專利名稱：：發酵方法和組合物的制作方法發酵方法和組合物發明領域本發明涉及用于生產發酵產品的酶方法和組合物，包括在發酵方法中改善酵母性能的方法和組合物。發明背景可使用發酵方法生產各種商品，包括醇(例如，乙醇、曱醇、丁醇)；有機酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸(itaconicacid)、乳酸、葡糖酸)；嗣(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如H2和C02),和更加復雜的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四環素)；酶；維生素(例如，核黃素、B,2、(3-胡蘿卜素)；激素，以及其它很難以合成方式生產的化合物。在消費性醇工業(例如，啤酒和葡萄酒)、乳業(例如，在生長酸奶和奶酪中)、皮革工業和煙草工業中也同樣通常使用發酵方法。還有進一步改善發酵方法和改善包括發酵步驟的方法的需要。發明概述本發明提供用于生產發酵產品的方法和組合物。本發明還提供了使用一種或多種如本發明中所描述的方法生產乙醇的改進方法。根據本發明(回收的)回槽(backset)的百分比，如以下所規定的，在發酵培養基中可以得到顯著地增加導致減少了往發酵方法中添加額外的水的需求。而且，發發酵產品，例如乙醇，和為發酵生物提供的碳水化合物營養。方法。首先一個方面本發明涉及在發酵培養基中生產發酵產品的方法，所述方法含有發酵步驟，包括使至少一種脂肪酸氧化酶與發酵培養基接觸。在本發明的一個具體實施方案中，在發酵之前或發酵期間使至少一種脂肪酸氧化酶加入到發酵培養基。在一個優選的具體實施方案中，本發明包括將發酵培養基與至少一種脂肪酸氧化酶相接觸。在一個具體的實施方案中在回槽回收至發酵罐/發酵容器前可用脂肪酸氧化酶預處理回槽。在另一個具體的實施方案中直接在含有或不含有回槽部分的發酵培養基上進行脂肪酸氧化酶處理。在一個優選的具體實施方案中直接往含回收的回槽的發酵培養基中加入脂肪酸氧化酶。在一個具體的實施方案中在發酵方法之前或期間加入脂肪酸氧化酶。脂肪酸氧化酶可以在加入發酵生物(例如酵母)之前加入到發酵培養基，但也可同時一起加入或在加入發酵生物之后加入。優選的是在發酵開始之前加入脂肪酸氧化酶。然而，在發酵期間加入脂肪酸氧化酶也在本發明范圍之內，例如在發酵開始后。在優選的實施方案中，用脂肪酸氧化酶預處理含回槽部分的發酵培養基。可在發酵前或發酵期間加入有效量的脂肪酸氧化酶。可在發酵之前加入有效量的脂肪酸氧化酶，例如，在發酵微生物增殖期間或發酵微生物增殖之后。在本發明的一個優選實施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶(lipoxygenase)。在一個優選方案中發酵微生物是酵母。在一個具體的實施方案中，本發明的發酵方法與糖化步驟(SSF)或液化步驟和糖化步驟(LSF)結合使用。除至少一種脂肪酸氧化酶之外也可加入其它的酶活性。這種酶活性包括酯酶活性，優選脂肪酶(lipase)和/或角質酶(cutinase)活性、漆酶活性、植酸酶活性、纖維素酶活性、木聚糖酶活性、ot-淀粉酶活性或葡糖淀粉酶活性。在一個優選的方案中，使用發酵方法生產醇類，優選乙醇。至少一種脂肪酸氧化酶的存在可用于提高乙醇的產率。根據本發明通過使用至少一種脂肪酸氧化酶能增加發酵培養基中(回收的)回槽的百分比。回槽可構成發酵開始前發酵培養基液體部分的高至30%w/w,優選高至50%w/w，更優選70%wAv，并且甚至高至90。/。w/w。換句話說，這意味著例如回收50%w/w的回槽相當于含有36%w/w(粉碎的)顆粒物質、32%w/w水和32%w/w回槽的發酵培養基(淤漿)。術語"回槽"是指在將發酵副產品(即酒糟(wholestillage))分成(分離)固體部分(例如濕的顆粒)和液體的"回槽，，部分后，從來自發酵步驟的副產品(即酒糟)中獲得的液體部分。回槽"回槽"部分有時稱為"酒糟水"。回槽含有大約10%的固體和通常含有各種抑制發酵方法的化合物，這可導致降低乙醇產率。因此，通常避免加入回槽。根據本發明這問題可通過往發酵培養基中加入至少一種脂肪酸氧化酶來克月良。在一個伊乙選的實施方案中在一種或多種附加的酶活性存在下進《亍發酵。附加的酶可在脂肪酸氧化酶之前、當中/同時或之后引入。脂肪酸氧化酶可與一種或多種下列酶聯合使用酯酶，例如脂肪酶和/或角質酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶及其混合物。在本發明的另一個具體實施方案中，發酵微生物生長刺激劑與脂肪酸氧化酶和任選附加的本文所述的酶活性結合加入/存在，以進一步改進發酵方法。優選的生長刺激劑包括維生素和礦物質。本發明的最后一個方面涉及含有脂肪酸氧化酶和附加的酶和/或刺激劑的纟且合物。發明詳述本發明提供了生產發酵產品的方法和組合物，其中在發酵方法中使用至少一種脂肪酸氧化酶。在發酵之前或期間用脂肪酸氧化酶處理發酵培養基提高了發酵產率。而且，相對于沒有加入脂肪酸氧化酶獲得的產率，用脂肪酸氧化酶處理含有回槽部分的發酵培養基提高了發酵產率。加入一種或多種附加的酶活性導致了發酵產率的進一步提高。雖然未限定于任何一種工作原理，但在根據本發明的發酵方法中使用脂肪酸氧化酶可以認為，是由于造粉體膜從顆粒物質中破裂，基于淀粉釋放的增加。并且，脂肪酸氧化酶促進了蛋白質中s-s橋的形成。這被認為是增加了淤漿的穩定性。本發明首先一個方面涉及了在發酵培養基中生產發酵產品的方法，該方法含有發酵步驟，包括使發酵培養基與至少一種脂肪酸氧化酶接觸。脂肪酸氧化酶處理可在發酵方法的任何階段進行。在一個優選的具體實施方案中，有效量的脂肪酸氧化酶在發酵期間加入(例如，通過接觸發酵培養基)，例如，在發酵方法開始時。在另一個優選的具體實施方案中，有效量的脂肪酸氧化酶在發酵之前加入，例如，在發酵生物增殖期間或增殖之后或在糖化或糖化前步驟(pre-saccharification)或液化步驟期間。本發明的發酵方案可用于生產醇，例如乙醇，如作為傳統乙醇方法的一個不可分割的部分。發酵方法"發酵"或"發酵方法"是指任何發酵方法或包括發酵步驟的任何方法。本發明的發酵方法包括，但不限于，用于生產下列物質的發酵方法醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如112和C02);抗生素(例如青霉素和四環素)；酶；維生素(例如核黃素、B12、p-胡蘿卜素)；和激素。發酵方法還包括用于消費性醇工業(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(例如發酵的乳制品)、皮革工業和煙草工業的發酵方法。優選的發酵方法包括醇發酵方法，這種方法是為本領域技術眾所周知的。優選的發酵方法為厭氧發酵方法，這種方法是為本領域技術眾所周知的。在優選的實施方案中，本發明的發酵方法與液化方法和/或糖化方法聯合使用，其中附加的酶活性，例如酯酶，包括脂肪酶和/或角質酶；植酸酶；漆酶；纖維素酶；木聚糖酶；a-淀粉酶；葡糖淀粉酶；或其混合物，可用于處理底物，例如淀粉底物。在另一個優選的具體實施方案中，本發明的發酵方法用于生產乙醇的方法。在本發明的一個優選實施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。發酵培養基"發酵培養基"或"發酵培養基"是指進行發酵的環境，其包括發酵底物，即被發酵微生物代謝的碳水化合物源。可在例如發酵方法之前或同時通過粉碎、液化和/或糖化或其它所需要的工序來處理本發明的發酵方法中所使用的發酵培養基，包括發酵底物和其它原材料。因此，發酵培養基可以指加入發酵微生物之前的培養基，例如，處于或來自液化和/或糖化方法的培養基，以及含有發酵微生物的培養基，例如，在同時進行糖化和發酵方法(simultaneoussaccharificationandfermentationprocess)(SSF)或同日于進4亍液4匕—并唐4匕—發酵(simultaneousliquefaction-saccharification-fermentation)(LSF)方法中所用的培養基。發酵生物"發酵微生物"是指在所需要的發酵方法中適于使用的任何微生物。根據本發明適當的發酵微生物能夠發酵，即直接或間接地將糖類例如葡萄糖和/或麥芽糖轉變成所需要的發酵產品。發酵微生物的例子包括真菌生物例如酵母。優選的酵母包括酵母屬(&cc/zram_ycw)菌抹，特別是釀酒酵)。可用的商品化酵母包括，例如Sto/V丄^"fre五^a"o//ed(購自美國7WStor/Z^q^e)、SUPERSTART(購自Alltech)、GERTSTRAND(購自瑞典GertStrandAB)和FERMIOL(購自DSMSpecialties)發酵底物任何適當的底物或原料均可用于本發明的發酵方法。如同本領域技術眾所周知的，通常基于所需要的發酵產品和所采用的方法來選擇底物。適于本發明方法中使用的底物的例子包括含淀粉物質例如塊莖、根、整粒(wholegrains),玉米、玉米穗(cobs)、小麥、大麥、黑麥、高梁或谷類；含糖原料例如糖漿、水果材料、糖、甘蔗或甜菜、馬鈴薯和含纖維素物質例如木材或植物殘渣。適當的底物還包括碳水化合物源，尤其是能被發酵微生物代謝的低分子糖(DP,-3糖)，其可通過直接加入發酵培養基中供給。脂肪酸氧化酶術語"一種"脂肪酸氧化酶是指這種酶中的至少一種。術語"至少一種"是指這種酶中的一、二、三、四、五、六或甚至更多種。在本發明范圍內，"脂肪酸氧化酶"是一種相比于底物丁香醛連氮(syringaldazine)可更有效地水解底物亞油酸的酶。"更有效，，是指具有更高的反應速率。其可使用實施例2中所描述的方法來測試，并計算(1)每分鐘在底物亞油酸上增加的吸光度(在234nm的吸光度)和(2)每分鐘在丁香醛連氮底物上增加的吸光度(在530nm的吸光度)之間的差值，即計算反應速率的差值(RRD)=(d(A234)/dt-d(A53。)/dt)。如杲RRD大于0,則所考察的酶可看作是本文所定義的脂肪酸氧化酶。如果RRD等于或小于0，則所考察的酶不是脂肪酸氧化酶。在尤其具體的實施方案中，RRD至少為0.05、0.10、0.15、0.20或至少為0.25吸收單位/分鐘。在尤其具體的實施例2方法的實施方案中，酶進行了很好的定義。