132，2001，879-89)。
所有這些L-木酮糖還原酶活性的共同點是均嚴格地與NADPH偶聯。就我們所知，沒有與NADH偶聯的L-木酮糖還原酶活性有關的報道。
Hallborn等人“A short-chain dehydrogenase gene fromPichia stipitis having D-arabinitol dehydrogenase activity”，Yeast，11，1995，839-47描述了NAD+依賴性的D阿糖醇脫氫酶，所述脫氫酶從D阿糖醇形成D-核酮糖。在他們的報道中還提到針對NAD+和木糖醇的活性，但其結論是D木酮糖是該活性的產物。
一直存在對提供工業上可應用的將廉價生物物質轉化成有用產物的生物工程學方法的需要。
發明概述因此，本發明提供了新的分離的DNA分子，所述分子包含編碼表現優選特性的酶蛋白的基因。
此外，本發明提供了經遺傳工程改造的包含本發明基因的DNA分子，所述分子使本發明的基因能夠便利地在宿主微生物中轉化和表達。
本發明進一步提供了經遺傳修飾的微生物，所述微生物被本發明的DNA分子所轉化，并且能夠有效地使來自生物材料的碳水化合物(例如糖類或其衍生物)發酵，從而獲得有用的發酵產品。
本發明的另一個目的是提供酶蛋白，該酶蛋白能夠由宿主表達，用于將碳水化合物、特別是糖類或其衍生物例如糖醇在發酵介質中轉化成有用的轉化產品，或者該酶蛋白以酶制劑形式存在，用于在體外將上述碳水化合物轉化成有用的終產物或中間產物。
附圖簡述圖1.L-阿拉伯糖利用的真菌和細菌途徑。
圖2.包含于編碼NADH依賴性L-木酮糖還原酶的DNA分子中的SEQ ID No.1所示cDNA序列以及由所述cDNA編碼的SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
發明詳述本發明首次提供了分離的DNA分子，所述分子包含編碼酶蛋白的基因，所述酶蛋白表現NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性。下面描述分離和鑒定方法。
術語“NADH依賴性L-木酮糖還原酶”或“具有NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性的酶蛋白”此處是指本發明的酶蛋白表現L-木酮糖還原酶活性并且使用NADH作為輔因子，即是嚴格地NADH依賴性的酶，所述酶與已知的只使用NADPH作為輔因子的L-木酮糖還原酶相反。
術語“基因”此處是指包含編碼特定酶蛋白特征性的氨基酸序列的核酸序列的核酸片段。因此，本發明的基因包含這樣的核酸序列，所述核酸序列編碼具有NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性的酶蛋白特征性的氨基酸序列。“基因”可選地可包含進一步的核酸序列，例如調控序列。
很明顯，術語“DNA分子”、“DNA序列”和“核酸序列”也包括cDNA(互補DNA)。
由于NADH依賴性的原因，本發明的L-木酮糖還原酶提供了在包含L-木酮糖還原酶作為代謝途徑中的酶之一的所述途徑中用于氧化還原輔因子再生的可選擇方法。特別地，本L-木酮糖還原酶改善了例如真菌L-阿拉伯糖途徑中的NADP+-NAD+平衡。結果可提供工業上有利的真菌途徑，例如L-阿拉伯糖途徑，所述途徑可將L-阿拉伯糖轉化成D木酮糖，而不引起氧化還原輔因子的不平衡。
優選地，本發明的DNA分子的基因編碼NADH依賴性L-木酮糖還原酶，所述酶表現出可逆的將糖類轉化成糖醇的催化活性，其中，在費希爾投影式中，在L構型上，所述糖類在碳2(C2)上具有酮基基團，而所述糖醇在C2上具有羥基基團。特別地，所述NADH依賴性L-木酮糖還原酶表現可逆的將L-木酮糖轉化為木糖醇的催化活性。另一種有用的活性是將D-木酮糖和D-核酮糖轉化為D-阿糖醇的可逆反應。
在本發明的一個優選實施方案中，DNA分子的基因編碼包含SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的酶蛋白或其功能性等同變體。
在本發明的另一個優選的實施方案中，所述分離的DNA分子包含編碼真菌來源的NADH依賴性L-木酮糖還原酶的基因，即所述基因序列具有可從真菌L-木酮糖還原酶獲得的序列或其等同基因序列。優選的真菌來源的實例是Ambrosiozyma monospora，特別是上述菌株NRRLY-1484。
根據其它優選的實施方案，DNA分子的基因包含SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性等同變體。
2003年8月5日(5.8.2003)在布達佩斯協議條款下，VTTBiotechnology(地址是P.O.Box 1500，Tietotie 2，02044 VTT，Finland)針對SEQ ID No.1的cDNA序列在國際保藏機構DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)作了保藏，并已分配保藏號DSM 15821。所述保藏菌株釀酒酵母(S.cerevisiae)DSM 15821含有存在于多拷貝質粒上、處于組成型酵母啟動子控制下的SEQ IDNo.1所示cDNA(也參見圖2)，所述cDNA在下面的實驗部分也稱作ALX1基因。在該菌株中，L-木酮糖還原酶得到表達。保藏的核酸序列來源于已知的Ambrosiozyma monospora NRRL Y-1484。在下面的實驗部分，例如在實施例1和2以及圖2中給出了本發明的核酸和氨基酸序列、所述保藏菌株中使用的質粒和保藏菌株的更詳細情況。SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的序列列表也支持該數據。
眾所周知，來自不同生物、編碼具有相同催化活性的基因具有序列相似性，并且本領域技術人員可以多種方式利用這些相似性克隆來自其它生物的具有相同催化活性的其它基因。這些基因也適合于實施本發明。
