專利名稱：源自歐洲的細胞內羅森氏菌及其疫苗，診斷劑及使用方法
技術領域：
本發明涉及細胞內羅森氏菌疫苗及用于保護免受細胞內羅森氏菌感染及診斷細胞內羅森氏菌感染的方法。在某種程度上，本發明的產物及過程可作為用于培養大規模供應的細胞內羅森氏菌的改良方法的結果獲得，其包括歐洲來源的細胞內羅森氏菌(L.intracellularis of European origin)的新的分離株及制備含有作為疫苗產物的減毒歐洲分離株的凍干產物的方法。
背景技術：
細胞內羅森氏菌為豬增生性腸病(″PPE″)的病原體，其實際上會感染所有動物，所述動物包括兔子、雪貂、倉鼠、狐貍、馬及如同鴕鳥及鴯鹋具多樣性的其它動物。細胞內羅森氏菌系造成歐洲及美國豬群損失的尤其主要原因。
PPE的一致性特征系在腸感染部分的腸道細胞中出現胞質內、非膜結合的曲狀桿菌。與PPE相關的細菌在S.McOrist等人的Vet.Pathol.，Vol.26，260-264(1989)中已被稱作″彎曲桿菌樣生物″。隨后，已確認該致病菌為一種新穎的分類學屬及物種，別名稱作細胞內回腸共生微生物(Ilealsymbiont)(IS)。C.Gebhart等人，Int′l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-538(1993)。近來，所述新穎細菌的分類學名稱命名為細胞內羅森氏菌(L.)。S.McOrist等人，Int′l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.45，No.4，820-825(1995)。這三種名稱交換使用，指代本文進一步鑒定及描述的生物體。
細胞內羅森氏菌為一種強制性(obligate)細胞內細菌，其無法以常規細菌學方法于常規不含細胞的培養基中培養，且被認為為了生長，需要附著性上皮細胞。S.McOrist等人，Infection and Immunity，Vol.61，No.19，4286-4292(1993)及G.Lawson等人，J.of Clinical Microbiology，Vol.31，No.5，1136-1142(1993)論述了使用IEC-18大鼠腸道上皮細胞單層在常規組織培養燒瓶中培養細胞內羅森氏菌。此外，H.Stills，Infection and Immunity，Vol.59，No.9，3227-3236(1991)討論了使用腸407人類胚胎腸細胞單層及GPC-16豚鼠結腸腺癌細胞單層在常規組織培養燒瓶中培養細胞內羅森氏菌。
近來，美國已批準使用一種細胞內羅森氏菌疫苗，該疫苗系基于美國專利第5,714,375號及第5,885,823號所述及所申請專利的羅森氏菌分離株，所述兩個專利的全文均以引用的方式并入本文中。上述疫苗系由BoehringerIngelheim Vetmedica，Inc.，2621 North Belt Highway，St.Joseph，Missouri64506-2002以ENTERISOLIleitis為商標出售。
發明內容
本發明的一個目的是提供改良的細胞內羅森氏菌疫苗，其使用歐洲來源的分離株。
本發明的另一目的是提供用以大規模培養細胞內羅森氏菌的改良方法及用以制備細胞內羅森氏菌疫苗的改良技術。
為了達成所述及其它目的，且根據如本文體現及廣泛描述的本發明目的，本發明提供了來自歐洲的新近經分離的細胞內羅森氏菌、使該分離株減毒的方法及其減毒分離株。本文還提供了包含減毒分離株的疫苗。本文還提供了用以制備包含用于在用藥時復原的凍干形式的減毒分離株的疫苗及其凍干產物的方法。
在一個具體實施方案中，來自歐洲的新近經分離的細胞內羅森氏菌為分離株DK 15540，其是以PTA-4927登記號保藏于ATCC中的分離株。在另一具體實施方案中，衍生于分離株DK 15540的減毒分離株命名為分離株B3903，其則以PTA-4926登記號保藏于ATCC中。
具體內容如本文所用，術語″細胞內羅森氏菌″意謂由C.Gebhart等人，Int′l.J.ofSystemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-538(1993)及S.McOrist等人，Int′l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.45，No.4，820-825(1995)詳述的細胞內、彎曲的革蘭氏陰性細菌，所述文獻的全文各自均以引用的方式并入本文中，且該術語包括(但不限于)名為DK 15540的分離株(其在布達佩斯條約(BudapestTreaty)的約束下于2003-1-9保藏于美國典型培養物保藏中心(theAmerican Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209)及ATCC登記號PTA-4927；根據本領域的知識和本文的教導，自全世界PPE感染的豬及其它動物所獲的致病菌；及任何以上細菌的變異體或突變體，無論是以自然方式或是以人工方式取得。
如本文所用，術語″減毒分離株″意謂任何細胞內羅森氏菌分離株，其根據本文所揭示的培養及傳代技術所制備以實現當給予宿主動物時無毒性，同時可保持致免疫特性，所述分離株包括(但不限于)命名為B-3903的減毒分離株，其系在布達佩斯條約的約束下于2003-1-9保藏于美國典型培養物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，ACTT登記號PTA-4926。
本發明的減毒分離株可作為動物抗微生物疫苗中的免疫原，所述動物包括鳥、魚及諸如牛、豬、馬及靈長類的哺乳動物。以本領域熟練技術人員所知的技術及本文揭示的內容可制備所述疫苗。該疫苗包含在可藥用載體中的免疫有效量的減毒分離株。該疫苗可分一或多次給藥。根據本文所含有的教示，由本領域已知的手段而無需不恰當試驗法來測定免疫學有效量。無毒性細菌的量應足以刺激易患病動物的免疫反應，同時仍保持無毒性。這將取決于所涉及的具體動物、細菌及疾病。待給予易受感染動物的推薦劑量優選為約3.0TCID50(組織培養感染劑量50％終點)/劑量至約6.0TCID50/劑量且更優選為約4.0TCID50/劑量至約5.0TCID50/劑量)。在一優選具體實施方案中，該疫苗的效價如組織培養感染劑量50％終點稀釋度測定法(TCID50)所測定為約4.9TCID50/劑量。所述載體是本領域已知的且包括穩定劑及稀釋劑。該疫苗也可含有適當的佐劑。本發明的疫苗可與其它疫苗并用，例如作為另一疫苗的稀釋劑來使用。也可干燥所述疫苗制劑，例如，通過冷凍干燥來達成儲存目的或為了隨后將其調配為液態疫苗。
因此，本發明也包含一種為了保護宿主免受細菌感染而在動物宿主中誘導針對毒性、野生型細胞內羅森氏細菌的免疫反應的方法。該方法包含將免疫有效量的本發明的減毒細菌或滅活細菌給予宿主，且優選將本發明的疫苗給予宿主。
如本文所用，術語″大規模培養″意謂細胞內羅森氏菌的培養水平超過約2.0至3.0升且包括以100升或更大的規模來生產。如本文所用，″培養″意謂促進細胞內羅森氏菌的生長、繁殖及/或增殖的過程。
細胞內羅森氏菌可由本領域已知的方法來培養，優選根據美國專利第5,714,375號及第5,885,823號來培養。例如，可首先以包含細胞內羅森氏菌的接種物來接種培養細胞以使細菌感染所述細胞。多種細胞系均可用于實施本發明，其包括(但不限于)IEC-18(ATCC 1589)-大鼠腸道上皮細胞；HEp-2(ATCC 23)-人類表皮樣癌細胞；McCoys(ATCC 1696)-小鼠(未指定)細胞；BGMK (Biowhittaker#71-176)-水牛綠猴腎細胞及豬腸道上皮細胞。優選的培養細胞為HEp-2、McCoys或IEC-18細胞。
若在接種前使用培養細胞，則所述細胞可為單層形式。為了形成單層，可將所述細胞種于常規燒瓶中。各燒瓶通常種有與生長培養基混合的約1×105至約10×105個細胞每25、75、150、850cm2燒瓶或滾筒瓶(roller bottle)。該生長培養基可為任何用于細胞培養的培養基，其包括氮源、用于所選培養細胞的必需生長因子及碳源，例如葡萄糖或乳糖。優選的培養基是用含有1-5％胎牛血清的Ham′s F 12強化的DMEM，但也可使用其它市售培養基來產生良好結果。
通過使培養細胞保持恒定生長狀態來增強細胞內羅森氏菌的成功培養。因此，該單層培養細胞在接種時應為約20％至約50％滿底。優選地，所述細胞在接種時應為約30％至約40％滿底，最優選為約30％滿底。