更進一步的是，對于實施例2的方法調節了酶劑量，從而在234nm或在530nm獲得了最大的吸光度增量。在尤其具體的實施方案中，最大吸光度增量的范圍為0.05-0.50;0.07-0.4;0.08-0.3;0.09-0.2;或0.10-0.25吸收單位/分鐘。酶劑量范圍可以為例如在0.01-20、0.05-15、或0.10-10mg酶蛋白/ml。可供選擇的是，"脂肪酸氧化酶"可定義為相對于丁香醛連氮能更有效地氧化不飽和脂肪酸的酶。酶活性可在如本申請實施例1中所描述的在PH6和30。C的在含有丁香醛連氮或亞油酸作為底物的標準血氧計裝置中進行對比。在尤其具體的實施方案中，脂肪酸氧化酶定義為分類為EC1.11丄3或EC1.13.11.-.EC1.13.11.的酶-意思是指其任何亞類，目前為四十九個EC1.13.11.1-EC1.13.11.49。EC1.11.1.3是指月旨肪酸過氧物酶，ECU3.11是指通過結合兩個氧原子作用于單一供體的脂氧化酶。在更具體的實施方案中，EC1.13.11.-酶分類為EC1.13.11.12、EC1.13.11.31、EC1.13.11.33、ECU3.11.34、EC1.13.11.40、ECU3.11.44或EC1.13.11.45，分別是指脂氧化酶、花生四烯酸酯12-脂氧化酶、花生四烯酸酯15-脂氧化酶、花生四烯酸酯5-脂氧化酶、花生四烯酸酯8-脂氧化酶、亞油酸二醇合酶和亞油酸11-脂氧化酶。有效量的脂肪酸氧化酶的例子為0.001-400U/gDS(DrySolids)(千燥固體)。優選的是，所用的脂肪酸氧化酶的量為0.01-100U/gDS,更優選的是0.05-50U/gDS,甚至更優選0.1-20U/gDS。脂肪酸氧化酶的進一步優化此后可通過使用本領域已知的標準方法來獲得。脂氣化酶在優選的具體實施方案中，脂肪酸氧化酶為脂氧化酶(LOX),分類為EC1.13.11.12,它是催化聚不飽和脂肪酸特別是順，順-l,4-二烯例如亞油酸和制備氫過氧化物的酶。并且也可氧化其它的底物，例如單不飽和脂肪酸。微生物脂氧化酶可來自于例如釀酒酵母(Sacc/2^omycescerevWae)、普通嗜熱放線菌(Ther,ac""ow_ycesvw/gaWs)、FiW(3r/畫ax^5por畫、Fwsfln.ww;ra/^/^rafw附、才帛斗犬嗜熱絲孑包菌(772erwomyces/awwg/wosws)、尸j^'cw/w/a。o;zae和地霉屬菌抹(Geo^c/mw)。WO02/20730的實施例3-4中描述了來源于禾頂嚢殼(Gaewmcmwomycesgnaw/"/i1)的月旨氧4匕酶的制備。WO02/086114的實施例2中描述了在米曲霉中表達來源于Mag加;ow/7e■sa/v/"http://的脂氧化酶，可使用標準方法來純化這種酶，例如如WO02/20730的實施例4所描述的方法。脂氧化酶(LOX)也可從植物種子中萃取，例如大豆、豌豆、鷹嘴豆和菜豆。可供選擇地是，脂氧化酶可從哺乳動物細胞例如兔網織紅細胞中《曰狄付。脂氧化酶活性可如下面的"材料和方法"中所描述的來定義。脂氧化酶有效量的例子為0.001-400U/gDS(干燥固體)。優選的是，所用脂氧化酶的量為0.01-100U/gDS，更優選為0.05-50U/gDS，甚至更優選為0.1-20U/gDS。脂氧化酶的進一步優化值此后可使用本領域公知的標準方法來獲得。附加的酶在本發明優選的具體實施方案中一種或多種附加的酶活性可與本發明的脂肪酸氧化酶處理聯合(例如，在此之前、期間或隨后)使用。優選附加的酶是酯酶，例如脂肪酶和/或角質酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶例如a-淀粉酶、麥芽糖a-淀粉酶、(3-淀粉酶或葡萄淀粉酶、或它們的混合物。在本發明另一個優選的具體實施方案中，發酵微生物生長剌激物可與此處所述的酶活性結合加入以進一步改善發酵方法。優選的生長刺激物包括維生素和礦物質。酯酶在本發明優選的具體實施方案中，在發酵之前或期間使有效量的脂肪酸氧化酶與有效量的酯酶結合使用。酶可以在發酵之前或發酵期間加入，包括發酵微生物增殖期間或之后。也可用酶預處理發酵培養基(例如，加入或不加入回槽)。這里所使用的"酯酶"也稱羧酸酯水解酶，是指作用于酯鍵的酶，包括根據酶命名法分類于EC3丄1羧酸酯水解酶類的酶(分別可得自http:〃www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme或從EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego，California,增刊1(1993),增刊2(1994),增刊3(1995)，增刊4(1997)和增刊5，Eur.J.Biochem.1994,223，1-5;Eur.J.Biochem.1995,232，1-6;Eur.J.Biochem.1996,237，1-5;Eur.J.Biochem.1997,250;1-6,和Eur.J.Biochem.1999,264，610-650)。非限制性的酯酶的例子包括芳基酯酶、三酰基甘油酯酶、乙酰酯酶、乙酰膽石咸酯酶、膽i咸酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果膠酯酶、甾醇酯酶、葉綠素酶、L-阿拉伯糖內酯酶、葡萄糖內酯酶、糖醛酸內酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶、棕櫚酸視黃酯酶、羥丁酸二聚體水解酶、酰基甘油酯酶、3-氧己二酸烯醇-內酯酶(3-oxoadipateenol-lactonase)、1，4-內酯酶、半乳糖酯酶、4-吡噴醇內酯酶、酰基肉毒i成水解酶、氨酰4RNA水解酶、D-阿拉伯內酯酶、6-磷酸葡萄糖內酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰葡萄糖脫乙酰基酶、脂蛋白脂肪酶、二氫香豆素酯酶、檸檬苦素-D-環-內酯酶、類甾醇內酯酶、三乙酸酯內酯酶、放線菌素內酯酶、苔色酸縮酚酸水解酶、頭孢菌素-C脫乙酰酶、氯原酸水解酶、a-氨基酸酯酶、4-曱基草酰乙酸酯酶、亞曱酸基丁烯醇酶(carboxymethylenebutenolidase)、脫氧檸檬苦素A-環-內酯酶、2-乙酰基-1-烷基甘油磷酸膽堿酯酶、鐮孢氨酸-C鳥氨酸酯酶、芥子酸膽堿酯酶、蠟-酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脫酰酶、唾液酸-O-乙酰酯酶、乙酸基丁炔并p塞p分脫乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水楊酸脫乙酰基酶、曱基傘形乙酸鹽脫乙酰酶(methylumbelliferyl-acetatedeacetylase)、2-吡喃酮-4，6-二羧酸內酯酶、N-乙酰半乳糖胺聚糖脫乙酰基酶、保幼激素酯酶、二(2-乙基己基)鄰笨二曱酸酯酯酶、蛋白質-谷氨酸酯甲基酯酶、11-順式棕櫚酸視黃基酯水解酶、全反式棕櫚酸視黃基酯水解酶、L-鼠李糖-l,4-內酯酶、5-(3，4-雙乙酰氧基丁-1-炔基)-2，2'-聯逸吩脫乙酰基酶、酯酰乙酯合酶、木糖1,4-內酯酶、N-乙酰葡萄糖胺磷脂酰肌醇脫乙酰酶、西曲酸酯千基酯酶(cetraxatebenzylesterase)、乙酰烷基甘油乙酰水解酶和乙酰木糖酯酶。根據本發明優選的酯酶是脂肪分解酶，例如脂肪酶(分類為EC3丄1.3、EC3.1.1.23和/或EC3.1.1.26)和磷酸酯酶(分類為EC3.1.1.4和/或EC3丄1.32，包括分類為EC3丄1.5的溶血磷酸酯酶)。其它的優選酯酶為角質酶(分類為EC3.1.1.74)。當與應用除脂肪酸氧化酶之外的其它的酶的方法或處理結合使用時，例如在液化和/或糖化方法中所使用的例如植酸酶、漆酶、淀4分酶和葡糖淀粉酶，優選不抑制其它酶的酯酶組合物。例如，優選不含或僅含少量鈣結合化合物的酯酶。同樣地，優選不抑制發酵方法的酯酶。例如，優選不含或僅舍少量甘油的酯酶。可加入有效量的酯酶從而獲得所需要的有利于改善發酵微生物的性能的益處，例如改變發酵微生物內部和/或外部或發酵微生物細胞膜內脂質的組成/濃度，從而導致發酵期間溶質向發酵微生物內和/或向外運動的改善，和/或提供更易代謝的能源(例如，如通過轉變組分，例如將谷類底物中的油類轉變成對發酵微生物有用的組分，例如不飽和脂肪酸和甘油)，從而提高乙醇產量。酯酶有效量的例子為0.01-400LU/gDS(干燥固體)。優選的是，所使用的酯酶的量為0.1-100LU/gDS，更優選為0.5-50LU/gDS,甚至更優選為1-20LU/gDS。酯酶的進一步優化此后可使用本領域已知的標準方法來獲得。在一個優選的具體實施方案中酯酶是脂肪分解酶，更優選的是脂肪酶。此處所使用的"脂肪分解酶，，是指脂肪酶和磷酸酯酶(包括溶血磷酯酶)。月旨肪分解酶優選來自于微生物，尤其是來自于細菌、真菌或酵母。所用的脂肪分解酶可來自于任何來源，包括例如犁頭霉(JfczVfo)菌抹，尤其是^ZmW/aWa/^/ee"(3和傘枝翠頭霉(」^sWacoow&/era);無色桿菌屬菌抹，尤其是解毒無色桿菌(^c/romo6a"erz'o;/wgws);氣單胞菌屬菌株；鏈格孢屬菌抹，尤其是甘藍鏈格孢U/fe朋n'"^m!'c/o/a);曲霉菌屬菌林，尤其是黑曲霉和黃曲霉；無色桿菌屬菌抹，尤其是解毒無色桿菌；短梗霉屬菌抹，尤其是出芽短梗霉；芽胞桿菌屬菌林，尤其是短小芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5ac/〃ws5^eara^zerwo//n7ws)和枯草芽孢桿菌；白僵菌屬0Beawve〃'a)菌抹；索絲菌屬(Sroc/wAn*)菌抹，尤其是熱殺索絲菌(&oc/zo/zn'x^le削oso/iato);念珠菌屬菌株，尤其是鈹落念珠菌(Ca"d油qy/z>2(iracefl)、Ca"d油para/—/,.ca和Cawd油a齒rc"ca;色桿菌屬菌抹，尤其是粘稠色才干菌(CTzrawoZwcrerv&casww);鬼傘屬(Co;W/ms)菌斗朱，尤其是灰蓋鬼傘(Co戸.wwsc/we"'ws);嫌刀菌屬(7^fln.ww)菌抹，尤其是Fws(ar/ww。w。