因此，很明顯，基因的核苷酸序列中很多小的變異不會顯著地改變被編碼的蛋白的催化特性。例如，核苷酸序列中的許多改變不會改變被編碼的蛋白質的氨基酸序列。此外，氨基酸序列可具有不改變蛋白功能特性的變異，特別是其不阻止酶發揮其催化功能。DNA分子核苷酸序列上或氨基酸序列上的這些變異稱為“功能性等同變體”，因為其分別地不會顯著地改變基因編碼具有特定功能(例如催化特定反應)的蛋白的功能，并不會顯著地改變具有特定功能的蛋白質的功能。因此，SEQ ID NO 1所示核苷酸序列以及SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的這些功能性等同變體(包括片段)包括在本發明的范圍內。
此外，發明也涉及經遺傳工程改造的DNA分子，即重組DNA，合適地是載體特別是表達載體，所述DNA分子包含如上所述的本發明DNA分子的基因，從而使其能夠在宿主細胞即微生物中表達。在重組DNA中，本發明的基因特別地可以有效地與啟動子連接。所述載體可以是例如常規載體，例如病毒(如噬菌體)，或質粒，優選地是質粒。表達載體的構建在本領域技術人員的技能之內。下面描述一般方法和具體的實施例。
此外，上面定義的DNA分子優選地用于轉化微生物以產生NADH依賴性L-木酮糖酶，所述酶包含由如上定義的DNA分子的基因編碼的氨基酸。因此，提供了包含如上定義的本發明DNA分子以表達所述NADH依賴性L-木酮糖的經遺傳修飾的微生物。
本發明的DNA分子可轉移至任何適合用于從生物材料生產想要的轉化產物的微生物，所述生物材料包含碳水化合物，優選地糖類或糖類衍生物。很明顯，對于本領域技術人員來說，“合適的微生物”是指(1)其能夠表達編碼所述酶蛋白的本發明DNA的基因，并且可選地，(2)其可產生工業轉化原材料(即生物材料)以獲得想要的產物所需要的其它酶，和(3)其可耐受所形成的轉化產物，即任何中間產物和/或終產物，以便能夠進行工業生產。可以生物技術領域內已知的方法，優選地使用如上所述的或下面實施例部分描述的本發明載體實現微生物的轉化(或轉染)。
自然地，或者本發明的所述微生物所利用的生物材料包括可由本NADH依賴性L-木酮糖還原酶轉化的糖類產物，或者所述微生物能夠表達進一步的基因，從而生成將起始生物材料轉化為可由本發明基因表達的所述還原酶利用的糖類產物所需要的酶。
此外，取決于想要的轉化產物，所述微生物可包含額外的用于表達一個或多個其它酶的基因，所述酶可將本發明的NADH依賴性L-木酮糖還原酶的轉化產物轉化成想要的產物。優選地，本發明的酶和至少部分所述可選的其它酶是同一代謝途徑中的成員。此外，本發明的微生物可包含兩個或更多個代射途徑中的酶的基因，以使其中一條途徑的產物可被另一條代謝途徑利用。
也很明顯的是，在所述微生物的基因組中可包含、例如用于表達本發明酶產物的代謝途徑和/或其它途徑中的酶所需要的所述可選的其它基因，或所述微生物可用所述其它基因中的任何缺少的基因進行轉化。
本發明的經遺傳修飾的微生物具有利用碳水化合物例如糖類或其衍生物(例如糖醇)的能力。本發明提供了從碳源包含碳水化合物例如糖類或其衍生物的生產發酵產物的方法，其包括在合適的發酵條件下，在存在所述碳源的情況下培養如上所述的經遺傳修飾的微生物，并可選地回收想要的發酵產物。
在本發明的一個優選的實施方案中，所述經遺傳修飾的微生物具有增加的利用L-阿拉伯糖的能力。優選地，所述微生物產生真菌L-阿拉伯糖途徑和/或磷酸戊糖途徑的產物。特別是，所述經遺傳修飾的微生物利用包含L-阿拉伯糖的生物材料，并且至少包含真菌L-阿拉伯糖途徑的基因用于其表達，所述基因編碼醛醣還原酶(特別是EC1.1.1.21)和L-阿糖醇4-脫氫酶(特別是EC 1.1.1.12)的酶。更特別地，所述微生物進一步包含真菌L-阿拉伯糖途徑的基因以及任選地編碼已知的磷酸戊糖途徑中的酶的基因，所述真菌L-阿拉伯糖途徑的基因編碼D木酮糖還原酶(特別是EC 1.1.1.9)和/或木酮糖激酶(特別是EC 2.7.1.17)的酶。
可通過遺傳修飾的微生物獲得的所需轉化產物可包括真菌L-阿拉伯糖途徑的轉化產物，尤其是L-阿糖醇、L-木酮糖、木糖醇、D木酮糖和/或5磷酸D-木酮糖；和已知的磷酸戊糖途徑或其它途徑的轉化產物(特別是乙醇和/或乳酸)，所述途徑可利用例如真菌L-阿拉伯糖途徑的終轉化產物5磷酸D木酮糖。
本發明的經遺傳修飾的微生物優選地是真菌，其可選自酵母和絲狀真菌。合適地，所述真菌是酵母。
工業酵母具有加工工藝的有利方面，例如高乙醇耐受性、其它工業壓力的耐受性和快速發酵。其通常是多倍體的，并且其基因工程改造與實驗室菌株相比更加困難，但用于其基因工程改造的方法在本領域是已知的(參見，例如，Blomqvist等人“Chromosomal integrationand expression of two bacterialα-acetolactate decarboxylasegenes in brewer′s yeast”，Appl.Environ.Microbiol.57，1991，2796-2803；Henderson等人“The transformation of brewingyeasts with a plasmid containing a gene for copper resistance”，Current Genetics，9，1985，133-138)。可根據本發明被轉化從而用于利用本發明碳源(例如L-阿拉伯糖)的酵母特別地包括酵母屬(Saccharomyces)品種、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)種類例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)品種、畢赤酵母屬(Pichia)品種、念珠菌屬(Candida)品種或Pachysolen品種。也可提及許旺酵母(Schwanniomyces spp.)、Arxula，spp.、絲孢酵母(Trichosporonspp.)、漢遜酵母(Hansenula spp.)和Yarrowia spp.。一種優選的酵母是例如釀酒酵母的工業菌株，例如啤酒用酵母、釀酒或面包酵母。