或者，如下文所述，在接種前，所述細胞可生長于懸浮液中。優選地，首先使所述細胞在黏著型系統(如滾筒瓶系統)中以單層形式生長至100％滿底，且隨后將其轉移至3-3000公升器皿中且使其在懸浮液中生長。或者，可在接種前，利用適于細胞在此系統中生長的參數使所述細胞在3-3000公升器皿(生物反應器，發酵器，旋轉燒瓶等)中的懸浮中生長至所要細胞密度，例如2×105個細胞/毫升。
該接種物可為獲自感染的豬或其它動物的細胞內羅森氏菌的純培養物。該接種物優選可為獲自ATCC登記號PTA-4927的細胞內羅森氏菌的純培養物。
該接種物可為通過刮取感染了PPE的豬或其它動物的回腸黏膜而制得的腸道勻漿。在制備腸道勻漿時，被選作培養物的回腸切片應顯示出伴有腸肥大增厚的嚴重病變。由于細菌的脆弱性質，在尸檢后優選應盡快將樣品儲存于-70℃。細胞內羅森氏菌對其具有抵抗性的抗生素，例如萬古霉素(Vancomycin)、兩性霉素(Amphotericin)B或胺基糖苷組抗生素的成員(包括慶大霉素及新霉素，僅舉幾個實例)，優選將其加入接種物中以抑制細菌污染同時允許細胞內羅森氏菌生長。根據本文的教示，無論該接種物是否為純培養物或腸道勻漿，培養細胞的接種均可由本領域中已知的各種技術來進行。
隨后在降低的溶解O2濃度條件下保溫所述細菌及/或接種的培養細胞。在溶解氧濃度超過10％時，細胞內羅森氏菌的生長并非最優，最終在此范圍外的氧濃度下其生長終止。優選地，在約0％至約10％的溶解氧濃度保溫所述細菌及/或接種的培養細胞。更優選地，在約0％至約8％的氧濃度保溫所述細菌及/或細胞，最優選的氧濃度為約0％至約3.0％。
二氧化碳的適當濃度對于細胞內羅森氏菌的適當生長也具重要性。在二氧化碳濃度超過0％且低于4％時，發生非最優生長，最終在此范圍外的二氧化碳濃度其生長終止。二氧化碳濃度優選在約6％至約10％范圍內，最優選的二氧化碳濃度約為8.8％。
此外，優選在約4％至約10％范圍內的氫濃度保溫所述細胞。最優選地，在約0至約8.0％O2、約8.8％CO2及約4％H2保溫所述細胞。氮在含有氮(96％)及氫(4％)或氮(80％)、二氧化碳(10％)及氫(10％)的氣體混合物中用作″平衡體″以用于此生物生長。優選在約80％至96％的氮濃度保溫細胞。因此，最優選在約0至約8.0％O2、約8.8％CO2、約4％H2及約96％N2保溫細胞。
可在雙氣體保溫器或其它氣體腔室中保溫接種細胞，所述腔室含有適當的氫、氧及二氧化碳濃度且讓所述細胞在保溫期間懸浮。該腔室應包含用于使接種細胞保持懸浮的裝置，以及氣體監視器及供應源以提供并保持適當的氣體濃度。保溫溫度應在30℃至約45℃的范圍內且更優選在約36℃至約38℃的范圍內。該溫度最優選約為37℃。根據本文的教示，一般技術者易于獲得用于培養及減毒的必要設備。適于進行本發明的設備的一實例為雙氣體保溫器，例如與旋轉燒瓶并用以使細胞保持懸浮的模型480(Lab-Line，Melrose Park，IL)。目前的優選設備包含發酵器、生物反應器、攪拌盤或含有至少約2公升培養基且能夠經由適當濃度的噴射氣體使培養細胞保持懸浮的旋轉振蕩器或其它機械攪拌裝置，且連續監視培養基中的溶解O2含量。New Brunswick、Braun及其它公司均制備適于達成此目的的發酵器及生物反應器。
使接種細胞在保溫期間保持懸浮狀態，通過增強各個體細胞對于生長培養基的暴露及增加氫、氧及二氧化碳的適當混合物來達成所述細胞的最大生長，且因此達成細胞內羅森氏菌的最大生長。可攪拌所述培養細胞且由本領域中已知的各種方法使其保持懸浮，所述方法包括(例如)培養燒瓶、滾筒瓶、膜培養、生物袋(biobag)、WAVETM生物反應器系統、發酵器及旋轉燒瓶。在保溫期間可通過在雙氣體保溫器或類似裝置內部的旋轉燒瓶中保溫所述細胞而使其保持懸浮。如本文所用，術語″旋轉燒瓶″意謂燒瓶或其它容器，其采用漿狀物、螺旋槳或其它裝置來攪拌培養物且使其中所含細胞保持懸浮。
在一優選具體實施方案中，保溫所述接種細胞直至其達到滿底且隨后將所述細胞置于含有生長培養基的旋轉燒瓶中且在雙氣體保溫器中保溫，同時旋轉該燒瓶。優選地，刮下所述接種細胞或使其胰蛋白酶化且使其在旋轉燒瓶中傳代。這可由本領域中已知的各種方法來達成，例如使用細胞刮器來使細胞脫落。一旦將所述細胞引入旋轉燒瓶中，該旋轉燒瓶的漿狀物一般系在約5至約500rpm范圍內在磁性攪拌盤上旋轉以使感染細胞保持懸浮。
隨后使一部分所培養的細胞內羅森氏菌在新鮮培養物中傳代以增加細胞內羅森氏菌的產量。本文所用的術語″傳代″或其變化意謂為了使新鮮細胞感染細菌而將一部分所培養的細胞內羅森氏菌轉移至新鮮培養細胞中的過程。如本文所用，術語″新鮮″意謂尚未感染細胞內羅森氏菌的細胞。優選地，所述細胞平均僅為約一日齡。
可通過移除一部分原始培養物且將其加入含有新鮮培養細胞的新燒瓶中來實現細胞內羅森氏菌在懸浮培養物中的傳代。若原始培養物含有大數量的細菌/毫升(例如超過約104個細菌/毫升)，則最好將來自感染燒瓶的約1至10％(體積/體積)培養物添加于含有新鮮細胞的新燒瓶中。優選在感染了50-100％細胞時完成此操作。若少于50％的細胞被感染，則優選在新燒瓶中使培養物分為1∶2且通過加入新鮮組織培養細胞及培養基而按比例增大容積，由此來實現傳代。與先前技術中的單層培養物傳代形成直接對照，在兩種情況下，均不需要細胞溶解及其它步驟。
如間接熒光抗體(IFA)染色、TCID50或另一對照性方法所判定，在培養細胞充分生長及隨后由細胞內羅森氏菌感染以后，隨后收獲至少一部分所培養的細胞內羅森氏菌細菌。一般在約60％或更高的細胞感染性下進行收獲；然而，本領域熟練技術人員了解收獲可在低于60％的細胞感染性下進行。根據本文的教示，通過以一般技術者已知的各種技術使細菌自懸浮液中分離可進行收獲步驟。優選地，使所有或一部分懸浮液的內容物離心以使所述培養細胞沉淀，使所得細胞沉淀再懸浮且使所述感染細胞溶解，由此來收獲所述細胞內羅森氏菌細菌。通常，以約3000xg使至少一部分內容物離心約20分鐘以使所述細胞及細菌沉淀。隨后可使該沉淀再懸浮于(例如)蔗糖-磷酸鹽-谷胺酸(SPG)溶液中且使其通過25號(gauge)針約20次以溶解所述細胞。若需要進一步的純化，則可以約145xg使所述樣品離心約5分鐘以移除細胞核及碎片。隨后可以約3000xg使上清液離心約20分鐘且使所得沉淀再懸浮于適當稀釋液中，例如具有胎牛血清的SPG(為了制備適于凍干、冷凍或用作接種劑的所收獲細菌)或生長培養基(為了制備更適用于傳代至新鮮細胞的所收獲細菌)。
如先前所提及，通過使組織細胞保持活躍生長來增強用于大規模生產的細胞內羅森氏菌的有效生長。以單層而言，在培養物滿底時，細胞分裂率實質上減少。在單層組織培養物上生長細胞內羅森氏菌的嘗試已具有有限的成功且不可能大規模化。然而，使用懸液培養物極大地有助于使所述細胞保持活躍生長且允許連續的培養物膨脹及大規模化。如以上所說明，使用發酵器及在約0至約3％之間的溶解O2可使得多達108個細菌/毫升或更多的細菌生長。
在使用IEC-18細胞時，最好加入凝膠、瓊脂糖、膠原蛋白、丙烯醯胺或硅珠(例如Cultisphere-G多孔微載體(HyClone Laboratories，Logan Utah))，以及生長培養基。然而，根據本文所用的方法，HEp-2細胞及其它細胞均不需要微載體。
為了培養物保持的目的，就HEp-2培養物而言，優選以一周的時間間隔移除25％至50％的培養物且以新鮮培養基來置換。就具有微載體或珠粒的細胞培養物而言，優選地每周1-2次移除25％至50％的培養物且以新鮮培養基來置換。為了實現大規模化的目的，可將額外25％至50％的培養基(或具有微載體的培養基)添加于該培養物中。
視其中培養細胞變得受感染的速率而定，通常在約每個2日至約每7日發生新鮮細胞的傳代。假設培養細胞在2至7日內有至少70％受感染，傳代優選地發生在約每5至7日之間。
本發明也提供了對抗歐洲來源的細胞內羅森氏菌的新穎分離株的疫苗及制備疫苗的方法。優選地，在使受感染細胞在懸浮狀態保持一段延長時間(例如6-8個月)的后，收獲至少一部分所培養的細胞內羅森氏菌并監視潛在的減毒作用。優選通過宿主動物或動物模型攻擊來完成該監視以選出減毒分離株。根據本文所教示的方法將所述減毒分離株用于疫苗。