r廳、癡病鐮刀菌(Fiw"n.wmso/aw/)、S苑豆^S屬鐮孑包菌(FwsaWMmso/a"f;&()和大刀5欠3鬼色嫌孑包菌(Fksan'wwcw/moraw);i也審屬(Geofn'cww)菌才朱,尤其是帚狀地霉(Geofn'c謡/em'"7/(3"An);漢森酵母屬(//<mseww/<3)菌抹，尤其是異常漢遜氏酵母；腐殖菌屬(/ww/co/a)菌才朱，尤其是T/i/m/co/"菌抹；乳桿菌屬菌抹，尤其是彎曲乳桿菌(Z^"o6ac/〃wscwrva&s);Metarhizium菌4朱；毛霉菌屬(A^MCW")菌^朱；擬青霉屬CPaec/Zomyces)菌4朱；青霉屬菌4朱,尤其是圓孓瓜青霉(尸ew.C7'〃/"wcyc/op/ww)、皮落青霉(尸em'c〃/〖wwcn^stoswm)和擴展青霉(Pem'c!7/z'wmexpam;wwi);存i單月包菌屬菌斗朱,尤其是銅綠假單胞菌(Psez^fomo加sa/ca"genes)、洋蔥假單胞菌(同義詞為蔥伯克霍爾德氏菌(r^oWen'a))、熒光假單胞菌、莓實極毛桿菌(尸set^o加o"w/rag0、嗜麥芽假單月包菌(Pseiwfomowos1ma/fop/7//^3)、門多薩假單胞菌(尸sewcfomowas1me"(iocZ"a)、嗜中溫假單月包菌(i^ewdowowcwwep/2"Zca/(po/;^ca)、產堿假單月包菌(■Rsewcfomowasa/c"Z/gewes)、才直物作i單月包菌(尸sez^omo"osp/awa〃')、類產石咸作I單月包菌(尸化W(iowowas1/wei^oa/ca//gewe51)、腐臭，i單月包菌(尸化"(io"wwa、施氏々I單月包菌(/^ewcowowasWw/zen')和PsezWomcwasM^com7力eww'5";絲才亥菌屬(//n'zoctowa)菌才朱，尤其是立沖古絲氺亥菌(W/H'zoctom'aso/am');才艮毛審屬(WA/zowMCor)菌才朱，尤其是米赫才艮毛審(7/7/zomwcormz'e/ze/);才艮霉屬(7/n'zo/w力菌才朱，尤其是日本才艮霉(//2/zo/n^乂a/o"/cw)、小孑包根霉C//n'zo^"sAm'cm/ori^)和結節根霉(7/n'zo/7ws"odaswi1);紅冬孑包酵母屬(A/zoc/as^onWMm)菌才朱,尤其是念5朱訝犬纟工冬孑包酵母(W/20flfo5/(3nW/wm"rw/oWM);紅酵母屬(7/zo^)tora/a)菌株，尤其是粘紅酵母(W/zo^tora/ag7w""z^);扭卩孑包酵母屬(iS/o/"oZo/om7c&s)菌才朱,尤其是S/OA"o6o/omyc'e51s/7/6ato"ws;高溫霉屬(77zerwom_yc^y)菌抹尤其是77^rwow;vce51/""喂'"cwws(以前的//"Am.co/a/a"wg/"cwa)，Thiarosporella屬菌才朱尤其是77z/a/"as/o/-e〃a木霉屬(7Hc/2O0mwG)菌林,尤其是7Hc/2ocie削a//zarz/awwm和7Hc/zO(ien77a和/或輪枝霉屬(^f/c/〃/ww)菌抹。在優選的具體實施方案中，脂肪分解酶來自曲霉屬菌抹、無色桿菌屬菌抹、芽胞桿菌屬菌抹、念珠菌屬菌抹、色桿菌屬菌抹、鐮孢屬菌抹、腐質霉屬菌林、//，/zo矽wa菌株、假單胞菌屬菌林、毛霉屬菌抹、根霉菌屬菌林、或高溫霉屬(TTzerwomyces)菌抹。在更優選的實施方案中，脂肪分解酶為脂肪酶。脂肪酶可以因其具有能改變例如得自谷類底物中的發酵培養基(包括發酵酵母)的甘油三酯油脂和脂肪的結構和組成的能力而在此^^吏用。脂肪酶催化不同類型的甘油三酯轉化，例如水解、酯化和轉酯反應。適當的脂肪酶包括酸性、中性和堿性脂肪酶，如本領域眾所周知的，雖然在低脂肪酶濃度下酸性脂肪酶(例如，如購自Amano的脂肪酶GAMANO50)顯然比中性或堿性脂肪酶更為有效。優選用于本發明的脂肪酶包括Cam^/aa"^"c/^脂肪酶和Cam/,Wa脂肪酶。更優選的脂肪酶是純化的脂肪酶，例如Ca^//^2a"torc/to2脂肪酶(脂肪酶A),Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶B)Cam^foqy//"drace<a月旨肪酶和沙門氏柏干酷青霉菌(尸emW〃/wwcawew6eW/)月旨肪酶。所述脂肪酶可以是在EP258，068-A中公開的任一種脂肪酶或者是脂肪酶變體例如如WO00/60063或WO00/32758中所公開的變體，在這里將其引入作為參考。優選的商品化脂肪酶包括LECITASE、LIPOLASE和LIPEX(購自NovozymesA/S，Denmark)和GAMANO50(購自Amano)。優選加入脂肪酶的量大約為1-400LU/g，優選1-10LU/gDS，更優選1-5LU/gDS。在本發明的另一個優選的實施方案中，至少一種酯酶是角質酶。角質酶是能夠分解角質的酶。角質酶可從任何來源獲得。在一個優選的實施方案中，角質酶來自曲霉屬菌抹，尤其是米曲霉；鏈格孢屬菌抹，尤其是6ra^/"'o/a;嫌孑包菌屬菌才朱,尤其是腐皮嫌孑包菌(Fz^an'wwso/a"/)、雖宛豆癡屬鐮孑包菌(/^5an'WAWso/am'//s/)牙口大刀3史3鬼色鐮孑包菌(Fwsan'M附nwei/mCM/worwm)或4妾骨木3欠3鬼色嫌孑包(Fwsan.wmraewmsom6wc/ww);長入孑包屬(//e/w/加/2ospon^w)菌才朱，尤其是"l^頭長蟲需孑包(//e/w/wf/205porwm);腐殖霉屬菌抹(i/wm/co/a),尤其是//wm/co/a/mo/era;假單胞菌屬菌抹，尤其是門多薩假單胞菌或腐臭假單胞菌(尸化^fomowaspw/Wa);絲核菌屬CR/n'zoctow/a)菌才朱，尤其是癡屬絲核菌(^/n'zo"o"aso/am,);鏈霉菌屬菌株，尤其是齊痂病鏈霉菌(5^eptowycessca6/es);或單格孑包屬(Woc/a&'ww)菌抹，尤其是Woc/aAwrzcoraw"a/e。在一個最優選的具體實施方案中，角質酶來自//wm/co/az'rao/e似菌抹，尤其是z>wo/e"5菌抹DSM1800。//"w/co/a/wo/m角質酶在WO96/13580中作了描述，在這里將其引入作為參考。角質酶可以是變體，例如在WO00/34450和WO01/92502中所公開的一種變體，這里將其引入作為參考。優選的角質酶變體包括WO01/92502的實施例2中所列的變體，在此將其特別引入作為參考。有效量的角質酶在0.01-400LU/gDS，優選大約為0.1-100LU/gDS,更優選為l-50LU/gDS。此后可使用本領域已知的標準方法獲得角質酶量的進一步優化。在另一個優選的實施方案中，至少一種酯酶是磷脂酶。這里所使用的術語磷脂酶是一種對磷脂具有活性的酶。磷脂例如卵磷脂或磷脂酰膽堿，是由與兩個脂肪酸在外部(sn-l)和中間(sn-2)位置酯化以及與磷酸在第三個位置酯化的甘油組成；磷酸可依次被酯化成氨基醇。磷脂酶是參與磷脂水解的酶。可鑒別出若干種類的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其水解一個脂酰基(分別在sn-l和sn-2位置)形成溶血磷酸酯；溶血磷酸酶(或稱磷脂酶B)可水解溶血磷酸酯中剩余的脂酰基。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二脂酶)分別釋放二酰基甘油或磷脂酸。術語磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(Al或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。此處所使用的術語"磷脂酶A，，與本發明所述的酶相結合意在將所有具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶包括在內。磷脂酶活性可由具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可來自例如具有磷脂酶副活性的脂肪酶。在本發明另外的實施方案中，磷脂酶酶活性由基本上僅具有磷脂酶活性的酶提供，其中磷脂酶酶活性不是副活性。磷脂酶可來自任何來源，例如動物來源(例如，哺乳動物)，例如來自胰腺(例如牛或豬胰腺)，或蛇毒或蜂毒。可選擇性地，磷脂酶也可從微生物來源獲得，例如來自絲狀真菌、酵母或細菌，例如曲霉菌屬或種，例如黑曲霉(Am'ger);網柄菌屬(￡)!'c(yoWe//iwi)，例如D.<afaco/ofeww;毛霉菌屬(A^wcor)，例々口爪哇毛霉(M:乂m^m'cw)、大毛霉(wwceofo)、纟田月包毛屬(sz^"7/w/mz^);鏈孑包霉屬(A^wros;wra)，例^口4且壽造鏈孑包霉(W.crowo);根毛霉屬(旌zomwcw),例如兄根霉菌屬(//n'z叩M",例如無沖艮根霉(兄游/n'孺),日本根霉(.7'(3po"/cw)，葡4支才艮審(i.Wo/om)^/")，核盤霉(Sc/era"m'fl)，例如大豆核盤菌(&//6eW/a"a);毛褲菌屬(7/c/7o//^to"),例如剛果紅毛褲菌(7>M6rww);『/zetee//m'a，例如Wsc/era"on^w;芽孑包桿菌屬(Sac"/ws),例如巨大芽胞桿菌(RmegafeWwm)、枯草芽胞桿菌(R檸檬酸細菌屬(C"ratow)，例如氟氏檸檬細菌(C./腳"必);腸桿菌屬(E"^ra6ac^")，例如產氣腸桿菌(￡.)、陰溝愛德華氏菌(￡.c/oacae￡<iwara&!W/a)、塔達氏腸桿菌(￡);歐文氏菌屬(五rvWm'a)，例如草生歐文氏菌(￡./7eW/co/a);埃希氏4干菌屬(Esc/zen'c/z/")，例如大腸桿菌(五.co/0;克雷伯氏桿菌屬，例如肺炎克雷伯氏菌(K);變形桿菌屬(尸ra/ew)，例如普通變形桿菌(Pvw/gan's);普羅成登斯菌屬(iVoW血"c^),例如斯氏普羅威登斯菌(PW^m7)沙門氏菌屬(Sa〖wo"e〃a),例如鼠傷寒沙門氏菌(S.^pWmMr/wm);沙雷氏菌屬(&rm"a),例如乳紅化沙雷氏菌(51./z々we/osc/era)、粘質沙雷氏菌(Xwarcescera);志賀氏菌屬(S/z/ge〃a)，例如氟氏志賀氏菌(5".);鏈霉菌屬(S^pfomyces)，例如紫紅鏈霉菌(S.vi'o/eceorwfeer),耶爾森氏菌屬(1^w'm'a)，例如小腸結腸炎耶爾森氏菌(Kewmco""ca)。