此外，根據本發明也可轉化絲狀真菌。這些真菌包括木霉屬(Trichoderma)種類、鏈孢菌屬(Neurospora)種類、鐮孢屬(Fusarium)種類、青霉屬(Penicillium)種類、腐質霉屬(Humicol)種類、Tolypocladium geodes，Trichoderma reesei(Hypocreajecorina)、毛霉屬(Mucor)種類、Trichoderma longibrachiatum，構巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)等。
優選地，經轉化的本發明的微生物是釀酒酵母的工業菌株，其包含本發明的經轉化的基因，并額外地包含真菌L-阿拉伯糖途徑和可選地磷酸戊糖途徑的其它基因，并且所述菌株可將包含L-阿拉伯糖途徑的至少一種可利用產物(優選地L-阿拉伯糖)的碳源轉化成所述途徑的終產物和/或中間產物，或可選地轉化成磷酸戊糖途徑的產物。所有或部分所述其它基因可存在于所述菌株的基因組中，或所述菌株可以是經遺傳工程改造的菌株，它已被所有或部分所述其它基因所轉化。合適的示例是根據本發明被轉化的、并從起始生物材料產生乙醇的釀酒酵母。
本發明不局限于酵母和其它真菌。可在不能利用或不能有效地利用L-阿拉伯糖的任何生物例如細菌、植物或高等真核細胞中，通過使用本領域合適的和已知針對該特定生物的遺傳工具表達編碼L-木酮糖還原酶的基因。
也已分離和鑒定了具有NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性的新型酶蛋白。
本發明的其它方面也提供了酶蛋白，所述酶蛋白具有NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性，并包含由如上定義的DNA分子的基因編碼的氨基酸序列。
在本發明的一個特定實施方案中，所述酶蛋白包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或其功能性等同變體。所述功能性等同變體包含具有與SEQ ID NO.2至少30％、優選地至少50％、合適地至少70％，例如至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
本發明進一步涉及體外酶促制劑，其至少包含如上所述的酶蛋白。所述制劑可以酶制劑領域已知的形式存在，例如以粉劑形式例如凍干形式或是以溶液形式存在。粉劑形式的制劑可就此使用或在使用前溶解于合適的溶液中。與上述相似地，對于經遺傳修飾的微生物，本發明的酶制劑可包含一種或多種其它的酶，其可將起始材料轉化成可被本發明的酶產物利用的糖類產物和/或將所得的該酶的轉化產物轉化成進一步的轉化產物。對于所述經轉化的微生物，可轉化的原始材料、進一步的酶和/或想要的終產物可以是例如如上定義的。
此外，本發明提供了如上定義的NADH依賴性L-木酮糖還原酶用于將在C2位置具有酮基的糖轉化成其中C2羥基在Fisher投影中處于L-構型的糖醇或用于其相反的轉化，優選地用于將L-木酮糖轉化為木糖醇或用于其相反轉化的用途。
在轉化方法的一個實施方案中，所述酶可以由如上定義的經遺傳工程改造的微生物在發酵條件下在發酵介質中生成，所述條件使得所產生的酶能夠進行轉化作用，所述發酵介質相應地包含糖類或糖醇。
在其它實施方案中，作為體外轉化，使用如上定義的酶制劑進行轉化方法。可通過在微生物中表達酶和回收獲得的酶產物，或例如以肽化學中已知的方法化學地制備酶產物來獲得該制劑。酶制劑的轉化產物可就此使用(終產物)，或用作中間產物，所述中間產物由例如生物技術或化學方法進一步轉化。
用于分離和鑒定本發明的DNA分子的方法的描述為鑒定本發明的L-木酮糖還原酶基因，可以采用不同的方法，并且本領域技術人員可能使用不同的方法。一個方法是純化具有相應活性的蛋白和使用有關該蛋白的信息以克隆相應的基因。其可包括經純化的蛋白的蛋白水解消化、蛋白水解產物的氨基酸序列測序和通過用來源于所述氨基酸序列的引物進行PCR來克隆該基因的部分。然后可以各種方法獲得該DNA序列的其余部分。一個方法是通過使用來自文庫載體和該基因的已知部分的引物進行PCR而從cDNA文庫中獲得。當完整的序列是已知時，就可從cDNA文庫擴增所述基因并克隆入表達載體，在異源宿主中表達。如果篩選策略或基于序列間同源性的策略不合適時，這是個有用的策略。
克隆基因的另一個方法是篩選DNA文庫。當單個基因的過表達會導致容易檢測的表型時，這是個特別好和快捷的方法。既然我們已經公開了用編碼L-阿糖醇脫氫酶和L-木酮糖還原酶的基因對利用木糖的真菌進行轉化提供了其在L-阿拉伯糖中生長的能力，所以另一個尋找L-木酮糖還原酶基因的策略如下構建具有L-阿拉伯糖途徑中除了L-木酮糖還原酶外的所有基因的菌株用DNA文庫進行轉化，并通過其在L-阿拉伯糖中生長的能力進行篩選。
還存在其它的克隆L-木酮糖還原酶基因的方法和可能性可針對例如在L-木酮糖上的生長進行篩選以發現L-木酮糖還原酶。
可篩選現存的數據庫，以尋找與來自相關蛋白家族的基因有同源性的基因，并檢驗其是否編碼所需的酶活性。既然我們已公開了L-木酮糖還原酶基因的序列(SEQ ID NO 1)，本領域技術人員很容易篩選數據庫中與SEQ ID NO 1同源的基因。通過使用基于SEQ ID NO 1的探針對DNA文庫進行物理篩選也可容易地發現同源基因。合適的DNA文庫包括從分離自能夠利用L-阿拉伯糖或L-木酮糖的真菌和其它微生物的DNA或RNA產生的文庫。
對于本領域技術人員來說，存在許多不同的途徑來鑒定編碼具有所需酶活性的基因。此處描述的方法舉例說明了我們的發明，但也可使用本領域已知的任何其它方法。
