帶有一個可移動的檢測模件的熒光檢測系統和方法

專利名稱：帶有一個可移動的檢測模件的熒光檢測系統和方法
技術領域：
一般來說，本發明涉及熒光檢測系統，更具體地說，涉及這樣一種熒光檢測系統，它具有一個用來與熱循環器一起使用的可移動的激發/檢測模件(module)。
背景技術：
在本技術領域中已經知道熱循環器。在研究領域，醫學領域和工業領域中，在產生和檢測各種感興趣的分子例如核酸序列的多種過程中采用這樣的裝置。可以與傳統的熱循環器一起進行的過程包括但不限于采用比如聚合酶鏈反應(PCR)的步驟的核酸的放大。采用這樣的放大過程增加在核酸樣品中存在的靶(或目標)序列的數量。
也已經知道用來檢測在由熱循環器處理的樣品中靶分子的存在和/或濃度的多種技術。例如，可以使用熒光標記。熒光標記(或者熒光探針)一般是一種物質，當通過一種適當的電磁信號或輻射激勵它時，它吸收該輻射，并且發出一種信號(通常是輻射，這種輻射例如通過波長可以與激勵的輻射區分開)，當激勵的輻射繼續時，持續地發出該信號，即該物質發出熒光。一般將某些類型的熒光探針設計成僅只在靶分子存在(例如一種特別的核酸序列)時能起作用，使得來自一個樣品的熒光響應表示靶分子的存在。其它類型的熒光探針與在反應中存在的雙鏈(double-stranded)DNA的數量成比例地增加它們的熒光。典型地在放大反應設計成僅只在靶分子上進行的情況下使用這些類型的探針。
熒光檢測法包括將包含熒光標記或探針的樣品暴露給激勵的輻射(也稱為激發輻射)，比如適當波長的光源，從而激發該探針，并且產生熒光。采用一種適當的檢測器比如光電二極管、光電倍增器、電荷耦合裝置(CCD)，或者類似裝置檢測所發出的輻射。
在本技術領域中已經知道與帶熒光標記的樣品一起使用的熒光計。一種類型的熒光計是光學閱讀器，比如Andrews等人在美國專利No.6043880中描述的光學閱讀器。把一個包含樣品陣列的樣品板插入該光學閱讀器中，光學閱讀器將樣品暴露給激發光，并且檢測所發出的輻射。需要把樣品板由熱循環器移開限制了這種光學閱讀器的使用，使得它很難監測放大過程的進展。
一種改進是把光學閱讀器與熱循環器集成在一起，從而可以分析樣品板，而不用把它由熱循環器移開或者中斷PCR過程。在美國專利No.5928907，美國專利No.6015674，美國專利No.6043880，美國專利No.6144448，美國專利No.6337435和美國專利No.6369863中描述了這樣的組合裝置的示例。這樣的組合裝置在多種應用中是有用的，如例如在美國專利No.5210015，美國專利No.5994056，美國專利No.6140054，和美國專利No.6174670中描述的那樣。
現有的熒光計有多種缺陷。例如，在某些已有的設計中，對于在陣列中的不同樣品凹坑設置了不同的光源和檢測器。光源和/或檢測器之間的變化導致所檢測的熒光響應由一個凹坑到下一個凹坑會有變化。替代地，可以將光源和/或檢測器布置成與凹坑中的一個以上的凹坑處于光學連通狀態，到每個凹坑和/或離開每個凹坑有不同的光學路徑。由于有不同的光學路徑，所檢測的熒光響應由一個樣品凹坑到下一個樣品凹坑會有變化。為了補償這樣的變化，必須單獨地對每個樣品凹坑的響應進行校正。隨著在陣列中樣品凹坑的數目增加，這成為一件越來越耗費時間的任務，并且校正中的誤差會在后來的測量中引入顯著的誤差。
此外，一般將已有的熒光計設計成光源和檢測器是該儀器的固定部分。這限制了使熒光計適應于不同應用的實驗能力。例如，檢測不同的熒光標記通常要求使用不同的光源和/或檢測器。許多已有的熒光計使得實驗人員很難重新布置光源或檢測器，因此限制了可以使用的熒光標記的種類。
也很難同時進行在一個樣品中(或者在不同樣品中)存在的多個不同的熒光標記的測量。如上所述，為了使在一次化驗中獲得的數據達到最大化，實驗人員常常采用多個產生熒光標記的試劑，這些試劑有不同的激發和/或發射波長。適宜于將每種形成標記的試劑設定到一個不同的靶序列上，從而原則上可以在同一樣品中檢測多個靶序列。然而，現有的熒光計不能容易地進行這樣的多標記的實驗。許多熒光計設計成用于激發和發射波長的單一組合。其它的熒光計設有多個光源和檢測器，從而可以檢測多個標記；然而，這些構形常常一次只能探查一個標記，這是因為一個標記的激發波長可能與另一個標記的發射波長重疊；進入檢測器的激發光可能產生不正確的結果。通常不能平行地檢測多個標記，從而減慢了數據收集過程。
