制備l－蘇氨酸的方法

專利名稱：制備l－蘇氨酸的方法
技術領域：
本發明提供了改進的使用腸桿菌科細菌發酵制備L-蘇氨酸的方法。
背景技術：
L-蘇氨酸用于人藥品、制藥工業、食品工業和特別是動物營養品中。
已知可以通過發酵腸桿菌科的菌株、特別是大腸桿菌來制備L-蘇氨酸。由于該氨基酸非常重要，不斷地進行了改進制備方法的工作。工藝的改進可以基于發酵方法，例如攪拌和供氧，或者營養培養基的組成，例如發酵過程中的糖濃度，或者通過例如離子交換色譜加工得到終產物，或者細菌本身固有的(即源于遺傳的)性能特征。
US-A-5,538,873和EP-B-0593792或Okamoto等(Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry 61(11)，1877-1882，1997)描述了如何通過分批方法或補料分批方法的發酵來制備蘇氨酸。另外，US 6,562,601描述了使用腸桿菌科的菌株制備L-蘇氨酸的方法，其中在進行補料分批方法發酵后，將發酵液排至1-90體積％，然后用生長培養基補足剩余的發酵液，并優選地在生長期之后，通過所述的補料分批方法進行另一次發酵步驟。該方法可以重復數次，因此稱作重復補料分批方法。
另一種使用腸桿菌科細菌、特別是大腸桿菌制備蘇氨酸的方法，記載在專利說明書US 6,562,601中。它包括，首先以補料分批方法培養細菌，使蘇氨酸在發酵液中富集。在特定的時間，收獲發酵罐中的一部分發酵液，即10-99％。剩余的發酵液部分保留在發酵罐中。用營養培養基補足保留在發酵罐中的發酵液，通過補料分批方法進行另一次發酵。任選地，數次進行所述的循環。
發明目的本發明的目的是，提供改進的發酵制備L-蘇氨酸的新方法。

發明內容
本發明提供了一種發酵方法，其特征在于，a)將細菌接種到至少第一種營養培養基中，并培養，然后b)取出一些發酵液，其中大于90體積％、特別是大于91體積％、大于92體積％、大于93體積％、大于94體積％、大于95體積％、大于96體積％、大于97體積％或大于98體積％的發酵液總體積保留在發酵容器中，且其中最多99體積％、99.3體積％、99.6體積％或99.9體積％的發酵液總體積保留在發酵容器中，然后c)用一種或多種其它營養培養基補足剩余的發酵液，其中一種或多種其它營養培養基含有至少一種碳源、至少一種氮源和至少一種磷源，并在能形成L-蘇氨酸的條件下繼續培養，d)步驟b)和c)任選地進行幾次，和e)將根據步驟c)和/或d)的培養過程中的碳源濃度調節至不超過30g/l。
發明詳述典型地，在發酵罐(生物反應器)中進行根據步驟a)的細菌培養。它們具有工業生產規模的體積約10-500m3(立方米)。在實驗室規模，當可以以簡單方式驗證根據本發明的方法時，1-50升的發酵罐體積是典型的。在中試規模上，經常使用50升至10m3的發酵罐體積。
術語“工廠性能”應當理解為，在工廠、例如發酵罐中，以特定的產量和特定的速率或生產力或空間-時間產量，制備出的產品的重量或數量。這些參數很大程度上決定了工藝的成本或獲利能力。
“發酵液”應當理解為，使用發酵罐，在營養培養基中培養微生物(在本發明的情況下，是能生產L-蘇氨酸-的細菌)形成的微生物懸浮液。
根據本發明，通過上述的第一個步驟a)中的分批方法或補料分批方法培養，可以提高生產L-蘇氨酸的發酵罐的工廠性能，其中，當使用補料分批方法時，使用至少一種附加的營養培養基。在上述的步驟b)中，取出培養發酵液，其中取出小于10體積％、特別是小于9體積％、小于8體積％、小于7體積％、小于6體積％、小于5體積％、小于4體積％、小于3體積％、小于2體積％的發酵液總體積，且其中取出最小1體積％、0.7體積％、0.4體積％或0.1體積％的發酵液總體積。因此，根據步驟b)，在根據本發明的方法中，大于90直至最大99.9體積％的發酵液保留在發酵罐中。
然后，在步驟c)中，用一種或多種其它營養培養基補足剩余的發酵液到原始體積的約100％，其中一種或多種其它營養培養基含有至少一種碳源、至少一種氮源和至少一種磷源，并繼續在能形成L-蘇氨酸的條件下進行培養。該步驟c)任選地重復幾次。收集形成的L-蘇氨酸，并任選地進行純化和分離。
在步驟a)的培養過程中，將細菌接種到至少第一種營養培養基中，并通過分批方法或補料分批方法進行培養。當使用補料分批方法時，在大于0至不超過10小時后，優選地1-10小時后，優選地2-10小時后，特別優選地3-7小時后，補加一種營養培養基。
第一種營養培養基包含作為碳源的一種或多種選自下述的化合物蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、乳糖、半乳糖、麥芽糖、木糖、纖維素水解物、阿拉伯糖、醋酸、乙醇和甲醇，其濃度為1-100g/kg或1-50g/kg，優選10-45g/kg，特別優選20-40g/kg。“淀粉水解物”應當理解為玉米、谷類、馬鈴薯或木薯的水解產物。
可以在第一種營養培養基中使用的氮源可以是有機的含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素或無機化合物，例如氨、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨、硝酸鉀和硝酸鉀鈉。可以單獨地或作為混合物使用氮源，其濃度為1-40g/kg，優選1-30g/kg或10-30g/kg，特別優選1-25g/kg或10-25g/kg，非常特別優選1-30g/kg或1-25g/kg。
可以在第一種營養培養基中使用的磷源可以是磷酸、磷酸的堿金屬或堿土金屬鹽、特別是磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應的含鈉鹽，磷酸聚合物或肌醇的六磷酸酯(也稱作植酸)，或其堿金屬或堿土金屬鹽，其濃度為0.1-5g/kg，優選0.3-3g/kg，特別優選0.5-1.5g/kg。第一種營養培養基必須另外含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長必需的。這些物質的濃度為0.003-3g/kg。最后，除了上述的物質外，還采用基本生長物質，例如氨基酸(例如高絲氨酸)和維生素(例如硫胺素)。還可以使用消泡劑來控制泡沫的生成，例如脂肪酸聚乙二醇酯。
在補料分批方法中使用的添加的營養培養基通常僅僅包含作為碳源的一種或多種選自下述的化合物蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、乳糖、半乳糖、麥芽糖、木糖、纖維素水解物、阿拉伯糖、醋酸、乙醇和甲醇，其濃度為300-700g/kg，優選400-650g/kg，和任選的無機氮源，例如氨、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨、硝酸鉀或硝酸鉀鈉。或者，也可以分別補加這些和其它組分。
已經發現，在根據步驟c)和/或d)的本發明的方法中，可以以單一的其它營養培養基的形式和在許多其它營養培養基中，將其它營養培養基成分補加到培養物中。根據本發明，在至少2-10、優選2-7或2-5條補料流中的至少一條(1)補料流或在許多補料流中，將其它營養培養基補加到培養物中。
其它一種或多種營養培養基含有作為碳源的一種或多種選自下述的化合物蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、麥芽糖、木糖、纖維素水解物、阿拉伯糖、醋酸、乙醇和甲醇，其濃度為20-700g/kg，優選50-650g/kg。
另外，另一種或另外幾種營養培養基包含由下述成分組成的氮源有機含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素或無機化合物，例如氨、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨和/或硝酸鉀或硝酸鉀鈉。可以單獨地或作為混合物使用氮源，其濃度為5-50g/kg，優選10-40g/kg。
另外，另一種或另外幾種營養培養基包含由下述成分組成的磷源磷酸或磷酸的堿金屬或堿土金屬鹽、特別是磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應的含鈉鹽，磷酸聚合物或肌醇的六磷酸酯(也稱作植酸)，或對應的堿金屬或堿土金屬鹽。可以單獨地或作為混合物使用磷源，其濃度為0.3-3g/kg，優選0.5-2g/kg。所述的另一種或另外幾種營養培養基必須另外包含金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長必需的，其濃度為0.003-3g/kg，優選其濃度為0.008-2g/kg。最后，除了上述的物質外，還采用基本生長物質，例如氨基酸(例如高絲氨酸)和維生素(例如硫胺素)。還可以使用消泡劑來控制泡沫的產生，例如脂肪酸聚乙二醇酯。
當使用單一的其它營養培養基時，典型地將其在一條補料流中補加到培養物中。當使用許多其它營養培養基時，在相應的數目的補料流中補加它們。當使用許多其它營養培養基時，應當注意，它們在每種情況下都可以僅僅包含一種所述的碳源、氮源或磷源，或者是所述的碳源、氮源或磷源的混合物。
根據本發明，調節補加的一種或幾種其它營養培養基，使磷/碳比(P/C比)不超過4；不超過3；不超過2；不超過1.5；不超過1；不超過0.7；不超過0.5；不超過0.48；不超過0.46；不超過0.44；不超過0.42；不超過0.40；不超過0.38；不超過0.36；不超過0.34；不超過0.32；或不超過0.30毫摩爾磷/每摩爾碳。
在小于180分鐘、優選地在小于120分鐘、特別優選地在小于60分鐘和非常特別優選地在小于30至小于15分鐘的時間內，完成步驟b)所述的發酵液的取出。
如果使用另一種或另外幾種營養培養基進行步驟c)所述的補足，可以以一批或幾批或連續給料的形式或使用2種方法的聯合，進行該補足。再次達到約100％原始體積的最終補足水平。在上下文中的表述“約100％”是指，在能達到最終的補足水平的技術可行方案的范圍內，可以有一些變動，例如，97％-103％、98％-102％、99-101％、99.5-100.5％或99.9-100.1％原始體積。
如果以一批或幾批的形式進行補足，根據本發明，這應當盡可能快地進行，即在小于180分鐘、優選地在小于120分鐘、特別優選地在小于60分鐘和特別優選地在小于30至小于15分鐘的時間內完成。如上所述補足至約100％原始體積后，進行培養，直到已經耗盡碳源，或直到即將徹底耗盡碳源之前的另一個合適的時間，直到即將在根據步驟b)再次取出發酵液之前。在該時間點，碳源的濃度是＞0至≤5g/l，＞0至≤3g/l，＞0至≤2g/l，＞0至≤1g/l，＞0至≤0.5g/l。
在連續補足過程中，用一種或多種其它營養物進行補足，直到再次達到約100％原始體積。然后，繼續培養發酵液，直到已經耗盡或幾乎(見上)耗盡碳源。
當聯合使用所述的兩種方法時，一種或多種其它的營養培養基以一批或幾批的形式盡可能快地添加，隨后將一種或多種其它的營養培養基連續導入用以連續培養。繼續培養發酵液，直到已經耗盡或幾乎(見上)耗盡碳源。
在能形成L-蘇氨酸的條件下，進行步驟a)和c)的培養。在培養過程中，將溫度調節至27-45℃，優選29-42℃，特別優選33-40℃。可以在大氣壓力下，或任選地在過壓下，優選地在0-2.5巴、特別優選在0-1.5巴的壓下，進行發酵。將氧分壓調節至5-50％、優選約20％大氣飽和度。用25％濃氨水將pH調節至約6-8，優選6.5-7.5。在培養過程中，培養條件可以保持恒定，或可以改變。同樣地，步驟a)和c)中的培養條件可以相同或不同。
根據d)，重復步驟b)和c)＞(大于)0-100次、優選地2-90或2-80次、特別優選地4-70、4-60、4-50或4-40次，和特別優選地5-30、6-30、7-30、8-30、9-30或10-30次。