本發明允許快速培養膨脹、100-1000倍的產量增加及歐洲來源的細胞內羅森氏菌的生產成本的降低。因此，為了疫苗生產的目的而使所得大量供應的細胞內羅森氏菌易于減毒。在懸浮液中使細胞內羅森氏菌生長的方法極大地增加了可用于達成此目的的細菌的易得性(ease)、速率及數目。愈多的細胞及細胞分裂出現，愈高程度的突變就會出現，其對于疫苗發育有益。因此，在懸浮液中的生長增加了由環境調節基因所控制的重要免疫原的表達及其表達產物。
所得減毒分離株雖可在組織培養物單層中培養，但優選在懸浮培養物中培養。其它減毒裝置可包括通過使用(例如)N-甲基亞硝基胍及本領域中已知的其它物質所進行的化學減毒。通過使用多重傳代或化學裝置，為疫苗制備來生產或挑選減毒的細胞內羅森氏菌。在一優選具體實施方案中，所得減毒分離株的ATCC登記號為PTA-4926。
可通過如上所述的離心過濾或微過濾來收獲疫苗抗原。隨后基于最優的宿主動物免疫反應從而在界定的水平使該抗原標準化，如宿主動物種類中的劑量效價所確定的。可由本領域中已知的方法來滅活細菌，例如，通過使用0.3％福爾馬林或其它滅活劑，由此制備滅活的疫苗。隨后向該抗原中加入適合的佐劑如氫氧化鋁或礦物油中以增強免疫反應。隨后將該抗原用以經由肌肉內或皮下感染接種至宿主體內，在豬為約3-4周齡的情況下，必要時給予強化劑量。
優選地，將所述細菌連續傳代以誘導及挑選減毒、無毒的活培養物。在宿主動物中測試該培養物的減毒跡象。如前所述來收獲該培養物且將其凍干。例如，對豬經口接種1×104至1×106個細菌。在接種疫苗后約28日時，使該豬經口接種來自較少傳代(經由來自腸勻漿的原始分離后在活體外傳代少于30次)的細胞內羅森氏菌毒性培養物的約1×107個生物體。在攻擊后21日時對經感染的動物進行尸檢且觀察小腸的大體病變及微觀病變。也應進行PCR、間接熒光抗體(IFA)或免疫組織化學(IHC)。
約80％的對照動物將顯示大體或微觀病變且使用PCR、IFA或IHC測試方法來測試細胞內羅森氏菌在腸黏膜細胞中的陽性存在。經疫苗接種的動物將具有如組織學觀察所判定的正常黏膜表面且將通過接種后3至4周時所進行的PCR檢測而顯示為陰性。
通常在連續培養約150至約250日后產生減毒致免疫性細胞內羅森氏菌分離株，在此期間該培養物傳代約50-100次。然而，本領域熟練技術人員了解其它減毒培養物可通過改變所述數字而產生。
可凍干本發明的疫苗產物。在收獲后，可由本領域中已知的各種方法來濃縮該分離株且使其與穩定劑(例如蔗糖凝膠穩定劑)混合。隨后可使該疫苗產物經受冷凍及干燥(凍干)。通常，該冷凍步驟包含遞減(ramp)至約-45℃±3℃且保持約150分鐘至約480分鐘。該干燥步驟可包含一級與二級干燥步驟。例如，一級干燥步驟可包含(a)遞減至約-30℃至約-5℃且保持約120分鐘至約1000分鐘，及可選(b)遞減至約-5℃至約5℃且保持約150分鐘至約2000分鐘。二級步驟通常包含遞減至約27℃±5℃且保持約330分鐘至約1120分鐘。本領域熟練技術人員了解所述范圍可根據條件(例如起始容積)進行調整。
隨后制備在可藥用載體中包含免疫學有效量的減毒細胞內羅森氏菌的疫苗。在一優選具體實施方案中，疫苗包含在可藥用載體中的ACTT登記號PTA-4926。經組合的免疫原及載劑可為水性溶液、乳液或懸浮液。免疫學上的有效量可根據本發明的教導由本領域中已知的手段而無需不適當試驗法來判定。一般而言，在使用純化細菌時，免疫原的量將在5至5000微克之間，且在102.0至109.0TCID50之間，優選在103.0至106.0TCID50之間，更優選在104.0至105.0TCID50之間。
本發明也涵蓋組合疫苗，所述疫苗包含指定為ATCC登記號PTA-4926的減毒細胞內羅森氏菌分離株及來自至少一種其它病原菌的抗原物質及可藥用載體，所述其它病原菌包括(但不限于)沙門氏菌屬(Salmonella spp)(例如豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium))、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix spp)(例如豬丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae))、嗜血桿菌屬(Haemophilus spp)(例如豬副嗜血桿菌(Haemophilus parasuis))、支原體屬(Mycoplasma spp)(例如豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumonia))、鉤端螺旋體屬(Leptospira spp)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp)(例如產氣梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfingens)、艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile))、鏈球菌屬(Streptococcus spp)(例如豬鏈球菌(Streptococcus suis))、螺旋體屬(Brachyspira spp)(例如豬痢疾蛇形螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae))、博爾德氏桿菌(Bordetella)(例如支氣管敗血性博氏桿菌(Bordetella bronchiseptica))、巴斯德氏菌屬(Pasteurella spp.)(例如多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida))、環狀病毒(circovirus)(例如豬環狀病毒2型(porcine circovirus type 2))、豬生殖與呼吸癥候群(porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)(PRRS)病毒、豬流感病毒(swine influenzavirus)(SIV)、冠狀病毒(例如傳染性胃腸炎(transmissible gastro-enteritis)(TGE)病毒、豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory corona virus))、細小病毒(parvovirus)或大腸桿菌(Escherichia coli)。
在一具體實施方案中，該組合疫苗包含指定為ATCC登記號PTA-4926的減毒細胞內羅森氏菌分離株及來自沙門氏菌、丹毒絲菌、嗜血桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、螺旋體屬、傳染性胃腸炎(TGE)病毒及大腸桿菌的抗原物質及可藥用載體。來自梭狀芽孢桿菌屬的抗原物質可包括(但不限于)產氣梭狀芽孢桿菌與艱難梭狀芽孢桿菌。來自丹毒絲菌屬的抗原物質可包括(但不限于)豬丹毒絲菌。
在另一具體實施方案中，該組合疫苗包含ATCC登記號為PTA-4926的減毒細胞內羅森氏菌分離株及來自豬霍亂沙門氏菌及丹毒絲菌屬的抗原物質及可藥用載體。在另一具體實施方案中，該組合疫苗包含ATCC登記號為PTA-4926的減毒細胞內羅森氏菌分離株及來自豬霍亂沙門氏菌及豬丹毒絲菌的抗原物質及可藥用載體。
在另一具體實施方案中，該組合疫苗包含指定為ATCC登記號PTA-4926的減毒細胞內羅森氏菌分離株及來自至少一種其它病原菌的抗原物質及可藥用載體，所述其它病原菌包括(但不限于)梭狀芽孢桿菌屬(例如破傷風桿菌)、馬流感病毒(EIV)(例如EIV-1、EIV-2)、馬皰疹病毒(EHV)(例如EHV-1、EHV-2、EHV-3、EHV-4、EHV-5、EHV-6、EHV-7)、α病毒(例如東方腦炎病毒、西方腦炎病毒、維內瑞拉腦炎病毒)或西尼羅河病毒。
根據本發明的疫苗通常系以一或多個劑量給予易感動物，優選為豬。該活疫苗或死疫苗可于2周的時間間隔用藥1或2次。對于減毒活疫苗而言，優選為一次用藥。雖然減毒活分離株的優選用藥路徑為肌肉內、經口或鼻內方式，但對于死疫苗而言，肌肉內與皮下注射路徑為最優選。
由于培養致病細菌需要時間而阻礙了PPE的有效診斷。由于本發明，發展快速及準確分析法用以測定易感PPE豬只及其它動物所取出的生物樣品中細胞內羅森氏菌的存在的診斷工具目前已具有可能性。