可將L-阿拉伯糖途徑中的所有或一部分基因(包括本NADH依賴性L-木酮糖還原酶)導入新的宿主生物體中，所述生物體缺少該途徑或已具有部分所述途徑。例如，可利用D木糖的真菌可能只需要將L-阿糖醇轉化成木糖醇的酶。然后，L-阿糖醇4-脫氫酶和L-木酮糖還原酶的表達足以完成L-阿拉伯糖途徑。已描述了針對真菌阿拉伯糖途徑所有步驟的酶測定法(Witteveen等人，1989)，如果需要的話，可使用這些方法來幫助鑒定特定宿主中缺少或低效的步驟。
在實施例中使用來自釀酒酵母的PGK1啟動子表達L-木酮糖還原酶。所述啟動子被認為是強的組成型啟動子。可使用更強的或稍弱些的其它啟動子。使用組成型啟動子也不一定是必需的。可使用可誘導的或可抑制的啟動子，所述啟動子可以具有有利方面，例如，如果想要按順序發酵不同的糖時就比較有利。
在我們的實施例中，針對L-木酮糖還原酶的基因，我們使用質粒。所述質粒包含選擇性標記。所述基因也可從不具有選擇性標記的質粒中表達，或可整合入染色體中。使用選擇性標記可更容易地發現成功的轉化，并穩定遺傳構建體。用醋酸鋰方法轉化酵母菌株。其它轉化方法在本領域是已知的，一些方法對于特定的宿主而言比較優選，它們可用于實現我們的發明。
本發明的特定實施方案根據本發明的一個優選的實施方案，通過真菌的遺傳修飾解決了所述真菌不能有效地利用L-阿拉伯糖的缺點，該方法的特征在于用NADH依賴性L-木酮糖還原酶基因轉化所述真菌。
根據另一個實施方案，用編碼L-阿拉伯糖途徑的酶的所有或一些基因轉化微生物(優選地真菌)，即至少用醛醣還原酶、L-阿糖醇4-脫氫酶和本L-木酮糖還原酶基因進行轉化，并可選地用D-木酮糖還原酶和/或木酮糖激酶進行轉化。優選地，用L-阿拉伯糖途徑中的所有基因轉化該微生物。然后，所得的微生物例如真菌能夠更有效地利用L-阿拉伯糖。
在其它實施方案中，用L-阿糖醇4-脫氫酶和L-木酮糖還原酶的基因轉化可利用D木糖、但不能利用L-阿拉伯糖的真菌，例如經遺傳工程改造的釀酒酵母，以利用L-阿拉伯糖。
術語“利用”此處是指生物體能夠使用碳水化合物，例如糖或其衍生物，例如L-阿拉伯糖，作為碳源或作為能源，或指其可將所述產物(例如阿拉伯糖)轉化成另一種有用的化合物。
下面用優選的實施方案描述本發明，以在實踐中顯示真菌微生物可通過遺傳工程改造來利用包含碳水化合物、例如糖類或其衍生物(例如L-阿拉伯糖)的生物材料。一些真菌可天然地利用例如L-阿拉伯糖，其它的則不能。將利用L-阿位伯糖的能力轉移至缺乏L-阿拉伯糖利用能力、但具有其它所需特性(例如耐受工業條件或產生特定的有用產物例如乙醇或乳酸或木糖醇的能力)的生物體中是合乎需要的。為了通過遺傳工程轉移L-阿拉伯糖利用能力，必需知道可在宿主細胞中一起作用而將L-阿拉伯糖轉化成所述宿主可分解代謝從而產生有用產物的衍生物(例如5-磷酸D-木酮糖)所有的一套酶的基因。然后在特定的宿主中通過用編碼缺失的酶的基因轉化宿主來使該特定宿主內的該套酶完整。
一個示例是遺傳工程改造的釀酒酵母以利用L-阿拉伯糖。釀酒酵母是個良好的乙醇生產者，但缺乏利用L-阿拉伯糖的能力。其它示例是具有有用特性、但缺乏功能性L-阿拉伯糖途徑的至少部分的生物體。
據信在真菌中發揮作用的L-阿拉伯糖途徑顯示于表1中。編碼醛糖還原酶(EC 1.1.1.21)、D-木酮糖還原酶(EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的基因是已知的。此外，近來在WO 02/066616中已顯示了所需要的兩個額外的基因，即L-阿糖醇4-脫氫酶(EC1.1.1.12)和L-木酮糖還原酶(EC 1.1.1.10)的基因以及氨基酸序列，此處將該文獻引用作為參考。
在例如WO 02/066616中公開的L-木酮糖還原酶(EC 1.1.1.10)將木糖醇和NADP+轉化成L-木酮糖和NADPH。本發明提供了可選擇的L-木酮糖還原酶，它是NADH依賴性的，并且可有利地代替已知的NADPH依賴性還原酶使用。
不能利用L-阿拉伯糖、但卻是良好的乙醇生產者的真菌、例如釀酒酵母可用醛糖還原酶、L-阿糖醇4-脫氫酶、本L-木酮糖還原酶、D-木酮糖還原酶和木酮糖激酶進行轉化，其變得能夠有效地利用L-阿拉伯糖和D-木糖。在該菌株中，可將最豐富的己醣和戊糖發酵成乙醇。
有時生物體含有在生物工程應用中有用的條件下不表達的基因。例如，盡管曾普遍地相信S.cerevisiae不能利用木糖，從而預期釀酒酵母不含有編碼能夠使其利用木糖的酶的基因，但已顯示釀酒酵母確實含有這樣的基因(Richard等人″Evidence that the geneYLR070c of Saccharomyces cerevisiae encodes a xylitoldehydrogenase″，FEBS Lett，457，1999，135-8)。然而，這些基因通常表達不充分。因此，我們的發明的另一方面是在宿主生物體自身中鑒定NADH依賴性的L-木酮糖還原酶的基因，和使所述基因在便于生物工程加工(例如含有L-阿拉伯糖的生物物質的乙醇發酵)的條件下在該相同的生物體中表達。我們公開了鑒定這類正常情況下不表達的基因的候選者的方法，所述方法是搜索與SEQ ID NO 1的相似性。然后可將候選基因克隆入表達載體并在合適的宿主中表達，并如實施例中所述就合適的催化活性對宿主的無細胞提取物進行測試。當正常情況下不表達或不充分表達的基因已被證實編碼所需的酶時，可將所述基因克隆回該原始的生物體中，但其具有可使該基因在恰當的生物工程條件下表達的新啟動子。這也可通過在完整的生物體中遺傳工程改造所述基因的啟動子來實現。
在本發明的另一個方面，現在通過與SEQ ID NO 1的相似性可容易地鑒定編碼來自具有利用L-阿拉伯糖的能力的真菌(包括例如絲狀真菌)的L-木酮糖還原酶的基因。然后通過例如將其啟動子改變成更強的啟動子或具有不同特性的啟動子來修飾該基因，以增強該生物體利用L-阿拉伯糖的能力。