因此，磷脂酶可以是真菌，例如來自核菌綱(尸jre"ow少ce/es),例如鐮刀菌屬(Fw^n'ww)，例如大刀鐮孢(Fcw/morww)、異孢鐮孢(F&&ros;9orwm)、茄屬鐮孢(Fw/am')菌抹，或尖孢鐮孢(Fojcjworww)菌株。磷脂酶也可來自曲霉菌屬的絲狀真菌菌抹，例如泡盛曲霉(As/7erg/〃wawawon')菌株、臭曲霉屬菌0^/wg!7/ws/o"!Ww力、日本曲霉屬菌、黑曲霉或米曲霉。優選的商品化磷脂酶包括LECITASETM和LECITASEULTRA(可從丹麥的NovozymesA/S購買)。磷脂酶的有效量在0.01和400LU/gDS之間，優選大約為0.1-100LU/gDS，更優選1-50LU/gDS。可使用本領域已知的標準方法獲得磷脂酶量的進一步優化。植酸酶在優選的實施方案中，脂肪酸氧化酶與有效量的植酸酶聯合使用。根據這個具體實施方案，可以利用植酸酶促進從存在于培養基中的植酸(myo-inositolhexakisphosphate)或其中的任何鹽類(植酸鹽)釋放無機磷酸。植酸酶可根據其在最初水解步驟中的專一性來分類，即根據最初被水解的磷酸酯基來分類。所使用的植酸酶可具有任一專一性，例如3-植酸酶(E.C.3丄3.8)、6-植酸酶(E.C.3丄3.26)或5-植酸酶(無E.C.編號)。植酸酶可在發酵期間加入或在發酵前加入，例如，在增殖期間或在發酵前的步驟中，例如液化和/或糖化步驟。如WO01/62947中所描述的，可加入植酸酶，例如以改善酵母必需礦物質的生物利用度，這里將其引入作為參考。植酸酶也可用于預處理發酵培養基(例如，有或沒有回槽)。植酸酶可來自植物或微生物，例如細菌或真菌，如酵母或絲狀真菌。植物植酸酶可來自小麥麥麩、玉米、大豆或百合花粉。適當的植物植酸酶在以下文獻中作了描述:Thomlinsonetal，Biochemistry,1(1962)，166-171;Barrientosetal，Plant,Physio.，106(1994),1489-1495;WO98/05785;WO98/20139。細菌植酸酶可來自芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或埃希氏桿菌屬(Escherichia),優選枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或大腸桿菌(E.coli)種。適當的細菌植酸酶在以下文獻中作了描述Paver和Jaga腿than，1982,JournalofBacteriology151:1102-110&Cosgrove,1970,AustralianJournalofBiologicalSciences23:1207-1220;Greineretal，Arch.Biochem.Bio-phys.,303,107-113，1993;WO98/06856;WO97/33976;WO97/48812。酵母植酸酶或肌醇單磷酸酶可來自糖酵母屬(&cc/zarawyces)或許旺氏酵母屬(scMvawm'om^ce51)，優選酉良酒酵母(5"acc/zo7"cw^cesrerev/57.ae)或西方許旺氏酵母(5"c/wa"m'omycesocc/cfe"to/^)種。適當的酵母植酸酶在以下文獻中作了描述Nayinietal,1984,LebensmittelWissenschaftundTechnologie17:24-26;Wodzinskietal，Adv.Appl.Microbiol"42,263-303;AU-A-24840/95。絲狀真菌植酸酶可來自真菌門子嚢菌(爿^wnj;coto)(子嚢菌綱(asrowjce/^s))或4旦子菌門(5as/Womycoto),仿H口曲霉菌屬(/^/ergz'〃"s)、高溫霉屬(7Tzwww7^cas)(也稱腐殖霉屬)、毀絲霉屬(MFe//o//z/2ora)、A/a"ascws、青霉屬(尸em,c/〃/ww)、隔孑包革菌屬(Pem-op/wnx)、田頭霉屬(^g,'oqy6e)、樁菇菌屬(尸ax/〃w)或栓菌屬(Tram"e5)，優選土曲霉(力5/erg/〃ws)、黑曲霉(J5/erg7'〃wsw/ger)、黑曲霉;包盛曲霉哭種(y4j/erg〃/iwvor.a而mon')、無花果曲霉(v45/erg7'〃z^_/^扁)、煙曲霉(y^/erg"/w51/ww/gv2Z"s)、米曲霉(/^/ergz7/wso/jzae)、27/awMg/"oyws(也稱/朋wg7力osa)、嗜熱毀絲霉(柳ce/—勵omAe/TnopMa)、尸em.o//zora/_yc"、平田頭茲(Jgrocj^epWaGfes)、M""oscwsa"A:"、_Pox/〃i/wvo/加或織毛檢菌(rrawe&s;MZ^cms)。適當的真菌植酸酶在下列文獻中作了描述:Yamadaetal.，1986,Agric.Biol.Chem.322:1275-1282;Pidding-tonetal.，1993，Gene98/28409;JP7-67635;WO98/44125;WO97/38096;WO98/13480，此處^夸它們并入作為參考。修飾過的植酸酶或植酸酶變體可采用本領域已知的方法獲得，特別是通過下列文獻中所公開的方法獲得EP897,010;EP897,985;WO99/49022;WO99/48330。可購買的商品化植酸酶包括BIO-FEEDPHYTASETM、PHYTASENOVOCT或L(丹麥NovozymesA/S),或NATUPHOSNG5000(DSM)。優選可加入的植酸酶在5，000-250，000FYT/gDS范圍，優選10，000-100,000FYT/gDS。植酸酶優選的合適用量在0.005-25FYT/gDS,更優選在0.01-10FYT/g,例如0.1-1FYT/gDS。此處植酸酶活性用FYT單位定義，一個FYT指在下列條件下每分鐘釋放1毫摩爾無機正磷酸鹽PH5.5;溫度37°C;底物濃度為0.0050mole/L的植酸鈉(C6H6024P6Nal2)。蛋白酶在另一個優選的實施方案中，脂肪酸氧化酶處理與至少一種蛋白酶結合使用。可使用蛋白酶用于例如消化蛋白質以產生游離氨基氮(FAN)。這種游離氨基酸可作為酵母的養分，從而增進酵母的生長并就此制備乙醇。在發酵方法中使用的發酵微生物可通過在至少一種蛋白酶的存在下增殖發酵微生物來制備。雖然未限定于任一種工作原理，但確信的是，與在未加蛋白酶的相同條件下增殖的發酵微生物相比，當發酵微生物接著用于發酵方法中時，具有至少一種有效量的蛋白酶的發酵微生物的增殖縮短了發酵微生物的延遲時間(lagtime)。可認為的是，在增殖方法中蛋白酶的作用直接或間接導致了在發酵期間對發酵微生物有害或有益的基因分別抑制或表達，從而縮短延遲時間并導致加快發酵周期。蛋白酶是本領域已知，是指可催化肽鍵裂解的酶。適當的蛋白酶包括真菌和細菌蛋白酶。優選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即以在低于PH7的酸性條件下能水解蛋白質為特征的蛋白酶。適當的酸性(acid)真菌蛋白酶包括來自下列的真菌蛋白酶曲霉屬(y^^rgz'〃w)、毛霉屬(Mwcor)、酒曲菌屬(//n'zo;ws)、念珠菌屬(Ca"AWa)、草蓋菌屬(Cor/o/ws)、疫病霉屬(￡>zc/of/7/a)、￡>z/zomop/^A"a、l巴菌屬(/r/ex)、青霉屬(尸ew/c,〃/ww)、菌才亥(5Wmn'"w)和球擬酵母屬(rora/o;^)。特別傾向的是來自黑曲霉的蛋白醵(參見，例d^Koazeetal.，(1964),Agr.BioLChem.Japan,28,216)，^Lyperg/〃"ssm'to/(參見，例i口Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(J，rg/腸a而膨W)(Hayashidaetal.，(1977)Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，棘孢曲霉(如，7/w,/e咖)(WO95/02044)，或米曲霉(Ay/erg7'〃"51和來自微小毛霉(Mwcor或米赫毛霉(mz'e/2e/)的酸性蛋白酶。不是酸性蛋白酶的細菌蛋白酶，包括商品化產品ALCALASE和NEUTRASETM(可從NovozymesA/S購買)。其它的蛋白酶包括GenencorInt,Inc.USA的GC106和丹麥NovozymesA/S的NOVOZYMTM50006。優選的是，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，如同下列文獻中所描敘的HandbookofProteolyticEnzymes,A.,J.Barrett,N.D.RawlingsandJ.F.Woessner編輯，AcademicPress,SanDiego,1998,270章。天冬氨酸蛋白酶適當的例子包括例如在下列文獻中所公開的那些R.M.Berkaetal.Gene，96,313(1990));(R.M.Berkaetal.Gene,125,195-198(1993));和Gomietal.Biosci.Biotech.Biochem.57,1095-1100(1993)，在此將其引入作為參考。漆酶在另一個優選的實施方案中，脂肪酸氧化酶處理與漆酶結合使用。可在發酵期間加入有效量的漆酶，和/或在發酵之前或發酵期間例如，在發酵微生物增殖期間施用有效量的漆酶。雖然未限定于任一種工作原理，但可認為的是在發酵方法中使用至少一種漆酶促進了抑制劑的氧化和缺氧，從而促進更適于發酵微生物的缺氧環境的形成。在本發明范圍內，漆酶和涉及漆酶的酶包括酶分類(EC1.10.3.2)所包含的任何漆酶、酶分類(EC1.10.3.1)所包括的任何兒茶酚氧化酶、酶分類(EC1.3.3.5)所包括的任何膽紅素氧化酶或酶分類(EC1.14.18.1)所包括的4壬何單酚單加氧酶。上述酶可來自植物、細菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)，適當的例子包括來自下列菌屬的抹的漆酶曲菌屬(^yp^g///^);鏈孢霉屬(A^ewrawora),例如粗糙鏈孢霉(iV.);束柄霉屬(戶。