取出至少0.1體積％至小于10體積％發酵液總體積、完成補足至約100％、隨后培養并再次取出發酵液之間的時間是最多10小時或最多5小時，優選地最多3小時，特別優選地最多2小時至最多1小時。
因此，可以以相當于小于100小時或小于50小時、優選地小于30、非常特別優選地小于20或小于10小時的平均停留時間的速度，取出發酵液、用營養培養基補足、隨后培養并再次取出發酵液。所述平均停留時間是顆粒停留在培養中的理論時間。通過反應器中的液體體積與流過量的比，描述平均停留時間(Biotechnologie；H.Weide，J.Páca和W.A.Knorre，Gustav Fischer Verlag Jena，1991)。將“流過量”定義為排出的發酵液體積或用于補足的其它一種或多種營養培養基的體積。可以直接地(例如，使用雷達測量)或間接地(例如，使用重量測量)進行全過程的測量。
根據本發明，在根據步驟c)和/或d)的培養過程中，一般將碳源濃度調節至最多30g/l，最多20g/l，最多10g/l，優選地最多5g/l，特別優選地最多2g/l。根據步驟b)和/或c)維持該濃度穩定至少75％、優選地至少85％、特別優選地至少95％的培養時間。使用現有技術所公開的方法，確定碳源濃度。例如在購自Yellow Springs Instruments(Yellow Springs，Ohio，USA)的YSI 02700 Select葡萄糖分析儀中，測定β-D-葡萄糖。
任選地，可以為被取出的培養液提供氧氣或含氧的氣體，任選地進行攪拌，直到碳源的濃度降至小于2g/l、小于1g/l或小于0.5g/l。
在根據本發明的方法中，產率是至少31％、至少33％、至少35％、至少37％、至少40％、至少42％、至少44％、至少46％或至少48％。在這里，將“產率”定義為在培養過程中形成的L-蘇氨酸的總量與采用的或消耗的碳源總量的比。
在根據本發明的方法中，生產L-蘇氨酸的時空產率是至少1.5-2.5g/l/h、至少2.5-3.5g/l/h、至少2.5-大于3.5g/l/h、至少3.5-5.0g/l/h、至少3.5-大于5.0g/l/h或至少5.0-8.0g/l/h或更多。在這里將“時空產率”定義為，經過培養的總時間，在培養過程中形成的蘇氨酸的總量與培養體積的比。時空產率也稱作體積生產力。
自然地，在類似于根據本發明的發酵方法中，以特定的產率和特定的時空產率(體積生產力)制備產物。在根據本發明的方法中，可以以至少31％的產率和至少1.5-2.0g/l/h的時空產率制備L-蘇氨酸。由上面的陳述，易于得到產率和時空產率的其它關聯，例如，至少37％的產率和至少2.5g/l/h的時空產率。
從被取出的培養液中，可以分離、收集或濃縮L-蘇氨酸，并任選地進行純化。
通過完全地(100％)或幾乎完全地(即超過或大于(＞)90％、95％、97％、99％)取出培養液中含有的細菌生物質，并在產品中較多地留下發酵液中的其它組分，即將30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％或90％-100％，優選大于或等于(≥)50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或≥95％甚至所有的(100％)組分留在產品中，也可以將被取出的培養液(＝發酵液)制成產品。
分離方法例如離心、過濾、傾析、絮凝或其組合可用于取出或分離出生物質。
然后，通過已知的方法，例如，通過旋轉蒸發器、薄膜蒸發器、降膜蒸發器、反滲透、納米過濾或其組合，稠化或濃縮得到的肉湯。
然后，通過冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧粒化的方法或通過其它方法，處理該濃縮的肉湯，生成較佳地自由流動的、細碎的粉末。然后，通過合適的壓縮或成粒方法，又可以將該自由流動的、細碎的粉末轉化成粗糙的、容易自由流動的、可儲存的且很大程度上無塵的產品。通過該方式，去除的水總量達到大于90％，所以產品中的水含量小于10％，小于5％。
不一定以在此所述的次序進行所述的工藝步驟，但是可以任選地以工業上適當的方式進行組合。
更具體地，根據本發明的方法的特征在于，與常規補料分批方法相比提高的時空產率。
通過陰離子交換色譜和隨后的茚三酮推導，如Spackman等(Analytical Chemistry，301190-1206(1958))或通過反相HPLC，如Lindroth等(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))所述，可以分析L-蘇氨酸和其它氨基酸，為了實現本發明的方法，優選選自埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、普羅威登菌屬和沙雷菌屬的能生產L-蘇氨酸的腸桿菌科細菌。埃希氏菌屬和沙雷菌屬是優選的。在埃希氏菌屬中，特別提及大腸桿菌，且在沙雷菌屬中，特別提及粘質沙雷菌。
該細菌含有至少一個拷貝的thrA基因或等位基因，它編碼蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I。在這方面，在文獻中提到了“反饋”抗性的或甚至脫敏的變體。這種類型的細菌典型地對蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性(Shiio和Nakamori，Agricultural and Biological Chemistry 33(8)，1152-1160(1969))。對“反饋”抗性的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I變體的生化研究，記載在例如，Cohen等(Biochemical和Biophysical Research Communications 19(4)，546-550(1965))和Omori等(Journal of Bacteriology 175(3)，785-794(1993))中。任選地，蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I是過表達的。
現有技術已經充分描述了過表達的方法，例如Makrides等(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))。通過使用載體，使拷貝數增加了至少一(1)個拷貝。可以使用質粒作為載體，例如記載在例如US 5,538,873中。噬菌體也可以用作載體，例如噬菌體Mu，如EP 0 332 448所述，或噬菌體lambda(λ)。通過將另一個拷貝整合進染色體的另一個位點-例如噬菌體λ的att位點，也可以實現拷貝數的增加(Yu和Court，Gene 223，77-81(1998))。US5,939,307公開了，通過在染色體蘇氨酸操縱子的上游整合表達盒或啟動子，例如tac啟動子、trp啟動子、lpp啟動子或噬菌體λ的PL啟動子和PR-啟動子，可以實現表達的增強。可以以相同的方式使用噬菌體T7的啟動子、齒輪箱啟動子(gear-box promoters)或nar啟動子。如EP 0 593 792所述，也可以使用這種表達盒或啟動子以過表達質粒-結合的基因。同樣通過使用lacIQ等位基因，可以控制質粒-結合的基因的表達(Glascock和Weickert，Gene 223，221-231(1998))。通過去除蘇氨酸操縱子的弱化子(Park等，BiotechnologyLetters 24，1815-1819(2002))或通過使用thr79-20突變(Gardner，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 76(4)，1706-1710(1979))或通過thrS基因的突變，它編碼蘇氨酰基-t-RNA合成酶，如Johnson等(Journal of Bacteriology 129(1)，66-70(1977)所述，可以類似地實現過表達。通過所述的方法，特定天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I蛋白變體的胞內濃度比原始菌株增加了至少10％。
合適的thrA-等位基因記載在US 4,278,765中，且可以以菌株MG442的形式，從俄國工業微生物國家中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM，Moscow，Russia)得到，登記號CMIM B-1628。其它合適的thrA等位基因記載在WO00/09660和WO 00/09661中，且可以在登記號KCCM 10132和KCCM10133下從韓國微生物培養中心(Korean Culture Centre forMicroorganisms)(KCCM，Seoul，Korea)得到。另一種合適的thrA等位基因存在于菌株H-4581中，它記載在US 4,996,147中，且可以在登記號Ferm BP-1411下從國家高等工業科技研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)得到。最后，其它thrA等位基因記載在US 3,580,810中，且可以以保藏在ATCC的菌株ATCC21277和ATCC 21278的形式得到。另一種等位基因記載在US3,622,453，且可以在登記號ATCC 21272下以菌株KY8284的形式從ATCC得到。另外，WO 02/064808描述了另一種thrA等位基因，它以菌株pGmTN-PPCl2的形式保藏在KCCM，登記號KCCM 10236。
任選地，使用充分已知的常規地使用誘變物質誘變細胞的方法，例如N-甲基-N＇-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)或甲磺酸乙酯(EMS)或誘變射線，例如紫外線，并隨后選擇蘇氨酸類似物(例如AHV)抗性的變體，可以分離出能編碼“反饋”抗性的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I變體的thrA等位基因。這些類型的誘變方法記載在，例如，Shiio和Nakamori(Agricultural and Biological Chemistry 33(8)，1152-1160(1969))或Saint-Girons和Margerita(Molecular andGeneral Genetics 162，101-107(1978))或已知的手冊J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，USA，1992)、特別是第135-156頁中。Shiio和Nakamori，例如，在室溫(即通常約16-26℃)用0.5mg/ml MNNG(在0.1M磷酸鈉緩沖液中，pH7)處理了大腸桿菌細胞懸液約15分鐘，以產生突變。Miller推薦，例如，對于每2ml細胞懸液(在0.1M Tris緩沖液中，pH7.5)，在37℃的溫度用30ul EMS處理5-60分鐘。可以以明顯的方式，修改這些誘變條件。在典型地含有2-10mM AHV的最小瓊脂上選擇AHV-抗性的突變體。然后可以克隆對應的等位基因，并進行測序，并可以檢測由這些等位基因編碼的蛋白變體的活性。任選地，也可以直接地使用生產的突變體。詞語“直接地”是指，生產的突變體可以在根據本發明的方法中用于制備L-蘇氨酸，或者可以對這些突變體進行其它修飾，以提高產出性質，例如，蘇氨酸降解的弱化或蘇氨酸操縱子的過表達。