因此，希望有一種可以克服這些缺點的用于熱循環器的改進的熒光計。

發明內容
本發明的實施例提供了在熱循環設備中的熒光檢測。按照本發明的一個方面，一種用來分析位于熱循環器中的多個凹坑中的樣品的熒光檢測設備包括安裝到該熱循環器上的支承結構，以及可移動地安裝在該支承結構上的檢測模件。該檢測模件包括激發光發生器和發射光檢測器，它們兩個都設置在檢測模件內。當把支承結構安裝到熱循環器上、并且把檢測模件安裝在支承結構上時，檢測模件可移動，從而使它的位置與多個凹坑中不同的凹坑處于光學連通狀態。
按照本發明的另一方面，檢測模件可以包括兩個或多個激發光發生器和兩個或多個發射光檢測器，它們布置成形成兩個或多個激發/檢測對。在一個實施例中，激發/檢測對布置成可以同時使得每個激發/檢測對的位置與多個凹坑中不同的凹坑處于光學接觸狀態。在一個替代的實施例中，激發/檢測對布置成使得當把激發/檢測對中的第一對的位置與多個凹坑中任何一個凹坑處于光學接觸狀態時，激發/檢測對中任何其它對的位置不與多個凹坑中任何一個凹坑處于光學接觸狀態。在某些實施例中，檢測模件可拆卸地安裝在支承結構上，從而使得使用者可以用不同的檢測模件替換該檢測模件。
按照本發明的又一方面，提供了一種用來檢測靶分子在溶液中存在的方法。制備多個樣品，每個樣品中包含適宜于結合到靶分子上的熒光探針。把每個樣品放置在熱循環設備的多個樣品凹坑中的相應的一個凹坑中，該熱循環設備有可移動地安裝在其中的檢測模件，該檢測模件包括激發/檢測通道，該激發/檢測通道包括設置在檢測模件內部的激發光發生器，以及設置在檢測模件內部的發射光檢測器。采用該熱循環設備激發反應，并且，對多個樣品凹坑進行掃描，通過移動檢測模件、并且啟動激發/檢測通道檢測熒光響應。在進行掃描的過程中，使得檢測模件移動，從而順序地使激發/檢測通道的位置與多個凹坑中每個凹坑處于光學連通狀態。在檢測模件包括多個激發/檢測對或通道的情況下，可以平行地或者順序地激活這些通道。
下面的詳細描述與附圖一起將使得對本發明的本質和優點有更好的理解。


圖1是按照本發明的一個實施例的熱循環設備的透視圖；圖2是用于按照本發明的一個實施例的熱循環設備的蓋組件的部件分解圖；圖3是用于按照本發明的一個實施例的熱循環設備的熒光計組件的底視圖；圖4是按照本發明的一個實施例的檢測模件的頂視圖；圖5A-B是按照本發明的另一個實施例的檢測模件的底視圖；圖6是用于按照本發明的一個實施例的檢測模件的激發/檢測對的示意圖；圖7是一個框圖，示出了用于按照本發明的一個實施例的熱循環設備的蓋組件的電路連接；以及圖8是使用有按照本發明的一個實施例的熒光檢測系統的熱循環器的過程的流程圖。
具體實施例方式
現將參考著附圖描述本發明的一個示例性設備的實施例，在這些圖中相同的附圖標記表示相對應的部件。也將描述使用該設備的方法。應當理解，在這里示出和描述的實施例是說明性的，并且對本發明不構成限制。
I.示例性設備圖1是按照本發明的一個實施例的熱循環設備100的透視圖。設備100包括一個底座單元110和一個蓋組件112。底座單元110可以是傳統的設計，通過傳統的電子部件(未示出)比如可編程的處理器，時鐘以及類似件提供對于熱循環過程的供電和控制功能。底座單元110也提供一個用戶接口116，它可以包括一個鍵盤118和一個LCD顯示屏120，使得使用者可以控制和監視熱循環器的運行。通過一個電源電纜121把底座單元110連接到外部電源(例如標準的120伏交流電源)上。底座單元110的某些示例包括由本申請的受讓人MJ Research，Inc.公司銷售的DNA Engine，DyadTM，TetradTM熱循環器。
蓋組件112包括設置在蓋122內的一個樣品單元和一個熒光檢測設備；下面將描述這些部件。蓋122有一個把手124，以幫助把它放在底座單元110上以及由底座單元110移開，而且蓋122還有通氣孔126。蓋122對在蓋組件112內部的部件提供光學隔離和熱隔絕。