真菌可能天然地不具有乳酸生產所需的酶，或其可能低效地產生乳酸。在這些情況下，可在真菌中增加或提高編碼乳酸脫氫酶(LDH)的基因的表達，從而真菌可更有效地產生乳酸(例如WO 99/14335)。類似地，通過使用本領域已知的方法，可進一步修飾本發明中描述的經修飾而能更有效地利用阿拉伯糖的真菌，以生產乳酸。同乙醇、乳酸和糖醇例如阿糖醇和木糖醇一樣，也可從本發明的利用L-阿拉伯糖的真菌獲得、其它有用的產物。這些真菌通過阿拉伯糖途徑將L-阿拉伯糖轉化為5-磷酸木酮糖，其是磷酸戊糖途徑的中間產物。因此，也可生成磷酸戊糖途徑的衍生物，例如芳香族氨基酸，以及來源于丙酮酸(乳酸和乙醇的共同前體)的其它物質。
然后將經轉化的真菌用于發酵碳源，例如包含農業或森林產物的生物物質和含有例如L-阿拉伯糖和可能地還有其它戊糖或其它可發酵糖類的廢產物。用于發酵的碳源的制備和發酵條件可與使用宿主真菌發酵相同碳源的相同。然而，本發明的經轉化的真菌比宿主真菌消耗更多的L-阿拉伯糖，并且在總碳水化合物上產生以比宿主真菌更高的產率生成乙醇。眾所周知，可根據被發酵的原材料和用于發酵的真菌的特性優化發酵條件，包括碳源的制備、共底物和其它營養物的加入、以及發酵溫度、攪拌、供氣、供氮、pH控制、加入的發酵用生物體的量。因此，與宿主真菌相比，經轉化的真菌的改善了的性能可通過按照已良好建立的加工工程方法優化發酵條件而得到進一步提高。
使用本發明的經轉化的真菌從包含L-阿拉伯糖和其它可發酵糖類的碳源生產乙醇具有幾個工業上的優勢。這些優勢包括每噸碳源產生乙醇的產率更高和發酵材料中乙醇的濃度更高，兩者都有助于降低生產例如用作燃料的蒸餾乙醇的成本。此外，因為L-阿拉伯糖的含量降低，來自發酵的廢物中的污染物質有所降低，這是一條更清潔的加工方法。
在自然界中，木素纖維素原材料非常豐富，從而為微生物加工提供了可再生和廉價的碳源。含有阿拉伯糖的原材料是例如各種果膠和半纖維素(例如木聚糖)，其包含己醣和戊糖(木糖，阿拉伯糖)的混合物。有用的原材料包括來自紙張和制漿工業的副產品，例如廢液和木材水解產物，以及農業副產品，例如糖蔗渣、玉米穗軸、玉米纖維、燕麥、小麥、大麥和水稻谷殼、莖桿及其水解產物。還可利用包含聚合材料的阿聚糖或半乳糖醛酸。
因此，本發明提供了用于表達所述途徑中的酶例如L-阿拉伯糖以及可選地磷酸戊糖途徑中的酶、以便于在微生物特別是真菌中利用L-阿拉伯糖的有利方法。
實施例實施例1篩選在阿拉伯糖中提高的生長使用釀酒酵母菌株H2651(Richard等人″The missing link inthe fungal L-arabinose catabolic pathway，identification of theL-xylulose reductase gene″，Biochemistry，41，2002，6432-7)就L-阿拉伯糖中提高的生長對Ambrosiozyma monospora cDNA文庫進行篩選。H2651含有真菌L-阿拉伯糖途徑的所有基因。將分別編碼醛糖還原酶和木糖醇脫氫酶的Pichia stipitis XYL1和XYL2基因整合入URA3基因座。所述菌株也表達編碼木酮糖激酶的內源性XKS1基因。編碼來自Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei)的L-阿糖醇脫氫酶和L-木酮糖還原酶的lad1和lxr1基因分別存在于具有LEU2和URA3標記基因的多拷貝表達載體上。
Ambrosiozyma monospora cDNA文庫的建立在含有2％L-阿拉伯糖作為碳源的YNB培養基(Difco)中培養酵母Ambrosiozyma monospora(NRRL Y-1484)。將所述細胞在30℃下培養過夜并通過離心收集。根據廠商說明書使用Trizol reagent試劑盒(Life Technologies Inc.)從細胞中提取總RNA。用Oligotex mRNA試劑盒(Qiagen)從總RNA中分離mRNA。使用SuperScript cDNA合成試劑盒(Invitrogen)合成cDNA并匯集含有cDNA的級分，將其與經SalI-NotI切割的pEXP-AD502載體(Invitrogen)連接。根據廠商說明書，通過在′Gene pulser/micro pulser cuvette′(BioRad)中進行電穿孔將所述連接混合物轉化入大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株。溫育過夜后，從氨芐青霉素板中匯集大約30 000個獨立的集落并在-80℃下貯存于50％甘油+0.9％NaCl中。在從轉化體中提取質粒之前，將其在LB培養基中培養4小時以擴增文庫。
篩選釀酒酵母的cDNA文庫使用Gietz Lab Transformation試劑盒(Molecular ResearchReagents Inc.)用cDNA文庫轉化釀酒酵母菌株H2651。將所述轉化體在缺少尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸、含有2％葡萄糖作為碳源的選擇性培養基上涂板。2天后，將平板復制在含有1％L-阿拉伯糖作為碳源的平板上。從出現的第一批集落中取出質粒，并將其轉化入大腸桿菌DH5α菌株。通過用針對pEXP-AD502載體的特異性引物進行PCR來鑒定攜帶來自文庫的質粒的集落，引物f2為5′-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3′，引物γ為5′-TAAATTTCTGGCAAGGTAGAC-3′。提取質粒并進行用相同的引物測序。
其中一個克隆含有攜帶開放閱讀框架的質粒，所述閱讀框架編碼具有272個氨基酸、分子量為29 495Da的蛋白。推測的蛋白質序列與從P.stipitis，白色念珠菌(Candida albicans)和熱帶念珠菌(Candida tropicalis)中發現的D-阿糖醇脫氫酶具有高度同源性。此外，其與H.jecorina的編碼L-木酮糖還原酶的lxr1基因產物具有較低的同源性。A.monospora L-木酮糖還原酶的基因被命名為ALX1。其序列列于SEQ ID NO 1中。