(ios/ora);葡萄孑包屬(5"o^;y);金錢菌屬(C0〃76/a);層孔菌屬();香菇屬(丄e""騰);北風菌屬(尸/e騰to);栓菌屬(r讀由),例如！Tv/〃謹和7:ver57'co/or;絲核菌屬(/^Zzo"o"/a),例^口癡屬絲核菌(兄so/awz');鬼傘屬(Co/n'"^)，仿H口C.c/werew5sC.cowans,C./n'es//牙口C.pZ/caZ//"';尸s"^yre〃a,侈'H口f！co"(ie〃e(2"(3;尸a"aeo/iw,例i口尸/apz7/ow(acew;f殳絲霉屬(A^ce//o;/7Aora!),例4口P耆熱^:絲零(A/.Aermo//7z7a);Sc/7yto/W/Mm，例:i口5"./Ae/Twop/n'/ww;多孑L菌屬(尸o/y/on^)，例i口尸p/m7w;密孑L菌屬(尸yc"c^omy),例如朱紅密孑L菌(尸c/"w^<an>ms);射脈菌屬(尸A/e6/a),例如輻射射脈菌(尸ra麵)(WO92/01046),或草蓋菌屬(Cor油s),例如C.(JP2-238885)。優選來自下列菌屬的漆酶鬼傘屬(Co;n'"w)、毀絲霉屬(Afyce//op/^/zora)、多孑L菌屬(尸o(y;onw)、密孑L菌屬(尸少c"opoms)、柱霉屬(Sc少to/Wwm)或絲核菌屬(//H'zocom'a),特別是來自灰鬼傘屬(Co/r/"w".were^s)、嗜熱毀絲霉(Afyce/Zop緣on3Ae/vwop/n'/o)、尸o/y/orws//ra""5、朱纟工密孑L菌(尸j;cwopo^s">wa6an'wws)、■Scyfa/i.^'wrnf/jermo//n7w;77或jS屬絲核菌(A/n'zocom'aso/aw/)的S泰酵。淀粉酶在另一個優選的實施方案中，脂肪酸氧化酶處理與淀粉酶結合使用。優選來自真菌或細菌的a-淀粉酶。a-淀粉酶更優選是芽孢桿菌屬a-淀粉酶，例如來源于地衣芽孢桿菌(及//c/^m/orw/s)、解淀粉芽孢桿菌(Ram_y/o/,々we/ac/era)、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(及wMto)的菌抹。其它a-淀粉酶包括來自芽孢桿菌屬(B鎖7/zww.)NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的a-淀粉酶，所有的這些在WO95/26397中進行了詳細描述和Tsukamotoetal.，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,151(1988)，pp.25-31中描述的a-淀粉酶。其它a-淀粉酶變體和雜交體在W096/23874、W097/41213和W099/19467中作了描述。其它的a-淀粉酶包括來源于曲菌屬菌抹的a-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉a-淀粉酶。在一個優選的實施方案中，a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶。在更優選的具體實施方案中，酸性a-淀粉酶是酸性真菌a-淀粉酶或酸性細菌a-淀粉酶。更優選的是，酸性a-淀粉酶是來源于曲霉菌屬的酸性真菌a-淀粉酶。可購買的商業化酸性真菌淀粉酶為SP288(購自丹麥的NovozymesA/S)。在一個優選的實施方案中，a-淀4分酶是酸性a-淀4分酶。術語"酸性a-淀粉酶，，是指加入的有效量的a-淀粉酶(E,C.3.2丄1)在PH3.0-7.0的范圍內、優選3.5-6.0或更優選4.0-5.0范圍內具有活性。優選的酸性真菌a-淀粉酶為芬加密爾(Fungamyl)樣的a-淀粉酶。在本發明中所用的術語"芬加密爾樣a-淀粉酶，，是指顯示出高同源性的a-淀粉酶，即對在W096/23874中所示的SEQIDNO.10氨基酸序列超過50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%的同源性。當用作產生麥芽糖的酶時，可加入真菌a-淀粉酶的有效量為0.001-1.0AFAU/gDS,優選為0.002-0.5AFAU/gDS，優選0.02-0.1AFAU/gDS。優選a-淀粉酶為酸性a-淀粉酶，優選來源于曲霉屬，優選黑曲霉或米曲霉種。在一個優選的實施方案中酸性真菌a-淀粉酶是如在Swiss-prot/TeEMBL數據庫以最初登記號為P56271的"AMYA—ASPNG，，中披露的黑曲霉(A.niger)中的酸性真菌a-淀粉酶。此外考慮所述的酸性真菌淀粉酶變體，其具有與其最少70%的同源性(一致性)，例如至少80%的同源性或甚至至少90%的同源性。優選含有a-淀粉酶的商品化組合物包括DSM的MYCOLASETM(GistBrochades)、BAN、TERMAMYLSC、FUNGAMYL、LIQUOZYMEX和SANSUPER,和SANEXTRAL(novozymesA/S)和CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEYMEFRED、SPEYMEAA和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt)，以及以商品名SP288銷售的酸性真菌a-淀粉酶(購自丹麥的NovozymesA/S)。淀粉酶也可是產麥芽糖(maltogenic)a-淀粉酶。"產麥芽糖a-淀粉酶"(葡聚糖1,4-a-麥芽糖水解酶，E.C.3.2丄133)能將直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成a構型的麥芽糖。來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(5.WeflraAermopMw)菌抹NCIB11837的產麥芽糖a-淀粉酶可從NovozymesA/S公司以商品名NOVAMYL購買到。產麥芽糖a-淀粉酶在下列文獻中作了描述美國專利號US4，598,048;4,604，355,和6,162,628,在此將其引入作為參考。優選的是，例如如同在WO95/10627中所描述的將產麥芽糖a-淀粉酶在粗淀粉水解方法中使用，此處將其引入作為參考。a-淀粉酶可以本領域眾所周知的量加入。當以AAU單位計量時，優選酸性a-淀粉酶活性的存在量為5-50,0000AAU/kgDS、量為500-50,000AAU/kgDS或更優選為100-10,000AAU/kgDS，例如500-1，000AUU/kgDS。優選加入真菌酸性a-淀粉酶的量為10-10,000AFAU/kgDS、量為500-2,500AFAU/kgDS或更優選量為100-1,000AFAU/kgDS,例如大約為500AFAU/kgDS。根據本發明方法的實施方案中所用的葡糖淀粉酶可來源于任何合適來源，例如來源于微生物或植物。優選的葡萄糖淀粉酶來自真菌或細菌，選自由曲霉屬葡萄糖淀粉酶組成的組，具體為黑曲霉Gl或G2葡萄糖淀粉酶(Bodetal.(1984),EMBOJ.3(5)，p.1097-1102)，或其變體，例如公開于WO92/00381和WO00/04136;泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(A,oryzae)(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4)，p.941-949)，或其變體或片段。其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括增強其熱穩定性的變體G137A和G139A(Chenetal.(1996)，Prot.Engng.9,499-505);D257E和D293E/Q(Chenetal.(1995),ProtEngng.8,575-582);N182(Chenetal.(1994)，Biochem.J.301，275-281);二硫鍵，A246C(Fierobeetal.(1996)，Biochemistry,35，8698-8704;以及在A435和S436位置引入殘基(Lietal.(1997),ProteinEngng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括踝節菌屬(ra/aram_yces)葡糖淀粉酶，特別是來自ra/araw_ycesemersow'/(WO99/28448)、ra/aramyc^/eyce,towws(美國專利號.Re.32,153)、7h/orcw^ces<iwpo/^'、ra/arawyes//7enwp/n7^(美國專利號US4,587,215)。所考慮的細菌葡糖淀粉酶包括來自梭狀芽胞桿菌屬(C7oWrWwn)，特別是C.f/^moamy/o/,'CMm(EP135,138)和C.Aermo/z>^msw//wWcMW(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。含葡糖淀粉酶的商品化組合物包括AMG200L;AMG300L;SANTMSUPER,SANEXTRAL，SPIRIZYMEPLUS,SPIRIZYMEFUEL和AMGE(購自NovozymesA/S);OPTIDEX300(購自GenencorInt.);AMIGASE和AMIGASEPLUS(購自DSM);G-ZYMEG900,G-ZYMETM和G990ZR(購自GenencorInt.)。可加入葡糖淀粉酶的有效量為0.02-20AGU/gDS，優選0.1-10AGU/gDS,例如2AGU/gDS。木聚糖酶在另一個優選的實施方案中，脂肪酸氧化酶處理與木聚糖酶結合使用。木聚糖酶(EC.3.2.1.8)活性可源于任何適合的來源，包括真菌和細菌生物體，例如曲霉屬、ZXs;orafn'c/mw、青霉屬、脈孢菌、鐮刀菌屬和木霉屬。含有木聚糖酶的優選商品化制品包括SHEARZYME、BIOFEEDWHEAT、CELLUCLAST、ULTRAFLO、VISCOZYME(NovozymesA/S)和SPEZYMECP(GenencorInt.)