以相同的方式，也可以使用體外誘變的方法，例如記載在，例如，已知Sambrook等的手冊(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA，1989)。也可以在商業上以所謂的“試劑盒”的形式得到相應的方法，例如，Papworth等(Strategies 9(3)，3-4(1996))所述的由Stratagene(La Jolla，USA)提供的″QuikChange定位誘變試劑盒″。這些誘變方法當然也可以用于其它基因、等位基因或菌株或目標和任務，例如，對L-蘇氨酸抗性的突變體的生產和分離。
能編碼天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I變體的那些thrA等位基因是優選的，與沒有L-蘇氨酸的情況下的活性相比，所述的變體在有10mM L-蘇氨酸存在的情況下，具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的高絲氨酸脫氫酶活性，和/或在有1mM L-蘇氨酸存在的情況下，其具有至少70％、至少75％或至少80％的高絲氨酸脫氫酶活性。任選地，在有10mM L-蘇氨酸存在的情況下，天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I變體的天冬氨酸激酶活性是沒有L-蘇氨酸的情況下的活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。
另外，含有選自下述元件的腸桿菌科細菌也是合適的選自rpoS基因中的opal、ochre和amber，優選amber的終止密碼子，和選自opal抑制基因，ochre抑制基因和amber抑制基因，優選amber抑制基因的t-RNA抑制基因。amber突變優選地位于根據RpoS基因產物的氨基酸序列的位點33處。優選地，使用supE作為amber抑制基因。這些細菌記載在PCT/EP02/02055中。在登記號DSM 15189下，可以從Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen[德國微生物和細胞培養物中心](Braunschweig，Germany)得到在rpoS基因和抑制基因supE中含有所述突變的菌株。
在現有技術中可以發現rpoS基因的核苷酸序列。與登記號AE000358相對應的rpoS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。相關的RpoS基因產物或蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在SEQID NO.3中，再現了rpoS等位基因的核苷酸序列，其在與RpoS基因產物或蛋白的氨基酸序列的位點33相對應的核苷酸序列位點處含有amber類型的終止密碼子，二者分別對應著SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。現有技術記載了抑制基因supE，且如SEQ ID NO.4所示。
另外，不能在好氧培養條件下分解蘇氨酸或使用它作為氮源的腸桿菌科細菌也是合適的。“好氧培養條件”應當理解為這樣的條件，其使發酵培養物中的氧分壓在90％、優選95％、非常特別優選99％的發酵時間中大于(＞)0％。這種菌株是，例如，Okamoto(Bioscience，Biotechnology and Biochemistry 61(11)，1877-1882(1997))所述的菌株KY10935。不能分解蘇氨酸、但是能清除氮的菌株通常具有弱化的蘇氨酸脫氫酶(EC 1.1.1.103)，其由tdh基因編碼。該酶已經記載在Aronson等(The Journal of Biological Chemistry 264(9)，5226-5232(1989))。弱化的tdh基因記載在，例如，Ravnikar和Somerville(Journal of Bacteriology，1986，168(1)，434-436)，US 5,705,371，WO 02/26993和Komatsubara(Bioprocess Technology19，467-484(1994))等中。
合適的tdh等位基因記載在US 5,538,873中，且可以在登記號1876下，以菌株B-3996的形式從俄國工業微生物國家中心(VKPM，Moscow，Russia)得到。另一種tdh等位基因記載在US 5,939,307中，且可以在登記號NRRL B-21593下，以菌株kat-13的形式從農業研究服務專利培養物中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection)(Peoria，Illinois，USA)得到。最后，tdh等位基因記載在WO 02/26993中，且以菌株TH21.97的形式保藏在NRRL，登記號為NRRL B-30318。在登記號CGSC 6945下，可以從大腸桿菌品種中心(E.coli Genetic Stock Centre)(New Haven，Conn.，USA)得到能編碼缺陷型蘇氨酸脫氫酶的等位基因tdh-1 ∷ cat1212。
另外，至少部分地需要異亮氨酸的腸桿菌科細菌(″滲漏表型″)也是合適的，通過加入濃度為至少10、20或50mg/l的L-異亮氨酸或濃度為至少50、100或500mg/l的L-蘇氨酸，可以滿足該需要。
“需要或營養缺陷型”通常應當理解為指這樣的事實，作為野生型功能的突變結果，菌株已經徹底喪失了例如酶活性，且生長需要添加補充物，例如氨基酸。“部分需要或部分營養缺陷型”是指，作為野生型功能的突變結果，例如氨基酸的生物合成途徑中的酶的活性受到削弱或弱化，但是沒有徹底消除。在沒有補充物的情況下，具有部分需要的菌株典型地具有比野生型降低的，即大于(＞)0％且小于(＜)90％、50％、25％或10％的生長速度。在文獻中，該關系也稱作“滲漏”表型或“泄漏”(Griffiths等An Introduction to Genetic Analysis，第6版，1996，Freeman and Company，New York，USA)。
具有這種類型的異亮氨酸部分需要的菌株記載在，例如，WO01/14525中，且以菌株DSM9906的形式保藏在KCCM，登記號KCCM10168。需要異亮氨酸的能分泌或生產蘇氨酸的菌株通常具有弱化的蘇氨酸脫氨酶(E.C.Number 4.3.1.19)，其由ilvA基因編碼。蘇氨酸脫氨酶也稱作蘇氨酸脫水酶。能實現部分異亮氨酸營養缺陷型的弱化的ilvA基因記載在，例如，US 4,278,765中，且可以以菌株MG442的形式得到，在登記號B-1682下保藏在VKPM。
另一種弱化的ilvA基因記載在，例如，WO 00/09660，且可以以菌株DSM 9807的形式得到，在登記號KCCM-10132下保藏在KCCM。Komatsubara(Bioprocess Technology 19，467-484(1994))描述了其它弱化的ilvA基因。
合適的和新的蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列包含，例如，SEQ ID NO.6的序列，其中除谷氨酸之外的任意氨基酸可以位于位點286處。優選地用賴氨酸(E286K)替換谷氨酸。
術語“氨基酸”更具體地指選自下述的蛋白原的L-氨基酸，包括它們的鹽L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
SEQ ID NO.8顯示了蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列，其含有在位點286處的氨基酸賴氨酸；相關的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO.7中。它含有在位點856處的核堿基腺嘌呤。
另一種合適的蘇氨酸脫氨酶是Lee等(Journal of Bacteriology185(18)，5442-5451(2003))所述的變體，其中苯丙氨酸(S97F)替換了在位點97處的絲氨酸。其它合適的蘇氨酸脫氨酶是Fischer和Eisenstein(Journal of Bacteriology 175(20)，6605-6613(1993))所述的變體，其具有至少一種選自下述的氨基酸替換在位點46處的天冬酰胺替換為天冬氨酸(N46D)，在位點66處的丙氨酸替換為纈氨酸(A66V)，在位點156處的脯氨酸替換為絲氨酸(P156S)，在位點248處的甘氨酸替換為半胱氨酸(G248C)和在位點266處的天冬氨酸替換為酪氨酸(D266Y)。
通過至少一個堿基對或核苷酸的插入或缺失誘變，或通過編碼區的至少一個密碼子的插入或缺失，或通過轉換或顛換誘變將終止密碼子整合進ilvA基因的編碼區，可以分離出等位基因，其中ilvA基因的表達通常被完全消除。該方法也可以應用于能編碼蘇氨酸脫氫酶的其它基因、等位基因或開放讀碼框，例如，tdh基因。
另外，在生長中對L-蘇氨酸和/或L-高絲氨酸的抑制有抗性的腸桿菌科細菌也是合適的。蘇氨酸-抗性的菌株和其制備記載在，例如，Astaurova等(Prikladnaya Biokhimia Microbiologiya(1985)，21(5)，485，其英文翻譯作Applied Biochemistry and Microbiology(1986)，21，485-490))。Austaurova描述的突變體對40mg/ml L-蘇氨酸是抗性的。另外，例如，菌株472T23，其可以在有5mg/ml L-蘇氨酸存在的情況下生長，且同時是L-高絲氨酸抗性的，記載在US5,175,107中。菌株472T232可以在登記號BKIIM B-2307下從VKPM得到，和在登記號ATCC 9801下從ATCC得到。另外，WO 00/09660描述菌株DSM 9807可以在含有7％L-蘇氨酸的固體營養培養基上生長。菌株DSM 9807可以在登記號KCCM-10132下從KCCM得到。最后，WO01/14525描述菌株DSM 9906可以在含有60％-70％的L-蘇氨酸發酵目液的培養基中生長。菌株DSM 9906可以在登記號KCCM-10168下從KCCM得到。
已知(見EP 0994 190 A2和Livshits等(Research inMicrobiology 154，123-135(2003))，對L-蘇氨酸和L-高絲氨酸的抗性，是由rh tA基因的增強引起的。通過增加該基因的拷貝數，或通過使用rhtA23突變，可以實現該增強。
EP 0 994 190 A2公開了，rhtB基因的增強會實現對L-高絲氨酸和L-蘇氨酸、特別是對L-高絲氨酸的抗性，并提高蘇氨酸生產。通過在稱作N99的菌株中過表達RhtB基因產物，可以使最低抑制濃度從250ug/ml增加到30,000ug/ml。
EP 1,013,765 A1公開了，rhtC基因的增強會造成對L-蘇氨酸的抗性，并提高蘇氨酸生產。將能在有濃度為至少30mg/ml的L-蘇氨酸存在的最小瓊脂上生長的菌株稱作L-蘇氨酸抗性的。它還公開了，rhtB基因的增強會實現對L-高絲氨酸的抗性，并提高蘇氨酸生產。將能在有濃度為至少5mg/ml的L-高絲氨酸存在的最小瓊脂上生長的菌株稱作L-高絲氨酸抗性的。所述的專利申請公開了對10mg/ml L-高絲氨酸抗性的且對50mg/ml L-蘇氨酸抗性的菌株。US 4,996,147公開了菌株H-4581，它是15g/l高絲氨酸抗性的。菌株H-4581可以在登記號FERM BP-1411下從國家高等工業科技研究所得到。
EP 1 016 710 A2公開了，開放讀碼框或基因yfiK或yeaS的增強會實現對L-蘇氨酸和L-高絲氨酸的抗性。通過在在稱作TG1的菌株中過表達YfiK基因產物，可以使關于L-高絲氨酸的最低抑制濃度從500ug/ml增加到1,000ug/ml，使關于L-蘇氨酸的最低抑制濃度從30,000ug/ml增加到40,000ug/ml。通過YeaS基因產物的過表達，可以使關于L-高絲氨酸的最低抑制濃度從500ug/ml增加到1,000ug/ml，使關于L-蘇氨酸的最低抑制濃度從30,000ug/ml增加到50,000ug/ml。另外在所述的專利申請中證實了，通過YfiK基因產物的過表達提高了蘇氨酸生產。