圖2是蓋組件112內部的部件分解圖。示出了一個樣品單元202，一個蓋加熱器204，以及一個熒光計組件206。樣品單元202包括布置在規則的陣列中的多個樣品凹坑210(例如8×12格點)。在一個實施例中，每個樣品凹坑210保持一個可移去的反應容器(未示出)，比如一個管，它包含要被檢驗的核酸樣品，連同適當的PCR反應物(緩沖劑，引發劑(primers)和探針，核苷酸，以及類似物)，包括適宜于設定到靶核酸序列上或者以其它方式對靶核酸序列的存在作出響應的至少一種熒光標記或探針。反應容器最好設有透明的樣品帽蓋(未示出)，這些帽蓋牢固地配裝在容器的頂部上，以防止在處理過程中樣品的交叉污染或者溢出。也可以以其它方式密封反應容器，包括使用薄膜比如MicrosealB(由MJ Research，Inc.公司制造)，臘產品比如Chill-outTM(由MJ Research，Inc.公司制造)，或者礦物油。在一種替代的構形中，使用一個可移去的樣品盤(未示出)，該樣品盤在與樣品凹坑210相對應的位置保持一個或多個不同的樣品。也可以以上述的方式中任何一種方式把樣品盤密封。
樣品單元202也包括加熱件(例如Peltier效應熱電裝置)，熱交換件，用于把加熱件連接到底座單元110上的電連接件，以及機械連接件。這些部件(未示出)可以是傳統的設計。樣品單元202也通過多股線的電纜212為蓋加熱器204和熒光組件206提供電連接，該電纜可拆卸地連接到連接器214上。
蓋加熱器204具有從中穿過的孔220，與樣品凹坑210的尺寸和間隔相匹配，還有以電子學方式控制的加熱件(未示出)。蓋加熱器204連接到蓋122上。連接機構(未示出)最好是可移動的(例如可以通過一個鉸鏈把蓋加熱器204裝接到蓋122上)，為的是當把蓋122由樣品單元202移去時，可以接近熒光計組件206。當蓋122處于樣品單元202上的位置時，支承件224將蓋加熱器204保持在其位置。最好支承件224的下部226設計成朝向樣品單元202對蓋加熱器204施加壓力，從而減小在設備100運行過程中樣品蒸發的可能性。這種加壓也使得可以使用有不同尺寸的反應容器。使用蓋加熱器204控制反應容器的樣品凹坑210的樣品帽蓋(或其它密封件)的溫度，為的是防止在熱循環器的運行過程中在帽蓋上形成凝結。
蓋加熱器204最好包括定位在孔220中的選定的孔之間或者設置在離開孔的其它位置比如靠近蓋加熱器204的周邊的位置的一個或多個校準件222。校準件222提供已知的熒光響應，并且可以使用它們校準在熒光計組件206中的熒光檢測器。可以例如將校準件222做成在玻璃或塑料基底上一層熒光涂層，或者它們可以包括一種帶有在其中浸漬了染料的塑料，熒光玻璃，或者熒光塑料比如聚醚酰亞胺(PEI)構成。可以將中密度或者其它類型的濾光器放置在熒光材料上，為的是避免使熒光檢測器飽和。一般說來，可以使用任何材料，只要它的熒光特征在光照射(光漂白)和加熱的時間內足夠穩定就可以。在實用的范圍內，最好使溫度對熒光響應的影響減到最小。在設置多個校準件222的情況下，對于校準件中的不同件可以使用不同的材料。在一個替代的實施例中，可以省去蓋加熱器204，并且可以將校準件222設置在樣品單元202的表面上。
樣品單元202和蓋加熱器204可以是傳統的設計。適用的設計的示例包括由本申請的受讓人MJ Research，Inc.公司銷售的多種AlphaTM模件的樣品單元和蓋加熱器部件。
熒光計組件206包括固定地安裝在蓋122內部的一個支承框架或平臺230。將一個往復移動件232可移動地安裝在支承框架230的下側面上，該往復移動件保持一個檢測模件234。往復移動件232可以在兩個方向上移動，從而將檢測模件234定位，通過蓋加熱器204中對應的孔220與樣品單元202中的樣品凹坑210中的不同的凹坑在光學上連通。最好支承框架230和支承件224的尺寸確定成當把蓋122放置在底座單元110中并且把蓋關閉起來時，檢測模件234保持在緊靠著蓋加熱器204的位置；本領域技術人員將理解，這樣的布置減小了樣品凹坑與檢測模件之間的光損失。