實施例2釀酒酵母中L-木酮糖還原酶的表達在用SalI-NotI消化后分離ALX1基因，并將其連接至具有尿嘧啶選擇性和PGK1啟動子的多拷貝表達載體上。通過將SalI和NotI限制性位點引入多克隆位點，從pFL60產生所述表達載體。所得的質粒被稱為p2178。然后將其轉化入釀酒酵母菌株CEN.PK2。該菌株被稱為H2986，并且如上所述以保藏號DSM 15821作了保藏。
細胞提取物中的酶促測量使用來自菌株H2986的細胞提取物測試對各種底物的酶促活性。將細胞在選擇性葡萄糖培養基上培養過夜，并用Y-PER試劑(Pierce)制備細胞提取物。使用0.5ml所述試劑裂解0.1g細胞。在裂解前，將′不含EDTA的完全蛋白酶抑制劑(Complete protease inhibitorswithout EDTA)′(Roche)加入到細胞懸浮液中。
在含有100mM Tris-HCl、0.5mM MgCl2和2mM NAD+或2mM NADP+的試劑中測量D-阿糖醇和木糖醇的酶促活性。為開始反應，加入100mM糖醇(終濃度)。在30℃下在Cobas Mira自動分析儀(Roche)中進行所有測定。
當糖醇是D-阿糖醇或木糖醇時觀察到以糖醇和NAD+為底物的活性。針對這些多元醇的活性是相似的。使用只缺少ALX1的相似菌株作為對照。對照菌株顯示沒有活性。對于表達ALX1的菌株沒有觀察到對C5糖醇即L-阿糖醇和C6糖醇即D-甘露醇和D-山梨醇的活性。
His標記的NAD-LXR1的純化通過使用下列引物進行PCR來擴增基因，從而將含有6組氨酸的組氨酸標記加到蛋白的N末端5′-GACTGGATCCATCATGCATCATCATCATCATCATATGACTGACTACATTCCAAC-3′和5′-ATGCGGATCCCTATATATACCGGAAAATCGAC-3′。兩個引物都具有BamHI位點以便于克隆。將基因克隆入具有PGK1啟動子的多拷貝表達載體YEplac195(Verho等人″Identification of the first fungalNADP-GAPDH from Kluyveromyces lactis″，Biochemistry，41，2002，13833-8)。所得的質粒被稱作p2250。將所述基因在釀酒酵母菌株CEN.PK2中表達，并在細胞提取物中用酶活性測量法確定組氨酸標記的蛋白質的活性。為純化該蛋白質，將表達組氨酸標記的構建體的酵母菌株在含有2％葡萄糖的500ml選擇性培養基中培養過夜，收集細胞。如上所述用Y-PER試劑裂解所述細胞，并將裂解產物加入至NiNTA柱(Qiagen)中。
使用純化的組氨酸標記的蛋白質的酶促測量與用粗細胞提取物觀察到的相似，當糖醇是D-阿糖醇或木糖醇時，觀察到了以糖醇和NAD+作為底物的活性。對于C5糖醇即L-阿糖醇和側金盞花醇(核糖醇)以及C6糖醇即衛矛醇(半乳糖醇)沒有觀察到活性。為起始反應，除了衛矛醇(半乳糖醇)之外，針對所有其它糖醇均加入100mM糖醇(終濃度)。對衛矛醇使用10mM的濃度。當用NADp+取代NAD+時，沒有發現活性。也利用純化的蛋白測量正向反應。在含有100mM Hepes-NaOH pH 7、2mM MgCl2和0.2mM NADH的試劑中進行以糖為底物的正向反應的活性測量。除了D-山梨糖外，對所有其它糖類使用50mM終濃度的糖來起始反應。對于D-山梨糖使用10mM的終濃度。在使用糖和NADH為底物的方向上，觀察到對L-木酮糖和D-核酮糖的活性。對戊酮糖D-木酮糖觀察到顯著降低的活性，沒有觀察到對已酮糖D-山梨糖、L-山梨糖和D-阿洛酮糖和D-果糖的活性。
也利用該純化的蛋白質來確定酶的米-曼氏常數。針對D-核酮糖的Km是2,2±0,8mM，針對L-木酮糖的Km是8,1±0,7mM。針對D-核酮糖的Vmax值是1900±330nkat/mg，針對L-木酮糖的Vmax是4100±100nkat/mg。針對木糖醇的上述動力學參數是7,6±1,3mM和220±15nkat/mg，針對D-阿糖醇的上述動力學參數是2,4±0,1mM和210±11nkat/mg。
通過HPLC進行的產物鑒定也利用純化的酶來鑒定反應產物。對于正向反應，使用100mMHepes-NaOH pH 7、2mM MgCl2、2mM NADH、2mM戊酮糖的混合物。在含有100mM Tris-HCl、pH 9、2mM MgCl2、10mM NAD+和20mM多元醇的試劑中鑒定反向反應的產物。將6nkat的酶加入到反應試劑中并在室溫下溫育3小時。
用HPLC分析鑒定產物。在85℃下用水以0.6ml/分鐘的流速流經Aminex Pb柱(Bio-Rad)。用Waters 410 RI檢測器檢測多元醇和戊酮糖。
因為觀察到在還原反應中針對D-核酮糖和L-木酮糖以及在氧化反應中針對木糖醇和D-阿糖醇的主要活性，所以通過HPLC鑒定這些反應中的產物。從L-木酮糖形成了木酮醇。所述分析排除了任何阿糖醇或側金盞花糖醇(核糖醇)的生成。從D-核酮糖形成阿糖醇。使用的HPLC方法不能夠區分L-和D-阿糖醇。在反向方向，從D-阿糖醇形成核酮糖和木酮糖，從木糖醇形成木酮糖。同樣，所述方法也不能區別L-和D-木酮糖或L-和D-核酮糖。
序列表<110>Valtion teknillinen tutkimuskeskus<120>體內和體外利用碳水化合物的新型酶<130>BP110008<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>816<212>DNA<213>Ambrosiozyma monospora<220>