。纖維素酶在另一個優選的實施方案中，脂肪酸氧化酶處理與纖維素酶結合使用。根據發明所使用的纖維素酶活性源于任何適合的來源；優選纖維素酶是源于微生物，例如源于絲狀真菌菌抹(例如曲霉屬、木霉屬、腐殖菌屬、鐮刀菌屬)。可使用的含有纖維素酶的商品化制品包括CELLUCLAST、CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(NovozymesA/S)、LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.)，以及ROHAMENT7069W(購自R6hmGmbH)。酶的制備脂肪酸氧化酶和此處所引用的其它酶可來源于或獲得于任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母或哺乳動物源。術語"來源"在本文中的意思是所述酶可以從其天然存在的生物體中分離出，即該酶的氨基酸序列與天然酶一致。術語"來源，，也指該酶可以由宿主生物體重組產生，重組生成的酶具有與天然酶一致的特性或具有修飾的氨基酸序列，例如具有一個或多個缺失、插入和/或替換的氨基酸，即重組生成的酶為天然氨基酸序列的突變體和/或片段，或通過本領域已知的核酸改組的方法產生的酶。在天然酶意義內包括天然的變體。此外，術語"來源"包括合成產生的酶，例如肽合成。術語"來源"還包括不論是在體內或體外經過修飾例如通過糖化、磷酸化或其它的化學修飾的酶。術語"獲得"在本文中的意思是指具有與天然酶一致的氨基酸序列的酶。該術語包括已從天然存在的生物體中分離的酶，或在同種或不同種類的生物體中已重組表達的酶，或通過合成例如肽合成產生的酶。就重組產生的酶而言，術語"獲得"和"來源"是指酶的特性，而非其在其中重組產生的宿主生物體的特性。酶也可以被純化。這里所使用的術語"純化的"包括不含其所來源的生物體的其它組分的酶。術語"純化的"還包括不含其所從其獲得的天然生物體中組分的酶。酶可以純化至僅有少量的其它蛋白存在。措詞"其它蛋白質"特別是指其它的酶。這里所使用的術語"純化的"也指除去其它組分，特別是其它的蛋白質，更具體指存在于本發明酶的來源的細胞中的其它酶。酶可以是"基本上，，純的，即不含其從中產生的生物體的其它組分，即例如重組產生酶的宿主生物體。在優選的實施方案中，酶至少為75%(W/W)純，更優選至少為80%、至少為85%、至少為卯％、至少為95%、至少為96%、至少為97%、至少為98%或至少為99%純。在另一個優選的實施方案中，酶為100%純。根據本發明所使用的酶可以以任何適合的形式用于此處所描述方法中使用，例如，如以干粉或顆粒、無塵顆粒、液體、穩定液體或受保護酶的形式。例如可如在美國專利US4，106，991和US4,661,452中所公開的方法制備顆粒，并且可任選采用本領域已知的方法包被。可根據既定方法例如通過加入穩定劑如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有機酸來穩定液體酶制劑。受保護的酶可根據EP238，216中所公開的方法制備。發酵刺激劑根據本發明的另一個優選方案，發酵刺激劑可與此處所描述的任何的酶方法結合使用以進一步改善發酵方法，特別是，改善發酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇產率。"發酵刺激劑"是指發酵微生物生長刺激劑，發酵微生物特別是酵母。優選的發酵生長刺激劑包括維生素和礦物質。維生素的例子包括多種維生素、生物素、泛酸、煙酸、內消旋肌醇、石克胺、吡哆醇、對氨基苯酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E，例如參見Alfenoreetal.,"ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiabyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess",Springer-Verlag(2002)，其在此弓1入作為參考。礦物質的例子包括那些能提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu營養素的礦物質和礦物質。液化或糖化任何液化或糖化均可與本發明的發酵方法結合使用。根據本發明糖化和液化可與發酵方法同時或分開進行。在本發明的一個優選實施方案中，液化、糖化和發酵方法同時進行(LSF)。"液化"是其中磨碎的(完整的)谷類原料被分解(水解)成麥芽糖糊精(糊精)的方法。液化通常以三步熱淤漿方法進4亍。在60-95。C、優選80-85。C加熱淤漿，和加入酶以引發液化(稀釋)。然后在95-140。C、優選在105-125。C下噴烤(jet-cooked)淤漿以使淤漿徹底糊化(gelanitization)。接著使淤漿冷卻至60-95。C并加入更多的酶以結束水解(二級液化)。液化方法通常在PH4.5-6.5進行，特別是在PH5-6。磨碎并液化的全粒稱為糊狀物(mash)。通常使用上述"淀粉酶"部分中所列的任何a-淀粉酶進行液化方法。"糖化"是使麥芽糖糊精(例如由液化方法產生)變成可被發酵微生物例如酵母代謝的低分子量糖DPw(即碳水化合物源)的方法。糖化方法是為本領域眾所周知的，通常由葡糖淀粉酶酶催化進行。可選擇地或附加地，可使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。整個糖化方法可持續大約24-72小時，通常大約在30-65。C的溫度、和在PH4-5、通常大約在PH4.5的條件下進行。然而，通常更優選進行預糖化步驟，該步驟持續大約40-90分鐘、在30-65。C的溫度、典型地大約在6(TC下進行，隨后在發酵期間在同時發生的糖化和發酵方法(SSF)中完全糖化。在乙醇生產中使用的最普遍的方法是同時進行糖化和發酵(SSF)方法，其中不經過糖化保持階段，這意味著共同加入發酵生物(例如酵母)和酶。在SSF方法中，通常恰恰在發酵前，在5(TC以上的溫度引入預糖化步驟。更優選的是，液化、糖化或發酵方法是同時進行液化-糖化-發酵(LSF)方法或單一酶方法，其中液化、糖化和發酵方法全部在一個方法中進行，即所有用于液化、糖化和發酵的酶(或可替換的或另外的非酶試劑)在同一個方法中加入，更優選在同一方法內同時加入。優選的LSF方法的工藝條件包括溫度約26-40°C、優選大約32。C,大約PH4至大約8、優選大約PH5，和方法步驟時間大約48-72小時，優選大約72小時。優選LSF方法或單一酶催化方法為粗淀粉水解(RSH)方法，更優選用于生產醇例如乙醇。"粗淀粉水解，，方法(RSH)不同于常規的淀粉處理方法在于粗的未煮過的淀粉(也稱顆粒淀粉)用于乙醇發酵方法。此處所使用的術語"顆粒淀粉"是指粗的未煮過的淀粉，即以天然形式存在于谷物、塊莖或谷類中的淀粉。淀粉在植物細胞內形成不溶于水的細小顆粒。當置于冷水中時，淀4分顆粒可吸收少量液體并膨脹。在高至50-75。C的溫度時膨月長是可逆的。然而，在更高的溫度下開始不可逆膨脹，叫做糊化。術語"初始糊化溫度，，是指淀粉開始糊化的最低溫度。在水中加熱的淀粉于50-75。C之間開始糊化；確切的糊化溫度取決子具體的淀粉，并且本領域技術人員能容易地確定該溫度。因此，初始糊化溫度可根據植物品種.植物品種的具體變種以及生長條件而不同，在本發明范圍內，給定淀粉的最初糊化溫度為在通過使用Gorinstein.S.和Lii.C.,Starch/Starke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)中所描述的方法雙折射損失5%淀粉顆粒的溫度。根據一個優選的實施方案，優選脂肪酸氧化酶與酯酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶結合使用，以提高粗淀粉水解方法中的乙醇產率。在優選的實施方案中，本發明包括用脂肪酸氧化酶和選自下列組中的一種或多種酶活性在低于顆粒淀粉的最初糊化溫度下處理顆粒淀粉淤漿，其中所述組為植酸酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、葡糖淀粉酶和/或(產麥芽糖)a-淀粉酶、酵母。優選酵母是乙醇紅(red"/zam/)酵母。優選淀粉酶是酸性a-淀粉酶，更優選是酸性真菌a-淀粉酶。在更優選的實施方案中，粗淀粉水解方法需要用葡糖淀粉酶和/或a-淀粉酶在低于顆粒淀粉最初糊化溫度的0-20。C下處理顆粒淀粉淤漿，隨后在10-35。C溫度下用葡糖淀粉酶和/或a淀粉酶、酵母和至少一種脂肪酸氧化酶以及任選的酯酶、蛋白酶、植酸酶、漆酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶處理淤漿。在另一個優選的實施方案中，該方法需要下列連續步驟(a)在低于顆粒淀粉最初糊化溫度的0-2(TC下用酸性a-淀粉酶和葡糖淀粉酶處理顆粒淀粉淤漿，優選時間為5分鐘-12小時，(b)在10-35i:在酸性a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酵母和至少一種脂肪酸氧化酶以及任選的植酸酶、蛋白酶、漆酶、酯酶存在下處理淤漿，優選時間為20-250小時，以生成乙醇。在RSH步驟中，可將其它酶和發酵刺激劑與脂肪酸氧化酶處理結合使用。優選其它的酶選自酯酶例如脂肪酶、或角質酶、植酸酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶或a-淀粉酶例如產麥芽糖a-淀粉酶、葡糖淀粉酶或它們的組合。在RSH步驟中存在大量的植酸。因此，在優選的實施方案中，如前面所述，4直酸酶可用于促進乂人才直酸(myoinositolhexakisphosphate)或其任何鹽(植酸鹽)中釋放無機磷酸。在另一個優選的實施方案中，在RSH方法中將產麥芽糖a-淀粉酶與脂肪酸氧化酶結合使用。本發明所述的發酵方法和組合物優選應用于醇的生產方法中(例如，用作燃料或燃料添加劑的乙醇)，更優選使用粗淀粉水解方法。使用如本發明所述的方法，例如可提高乙醇生產的速度和/或產率。加入至少一種有效量的脂肪酸氧化酶可用于改善發酵產品的乙醇產率。乙醇生產方法通常包括磨碎、液化、糖化、發酵和蒸餾步驟。