根據這些技術說明，制備了可以在有≥(至少)≥5g/l、≥10g/l、≥20g/l、≥30g/l、≥40g/l、≥50g/l、≥60g/l和≥70g/l L-蘇氨酸存在下生長的(即L-蘇氨酸抗性的)、且適用于在根據本發明的方法中制備L-蘇氨酸的菌株。
具有至少下述特征的菌株特別適用于根據發明的方法a)蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I，其任選地以過表達形式存在，和b)選自下述的終止密碼子在rpoS基因中的opal、ochre和amber，優選amber，和選自下述的t-RNA抑制基因opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，優選amber抑制基因。
另外，具有至少下述特征的菌株也特別適用于根據發明的方法a)蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I，其任選地以過表達形式存在，b)在好氧培養條件下，不能分解蘇氨酸，優選歸因于蘇氨酸脫氫酶的弱化，c)至少部分需要異亮氨酸，和d)在有至少5g/l蘇氨酸存在下生長。
具有至少下述特征的菌株非常特別適用于根據發明的方法a)蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I，其任選地以過表達形式存在，b)選自下述的終止密碼子在rpoS基因中的opal、ochre和amber，優選amber，和選自下述的t-RNA抑制基因opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，c)在好氧培養條件下，不能分解蘇氨酸，優選歸因于蘇氨酸脫氫酶的弱化，d)至少部分需要異亮氨酸，和e)在有至少5g/l蘇氨酸存在下生長。
另外，在根據本發明的方法中采用的細菌可以另外具有一種或多種下述的特征；●由pckA基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEP羧激酶)的弱化，如例如WO 02/29080中所述，●由pgi基因編碼的磷酸葡萄糖異構酶的弱化(Froman等Molecular and General Genetics 217(1)126-31(1989))，●由開放讀碼框ytfP編碼的YtfP基因產物的弱化，如例如WO02/29080所述，●由開放讀碼框yjfA編碼的YjfA基因產物的弱化，如例如WO02/29080所述，●由poxB基因編碼的丙酮酸氧化酶的弱化，如例如WO 02/36797所述，●由開放讀碼框yjgF編碼的YjgF基因產物的弱化，如例如PCT/EP03/14271所述。Wasinger VC.和Humphery-Smith I.(FEMS Microbiology Letters 169(2)375-382(1998))，VolzK.(Protein Science 8(11)2428-2437(1999))和Parsons等(Biochemistry 42(1)80-89(2003))已經描述了大腸桿菌的yjgF Orf。相關的核苷酸或氨基酸序列可以在登記號AE000495下從公開的數據庫中得到。為了更清楚，它們如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
●由基因pntA和pntB編碼的轉氫酶的增強，如例如EP 0 733 712A1所述，●由pps基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強，如例如EP 0877 090 A1所述，●由ppc基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增強，如例如EP 0723 011 A1所述，和●由rseB基因編碼的調節劑RseB的增強，如例如EP 1382685所述。Missiakas等(Molecular Microbiology 24(2)，355-371(1997))，De Las Penas等(Molecular Microbiology 24(2)373-385(1997))和Collinet等(Journal of BiologicalChemistry 275(43)33898-33904(2000))已經描述了調節劑RseB。相關的核苷酸或氨基酸序列可以在登記號AE000343下從公開的數據庫得到。
●由galP基因編碼的半乳糖質子協同轉運子(＝半乳糖通透酶)的增強，如例如DE 10314618.0所述。Macpherson等(TheJournal of Biological Chemistry 258(7)4390-4396(1983))和Venter等(The Biochemical Journal 363(Pt 2)243-252(2002))已經描述了galP基因和它的功能。相關的核苷酸或氨基酸序列可以在登記號AE000377下從公開的數據庫得到。
●能使用蔗糖作為碳源的能力。關于蔗糖利用的遺傳決定子記載在現有技術中，例如FR-A-2559781，Debabov(InProceedingsof the IV International Symposium on Genetics ofIndustrial Microorganisms 1982.Kodansha Ltd，Tokyo，Japan，p 254-258)，Smith和Parsell(Journal of GeneralMicrobiology 87，129-140(1975))和Livshits等(InConference on Metabolic Bacterial質粒。TartuskUniversity Press，Tallin，Estonia(1982)，p 132-134和144-146)和US 5,705,371。通過接合將Smith和Parsell描述的關于菌株H155利用蔗糖的遺傳決定子轉入對萘啶酸抗性的大腸桿菌K-12突變體中，并在2004年3月16日將對應的轉化接合子保藏在Deutsche Sammlung für Mikroorganismenund Zellkulturen[德國微生物和細胞培養物中心](Braunschweig，Germany)，保藏號為DSM 16293。關于蔗糖利用的遺傳決定子也包含在菌株472T23中，它記載在US5,631,157中，且可以在登記號ATCC 9801下從ATCC得到。Bockmann等(Molecular and General Genetics 235，22-32(1992))描述了關于蔗糖利用的另-種遺傳決定子，且以名稱csc系統公開。
●由開放讀碼框yedA編碼的YedA基因產物的增強，如例如WO03/044191所述，●在有至少0.1-0.5mM或至少0.5-1mM疏螺旋體素存在下生長(疏螺旋體素抗性)，如US 5,939,307所述。疏螺旋體素-抗性的菌株ka t-13可以在登記號NRRL B-21593下從NRRL得到。
●在有至少2-2.5g/l或至少2.5-3g/l二氨基琥珀酸存在下生長(二氨基琥珀酸抗性)，如WO 00/09661所述。二氨基琥珀酸-抗性的菌株DSM 9806可以在登記號KCCM-10133下從KCCM得到。
●在有至少30-40mM或至少40-50mMα-甲基絲氨酸存在下生長(α-甲基絲氨酸抗性)，如WO 00/09661所述。α-甲基絲氨酸-抗性的菌株DSM 9806可以在登記號KCCM-10133下從KCCM得到。
●在有不超過30mM或不超過40mM或不超過50mM氟代丙酮酸存在下生長(氟代丙酮酸敏感性)，如WO 00/09661所述。氟代丙酮酸-敏感的菌株DSM 9806可以在登記號KCCM-10133下從KCCM得到。
●在有至少210mM或至少240mM或至少270mM或至少300mML-谷氨酸存在下生長(谷氨酸抗性)，如WO 00/09660所述。谷氨酸-抗性的菌株DSM 9807可以在登記號KCCM-10132下從KCCM得到。
●至少部分需要甲硫氨酸。至少部分需要甲硫氨酸的菌株是，例如，菌株H-4257，它記載在US 5,017,483中，且可以在登記號FERM BP-984下從國家高等工業科技研究所得到。通過添加至少25、50或100mg/l L-甲硫氨酸，可以滿足該需要。
●至少部分需要間二氨基庚二酸。至少部分需要間二氨基庚二酸的菌株是，例如，菌株H-4257，它記載在US 5,017,483中，且可以在登記號FERM BP-984下從國家高等工業科技研究所得到。通過添加至少25、50或100mg/l間二氨基庚二酸，可以滿足該需要。
●在至少100mg/l利福平存在下生長(利福平抗性)，如US4,996,147所述。利福平-抗性的菌株H-4581可以在登記號FERM BP-1411下從國家高等工業科技研究所得到。
●在至少15g/l L-賴氨酸存在下生長(賴氨酸抗性)，如US4,996,147所述。L-賴氨酸-抗性的菌株H-4581可以在登記號FERM BP-1411下從國家高等工業科技研究所得到。
●在至少15g/l甲硫氨酸存在下生長(甲硫氨酸抗性)，如所述US 4,996,147。甲硫氨酸-抗性的菌株H-4581可以在登記號FERM BP-1411下從國家高等工業科技研究所得到。
●在至少15g/l L-天冬氨酸存在下生長(天冬氨酸抗性)，如US4,996,147所述。L-天冬氨酸-抗性的菌株H-4581可以在登記號FERM BP-1411下從國家高等工業科技研究所得到。
●由pyc基因編碼的丙酮酸羧化酶的增強。合適的pyc基因或等位基因是，例如，來自谷氨酸棒桿菌(WO 99/18228、WO 00/39305和WO 02/31158)、埃特里根瘤菌(US 6,455,284)或枯草桿菌(EP 1092776)的那些。任選地，也可以使用來自內源地含有丙酮酸羧化酶的其它微生物的Pyc基因，例如，Methanobacterium thermoautotrophicum或熒光假單胞菌。
如果使用含有蔗糖的營養培養基，給菌株裝配了關于蔗糖利用的遺傳決定子。
在這方面，術語“增強”描述了微生物中的一種或多種由相應DNA編碼的酶或蛋白的胞內活性或濃度的提高，例如通過使用強啟動子或能編碼對應的具有高活性的酶或蛋白的基因或等位基因，并任選地組合這些方法，使開放讀碼框、基因或等位基因或多種開放讀碼框、基因或等位基因的拷貝數增加至少一個(1)拷貝。
當使用增強方法和使用弱化方法時，通常優選地使用內源基因、等位基因或開放讀碼框。″內源基因″或″內源核苷酸序列″應當理解為，存在于種屬群體中的基因或開放讀碼框或等位基因或核苷酸序列。
如果使用質粒來提高拷貝數，任選地，通過一種或多種選自下述的遺傳基因座來穩定它們Rasmussen等(Molecular and GeneralGenetics 209(1)，122-128(1987))、Gerdes等(MolecularMicrobiology 4(11)，1807-1818(1990))和Thistedt和Gerdes(Journal of Molecular Biology 223(1)，41-54(1992))所述的質粒R1的pa rB基因座，Loh等(Gene 66(2)，259-268(1988))所述的F質粒的flm基因座，Miller等(Gene 24(2-3)，309-315(1983)所述的質粒pSC101的par基因座，Leung等(DNA 4(5)，351-355(1985)所述的質粒ColE1的cer基因座，Sobecky等(Journal ofBacteriology 178(7)，2086-2093(1996))和Roberts和Helinsky(Journal of Bacteriology 174(24)，8119-8132(1992))所述的質粒RK2的par基因座，Eberl等(Molecular Microbiology 12(1)，131-141(1994))所述的質粒RP4的par基因座，和Gerdes和Molin(Journal of Molecular Biology 190(3)，269-279(1986))、Dam和Gerdes(Journal of Molecular Biology 236(5)，1289-1298(1994))和Jensen等(Proceedings of the National Academy ofSciences USA 95(15)，8550-8555(1998)所述的質粒R1的parA基因座。