<223>cDNA<400>1atgactgact acattccaac ttttagattc gatggccact taaccattgt cacaggtgcc 60tgtggtggtt tagctgaagc tttaatcaag ggtttgttgg cctacggttc tgacattgct120ttgcttgata tcgaccaaga aaagactgct gccaaacaag ccgaatacca caaatacgct180actgaagaat tgaagttgaa agaagttcca aagatgggtt catatgcctg tgatatttct240gattctgata ccgttcacaa ggtgtttgct caagttgcta aggattttgg taagttgcca300ttgcacttgg ttaacacagc tggttactgt gaaaacttcc catgtgaaga ttacccagcc360aagaacgctg agaagatggt gaaggttaac ttgttgggtt ctttgtatgt ttctcaagcc420tttgctaagc cattgatcaa agaaggtatc aagggtgctt ctgttgtttt gattggttct480atgtctggtg ccattgtcaa cgatcctcaa aaccaagttg tctacaacat gtccaaggct540ggtgttatcc atttggctaa gactttggct tgtgaatggg ctaagtacaa catcagagtt600aattctttaa acccaggtta catctacggt cctttgacca agaatgttat caatggtaac660
gaagaattgt acaacagatg gatctctggt atcccacaac aaagaatgtc cgaaccaaag720gaatacattg gtgctgtttt gtacttgctt tctgaatctg ctgcttcata cactactggt780gccagcttac tggttgatgg tggtttcact tcttgg 816<210>2<211>272<212>PRT<213>Ambrosiozyma monospora<400>2Met Thr Asp Tyr Ile Pro Thr Phe Arg Phe Asp Gly His Leu Thr Ile1 5 10 15Val Thr Gly Ala Cys Gly Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ile Lys Gly Leu20 25 30Leu Ala Tyr Gly Ser Asp Ile Ala Leu Leu Asp Ile Asp Gln Glu Lys35 40 45Thr Ala Ala Lys Gln Ala Glu Tyr His Lys Tyr Ala Thr Glu Glu Leu50 55 60Lys Leu Lys Glu Val Pro Lys Met Gly Ser Tyr Ala Cys Asp Ile Ser65 70 75 80Asp Ser Asp Thr Val His Lys Val Phe Ala Gln Val Ala Lys Asp Phe85 90 95Gly Lys Leu Pro Leu His Leu Val Asn Thr Ala Gly Tyr Cys Glu Asn100 105 110Phe Pro Cys Glu Asp Tyr Pro Ala Lys Asn Ala Glu Lys Met Val Lys115 120 125Val Asn Leu Leu Gly Ser Leu Tyr Val Ser Gln Ala Phe Ala Lys Pro130 135 140Leu Ile Lys Glu Gly Ile Lys Gly Ala Ser Val Val Leu Ile Gly Ser145 150 155 160
Met Ser Gly Ala Ile Val Asn Asp Pro Gln Asn Gln Val Val Tyr Asn165 170 175Met Ser Lys Ala Gly Val Ile His Leu Ala Lys Thr Leu Ala Cys Glu180 185 190Trp Ala Lys Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Leu Asn Pro Gly Tyr Ile195 200 205Tyr Gly Pro Leu Thr Lys Asn Val Ile Asn Gly Asn Glu Glu Leu Tyr210 215 220Asn Arg Trp Ile Ser Gly Ile Pro Gln Gln Arg Met Ser Glu Pro Lys225 230 235 240Glu Tyr Ile Gly Ala Val Leu Tyr Leu Leu Ser Glu Ser Ala Ala Ser245 250 255Tyr Thr Thr Gly Ala Ser Leu Leu Val Asp Gly Gly Phe Thr Ser Trp260 265 270
權利要求
1.一種分離的DNA分子，其特征在于其包含編碼具有NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性的酶蛋白的基因。
2.權利要求1的分離的DNA分子，其特征在于所述酶蛋白具有可逆的將在碳2即C2位置上具有酮基的糖轉化成在C2上具有在Fischer投影中處于L-構型的羥基的糖醇的催化活性。
3.權利要求1或2的分離的DNA分子，其特征在于所述酶蛋白包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其功能性等同衍生物。
4.權利要求1至3中任一項的分離DNA分子，其特征在于所述酶蛋白是真菌來源的NADH依賴性L-木酮糖還原酶。
5.權利要求1至4中任一項的分離DNA分子，其特征在于所述真菌來源是Ambrosiozyma monospora。