在生產乙醇和其它的基于淀粉的產品中，需要粉碎原料例如全粒，優選玉米，以便破壞結構然后進行下一步加工。根據本發明優選使用兩種方法濕法磨碎和干法磨碎。優選使用干法磨碎生產乙醇，其中將整個籽粒磨碎然后在后面的步驟中使用。也可使用濕法磨碎并且可很好的分離微生物和粗粉(淀粉顆粒和蛋白質)，除少數情況外濕法磨碎在平行生產糖漿時使用。濕法和干法磨碎方法是本領域所公知的。在乙醇生產中，發酵生物優選酵母，將其應用于麥芽漿。酵母優選來源于酵母菌屬(Sacc/2aramyc"&ss//.),更^f尤選來于酉良酒酵母(Sacc/zGramyc'escerev&ae)。在優選的實施方案中，將酵母加入麥芽漿，然后發酵進行24-96小時，例如典型的為35-60小時。在優選的實施方案中，溫度通常為26-34。C，特別是大約為32。C，PH值通常為PH3-6，優選大約為PH4-5。施用的酵母細胞的量優選為105-1012，優選為107-101Q,特別是為每毫升發酵肉湯中活酵母計數為5xl07。在乙醇產生階段酵母細胞計數優選在107-101()范圍內，特別是大約為2xl08。關于使用酵母用于發酵的更多指導可參見，例如，"ThealcoholTextbook"(EditorsK.Jacques,T.P.LyonsandD.R.Kelsall,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)，在此將其引入作為參考。發酵后，可蒸餾麥芽漿以提取醇產品(乙醇)。在根椐本發明方法獲得的最終產品是乙醇的情況，其可用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即飲用酒精；或工業乙醇。另一方面本發明涉及一種生產乙醇的方法，包括U)磨碎全粒；(b)液化步驟(a)的產品；(c)糖化液化的物質；(d)使用微生物來發酵糖化的物質，其中發酵方法還包括使發酵培養基與至少一種脂肪酸氧化酶相接觸。脂肪酸氧化酶和附加的酶以及刺激劑可以是上面提到的任一種。脂肪酸氧化酶優選是脂氧化酶。最后本發明涉及一種組合物，所述組合物舍有脂肪酸氧化酶和一種或多種選自由酯酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶例如a-淀粉酶或葡糖淀粉酶或它們的混合物組成的酶。在一個優選的實施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶(LOX)，優選上面所提到的任一種。在一個實施方案中組合物還含有脂肪酶和任選的a-淀粉酶，組合物還可含有脂肪酶和任選的a-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。材料和方法脂肪酸氧化酶脂氧化酶來源于Maga/oW/zew/v/m7,其公開于WO02/086114(可購自丹麥的NovozymesA/S)。脂肪酶LIPOLASE100L(購自丹麥的NovozymesA/S)葡糖淀粉酶SPIRIZYMEFUEL(購自NovozymesA/S)蛋白酶NOVOZYM50006(購自丹麥NovozymesA/S)酵母乙醇紅，購自美國RedStar/Lesaffre方法回槽的制備從發酵醪(beer)解吸塔(stripper)柱中離心發酵的粗淀粉后的離心分離液。脂氧化酶活性脂氧化酶活性可在25。C下通過監測氫過氧化物的形成采用分光光度來測定。對于標準分析方法，將10微升酶加入到含980微升25mM的磷酸鈉緩沖液(PH7.0)和10微升底物溶液(10mM分散有0.2%(v/v)Tween20的亞油酸(不應保存時間過長))的lml石英池中。通常將酶足夠稀釋以確保在第一時間內最大使加入的底物轉換10%。吸收在234nm進行，其吸收率可通過曲線的直線部分來估計。假定順式-反式-共軛的羥基(過氧)脂肪酸具有的分子消光系數為23,000M-'cm—'。a-淀粉酶活性(KNU)可采用馬鈴薯淀粉作為底物來測定淀粉分解活性。該方法以由酶破壞修飾的馬鈴薯淀粉為基礎，隨后通過使淀粉/酶溶波樣品和碘溶液混和進行反應。最初形成微黑-藍色，但分解淀粉期間藍色變弱，然后逐漸變成紅褐色，將其與有色玻璃標準比較。1KiloNovoa-淀粉酶單位(KNU)的定義為在標準條件下(即在37°C+/-0.05;0.0003MCa2+;和PH5.6)糊精化5260mg可溶性MerckAmylum淀粉干燥物所需要酶的量。這種分析方法在文件EB-SM-0009.02/01中作了更詳細地描述,其可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。植酸酶活性植酸酶活性以FYT單位來計量，在下列條件下PH5.5;溫度37。C;底物濃度為0.0050mol/L的植酸鈉(C6H6024P6Na12)，1FYT是指每分鐘釋放1毫摩爾無機正磷酸鹽所需要酶的量。FAU活性測定1真菌a-淀粉酶單位(FAU)是指基于下列標準條件下每小時分解5.26g淀粉(MerckAmylum的可溶性Erg.B.6，批號9947275)所需要的酶的量底物..........可溶性淀粉溫度.........37°CpH............4.7反應時間.........7-20分鐘酸性a-淀粉酶活性(AFAU)測試酸性a-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)來計量，其相對于酶的標準來確定。使用的標準是AMG300L(丹麥NovozymesA/S，野生型黑曲霉屬Gl葡糖淀粉酶，還公開于Boeletal.(1984)，EMBOJ.3(5),p.1097-1102)和WO92/00381)。在這一AMG的中性a-淀粉酶經在室溫下存儲3星期后從大約1FAU/mL降至^氐于0.05FAU/mL。在這一AMG標準中的酸性a-淀粉酶活性根據下列說明來確定。在該方法中，1AFAU是指在標準條件下每小時分解5.260mg淀粉干物質所需的酶的量。碘與淀粉而不是與其降解物形成藍色絡合物。顏色的強度與淀粉的濃度成正比。使用反向比色法如在所規定的分析條件下通過淀粉濃度的降低來測定淀粉酶活性。a-淀粉酶淀粉+碘-糊精+低聚糖4(TC,pH2.5藍/紫t-23秒褪色標準條件/反應條件(每分鐘)底物淀粉，大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，大約0.03M碘(12):0.03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05孵育溫度40°C反應時間23秒波長？i=590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL如需更詳細的細節，可在EB-SM-0259.02/01中找到，其可從丹麥的NovozymesA/S得到，在此并入本發明作為參考。酸性a-淀粉酶單位(AAU)酸性a-淀粉酶活性可以AAU(酸性a-淀粉酶單位)來計量，其是一個絕對的方法。一個酸性淀粉酶單位(AAU)是在標準條件下與強度已知等同于某一顏色基準的碘溶液反應后，將lg淀粉(100%干料)轉變成在620nm能傳輸(transmission)的產品每小時所需的酶的量。標準條件/反應條件底物濃度大約為20gDS/L的可溶性淀粉緩沖液檸檬酸鹽，大約0.13M,pH=4.2石爽溶液4t).176g硤化鉀+0.088g碘/L的自來水15°-20°dH(德國度硬度)PH:4.2孵育溫度30。C反應時間11分鐘波長620nm酶濃度0.13-0.19AAU/mL酶工作范圍0.13-0.19AAU/mL淀粉應該是Lintner淀粉，它是一種用于實驗室的作為比色指示的低稠性(thin-boiling)淀粉。Lintner淀粉是通過稀鹽酸處理天然淀粉而獲得的從而使其保持遇碘變藍色的性能。在EP0140410B2中作了更詳細的描述,在此將其并入作為參考。測定葡糖淀粉酶活性(AGI)葡糖淀粉酶(相當于淀粉葡萄糖苦酶)使淀粉轉變成葡萄糖。在此通過葡萄糖氧化酶方法測定活性來測定葡萄糖的量。所述方法在下列文獻中作了描述參見"ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists"的76-11章節Starch-GlucoamylaseMethodwithSubsequentMeasurementofGlucosewithGlucoseOxidase.Vol.1-2AACC,AmericanAssociationofCerealChemists,(2000);ISBN:1-891127-12-8。1葡糖淀粉酶單位(AGI)是指在方法的標準條件下每分鐘形成1微摩爾葡萄糖所需要的酶的量。標準條件/反應條件底物可溶性淀粉，濃度大約為16g干燥物質/L.緩沖液檸檬酸鹽，大約0.04M，pH=4.3pH:4.3孵育溫度60°C反應時間15分鐘中止反應加入NaOH至濃度大約為0.2g/L(PH~9)酶濃度0.15-0.55AAU/mL淀粉應該是Lintner淀粉，它是一種用于實驗室的作為比色指示的低稠碘變藍色的性能。葡糖淀粉酶活性(AGU)所述Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標準條件37。C和PH4.3底物麥芽糖23.2mM，緩沖液乙酸鹽0.1M,反應時間5分鐘下水解1微摩爾麥芽糖每分鐘所需的酶的量。可使用自動分析儀系統。往葡萄糖脫氬酶試劑中加入變旋酶以使存在的任一a-D-葡萄糖轉變成P-D-葡萄糖。葡糖脫氫酶專一地與上述反應中的卩-D-葡萄糖反應，形成NADH，其如同測量最初的葡萄糖濃度那樣通過使用光度計在340nm測定。AMG孵育<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>更詳細地描述這種分析方法的文件EB-SM-0131.02/01可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。測定角質酶活性(LU)如同測定脂解活性，可采用三丁酸甘油酯(tributyrine)作為底物來測定角質酶活性。所述方法基于酶水解三丁酸甘油酯，然后作為時間的函數來記錄堿的消耗量。1脂肪酶單位(LU)定義為在標準條件下(即30°C;PH7.0;阿拉伯樹膠(GumArabic)作為乳化劑和三丁酸甘油酯作為底物)釋放1微摩爾可滴定的丁酸每分鐘所需的酶的量。