通過增強方法、特別是過表達，通常會使對應的蛋白或酶的活性或濃度提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％、至多高達1,000％或2,000％，基于野生型蛋白的活性或濃度，或起始微生物中的蛋白的活性或濃度。
為了實現增強，例如，可以提高基因的表達或酶或蛋白的催化或功能性質。可以任選地組合這2種方法。
因而，例如，可以使對應基因的拷貝數增加至少一個(1)，或者可以誘變位于結構基因上游的啟動子和調節區或核糖體結合位點。整合在結構基因上游的表達盒可以以相同的方式發揮作用。通過可誘導的啟動子，還可以增強在發酵生產L-蘇氨酸的過程中的表達。通過延長m-RNA的壽命的方法，可以類似地提高表達。另外，通過預防酶蛋白的降解，也能提高酶活性。基因或基因構建體可以以不同的拷貝數存在于質粒中，或者可以整合進染色體中并擴增。或者，通過改變培養基的組成和培養方法，也可以實現相關基因的過表達。
術語“弱化”在這方面描述了微生物中的一種或多種由對應DNA編碼的酶或蛋白的胞內活性或濃度的減少或消除，例如通過使用弱啟動子，或能編碼對應的具有低活性的酶或蛋白、或能使對應的酶或蛋白或基因失活的基因或等位基因，并任選地組合這些方法。
通過弱化方法，通常會使對應的蛋白或酶的活性或濃度減少到野生型蛋白的活性或濃度或起始微生物中的蛋白的活性或濃度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％或0-1％或0-0.1％。
為了實現弱化，例如，可以減少或消除基因或開放讀碼框的表達或酶或蛋白的催化或功能性質。可以任選地組合這2種方法。
通過合適的培養，通過基因表達的信號結構的遺傳修飾(突變)，或通過反義-RNA技術，可以減少基因表達。基因表達的信號結構是，例如，阻遏物基因、活化劑基因、操縱子、啟動子、弱化子、核糖體結合位點、起始密碼子和終止子。專家可以發現這方面的信息，尤其是，例如，在Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering58191-195(1998))中，在Carrier and Keasling(BiotechnologyProgress 1558-64(1999))中，在Franch和Gerdes(Current Opinionin Microbiology 3159-164(2000))中，和在已知的遺傳學和分子生物學教材中，例如，Knippers(″Molekulare Genetik[MolecularGenetics]″，第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或Winnacker(″Gene und Klone[Genes and Clones]″，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)的教材。
會導致酶蛋白的催化性質變化(例如減小)的突變是現有技術已知的。可以提及的實例是Qiu和Goodman(Journal of BiologicalChemistry 2728611-8617(1997))、Yano等(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America955511-5515(1998))、Wente和Schachmann(Journal ofBiologicalChemistry 26620833-20839(1991))的著作。在已知的遺傳學和分子生物學教材中，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik[GeneralGenetics]″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)，可以發現總結和綜述。
可行的突變是至少一個(1)堿基對或核苷酸的轉換、顛換、插入和缺失。根據突變造成的氨基酸交換對酶活性的影響，指“錯義突變”或“無義突變”。錯義突變會導致蛋白中的特定氨基酸替換為另一種，這意味著，尤其是，非保守的氨基酸交換。通過這種方法，可以削弱蛋白的功能能力或活性，并減少至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％、0-5％、0-1％或0-0.1％的值。無義突變會在基因的編碼區產生終止密碼子，并因此在翻譯中產生過早的中斷。至少一個堿基對在基因中的插入或缺失會導致移碼突變，這會導致整合進不正確的氨基酸或過早中斷翻譯。如果突變造成在編碼區形成終止密碼子，這也會導致翻譯的過早終止。至少一個(1)或多個密碼子的缺失，典型地也會導致酶活性或功能的完全喪失。
適用于根據本發明的方法的菌株是，尤其是，US 5,175,107所述的菌株BKIIM B-3996，WO 00/09660所述的菌株KCCM-10132，和WO98/04715所述的菌株kat-13的需要異亮氨酸的突變體。任選地，可以用所述方法使菌株適應根據本發明的方法，特別是通過將終止密碼子整合進rpoS基因中，例如位于與RpoS蛋白的氨基酸序列的位點33相對應的位點處的amber密碼子，并同時整合對應的t-RNA抑制基因，例如supE。
通過確定能分泌L-蘇氨酸的(L-threonine-eliminating)大腸桿菌菌株中的rpoS基因的核苷酸序列，也可以鑒別出適用于根據本發明的方法的菌株。為此目的，克隆了rpoS基因，或用聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增，并確定核苷酸序列。如果rpoS基因含有終止密碼子，在第2個步驟中檢查它是否也含有對應的t-RNA抑制基因。任選地，為以該方式鑒定出的菌株提供上述的性質，例如，thrA等位基因的過表達，在好氧培養條件下發生的蘇氨酸分解的弱化，會實現至少部分需要異亮氨酸或在有至少5g/l蘇氨酸存在下生長的導入ilvA基因的突變，或提供一種或多種上述的其它性質。
通過轉化、轉導或接合，可以將所述性質或特征轉移進理想菌株中。
在轉化方法中，將分離的遺傳物質(典型地DNA)導入目標菌株中。在腸桿菌科細菌(例如大腸桿菌)的情況下，將用于該目的的DNA整合進質粒-DNA或噬菌體-DNA中，然后將其轉移進目標菌株中。對應的方法和操作規程是現有技術充分已知的，且詳細記載在，例如J.Sambrook的手冊(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)中。
使用有條件的復制質粒，借助于基因或等位基因交換的方法，可以將確定的突變轉移進合適的菌株中。在確定的突變的情況下，已知了至少染色體中的位點，優選核堿基中的變化的準確位點和變化的性質(取代，即轉換或顛換，插入或缺失)。任選地，使用普通方法，開始時對對應的DNA進行測序。實現基因或等位基因交換的普通方法是Hamilton等(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))所述的那些，其中使用了pSC101衍生pMAK705，它能熱敏感地復制。使用該方法，可以將等位基因從質粒轉移進染色體中。以相同的方式，可以將染色體等位基因轉移到質粒中。可以類似地使用現有技術中公開的其它方法，例如，Martinez-Morales等(Journal of Bacteriology1817143-7148(1999))的方法，Boyd等(Journal of Bacteriology182842-847(2000))的方法或WO 01/77345中公開的方法。
該方法可以用于，尤其是，將rpoS等位基因(其含有，例如，終止密碼子)、抑制基因基因(例如，supE)、弱化的tdh等位基因(其含有，例如，缺失)、弱化的ilvA等位基因、thrA等位基因(其能編碼″反饋″抗性的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I變體)、rhtA23突變、弱化的pck等位基因、弱化的ytfP ORF的等位基因、弱化的yjfA ORF、弱化的poxB等位基因或弱化的yjgF ORF插入菌株中。
在轉導方法中，使用噬菌體將遺傳特征從供體菌株轉移進目標菌株中。該方法屬于現有技術，且記載在教材中，例如，E.A.Birge(Bacterial and Bacteriophage Genetics，第4版，Springer Verlag，New York，USA，2000)。
在大腸桿菌的情況下，噬菌體P1典型地用于普通轉導(Lennox，Virology 1，190-206(1955))。F.C.Neidhard(Escherichia coliand Salmonella Cellular and Molecular Biology，第2版，ASMPress，Washington，DC，USA，1996)的教材中的M.Masters的文章″Generalised Transduction″總結了普通轉導的方法。實踐規程包含在例如J.H.Miller(A Short Course In Bacterial Genetics.ALaboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and RelatedBacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA，1992)的教材或P.Gerhardt″Manual of Methods for GeneralBacteriology″(American Society for Microbiology，Washington，DC，USA，1981)的教材中。
使用轉導方法，可以將能賦予抗性的或其它顯性的遺傳性質，例如，抗生素抗性(例如卡那霉素抗性，氯霉素抗性，利福平抗性或疏螺旋體素抗性)，對抗代謝物的抗性(例如α-氨基-β-羥基戊酸抗性，α-甲基-絲氨酸-抗性或二氨基琥珀酸抗性)，對代謝物的抗性(例如蘇氨酸抗性，高絲氨酸抗性，谷氨酸抗性，甲硫氨酸抗性，賴氨酸抗性或天冬氨酸抗性)或利用蔗糖的能力，轉移進合適的目標菌株中。