6.權利要求1至5中任一項的分離DNA分子，其特征在于所述基因包含SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性等同衍生物。
7.權利要求1至6中任一項的分離DNA分子，其特征在于所述NADH依賴性L-木酮糖還原酶表現出可逆的將木酮糖轉化為木糖醇的催化活性。
8.包含權利要求1至7中任一項的DNA分子的載體。
9.用權利要求1至7中任一項的DNA分子轉化的經遺傳修飾的微生物，其用于表達所述NADH依賴性L-木酮糖。
10.權利要求9的經遺傳修飾的微生物，其特征在于其已被權利要求8的載體進行了轉化或轉染。
11.權利要求9或10的經遺傳修飾的微生物，其特征在于其具有利用糖或糖醇的能力。
12.權利要求11的經遺傳修飾的微生物，其特征在于其具有利用L-阿拉伯糖的能力。
13.權利要求9至12中任一項的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述微生物產生真菌L-阿拉伯糖途徑和/或磷酸戊糖途徑的衍生物。
14.權利要求9至13中任一項的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述微生物至少含有真菌L-阿拉伯糖途徑中編碼醛糖還原酶和L-阿糖醇4-脫氫酶的基因，用于其表達。
15.權利要求14的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述微生物進一步包含真菌L-阿拉伯糖途徑中編碼D-木酮糖還原酶和/或木酮糖激酶的基因，并可選地包含編碼磷酸戊糖途徑的酶的基因。
16.權利要求9至15中任一項的經遺傳修飾的微生物，其特征在于其產生阿糖醇、木糖醇、乙醇和/或乳酸。
17.權利要求9至16中任一項的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述經遺傳修飾的微生物是真菌，優選地選自酵母或絲狀真菌。
18.權利要求17的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述酵母是酵母屬(Saccharomyces)品種、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)品種、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)品種、畢赤酵母屬(Pichia)品種、念珠菌屬(Candida)品種或Pachysolen品種的菌株。
19.權利要求18的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述菌株是釀酒酵母，例如釀酒酵母的經遺傳工程改造的菌株。
20.權利要求17的經遺傳修飾的微生物，其特征在于所述絲狀真菌是曲霉屬(Aspergillus)品種、木霉屬(Trichoderma)品種、鏈孢菌屬(Neurospora)品種、鐮孢屬(Fusarium)品種、青霉屬(Penicillium)品種、腐質霉屬(Humicola)品種，Tolypocladium geodes，Trichodermareesei(Hypocrea jecorina)、毛霉屬(Mucor)品種，Trichodermalongibrachiatum，構巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株，例如其經遺傳工程改造的菌株。
21.用于從含有碳水化合物的碳源中產生發酵產物的方法，其特征在于所述方法包括在該碳源存在的情況下在合適的發酵條件下培養權利要求9至20中任一項的經遺傳修飾的微生物和可選地回收所述發酵產物的步驟。
22.權利要求21的方法，其特征在于所述碳源含有L-阿拉伯糖，并且所述微生物是權利要求12至15中定義的微生物。
23.權利要求21或22的方法，其特征在于所述碳源含有L-阿拉伯糖，并且所述發酵產物選自真菌L-阿拉伯糖途徑的產物和磷酸戊糖途徑的產物，優選地選自乙醇、乳酸、木糖醇和/或阿糖醇。
24.一種酶蛋白，所述酶蛋白具有NADH依賴性L-木酮糖還原酶活性，并且包含由權利要求1至7中任一項的DNA分子的基因編碼的氨基酸序列。
25.權利要求24的酶蛋白，其特征在于所述酶蛋白含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其功能性等同衍生物。
26.用于從碳源生產轉化產物的體外酶促制劑，其特征在于所述制劑含有包含由權利要求1至7中任一項的DNA分子編碼的氨基酸序列的酶蛋白。
27.NADH依賴性L-木酮糖還原酶、優選地包含由權利要求1至7中任一項所述DNA分子之基因編碼的氨基酸序列的酶用于將在C2位置處具有酮基的糖轉化為其中C2位置處的羥基在Fischer投影中處于L-構型的糖醇或用于其反向轉化的用途，優選地用于將木酮糖轉化為木糖醇或用于其反向轉化。
28.權利要求27的用途，其特征在于所述酶是由權利要求9至20中任一項的經遺傳工程改造的微生物在使所產生的酶能夠進行轉化的發酵條件下在發酵介質中產生的，所述發酵介質包含所述糖或相應地糖醇。
29.權利要求27的用途，其特征在于所述轉化是體外酶促轉化，并且使用權利要求26的體外酶促制劑。
全文摘要
本發明涉及分離的DNA分子，所述分子包含編碼具有NADH依賴性L－木酮糖還原酶活性的酶蛋白的基因。鑒定了編碼所述酶蛋白的DNA序列。本發明進一步涉及被本發明的所述DNA分子轉化的微生物以及NADH依賴性L－木酮糖還原酶。本發明可用于將含有碳水化合物的生物材料、例如工業廢料轉化成有用的終產物。
文檔編號C12P7/00GK1849393SQ200480026085
公開日2006年10月18日 申請日期2004年9月13日 優先權日2003年9月12日
發明者R·維霍, R·理查德, M·潘迪拉 申請人:芬蘭技術研究中心