更詳細地描述這種分析的方法在文件AF95/5可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。木聚糖分解(Xylanolvtic)活性(FXU)可用FXU單位表示木聚糖分解活性，其用remazol-木聚糖(用RemazolBrilliantBlueR染色的4-0-曱基-D-glucurono-D-木聚糖，Fluka)作為底物在PH6.0下來測定。用remazol-木聚糖底物孵育木聚糖酶樣品。通過乙醇沉淀不降解的染色底物的底色。在上層清液中保留的藍色(在585nm分光光度測定)與木聚糖酶活性成正比，然后相對于酶的標準在標準反應條件即在50.0°C、PH6.0和30分鐘的反應時間下測定木聚糖酶單位。更詳細地描述這種分析方法的文件EB-SM-352.02/01可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。測定產麥芽糖淀粉酶(MaltogenicAmylase)活性(MANU)1MANU(產麥芽糖淀粉酶Novo單位)可定義為在每毫升0.1M檸檬酸鹽緩沖液PH5.0濃度為每毫升10mg麥芽三糖(SigmaM8378)底物下37r和30分鐘的反應時間，釋放1微摩爾麥芽糖每分鐘所需要的酶的量。纖維素分解(CeHulvtic)活性(EGU)纖維素分解(cellulytic)活性可以內-葡聚糖酶單位來計算，其用羧甲基纖維素(CMC)作為底物在PH6.0來測定。制備底物溶液，其在PH6.0下在0.1M磷酸鹽緩沖液中含有34.0g/LCMC(Hercules7LFD)的底物溶液。將要分析的酶樣品在同一緩沖液中溶解。將5ml底物溶液和0.15ml酶溶液混和，然后轉移至振動粘度計(例如法國Sofraser的MIVI3000),在40。C恒溫30分鐘。1EGU定義為在這些條件下使粘度減至一半所需要酶的量。反應混合物中酶樣品的量應調至0.01-0.02EGU/mL。將主要標準(archstandard)定義為880EGU/g。更詳細地描述這種分析方法的文件EB-SM-0275.02/01可從丹麥的NovozymesA/S索取得到，在此將其引入作為參考。實施例實施例1測定基于亞油酸的脂肪酸氧化酶活性使用具有TriOxmatic300氧電極和4ml的標準反應容量的"Oxi3000Oximeter"(WTW,Weilheim，德國)。將10mg亞油酸(10ml60%亞油酸)溶于lml乙醇，然后加入2微升Tween20。將50微升這一底物原液加入含有3.85ml緩沖溶液(Britton-Robinson:100mM磷-、醋-和硼酸；用NaOH調節PH)的反應燒杯中，該反應燒杯還裝備有使溶液很好混和的小攪動棒，將氧電極插入反應燒杯。加入100微升純化的酶溶液，即，(a)來源于Mag"a;oW/zesa/v/""的月旨氧4b酶濃度大約為0.4mg/ml;或(b)來源于Gaewma""ow少cesgram//7^的脂氧化酶濃度大約為0.76mg/ml(其意味著在最終的反應中大約為0.02mg/ml)。這些脂氧化酶的制備如前面所述。溫度為25°C。測量溶解的氧的濃度(mg/1)并以時間(分鐘)作為函數繪圖。加入酶之后，計算曲線線性部分的斜率作為酶活性(mg/l/min)。當相關時用減法矯正基線，意思指在加入脂肪酸氧化酶(即對照物)之前，如果以時間作為函數顯示氧濃度的曲線具有大于大約0.05mg氧/ml/分鐘的斜率，則將該值從樣品的斜率值中減去。下面的表l列出了實驗結果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實施例2脂肪酸氧化酶如下面所描述來對四種酶進行檢測，即兩種漆酶和兩種脂氧化酶。來源于尸o(y;owsp/m/仏s的漆酶具有65kDaSDSMW65kDa、3.5、和在PH5.5下60。C的最佳溫度。來源于灰鬼傘屬(Coprinuscinereus)的漆酶具有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳MW67-68kDa、用IEF的pI3.5-3.8和在PH7.5下65。C的最佳溫度。酶的制備和純化如在WO96/00290和美國專利US6,008,029中所描述的方法進行。這兩種脂氧化酶來源于Magm^0W/7esa/v/m7和Gaewwa""ow;;cesgram/"^，它們的制備方法如前面所描述的。調節酶的劑量以確保在234nm/530nm每分鐘增加的吸光度最大，即每分鐘在0.1-0.25吸光度單位的范圍。底物溶液將11.65mg亞油酸(60%)和溶于乙醇的12.5ml0.56mM丁香醛連氮(Sigma)與去離子水相混和以達到25ml的總體積。將要測試的50微升酶制劑轉移至含有900微升磷酸鹽緩沖液(50mM,pH7.0)和50孩i升底物溶液的石英池中。所述石英池置于分光光度計(spectrofotometer)中，恒溫于23°C,在234nm和530nm測量作為時間的函數的吸光度。吸光度在530nm指示為丁香趁連氮的降解，而吸光度在234nm指示為亞油酸的降解。以時間為函數的吸光度增量可基子2-4分鐘的反應時間來計算，即d(A234)/dt，以及d(A53o)/dt。結果如下列表2中所示。四種酶中僅有兩種脂氧化酶符合如本文中所定義的脂肪酸氧化酶。這是因為僅有這兩種酶的RRD-反應速率差-(dA234/dt-dA530/dt)〉0。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*是指等同于0活性(分析誤差)實施例3含50。/。w/w回槽的LSF粗淀4分水解(RSH)以下列方式進行乙醇紅酵母(EthanolRedyeast)于500rpm和32.2。C下在0.02%DSNOVOZYM50006存在下有氧增殖8小時。通過混和粉碎的玉米(2-mm篩)、自來水和回槽來制備玉米淤漿，然后用磷酸調節PH至5。回槽的含量為液相的50%w/w,SP288,0.8AFAU/gDS、SPIRIZYMETMFUEL、2AGU/gDS。在填充配置有空氣塞的25ml發酵罐之前，將酵母繁殖立即導入淤漿中。空氣塞具有0.2屮m針筒式濾器以防止油的回流和微生物污染。發酵在32.2。C進行64小時。當發酵完成時，發酵罐在3，000rpm,2(TC離心15分鐘。迫使上層清液通過0.45卞m過濾器并通過HPLC分析。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>RSH中回槽濃度對64小時乙醇產率的影響。數據是在不同時間進行的7次發酵的平均。表1表明往發酵培養基中加入回槽降低了乙醇的產率。實施例4用^^加卯^/^^/^"http://脂氧化酶預處理發酵培養基和50°/。回槽的LSF重復如實施例3中所進行的實驗，其中使用發酵培養基，所述發酵培養基用脂氧化酶和發酵培養基中摻有脂肪酶的脂氧化酶預處理。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表2表明1)脂氧化酶和2)脂氧化酶和脂肪酶預處理發酵培養基增加了乙醇的產率。權利要求1.一種在發酵培養基中生產發酵產品的方法，所述方法含有發酵步驟，包括將發酵培養基暴露于至少一種脂肪酸氧化酶。2.權利要求1的方法，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶，優選來源于釀酒酵母、普通嗜熱放線菌、Fwsan'wm棉狀嗜熱絲孢菌、/>"/cw/an'aoo^e、地霉屬菌抹、禾頂囊殼或Magm^0W/2e3.權利要求1的方法，其中發酵微生物是酵母。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述發酵產品是乙醇。5.權利要求1-4中任一項的方法，其中發酵步驟是同時糖化和發酵方法(SSF)或液化、糖化和發酵方法(LSF)中的一部分。6.權利要求1-5中任一項的方法，其中發酵在一種或多種酶的存在下進行，所述酶選自酯酶、植酸酶、纖維素、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、a-淀粉酶或葡糖淀粉酶。7.權利要求1-6中任一項的方法，其中發酵是干法磨碎方法或濕法磨碎方法中的一部分。8.權利要求7的方法，其中用于磨碎方法的原料是含淀粉的原料，例如玉米、小麥、大麥或買羅高梁。9.一種生產乙醇的方法，包括(a)磨碎全粒；(b)液化步驟(a)的產品；(c)糖化液化的物質；(d)使用微生物發酵糖化的物質，其中發酵方法還包括使發酵培養基與至少一種脂肪酸氧化酶相接觸。10.權利要求9的方法，進一步還包括蒸餾發酵的物質。11.權利要求9或10的方法，其中所述方法是同時液化和糖化方法(SSF)或同時液化、糖化和發酵方法(LSF)。12.權利要求9-11中任一項的方法，其中所述方法包括加入一種或多種酶，所述酶選自酯酶例如脂肪酶或角質酶、植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、a-淀粉酶、葡糖淀粉酶或其混合物。13.權利要求9的方法，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。14.權利要求9的方法，其中所述微生物是酵母。15.—種組合物，其含有脂肪酸氧化酶和一種或多種酶，所述酶選自酯酶、植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、a-淀粉酶、葡糖淀粉酶或其混合物。16.權利要求15的組合物，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。17.權利要求15或16的組合物，進一步還含有脂肪酶。全文摘要本發明提供了一種改進的包括在生產乙醇方法中使用的發酵方法。所述改進的發酵方法包括在發酵方法中應用最少一種脂肪酸氧化酶(特別是脂氧化酶)。所述改進的發酵方法還包括加入各種附加的酶和發酵微生物生長刺激物，包括維生素和礦物質。文檔編號C12P7/10GK101146912SQ200480022900公開日2008年3月19日申請日期2004年6月9日優先權日2003年6月10日發明者瓦瓦拉·格里奇科申請人:諾維信北美公司