轉導方法也適用于將所謂的非選擇性的遺傳性質，例如，營養缺陷型或需要氨基酸(例如需要異亮氨酸，需要甲硫氨酸或需要間二甲基庚二酸)，需要維生素或對抗代謝物的敏感性(例如氟代丙酮酸敏感性)，插入目標菌株中。為此目的，使用在染色體上含有間隔約1分鐘的轉座子Tn10或Tn10kan的大腸桿菌菌株。在術語″Singer收集″或″Singer/Gross收集″(Singer等，Microbiological Reviews53，1-24，1989)下，這些菌株是已知的。這些菌株一般可以從YaleUniversity的大腸桿菌品種中心(New Haven，CT，USA)得到。在F.C.Neidhard(Escherichia coli and Salmonella Cellular andMolecular Biology，第2版，ASM Press，Washington，DC，USA，1996)的教材中的M.K.B.Berlyn等″Linkage Map of Escherichia coliK-12，Edition 9″文章中，可以發現其它信息。以類似的方式，可以將不是直接選擇性的遺傳性質(例如氟代丙酮酸敏感性，抑制基因突變)和不知其突變位點的那些，轉入不同的菌株中。在尤其是J.Scaife等(Genetics of Bacteria，Academic Press，London，UK，1985)的教材中，在上述的M.Masters的文章中，在上述的J.H.Miller的手冊中，可以發現在這種方法的說明。使用Bochner等(Journal ofBacteriology 143，926-933(1980))所述的方法，可以再任選地去除用轉座子Tn10插入的四環素抗性基因。
在接合方法中，通過細胞-細胞接觸，使遺傳物質從供體轉移進受體中。F-因子(F生育力)的接合轉移，使用Hfr菌株(Hfr高頻重組)和攜帶F′-因子的菌株(F′F prime)的接合基因轉移，屬于常規的遺傳學方法。在，尤其是，在F.C.Neidhard(Escherichia coliand Salmonella Cellular and Molecular Biology，第2版，ASMPress，Washington，DC，USA，1996)的標準著作中，可以發現綜述。實踐規程記載在例如，J.H.Miller(A Short Course In BacterialGenetics.A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coliand Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，USA，1992)的手冊中，或P.Gerhardt″Manual of Methods forGeneral Bacteriology″(American Society for Microbiology，Washington，DC，USA，1981)的手冊中。F-、F′和Hfr菌株一般可以從Yale University的大腸桿菌品種中心(New Haven，CT，USA)得到。
接合方法已經用于，例如，將Thèze和Saint-Girons(Journal ofBacteriology 118，990-998(1974))所述的突變thrC1010轉移進菌株MG442(Debaboy，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79，113-136(2003)中。具有利用蔗糖能力的接合質粒記載在現有技術中，例如Schmid等(Journal of Bacteriology151，68-76(1982))或Smith和Parsell(Journal of GeneralMicrobiology 87，129-140(1975))和Livshits等(InConferenceon Metabolic Bacterial Plasmids.Tartusk University Press，Tallin，Estonia(1982)，p 132-134 und 144-146)。因而，Debabov報道(InProceedings of the IVth International Symposium onGenetics of Industrial Microorganisms 1982。Kodansha Ltd，Tokyo，Japan，p 254-258)，通過接合，構建了已經導入了利用蔗糖能力的能生產蘇氨酸的菌株。
序列表<110>Degussa AG<120>用于制備L-蘇氨酸的方法<130>030235 BT<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>993<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(990)<223>rpos基因<400>1atg agt cag aat acg ctg aaa gtt cat gat tta aat gaa gat gcg gaa48Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu1 5 10 15ttt gat gag aac gga gtt gag gtt ttt gac gaa aag gcc tta gta gaa96Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu20 25 30cag gaa ccc agt gat aac gat ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag 144Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln35 40 45gga gcc aca cag cgt gtg ttg gac gcg act cag ctt tac ctt ggt gag 192Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu50 55 60att ggt tat tca cca ctg tta acg gcc gaa gaa gaa gtt tat ttt gcg 240Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Gtu Val Tyr Phe Ala65 70 75 80cgt cgc gca ctg cgt gga gat gtc gcc tct cgc cgc cgg atg atc gag 288Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu85 90 95agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gcc cgc cgt tat ggc aat cgt 336Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg100 105 110
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130 135 140Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn145 150 155 160Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn165 170 175Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu180 185 190Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp195 200 205Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr210 215 220Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp225 230 235 240Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys245 250 255Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu260 265 270Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu275 280 285Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln290 295 300Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln305 310 315 320Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu325 330<210>3<211>993<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>等位基因
<222>(1)..(990)<223>rpoS等位基因<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(99)<223>密碼子<400>3atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac 60ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaatagg aacccagtga taacgatttg 120gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt 180taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg 240cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt 300ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc 360gaagagggca acctggggct gatccgcgcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc 420cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac 480caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga 540accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag 600caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtcttaacga gcgcattacc 660tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat 720gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc 780aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993<210>4