本發明的歐洲來源的細胞內羅森氏菌(或衍生自所述細菌的成分)可作為ELISA或其它免疫分析法(例如免疫熒光抗體測試(″IFA″))中的抗原，以檢測疑受所述細菌感染的動物血清及其它體液中對抗細胞內羅森氏菌的抗體。目前優選的免疫分析法為如以下實例所述的IFA。或者，可將本發明的細菌用于Western印跡分析法中。
根據本發明，優選的ELISA實驗流程如下1.加入0.1毫升每孔經涂覆緩沖劑稀釋的抗原。在4℃保溫18小時。
2.PBS洗滌3次。
3.培養盤的各孔中加入0.25毫升封閉緩沖劑。在37℃保溫2小時。
4.洗滌緩沖劑洗滌3次。
5.用封閉緩沖劑稀釋血清，且將0.1毫升添加于培養盤的第一個孔中。使連續的1∶2稀釋液通過培養盤。在37℃保溫1小時。
6.洗滌緩沖劑洗滌3至5次。
7.封閉緩沖劑稀釋偶聯物，且將0.1毫升添加于培養盤的槽孔中，且在37℃保溫1小時。
8.洗滌緩沖劑洗滌3至5次。
9.加入底物。
10.分光光度計量測光的吸光度。
11.其中未加入抗原的槽孔用作空白槽孔。
12.陽性與陰性對照豬血清應用于每次實驗。
優選的Western印跡分析法實驗流程如下1.抗原在12％SDS-PAGE上跑膠，且將其轉移至硝化纖維膜。
2.膜置于封閉緩沖劑中2小時。
3.除封閉緩沖劑且以PBS漂洗1分鐘。
4.用封閉緩沖劑稀釋血清且將其加入膜中。在室溫保溫2小時。
5.用洗滌緩沖劑洗滌3次(每次洗滌歷時5分鐘)。
6.用封閉緩沖劑稀釋偶聯物且將其加入膜。在室溫保溫1小時。
7.用洗滌緩沖劑洗滌3次。
8.添加底物，保持10分鐘或直至出現強條帶。
9.用PBS漂洗。
10.空氣干燥且在暗處儲存。
本發明的歐洲來源的細胞內羅森氏菌細菌(或衍生自所述細菌的成分)也可用以制備用于診斷、預防或治療的抗血清或抗體。本發明的歐洲來源的細胞內羅森氏菌細菌(或衍生自所述細菌的成分)可以有效引起免疫反應的量用藥于非人類動物，且可根據本領域中已知及本文所述的方法來收集含有抗細胞內羅森氏菌細菌的抗體的抗血清或血漿，或衍生自所述細菌的成分。
以下實例進一步描述了本發明，所述實例僅為達成說明的目的且未被理解為本發明的限制。事實上，一般技術者將易于明白本發明的其它變異。
本文所提及的所有公開出版物及專利的全文均以引用的方式并入本文中。
實施例1細胞內羅森氏菌疫苗的制備來自患有豬增生性腸病(PPE)的歐洲豬的腸的細胞內羅森氏菌的分離及減毒細胞內羅森氏菌毒性分離株DK 15540(DK 15540，DK-15540及DK-15540在本文中可交換使用)系由明尼蘇達大學(the University ofMinnesota)自感染了急性豬出血性腸病的丹麥豬的回腸勻漿中分離而得。此分離株系在布達佩斯條約的約束下于2004-1-9保藏于美國典型培養物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，登記號PTA-4927。此分離過程包括自回腸刮下黏膜、勻漿、胰蛋白酶消化30分鐘，及使其通過組織勻漿器。隨后使該回腸勻漿通過一系列包括5.0、1.0及0.65μm的過濾器。在具有10％胎牛血清(FBS)的蔗糖磷酸谷胺酸酯緩沖劑中稀釋該勻漿。制得勻漿的等分試樣(6×1毫升)且將其儲存于低于-70℃。將該勻漿用作接種物以感染T-75cm2燒瓶中的McCoy細胞。刮下McCoy細胞單層，以氯化鉀處理使細胞溶解，且將濃縮細胞沉淀置于使用對細胞內羅森氏菌具特異性的單克隆抗體以IFA法染色的顯微鏡載玻片上，每日監視培養物的McCoy細胞感染。在貼壁(anchorage)依賴性細胞培養物上傳代11次的后，將來自第11次傳代的接種物轉移至含有McCoy細胞的250毫升旋轉燒瓶中且使其在懸浮液中生長直至收獲。通過連續的活體外傳代在McCoy細胞中使細胞內羅森氏菌的丹麥分離株(ATCC登記號PTA-4927)減毒80周且由單克隆抗體來測試同一性。將該減毒分離株指定為B3903(B3903、B 3903及B-3903在本文中可交換使用)。分離株B3903系在布達佩斯條約的約束下于2003-1-9保藏于美國典型培養物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，ATCC登記號為PTA-4926。
培養物鑒定利用特征生長要求、PCR反應及單克隆抗體反應來鑒定細胞內羅森氏菌主種子及工作種子材料。
純度以單克隆抗體染色、細菌及病毒的常規外源試劑測試來檢查培養物且進行無菌支原體測試，由此來判定細胞內羅森氏菌的主種子及工作種子的純度。
毒性如主種子及直腸(back passage)接種物缺乏產生在易受感染的豬暴露于毒性細胞內羅森氏菌后所觀察到的臨床跡象及大體病變的能力所證明，細胞內羅森氏菌的主種子不具毒性，如下文實例2進一步說明。
傳代培養物的范圍由細胞內羅森氏菌的生產所最終收獲的材料不超出主種子的11次傳代。
培養基組合物EU McCoy主細胞群(MCS)系在具有Ham′s加強的F12(DMEM/F12)及1-10％(體積/體積)新生牛血清(NBS)或胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良的Eagle培養基(細胞生長及保存的培養基)中生長及保存。
將主種子及工作種子儲存于具有1-10％(體積/體積)NBS或FBS及5-15％(體積/體積)甘油的DMEM/F12(主種子及工作種子儲存培養基)中。
將最終的收獲產物儲存于蔗糖凝膠穩定劑(SGS)(最終產物儲存培養基)中。
繁殖(Propagation)
使用上述細胞生長及保存培養基，使細胞內羅森氏菌的主種子及工作種子的培養物系在EU McCoy MCS中繁殖并保存在小于或約-35℃。
組織來源細胞內羅森氏菌的種子及生產生物體在McCoy主細胞群(ATCC登記號CRL 1696，批號F-10422)中生長。該主細胞群系在X代被鑒定為3894MMCSS傳代X。該主細胞群系額外傳代6次且經鑒定為EU McCoy MCS X+0。將EUMcCoy MCS的X+0代儲存于-70℃或更低的溫度。通過第40次傳代在EUMcCoy MCS細胞株傳代培養物中制備生產疫苗。
培養物容器使EU McCoy MCS在具有25-150cm2表面積的組織培養物燒瓶、Costar細胞立方體、具有850cm2至22250cm2的滾筒瓶、多達40L容量的旋轉燒瓶及具有3L至500L容量的生物反應器中繁殖。
細胞內羅森氏菌的種子培養物在250-40000毫升旋轉燒瓶、850cm2至2250cm2滾筒瓶、具有25-150cm2表面積的組織培養燒瓶或具有3L至500L容量的生物反應器中生長。
細胞內羅森氏菌的生產培養物在6L至40L的旋轉燒瓶或具有3L至500L容量的生物反應器中生長。
用于播種或接種的懸浮液的制備方法播種培養物在室溫(25℃±3℃)或37℃±2℃使冷凍或新鮮細胞內羅森氏菌的主或膨脹工作種子解凍。使先前以細胞密度為50,000至500,000個細胞/毫升的McCoy細胞播種的生物反應器、旋轉燒瓶或瓶子感染濃度為1至10％(體積/體積)或MOI為0.08至1.0的細胞內羅森氏菌。在降低的氧濃度下通過覆蓋(overlay)由96％N2、4％H2組成的氣體混合物來保溫受感染的培養物。在37℃±2℃、pH6.7至7.3將該培養物保溫3至10日，且連續攪動(10至100rpm)來維持細胞充分混合以保持懸浮狀態。
生產培養物在室溫(25℃±3℃)或37℃±2℃使冷凍或新鮮細胞內羅森氏菌的主種子或膨脹的工作種子解凍。使先前以細胞密度為50,000至500,000個細胞/毫升的McCoy細胞播種(0至7日)的生物反應器或旋轉燒瓶(容量為3L至500L)感染濃度為1至10％(體積/體積)或MOI為0.08至1.0的細胞內羅森氏菌。在降低的氧濃度下通過覆蓋或噴布(sparge)由96％N2、4％H2組成的氣體混合物來保溫受感染的培養物。在37℃±2℃、pH6.7至7.3將該培養物保溫3至8日，且連續攪動(10至100rpm)來維持細胞充分混合以保持懸浮狀態。
播種及生產培養物的接種技術種子培養物將多達10％(體積/體積)的主種子或工作種子接種(MOI＝0.08至1.0)在0-7日接種到播種了McCoy細胞的生物反應器、旋轉燒瓶或瓶子中的生長培養基中。
生產培養物在0-7日，將多達10％(體積/體積)的生產種子接種(MOI＝0.08至1.0)于播種了McCoy細胞的適當容積的生長培養基中，所述培養基位于3L至500L容量的器皿中，并具有適當的McCoy細胞密度。
微生物的保溫在37℃±2℃在降低的氧氣氛下將所述培養物保溫3至10日，同時攪拌以保持懸浮。可加入額外的培養基及/或McCoy細胞以繼續該生長過程。
在保溫期間肉眼觀察培養物異常生長或污染跡象的證據。
收獲培養物的加工及制備由間接熒光抗體(IFA)染色來檢查培養物的細菌適當生長的跡象。準備收獲的培養物例證了60至100％的細胞感染率。通過觀察至少3個視野來測定感染百分數，各視野含有足以填滿至少80％區域的McCoy細胞。考慮到感染，大約50％的細胞填滿了細菌。
在37℃±2℃保溫6日后，通過在使用特異性單克隆抗體(抗細胞內羅森氏菌的單克隆抗體VPM 53Lot 31599或其等價物；抗小鼠IgG-熒光素偶聯物(FITC)(ICN No.55499))來固定及染色的McCoy細胞上進行樣品滴定來測試收獲培養物的效力。
肉眼檢查培養物的任何明顯污染跡象。收獲發生于接種后3至10日。
收獲技術及說明書將生產培養物的生物反應器、旋轉燒瓶及瓶中的細胞及流體內容物部分或完全地收集于無菌接受器皿中。單獨收獲各生物反應器、旋轉燒瓶及瓶中的生產培養物或通過添加SGS使若干器皿中的內容物匯聚且將其儲存于1℃至7℃或更低的溫度。對所收獲的生產培養物抽樣，以通過TCID50來確定其效力且通過IFA染色對其進行鑒定。
由IFA染色使生產培養物顯示了至少4.9TCID50/毫升且在肉眼觀察時未發現任何污染證據。
疫苗產物的制備濃縮方法可由多種方法來濃縮疫苗產物，例如通過讓培養物與隨后傾析的上清液一起停留、通過膜過濾(0.22μm或更小)、灌注或通過離心過濾來濃縮疫苗產物。
蔗糖凝膠穩定劑(SGS)使凝膠與去離子水或注射用水以大約25％的SGS批量最終總容積混合且使其在高壓釜中在121℃水解120分鐘，由此來制備經水解的凝膠溶液。
隨后使經水解的凝膠溶液(40.0g/L)與去離子水或注射用水以大約75％的SGS批量最終總容積混合。加入氫氧化鉀(AR)(0.548g/L)、L-谷胺酸(1.440g/L)、磷酸二鉀(AR)(2.508g/L)、磷酸二氫鉀(AR)(1.030g/L)及蔗糖(AR)(150.00g/L)且充分混合該溶液。隨后以鹽酸或氫氧化鈉溶液將該穩定劑的pH值調節至6.8至7.0。加入去離子水或注射用水至100％的所要SGS最終容積。充分混合所有穩定劑，且通過使其濾過0.1微米過濾器來對整個溶液進行消毒。
制備一個系列的單元總成的實例如表1所示表1
平均系列容積為50L至500L。
凍干法根據表2中所概括的程序以10劑量循環(填入6.0毫升)或根據表3中所概括的程序以50/100劑量循環(填入10.0毫升)來凍干該疫苗產物。
表2
總時間1352分鐘(22.5小時)*在凍干劑的裝載期間，使架子(shelves)預冷卻至5±2℃。
表3
總時間2370分鐘(39.5小時)*在凍干劑的裝載期間，將架子預冷卻至5±2℃。
實施例2細胞內羅森氏菌疫苗的安全性(safety)目的此項研究的目標為兩方面。此項研究的第一目標為觀察及比較由三種不同細胞內羅森氏菌的低傳代分離株(兩種源自美國及一種源自歐洲)在6周齡的豬中所造成疾病的發病率。第二目標為在6周齡的豬中觀察兩種細胞內羅森氏菌的高傳代分離株(均為歐洲來源)的安全性。
材料及方法測試物質1.US細胞內羅森氏菌低傳代分離株N3432.US細胞內羅森氏菌低傳代分離株N1014943.EU細胞內羅森氏菌低傳代分離株DK 15540 p204.EU系細胞內羅森氏菌高傳代分離株DK 15540 p605.EU系細胞內羅森氏菌高傳代分離株DK 15540 p80(主種子命名為B3903)。
測試物質的配制將低傳代分離株在McCoy細胞懸浮液中分離后連續生長10-20周。將高傳代分離株在McCoy細胞懸浮液中分離后連續生長60-80周。以10,000RPM離心15分鐘收獲所有培養物。將含有羅森氏菌的McCoy細胞培養物離心沉淀物再懸浮于含有10％FBS的蔗糖-磷酸鹽-谷胺醯胺(SPG)溶液中。
測試物質的儲存將所收取的培養物儲存在-70℃，直至進行攻擊那天。將不同收取日但相同分離株的攻擊培養物解凍，且將其并入塑料疫苗瓶中，標記，且儲存于4℃或冰上，直至攻擊時。
測試物質的測定在攻擊時(第0日)，對所有匯聚的攻擊分離株進行TCID50。
平均效價(n＝3)(TCID50/毫升)如表4表4
研究設計該研究系由5個試驗組及一個對照組組成。在研究的第0日，組1(10只豬，6周齡)接受了一劑10毫升或等量胃內(IG)劑量的美國細胞內羅森氏菌低傳代分離株N343。組2(10只豬，6周齡)接受了一劑10毫升或等量IG劑量的美國細胞內羅森氏菌低傳代分離株N101494。組3(10只豬，6周齡)接受了一劑10毫升或等量IG劑量的歐洲細胞內羅森氏菌低傳代分離株DK15540p20。組4(10只豬，6周齡)接受了一劑10毫升或等量IG劑量的歐洲細胞內羅森氏菌高傳代分離株DK1554060周。組5(20只豬，6周齡)接受了一劑10毫升或等量劑量的歐洲細胞內羅森氏菌高傳代分離株DK15540p80。設計作為″嚴格對照組″的組6(10只豬，6周齡)則不接受處理。
從研究開始至測試動物的適當攻擊日，每日進行健康觀察。從攻擊日(第0日)至研究結束日(第21天)，每日以1至4的等級紀錄評分臨床健康狀態(行為、食欲、身體癥狀、被毛及排泄物稠度)。從攻擊日(第0日)至研究結束日(第21天)，計算平均每日重量增加(ADWG)。在第0、7、14及21日評估細胞內羅森氏菌的排泄物脫落。在研究中檢查一只死去動物(來自組1)的大體及微觀病變。如組織學及PCR分析所證實，判定死亡系由與PPE相關的病變造成；該動物未被放回原處。由PCR及回腸及結腸處的細胞內羅森氏菌的組織學評估來評估排泄物中羅森氏菌含量的定性分析。在此研究的第0、7、14及21日收集血清。
結果研究結果的概述表5
一般觀察每日健康觀察直至攻擊。研究期間的攻擊后，每日評估動物的臨床癥狀。觀察包括行為、食欲、身體癥狀、被毛及排泄物稠度。所述動物的臨床癥狀系基于數值點系統來進行評估，該系統反映了疾病的嚴重程度。各參數的評分在1至4范圍內。將具有正常、健康外表的動物評為1分，將表達嚴重臨床跡象的動物評為3分，且將已死亡動物評4分。嚴格對照組、DK15540p60及DK15540p80的平均每日評分為5.0。低傳代材料的平均每日評分為N343(5.23)、N101494(5.15)及DK15540p20(5.01)。使用Kruskal-WallisRank Sum Test對所述結果所進行的統計分析表明處理組與對照組之間沒有差異。
每日平均重量增加(ADWG)由攻擊時(第0日)至研究結束的時(第21日)計算平均每日重量增加。嚴格對照組的平均每日重量增加為0.9磅。低傳代處理組的平均重量增加僅為0.6(N343)、0.8(N101494)及0.86(DK15540p20)磅/日。高傳代處理組揭示了與嚴格對照組相比相同或增加的每日平均重量增加，其分別未接受以0.9磅/日(DK15540p60)及1.05磅/日(DK15540p80)所進行的攻擊。在研究的第21日時，N343處理組中的平均每日重量增加的平均差異與較高傳代處理組(DK15540p60 and p80)及嚴格對照組相比顯著較低。(Pearson Chi-squarep＜0.05)。
血清轉換(Seroconversion)使用IFAT分析法來測試抗羅森氏菌抗體的存在，由此來量測在豬中對于羅森氏菌暴露的血清轉換。在第0日，僅在N343處理組的2/10只豬觀察到了可檢測的血清轉換。在第7日觀察到2/9只豬(N343)及1/10只豬(DK15540p20)對于羅森氏菌抗體呈IFA陽性。在第14日，N343處理組的2/9只豬、DK15540p20及p60的1/10只豬分別呈IFA陽性。在第21日揭示了1/10只豬(N343)、4/10只豬(N101494)及6/10只豬(DK15540p20)呈IFA陽性，而高傳代處理組(DK15540p60及p80)顯示了不可檢測的血清轉換。在研究的第21日，在接受了美國及歐洲低傳代細胞內羅森氏菌分離株的處理組中對于羅森氏菌暴露的血清轉換有所增加。
排泄物脫落排泄物的PCR檢測證明在第14日開始細胞內羅森氏菌的脫落，其中在N343中的4/9、在N101494中的4/10及在DK15540p20中的5/10只低傳代動物在測試時呈陽性。在第14日，高傳代處理組及嚴格對照組呈PCR陰性。在第21日，DK15540p20處理組有一只動物呈PCR陽性，而所有其它處理組及對照組均呈PCR陰性。在研究期間使用PCR在高傳代分離株組(DK15540p60及p80)中沒有觀察到脫落物的證據。PCR陽性動物顯示了在研究的第14日在其排泄物中的羅森氏菌的活性脫落物與低傳代分離株組及嚴格對照組相比更明顯(Pearson Chi-square p＜0.05)。