<211>75<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>tRNA<222>(1)..(75)<223>supE等位基因<400>4tggggtatcg ccaagcggta aggcaccgga ttctaattcc ggcattccga ggttcgaatc60ctcgtacccc agcca 75<210>5<211>1545<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>ilvA-基因<400>5atg gct gac tcg caa ccc ctg tcc ggt gct ccg gaa ggt gcc gaa tat48Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr1 5 10 15tta aga gca gtg ctg cgc gcg ccg gtt tac gag gcg gcg cag gtt acg96Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr20 25 30ccg cta caa aaa atg gaa aaa ctg tcg tcg cgt crt gat aac gtc att 144Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile35 40 45ctg gtg aag cgc gaa gat cgc cag cca gtg cac agc ttt aag ctg cgc 192Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg50 55 60ggc gca tac gcc atg atg gcg ggc ctg acg gaa gaa cag aaa gcg cac 240Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His65 70 75 80
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<210>7<211>1545<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>ilvA-等位基因<220>
<221>突變<222>(856)..(856)<223>
<400>7atg gct gac tcg caa ccc ctg tcc ggt gct ccg gaa ggt gcc gaa tat 48Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr1 5 10 15tta aga gca gtg ctg cgc gcg ccg gtt tac gag gcg gcg cag gtt acg 96Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr20 25 30ccg cta caa aaa atg gaa aaa ctg tcg tcg cgt ctt gat aac gtc att144Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile35 40 45ctg gtg aag cgc gaa gat cgc cag cca gtg cac agc ttt aag ctg cgc192Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg50 55 60ggc gca tac gcc atg atg gcg ggc ctg acg gaa gaa cag aaa gcg cac240Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His65 70 75 80ggc gtg atc act gct tct gcg ggt aac cac gcg cag ggc gtc gcg ttt288Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe85 90 95tct tct gcg cgg tta ggc gtg aag gcc ctg atc gtt atg cca acc gcc336Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala
100 105 110acc gcc gac atc aaa gtc gac gcg gtg cgc ggc ttc ggc ggc gaa gtg384Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val115 120 125ctg cte cac ggc gcg aac ttt gat gaa gcg aaa gcc aaa gcg atc gaa432Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu130 135 140ctg tca cag cag cag ggg ttc acc tgg gtg ccg ccg ttc gac cat ccg480Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro145 150 155 160atg gtg att gcc ggg caa ggc acg ctg gcg ctg gaa ctg ctc cag cag528Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln165 170 175gac gcc cat ctc gac cgc gta ttt gtg cca gtc ggc ggc ggc ggt ctg576Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu180 185 190gct gct ggc gtg gcg gtg ctg atc aaa caa ctg atg ccg caa atc aaa624Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys195 200 205gtg atc gcc gta gaa gcg gaa gac tcc gcc tgc ctg aaa gca gcg ctg672Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu210 215 220gat gcg ggt cat ccg gtt gat ctg ccg cgc gta ggg cta ttt gct gaa720Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu225 230 235 240ggc gta gcg gta aaa cgc atc ggt gac gaa acc ttc cgt tta tgc cag768Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln245 250 255gag tat ctc gac gac atc atc acc gtc gat agc gat gcg atc tgt gcg816Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala260 265 270gcg atg aag gat tta ttc gaa gat gtg cgc gcg gtg gcg aaa ccc tct864
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100 105 110Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val115 120 125Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu130 135 140Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro145 150 155 160Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln165 170 175Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu180 185 190Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys195 200 205Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu210 215 220Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu225 230 235 240Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln245 250 255Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala260 265 270Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Lys Pro Ser275 280 285Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn290 295 300Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn305 310 315 320Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln325 330 335
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<221>DNA
<222>(1)..(1548)<223>
<220>
<221>CDS<222>(527)..(952)<223>yjgF-Orf<400>9tcgcgatctg gtactgtaag gggaaataga gatgacacac gataataaat tgcaggttga 60agctattaaa cgcggcacgg taattgacca tatccccgcc cagatcggtt ttaagctgtt120gagtctgttc aagctgaccg aaacggatca gcgcatcacc attggtctga acctgccttc180tggcgagatg ggccgcaaag atctgatcaa aatcgaaaat acctttttga gtgaagatca240agtagatcaa ctggcattgt atgcgccgca agccacggtt aaccgtatcg acaactatga300agtggtgggt aaatcgcgcc caagtctgcc ggagcgcatc gacaatgtgc tggtctgccc360gaacagcaac tgtatcagcc atgccgaacc ggtttcatcc agctttgccg tgcgaaaacg420cgccaatgat atcgcgctca aatgcaaata ctgtgaaaaa gagttttccc ataatgtggt480gctggccaat taattgcggt tggtaataaa agtctggctc cctata atg agc cag 535Met Ser Gln1act ttt tac cgc tgt aat aaa gga gaa atc atg agc aaa act atc gcg 583Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys Thr Ile Ala5 10 15acg gaa aat gca ccg gca gct atc ggt cct tac gta cag ggc gtt gat 631Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln Gly Val Asp20 25 30 35ctg ggc aat atg atc atc acc tcc ggt cag atc ccg gta aat ccg aaa 679Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val Asn Pro Lys40 45 50acg ggc gaa gta ccg gca gac gtc gct gca cag gca cgt cag tcg ctg 727Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ser Leu55 60 65