第21日的PCR回腸及結腸在尸檢的后(第21日)進行來自回腸及結腸的黏膜刮擦物的PCR檢測。對于細胞內羅森氏菌建群(colonization)呈PCR陽性的樣品在N101494(2/10結腸)及DK 15540p20低傳代分離株組中(2/10回腸，及4/10結腸)。在該研究的第21日，所有其它處理及對照組在組織中均呈PCR陰性。結果顯示與所有處理及對照組相比，在DK15540p20中的豬回腸及結腸中，羅森氏菌更明顯建群(*Pearson Chi-square p＜0.05)。
組織學在尸檢后(第21日)收集末端回腸及結腸切片，且將其置于用于組織學分析的緩沖的福爾馬林中。在以蘇木精與曙紅(H&E)及Warthin-Starry銀試劑染色的4/9只豬(N343)、3/10只豬(N101494)、2/10只豬(DK15540p60)及1/20只豬(DK15540p80)組織中觀察到細胞內細菌及腺管增生的存在。通過使用對抗在1/9只豬(N343)、3/10只豬(N101494)及1/10只豬(DK15540p60)中的羅森氏菌的單克隆抗體進行熒光抗體染色來確認病變的發展。FA未檢測到由所有處理及對照組的結腸中的羅森氏菌所造成的病變。FA結果顯示，N101494處理組與所有處理及對照組相比在豬回腸中的明顯病變發展。H&E/銀染色顯示了與所有處理及對照組相比在N343處理組中與PPE相關的明顯病變發展。(Pearson Chi-square p＜0.05)。
總分數在尸檢時(第21日)對回腸與結腸的與PPE相關的病變進行評分。將具有正常外表(無病變發展)的組織評為1分，將病變證實為輕微增厚的組織評為2分，將病變證實為中度增厚的組織評為3分且將病變證實為嚴重增厚的組織評為4分。嚴格對照組所具有的平均臨床評分為1.05、N343(1.0)、N101494(1.2)、DK15540p20(1.2)及DK15540p60及p80(1.0)。使用用于多重對照的ANOVA測試所得的平均總病變分數在對照及處理組之間顯示為無統計學差異。
結論基于所收集的資料，此項研究證實了用具有超過1×107個細菌/劑量的TCID50的低傳代劑量N343、N101494及DK15540所攻擊的豬增加了PPE在所述動物中的發生率。向具有超過1×107的TCID50的相同年齡豬所傳染的高傳代分離株(DK15540p60及p80)經證實具安全性且顯示了建群及與PPE相關的病變發展的減少。此結論系基于在回腸黏膜上的PCR、組織病理學及組織切片的FA染色。
與低傳代分離株相比，在高傳代分離株中由PCR判定排泄物中細胞內羅森氏菌脫落物明顯減少。與給出低傳代分離株的組(尤其N343處理組中的動物)相比，給出高傳代分離株的組及嚴格對照組證實了陽性一致每日重量增加，由此使所計算出的所有處理及對照組的平均每日重量增加支持了此結論。此觀察顯示了給出低傳代材料的動物中的重量增加的減少，其支持了給出高傳代材料的動物與接受無攻擊材料的動物的充分及類似的生長效能。與嚴格對照組相比，高傳代分離株基于臨床評分對于重量增加及總健康未顯示出負面影響。
實施例3效率及最小保護效價目的此項研究的目標使測定在3周齡豬中經口灌給予的包含分離株B3903(經凍干)(DK 15540，傳代80次)(″B3903(經凍干)疫苗″及″B3903疫苗″在本文中可交換使用)的疫苗的最小保護效價及證實對抗用低傳代細胞內羅森氏菌(豬的豬增生性腸病(PPE)的病原體)所攻擊的毒性異源純培養物攻擊的效率。
材料及方法測試物質細胞內羅森氏菌的減毒活培養物，分離株B3903。
B3903(經凍干)疫苗的配制在McCoy細胞懸浮液中分離后使DK 15540分離株連續生長80周。通過以10,000RPM離心15分鐘來收獲所有培養物。使含有羅森氏菌的McCoy細胞培養物沉淀再懸浮于具有10％FBS的蔗糖-磷酸鹽-谷胺醯胺(SPG)溶液中。如上文實施例1所述來進行干燥過程。使經凍干至產物在注射用水(足量的2.0毫升)中溶解。
B3903(經凍干)疫苗的儲存將該疫苗儲存于2℃-8℃直至準備使用。再懸浮的后，將該疫苗儲存于冰上直至用藥。
B3903(經凍干)疫苗的劑量1.劑量(處理組1)在研究的第0日經由直接經口灌藥1×2毫升(6.0logs/劑量)。
2.等劑量(處理組2)在研究的第0日經由直接經口灌藥1×2毫升(4.9logs/劑量)。
3.劑量(處理組3)在研究的第0日經由直接經口灌藥1×2毫升(3.8logs/劑量)。
測試物質安慰劑在研究的第0日將由懸浮于以5％NBS加強的DMEM/F 12生長培養基中的未感染McCoy組織培養細胞組成的安慰劑給予處理組4(攻擊對照組)及5(陰性對照組)。在處理組4中通過直接經口灌藥將此物質施以小豬且給予各測試動物1×2毫升的安慰劑。
測試物質細胞內羅森氏菌N101494毒性攻擊細胞內羅森氏菌N101494獲自來自印度農場的12周齡豬的腸(美國專利第5,714,375號)。
細胞內羅森氏菌N101494毒性攻擊的調配在自經感染的腸組織的最初分離的后，使細胞內羅森氏菌攻擊材料在McCoy細胞懸浮液中連續生長僅僅30代。使被鑒定為的SF 1422及SF 1423以及(1L)SF 1421的活性培養物(2×3L)在McCoy細胞懸浮液中連續生長7日直至15-30％的McCoy細胞感染。在攻擊之日(第21日)時，通過以10,000RPM離心15分鐘及懸浮于350毫升總容積的SPG穩定劑中的細胞沉淀來收獲活性培養物。匯聚所收獲的活性培養物以各個代(分離后傳代24至27次)的低傳代N101494的300毫升冷凍10X至20X濃縮攻擊母液。
細胞內羅森氏菌N101494毒性攻擊的儲存將準備用于攻擊的最終調配物儲存于2℃至8℃或冰上直至接種。
預/后接種及攻擊效價來自TCID50測定的結果證實了在接種及攻擊期間用藥于各測試動物每劑量的活的細胞內羅森氏菌的量。B3903疫苗及攻擊材料(細胞內羅森氏菌N101494)的滴定前及滴定后的平均效價(n＝5)如下表6表6
研究設計在此項研究中將65只3周齡的健康的細胞內羅森氏菌陰性斷奶小豬隨機分成5個處理組且對其分別進行圈養。在第0日，使處理組1(15只豬)通過直接經口灌注接受了2毫升劑量(6.0logs/劑量)的B3903疫苗。使處理組2(15只豬)通過直接經口灌注接受了以4.9logs/劑量滴定的1×2毫升劑量的B3903疫苗。使處理組3(15只豬)通過直接經口灌注接受了以3.8logs/劑量滴定的1×2毫升劑量的B3903疫苗。
使處理組4與5(每組10只豬)通過直接經口灌注接受了1×2毫升劑量的安慰劑。
在研究的第21日(接種后3周)，使處理組1-4中的測試豬由胃管飼法接受了1×10毫升劑量的毒性低傳代純培養物細胞內羅森氏菌異源分離株N101494。
在研究的第42日(攻擊后3周)，對所有處理組(1-5)均施以安樂死且對其進行尸檢以獲得大體及微觀病變來分析PPE。
自研究開始至攻擊之日對各測試動物進行每日健康觀察。自攻擊之日(第21日)至研究結束(第42日)每日對臨床健康狀況(腹瀉、行為及身體癥狀)評分。在接種之日(第0日)、攻擊之日(第21日)及研究結束之日(第42日)記錄重量以計算各處理組的平均每日重量增加。由聚合酶鏈式反應(PCR)通過在研究的第0、7、14、21、28、35及42日測試排泄物拭子來評估細胞內羅森氏菌的排泄物脫落。檢查所有在研究結束(第42日)施以安樂死的動物的大體及微觀病變。在研究的第42日，由PCR(t-PCR)連同回腸、結腸、扁桃體及腸系膜淋巴結中的細胞內羅森氏菌的組織學評估來對組織中細菌含量的定性分析進行評估。在研究的第0、7、14、21、28、35及42日收集血清。使用間接熒光抗體測試(IFAT)來測試血清以在測試動物中檢測抗羅森氏菌的抗體。通過對接種后及攻擊后的平均每日重量增加、臨床評分、血清轉換率(IFAT)、建群(t-PCR)、排泄物脫落(f-PCR)、大體病變及由免疫組織化學(IHC)所得的微觀病變發展對數據進行分析來對處理組進行比較。
結果原始結果的概述表7
*同樣的字母表示無顯著差異(p＜0.05)各處理組的最后測試結果揭示了不考慮組1、2及3(p＜0.05)中的劑量(高、中及低)，未接種的攻擊對照豬(組4)與疫苗接種豬相比在回腸及結腸中出現了顯著的大體及微觀病變發展(p＜0.05)。疫苗低劑量結腸的平均大體病變分數與攻擊對照組相比存在顯著差異。該疫苗低劑量組(組3)是唯一接受疫苗的處理組，其在整個研究中與未接受接種、安慰劑或攻擊的嚴格對照組相比，具有顯著病變發展(大體及微觀)。
臨床分數自攻擊之日(第21日)至尸檢時(第42日)每日記錄各動物的臨床分數。計算臨床分數以獲得平均每日臨床分數，其反映了由于接受細胞內羅森氏菌的毒性攻擊而在處理組中出現的疾病的嚴重程度及持續時間。表8中概述了各處理組的平均臨床分數。
表8
*相同字母表示自攻擊之日至尸檢時平均臨床分數沒有顯著差異(p＜0.05)。
通過回顧與接受平均臨床分數的處理組相關的資料使用單因子變異數分析(1-way ANOVA)來完成臨床分數的統計分析。非接種的攻擊對照組及嚴格對照組與高、中等或低劑量疫苗組相比，沒有顯著差異的證據。
平均每日重量增加自疫苗用藥時(第0日)起，至攻擊用藥(第21日)時，至研究結束(第42日)時計算平均每日重量增加(ADWG)。高劑量疫苗與未接種的攻擊對照處理組之間的重量增加差異的統計分析(lbs.＝磅)揭示了自攻擊用藥時至尸檢時顯著差異的證據(p＜0.05)。表9概述了重量數據。
表9
*相同字母表示自接種疫苗之日至攻擊時及自攻擊之日至尸檢時在處理組之間未出現ADWG的顯著差異(p＜0.05)。
血清轉換(IFAT)每周自各處理組的所有測試動物中收集血清樣品且在研究的第0、7、14、21、28、35及42日測試抗羅森氏菌IgG抗體的存在。陽性及陰性IFAT對照組樣品在此項研究所進行的所有測定中均為100％準確。在第0日至第21日(接種疫苗后3周)，各處理組的所有測試動物均呈IFA陰性。在研究的第28日(攻擊后1周)，疫苗高劑量處理組的1/15(6.7％)只測試動物呈IFA陽性而所有其它測試動物均呈IFA陰性。在研究的第35日(攻擊后2周)，疫苗高劑量及中等劑量處理組的4/15(26.7％)只豬與未接種的攻擊對照處理組的1/10(10％)只豬均對羅森氏菌抗體呈IFA陽性。在第35日，低劑量疫苗與嚴格對照處理組均呈IFA陰性。在研究的第42日(攻擊后3周)，攻擊對照組的8/10(80％)只豬、中等劑量疫苗組的6/15(40％)只豬、低劑量疫苗組的5/15(33.3％)只豬及高劑量疫苗組的3/15(20％)只豬均呈IFA陽性。在研究結束時(第42日)，嚴格對照處理組呈IFA陰性。
使用卡方(Chi-square)統計來分析血清轉換資料。關于自嚴格對照處理組所得到的結果，由于研究過程中在各測試動物中所發現的100％陰性反應而不計算卡方統計。在接受疫苗或安慰劑的處理組中，使用卡方統計與精確p值(Monte-Carlo)的估計來比較IFAT結果。在研究的第42日(攻擊后3周)，由接受了毒性純培養攻擊物的攻擊組所得到的陽性IFAT的結果顯著高于由接受了高劑量疫苗及低劑量疫苗的組所得到的結果。
細胞內羅森氏菌的排泄物脫落(PCR)每周由各處理組的所有動物來收集排泄物拭子且在研究的第0、7、14、21、28、35及42日由PCR來測試細胞內羅森氏菌的存在。陽性及陰性DNA萃取及PCR反應對照組對于此項研究中所進行的各分析法均為100％準確。自第0日(接種疫苗)至第21日(攻擊)，各處理組中所有測試動物的排泄物對于細胞內羅森氏菌均呈PCR陰性。在研究期間，嚴格對照組中的豬對于其排泄物中的細胞內羅森氏菌保持PCR陰性。在攻擊接種后，細胞內羅森氏菌的排泄物脫落(排泄物PCR陽性)每周在各種處理組中均較明顯。表10概述了所述結果。
表10
*相同字母表示接受了攻擊的處理組無顯著差異(p＜0.05)。
使用卡方統計與精確p值(Monte Carlo)的估計所進行的統計分析比較了各疫苗處理組與未接種的攻擊對照組中的陽性反應。因為在研究過程中每只豬對于細胞內羅森氏菌均呈100％排泄物PCR陰性，所以自組比較中取出來自嚴格對照組的結果。在第28日(攻擊后1周)，接受高劑量疫苗的豬與未接種的攻擊豬(p＝0.017)相比具有顯著較少的細胞內羅森氏菌脫落物。在第35日(攻擊后2周)，接受高劑量(p＝0.0024)及中等劑量(p＝0.041)疫苗的豬與未接種的攻擊豬相比，前兩者排泄物中具有顯著較少的細胞內羅森氏菌脫落物。在第42日(研究結束)，同樣地，接受高劑量及中等劑量(p＝0.017)疫苗的豬與未接種的攻擊豬相比，前兩者的排泄物中具有顯著較少的細胞內羅森氏菌脫落物。在攻擊后的任一日，低劑量組中的豬與攻擊對照組相比未出現PCR陽性的顯著減少。
細胞內羅森氏菌組織建群(PCR)在尸檢后(研究第42日)進行末端回腸、結腸、扁桃體及腸系膜淋巴結的組織切片的聚合酶鏈式反應檢測。在高劑量疫苗組中，1/15(6.7％)只豬對扁桃體中的細胞內羅森氏菌建群呈PCR陽性，而所有其它處理組均呈PCR陰性。腸系膜淋巴結組織的回腸炎PCR檢測揭示了在未接種的攻擊對照組中3/10(30％)只豬對于細胞內羅森氏菌呈陽性，而所有其它處理組均呈PCR陰性。末端回腸的黏膜刮擦物的回腸炎PCR檢測揭示了在攻擊對照組中的4/10(40％)只豬、在低劑量疫苗組中的4/15(26.7％)只豬、在中等劑量疫苗組中的2/15(13.3％)只豬及在高劑量疫苗組中的1/15(6.7％)只豬對細胞內羅森氏菌建群呈PCR陽性。結腸的回腸炎PCR檢測揭示了在攻擊對照組中的3/10(30％)只豬、在低劑量疫苗組中的5/15(33.3％)只豬、在中等劑量疫苗組中的1/15(6.7％)只豬及在高劑量疫苗組中的2/15(13.3％)只豬對細胞內羅森氏菌建群呈PCR陽性。在嚴格對照組的組織中未發現細胞內羅森氏菌建群的證據。
使用卡方統計與精確p值的蒙地卡羅(Monte Carlo)近似值來比較處理組中回腸炎PCR陽性結果的統計分析。腸系膜淋巴結PCR結果表明了在未接種的攻擊對照組與接受疫苗處理的所有處理組中存在顯著差異的證據(p＝0.054)。在研究的第42日，在處理組的回腸、結腸或扁桃體的細胞內羅森氏菌建群中未出現統計顯著性的證據。
組織學(IHC/H&E)為了組織學分析而在尸檢后(第42日)收集扁桃體、腸系膜淋巴結、末端回腸及結腸的2至4cm長的切片且將其置于10％緩沖福爾馬林中。在尸檢時，所有處理組的扁桃體切片的IHC染色未檢測出細胞內羅森氏菌。在尸檢時，通過所有組織樣品的IHC發現，嚴格對照組對細胞內羅森氏菌呈陰性。在未接種的攻擊對照組中的9/10(90％)只豬、低劑量疫苗組中的6/15(40％)只豬、中等劑量疫苗組中的3/15(20％)只豬及高劑量疫苗組中的1/15(6.7％)只豬的回腸中分別發現細胞內羅森氏菌及與PPE相關的微觀病變的存在。在攻擊對照組的8/10(80％)只豬、低劑量疫苗組的3/15(20％)只豬及高劑量疫苗組的1/15(6.7％)只豬的結腸中均出現明顯微觀病變。接受中等劑量的疫苗組結腸中的細胞內羅森氏菌呈IHC陰性。腸系膜淋巴結的染色切片僅在攻擊組中發現具有細胞內羅森氏菌的1/10(10％)只豬。在處理組中，回腸及結腸切片中的陽性IHC結果與由H&E操作法所證實的標記的隱窩增生的存在較好相關性。
使用單因子變異數分析及Kruskal-Wallis Rank Sum檢測來對定量IHC數據進行統計分析，然后對每個疫苗劑量組，對攻擊組及嚴格對照組與各疫苗劑量組進行了p值的具體對比(specific contrast)。在研究第42日，由于攻擊對照組(與疫苗接種的豬相比，不考慮劑量)的回腸及結腸中的細胞內羅森氏菌(p＜0.001)，統計分析揭示了顯著病變發展的證據。與嚴格對照處理組相比，在接受高或中等劑量疫苗的接種動物中回腸及結腸的平均IHC病變分數未出現明顯的統計學顯著性(p＞0.05)。與嚴格對照組相比，接受低劑量疫苗的豬由于回腸中的細胞內羅森氏菌而具有顯著較高的平均微觀病變分數(p＜0.05)。
大體分數在尸檢時(第42日)對各測試動物的回腸及結腸中與PPE相關的大體病變進行評分。來自嚴格對照組中的測試豬的組織正常，不含有病變，且接受了1.1(回腸)及1.0(結腸)的平均病變分數。在處理組中，在未接種的攻擊對照組中，測試動物的組織接受了回腸(3.6)及結腸(2.0)的最高平均大體病變分數。低劑量疫苗組中的測試豬接受了2.5(回腸)及1.5(結腸)的平均大體病變分數。中等劑量組中的測試豬接受了1.5(回腸)及1.0(結腸)的平均大體病變分數。高劑量疫苗組中的組織接受了1.5(回腸)及1.2(結腸)的平均大體病變分數。