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<211>141<212>PRT<213>大腸桿菌<400>10Met Ser Gln Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys1 5 10 15Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln20 25 30Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val35 40 45Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg50 55 60Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys65 70 75 80Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp85 90 95Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn100 105 110Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys115 120 125Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg130 135 140
權利要求
1.使用能生產L-蘇氨酸的腸桿菌科細菌制備L-蘇氨酸的方法，其中，a)將細菌接種到至少第一種營養培養基中，并培養，b)取出一些發酵液，其中大于90體積％的發酵液總體積保留在發酵容器中，然后c)用一種或多種其它營養培養基補足剩余的發酵液，其中一種或多種其它營養培養基含有至少一種碳源、至少一種氮源和至少一種磷源，并在能形成L-蘇氨酸的條件下繼續培養，d)步驟b)和c)任選地進行幾次，和e)將根據步驟c)和/或d)的培養過程中的碳源濃度調節至不超過30g/1。
2.根據權利要求1的方法，其中培養步驟(a)是通過分批方法完成的。
3.根據權利要求1的方法，其中培養步驟(a)是通過補料分批方法完成的，其中使用了至少一種附加的營養培養基。
4.根據權利要求1、2或3的方法，其中取出了小于8體積％發酵液。
5.根據權利要求1、2或3的方法，其中取出了小于5體積％發酵液。
6.根據權利要求1、2或3的方法，其中取出了小于2體積％發酵液。
7.根據權利要求1、2或3的方法，其中形成的L-蘇氨酸是純化的。
8.根據權利要求1的方法，其中碳源是一種或多種選自下述的化合物蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、纖維素水解物、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、醋酸、乙醇和甲醇。
9.根據權利要求1的方法，其中氮源是一種或多種有機含氮物，或選自蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素的物質的混合物，和/或一種或多種選自氨、含銨鹽和硝酸鹽的無機化合物。
10.根據權利要求9的方法，其中含銨鹽和硝酸鹽是硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨、硝酸鉀和硝酸鉀鈉。
11.根據權利要求1的方法，其中磷源是磷酸，或磷酸的堿金屬或堿土金屬鹽或聚合物，或植酸。
12.根據權利要求11的方法，其中磷酸堿金屬鹽是磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應的含鈉鹽。
13.根據權利要求1的方法，其中腸桿菌科細菌是大腸桿菌種。
14.根據權利要求1的方法，其中腸桿菌科細菌含有至少一個thrA基因或等位基因，其能編碼蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I。
15.根據權利要求1的方法，其中腸桿菌科細菌含有選自下述的終止密碼子在rpoS基因中的opal、ochre和amber，優選amber，和選自下述的t-RNA抑制基因opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，優選amber抑制基因。
16.根據權利要求1的方法，其中根據d)，重復步驟b)和c)0-100次、優選地2-80次、優選地4-50次，和特別優選地5-30次。
17.根據權利要求1的方法，其中完成取出發酵液至大于90體積％總體積和完成用營養培養基補足至約100％之間的時間是最多5小時。
18.根據權利要求17的方法，其中完成用營養培養基補足最多用2小時。
19.根據權利要求1的方法，其中在補加的一種或幾種營養培養基中，調節磷/碳比(P/C比)至不超過4；不超過3；不超過2；不超過1.5；不超過1；不超過0.7；不超過0.5；不超過0.48；不超過0.46；不超過0.44；不超過0.42；不超過0.40；不超過0.38；不超過0.36；不超過0.34；不超過0.32；不超過0.30。
20.根據權利要求1的方法，其中為取出的培養液提供氧氣或含氧的氣體，直到碳源的濃度降至小于2g/l、小于1g/l、小于0.5g/l。
21.根據權利要求19的方法，其中形成的L-蘇氨酸是純化的。
22.根據權利要求19的方法，其中在步驟(b)中取出的培養物中首先取出至少90％的生物質，然后取出至少90％的水。
23.根據權利要求1、2或3的方法，其中將培養過程中的碳源濃度調節至不超過20，10或5g/l。
24.根據權利要求1、2或3的方法，其中將培養過程中的碳源濃度調節至不超過5或2g/l。
25.根據權利要求1、2或3的方法，其中將培養過程中的碳源濃度調節至不超過5g/l。
26.根據權利要求1、2或3的方法，其中將培養過程中的碳源濃度調節至不超過2g/l。
27.根據權利要求1、2或3的方法，其中以采用的碳源為基礎，形成的L-蘇氨酸的產率是至少31重量％。
28.根據權利要求1、2或3的方法，其中以采用的碳源為基礎，形成的L-蘇氨酸的產率是至少37重量％。
29.根據權利要求1、2或3的方法，其中以采用的碳源為基礎，形成的L-蘇氨酸的產率是至少42重量％。
30.根據權利要求1、2或3的方法，其中以采用的碳源為基礎，形成的L-蘇氨酸的產率是至少48重量％。
31.根據權利要求1、2或3的方法，其中以5.0至大于8.0g/l/小時的時空產率形成L-蘇氨酸。
32.根據權利要求1、2或3的方法，其中以3.5至大于5.0g/l/小時的時空產率形成L-蘇氨酸。
33.根據權利要求1、2或3的方法，其中以2.5至大于3.5g/l/小時的時空產率形成L-蘇氨酸。
34.根據權利要求1的方法，其中在培養步驟a)中使用補料分批方法，且以至少2.5-5.0g/l/小時的時空產率形成L-蘇氨酸。
35.大腸桿菌K-12的能利用蔗糖的轉化接合子，其作為DSM16293保藏在德國微生物和細胞培養物中心(Braunschweig，Germany)。
36.根據權利要求1、2或3的方法，其中使用具有至少下述特征的菌株a)蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I，其任選地以過表達形式存在，和b)選自下述的終止密碼子在rpoS基因中的opal、ochre和amber，優選amber，和選自下述的t-RNA抑制基因opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因。
37.根據權利要求1、2或3的方法，其中使用具有至少下述特征的菌株a)蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I，其任選地以過表達形式存在，b)在好氧培養條件下，不能分解蘇氨酸，c)至少部分需要異亮氨酸，和d)在有至少5g/l蘇氨酸存在下生長。
38.根據權利要求1、2或3的方法，其中使用具有至少下述特征的菌株a)蘇氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I，其任選地以過表達形式存在，b)選自下述的終止密碼子在rpoS基因中的opal、ochre和amber，優選amber，和選自下述的t-RNA抑制基因opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，c)在好氧培養條件下，不能分解蘇氨酸，優選歸因于蘇氨酸脫氫酶的弱化，d)至少部分需要異亮氨酸，和e)在有至少5g/l蘇氨酸存在下生長。
39.根據權利要求36、37或38的方法，其中使用的菌株另外含有一種或多種選自下述的特征39.1由pckA基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的弱化，39.2由pgi基因編碼的磷酸葡萄糖異構酶的弱化，39.3由開放讀碼框ytfP編碼的YtfP基因產物的弱化，39.4由開放讀碼框yjfA編碼的YjfA基因產物的弱化，39.5由poxB基因編碼的丙酮酸氧化酶的弱化，39.6由開放讀碼框yjgF編碼的YjgF基因產物的弱化，39.7由基因pntA和pntB編碼的轉氫酶的增強，39.8由pps基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強，39.9由ppc基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增強，39.10由rseB基因編碼的調節劑RseB的增強，39.11由galP基因編碼的半乳糖質子協同轉運子的增強，39.12能使用蔗糖作為碳源的能力，39.13由開放讀碼框yedA編碼的YedA基因產物的增強，39.14在有至少0.1-0.5mM或至少0.5-1mM疏螺旋體素存在下生長(疏螺旋體素抗性)，39.15在有至少2-2.5g/l或至少2.5-3g/l二氨基琥珀酸存在下生長(二氨基琥珀酸抗性)，39.16在有至少30-40mM或至少40-50mM α-甲基絲氨酸存在下生長(α-甲基絲氨酸抗性))，39.17在有不超過30mM或不超過40mM或不超過50mM氟代丙酮酸存在下生長(氟代丙酮酸敏感性)，39.18在有至少210mM或至少240mM或至少270mM或至少300mML-谷氨酸存在下生長(谷氨酸抗性)，39.19至少部分需要甲硫氨酸，39.20至少部分需要間二氨基庚二酸，39.21在至少100mg/l利福平存在下生長(利福平抗性)，39.22在至少15g/l L-賴氨酸存在下生長(賴氨酸抗性)，39.23在至少15g/l甲硫氨酸存在下生長(甲硫氨酸抗性)，39.24在至少15g/l L-天冬氨酸存在下生長(天冬氨酸抗性)，和39.25由pyc基因編碼的丙酮酸羧化酶的增強。
全文摘要
本發明提供了改進的使用能生產L－蘇氨酸的腸桿菌科細菌發酵制備L－蘇氨酸的方法。
文檔編號C12N15/00GK1833028SQ200480022849
公開日2006年9月13日 申請日期2004年7月29日 優先權日2003年8月12日
發明者D·克勒澤, T·赫爾曼, G·蒂爾巴赫, M·里普金 申請人:底古薩股份公司