使用單因子變異數分析來完成處理組中平均大體病變分數的統計分析。平均大體病變分數表明了未接種的攻擊對照組與中等及高劑量疫苗組之間分別出現顯著差異的證據(p＜0.001)。與低劑量疫苗組相比，在攻擊對照組的平均大體回腸分數中觀察到顯著差異的證據(p＜0.001)。分別與中等及高劑量組相比，結腸的平均大體病變分數在攻擊對照組中顯著較高(p＜0.05)。此外，與嚴格對照組相比，在低劑量疫苗組的回腸中觀察到顯著大體病變發展(p＜0.001)。與嚴格對照處理組相比，在中等與高劑量疫苗組中，沒有平均大體病變分數(回腸與結腸)出現統計顯著性的證據。
結論此項研究證實在經口給予2毫升劑量的的B3903(經凍干)疫苗(每劑量含有最少的4.9logs活的細胞內羅森氏菌)時，完成保護3周齡豬免受PPE感染。在攻擊前3周時接受了6.0logs/劑量的高劑量疫苗處理組中明顯出現了類似(或稍好)的保護作用。與接受高或中等劑量的試驗疫苗的測試動物相比，低劑量疫苗組(3.8logs/劑量)不表明足夠的保護免受毒性純培養物異源的攻擊。在低劑量疫苗與非接種的攻擊對照組中，回腸與結腸的微觀病變的嚴重程度(p＜0.001)及回腸的平均大體病變分數(p＜0.01)的統計學差異是明顯的。然而，與未接受疫苗或攻擊的嚴格對照組相比，在此組的回腸(微觀病變)及結腸(大體病變)中觀察到顯著的PPE病變。
總而言之，來自此項研究的資料證實(1)單獨經口將B3903(經凍干)疫苗給予3周齡豬的最小保護效價為4.9logs/劑量；(2)B3903(經凍干)疫苗對抗毒性低傳代培養物純細胞內羅森氏菌、異源分離株N101494有效；及(3)與未接種的豬相比，B3903(經凍干)疫苗有助于減少疫苗接種豬中的細胞內羅森氏菌的大體及微觀病變、組織建群及排泄物脫落。
權利要求
1.細胞內羅森氏菌的毒性分離株，其中該毒性分離株為細胞內羅森氏菌保藏分離株ATCC No.PTA-4927，或具有保藏分離株ATCC No.PTA-4927所有確認特征的細胞內羅森氏菌分離株。
2.細胞內羅森氏菌的無毒分離株，其中該無毒分離株為細胞內羅森氏菌保藏分離株ATCC No.PTA-4926，或具有保藏分離株ATCC No.PTA-4926的所有確認特征的細胞內羅森氏菌分離株。
3.用于免疫動物的疫苗，其包含醫藥有效量的經滅活的細胞內羅森氏菌毒性分離株及可藥用載體，其中該毒性分離株是權利要求1或2的毒性分離株。
4.權利要求3的疫苗，其中該醫藥上有效量的細胞內羅森氏菌無毒分離株每劑量約103TCID50至約106TCID50。
5.用于免疫動物的疫苗，其包含權利要求2的細胞內羅森氏菌無毒分離株及選自至少一種下列病原菌的抗原物質沙門氏菌屬(Salmonella spp)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix spp)、嗜血桿菌屬(Haemophilus spp)、支原體屬(Mycoplasma spp)、鉤端螺旋體屬(Leptospira spp)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp)、鏈球菌屬(Streptococcus spp)、螺旋體屬(Brachyspira spp)、環狀病毒(circovirus)、豬生殖與呼吸癥候群(porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)病毒、豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)、傳染性胃腸炎(transmissible gastro-enteritis，TGE)病毒、細小病毒(parvovirus)及大腸桿菌(Escherichia coli)；且包含可藥用載體。
6.用于免疫動物的疫苗，其包含權利要求2的細胞內羅森氏菌無毒分離株及至少一種選自下列各病原菌的抗原物質豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、丹毒絲菌屬、傳染性胃腸炎(TGE)病毒、大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌屬或螺旋體屬；且包含可藥用載體。
7.用于免疫動物的疫苗，其包含權利要求2的細胞內羅森氏菌無毒分離株及選自豬霍亂沙門氏菌和/或丹毒絲菌屬的抗原物質；及可藥用載體。
8.用于免疫動物的疫苗，其包含權利要求2的細胞內羅森氏菌無毒分離株及至少一種選自下列病原菌的抗原物質梭狀芽孢桿菌屬、馬流感病毒(equine influenza virus，EIV)、馬皰疹病毒(equine herpes virus，EHV)、α病毒及西尼羅河病毒(West Nile virus)；且包含可藥用載體。
9.刺激動物免疫系統以便對病原性細胞內羅森氏菌的免疫抗原產生反應的方法，包括給予所述動物含有權利要求2的細胞內羅森氏菌的無毒分離株的免疫原組合物。
10.免疫動物以對抗豬增生性腸病的方法，包括給予醫藥學上可接受量的權利要求2的細胞內羅森氏菌的無毒分離株，其中該醫藥學上有效量的細胞內羅森氏菌無毒分離株為每劑量約103TCID50至約106TCID50。
11.制備疫苗的方法，其用于誘導動物對細胞內羅森氏菌的免疫反應，該方法包含步驟(a)在小于約10％的氧濃度下，將權利要求1或2的細胞內羅森氏菌分離株在懸浮狀態的培養細胞中保溫以培養所述細菌；及(b)將所述培養的細菌與可藥用載體混合。
12.權利要求11的方法，其進一步包含殺死所述培養的細菌的步驟，以制備含有經滅活的細胞內羅森氏菌的疫苗。
13.權利要求11的方法，其進一步包含培養所述細菌足以產生減毒分離株的時間的步驟。
14.培養細胞內羅森氏菌的方法，其包含(a)以包含權利要求1的細胞內羅森氏菌毒性分離株的接種物感染培養細胞，(b)在小于約10％的氧濃度下保溫所述感染細胞，而通過攪拌所述細胞足以增加所述細胞內羅森氏菌的產量的時間，使所述感染的細胞保持懸浮狀態，及(c)收取至少一部分的所述細胞內羅森氏菌。
15.權利要求14的方法，其中該氧濃度為約0％至約8％。
16.權利要求15的方法，其中該氧濃度為約0％至約3％。
17.權利要求14的方法，其中該保溫在約6％至約10％的二氧化碳下進行。
18.權利要求14的方法，其中所述培養的細胞選自由HEp-2、McCoy及IEC-18細胞所組成的組。
19.權利要求18的方法，其中所述IEC-18細胞系在微載劑上培養。
20.權利要求14的方法，其中所述感染的細胞根據步驟(c)保溫約2至約10日的期間。
21.權利要求14的方法，其進一步包含培養所述細菌一段足以產生減毒分離株的時間的步驟(d)。
22.權利要求21的方法，其中所述細菌根據步驟(d)培養約150日至約250日的期間。
23.權利要求22的方法，其進一步包含凍干該減毒分離株的步驟(e)。
24.權利要求23的方法，其中該凍干步驟包含主要干燥步驟及另一干燥步驟。
25.凍干的減毒分離株，其以權利要求23的方法制得。
26.活體外的方法，其用于診斷豬增生性腸病，其包含在非人類動物受驗者中實施分析法以檢測抗細胞內羅森氏菌抗體，所述方法包含(a)將該受驗者的樣品與權利要求1或2的細胞內羅森氏菌分離株接觸，以形成抗原-抗體復合物；及(b)檢測該復合物的形成，其中該復合物的存在與豬增生性腸病的診斷成正相關。
27.權利要求26的方法，其中該分析法包含選自放射性免疫分析法、酶聯免疫吸附分析法、熒光免疫分析法及免疫電泳分析法所組成的組。
28.一種方法，其用于在非人類動物中產生抗細胞內羅森氏菌抗血清，其包含(a)給予非人類動物有效引起免疫反應的量的權利要求1或2的細胞內羅森氏菌分離株；及(b)收集含有抗所述細胞內羅森氏菌抗體的抗血清或血漿。
全文摘要
本發明涉及細胞內羅森氏菌疫苗及用于保護免受細胞內羅森氏菌感染及診斷細胞內羅森氏菌感染的方法。在某種程度上，本發明的產物及過程可作為培養大規模供應的細胞內羅森氏菌的改良方法的結果獲得，其包括歐洲來源的細胞內羅森氏菌的新的分離株及制備含有作為疫苗產物的減毒歐洲分離株的凍干產物的方法。
文檔編號C12N1/21GK1829529SQ200480021627
公開日2006年9月6日 申請日期2004年7月15日 優先權日2003年7月25日
發明者邁克爾·B·魯夫, 杰里米·J·克羅爾, 杰弗里·P·尼特爾 申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司