圖3是熒光計組件206的底視圖，示出了往復移動件232和檢測模件234的可移動的安裝。在這個實施例中，采用由步進馬達驅動的平移臺使往復移動件232運動到所要求的位置，其中檢測模件234可拆卸地連接到此往復移動件上。具體地說，支承平臺230有一個x軸線的步進馬達302和一個安裝到其上的絲杠304。步進馬達302運行使絲杠304轉動，從而使平移臺306沿著x方向運動(由箭頭表示)。最好設置限位開關308，以將平移臺306的運動限制在一個適當的范圍以內，此運動范圍足夠大，容許檢測模件234的位置可與凹坑中的任何一個凹坑處于光學接觸狀態，同時防止平移臺306與其它的系統部件比如步進馬達302接觸。
平移臺306有一個y軸線的步進馬達316和一個安裝到其上的絲杠318。步進馬達316使絲杠318轉動，從而使平移臺306沿著y方向運動(由箭頭表示)。最好設置限位開關320，將平移臺306的運動限制在一個適當的范圍以內，此運動范圍足夠大，容許檢測模件234的位置可與凹坑中的任何一個凹坑處于光學接觸狀態，同時防止平移臺306與其它的系統部件比如步進馬達316接觸。
步進馬達302、316，絲杠304、318，以及限位開關308、320可以是大致傳統的設計。將會認識到，可以用其它的可移動安裝件替代。例如，替代直接把馬達連接到絲杠上，可以使用間接的連接，比如鏈驅動或者皮帶驅動。也可以使用鏈驅動，皮帶驅動，或者其它的驅動機構而不用絲杠，例如通過把平移臺裝接到鏈，皮帶，或者其它的驅動機構上使檢測模件定位。也可以使用其它類型的馬達比如伺服馬達或線性馬達。對于不同程度的自由度可以使用不同的驅動機構。
往復移動件232通過連接器330，331固定住檢測模件234。連接器330，331的設計可以變化，這些連接器構形成把檢測模件234支承在往復移動件232的下側面上，并且使檢測模件234在往復移動件232的下側面上對準。最好使得連接器適宜于容易地插入檢測模件234，并且將檢測模件234移開，從而可以容易地更換檢測模件。在一個實施例中，連接器330為一個圓柱部件(未示出)提供安裝，圓柱部件可樞轉地保持住檢測模件234的邊緣，而連接器331包括安裝在往復移動件232上的球柱塞，這些球柱塞可插入到檢測模件234上的對應的插座中。也可以在往復移動件232與檢測模件234之間設置電連接件(未示出)，如下面將描述的那樣。
圖4是檢測模件234的頂視圖。檢測模件234包括連接到往復移動件232的下側面上的對應的連接器330上的配裝件420，從而把檢測模件234固定在其位置，使得它與往復移動件234一起作為一個單元移動。檢測模件234也包括一個連接到往復移動件232的下側面上的對應的電連接器上的電連接器424，從而可以將控制信號和讀出信號提供給檢測模件234，并且由檢測模件234獲得控制信號和讀出信號。
圖5A是檢測模件234的一個實施例的底視圖，示出了四個開孔502，504，506，508，這些開孔用于設置在檢測模件234的本體內部的四個獨立控制的熒光激發/檢測通道(也被稱為“激發/檢測對”)。下面將描述激發/檢測通道的示例。開孔502，504，506，508的間隔與樣品凹坑210的間隔相對應。因此，當開孔502位于與樣品凹坑210中的一個凹坑處于光學連通狀態時，開孔504，506和508中的每個開孔與樣品凹坑210中的不同的一個凹坑處于光學連通狀態。開孔502，504，506，508可簡單地是穿過檢測模件234的底表面的孔，或者它們可以由對于它們相應的通道的激發光和檢測光的波長高度透明的任何材料構成。
圖5B是按照本發明的另一個實施例的檢測模件234’的底視圖。在這一實施例中，設置了四個開孔512，514，516，518，但是，它們以交錯的方式布置，從而一次僅只有一個開孔可以與樣品凹坑中的任何一個處于光學連通狀態。這種構形對于減少激發/檢測對之間的交叉影響是有用的。
圖6是一個示意圖，示出了一種按照本發明的一個實施例用于一個激發/檢測通道(或激發/檢測對)600的光學部件的構形。檢測模件234可包括一對或者多對激發/檢測對600，每一對提供一個獨立的熒光檢測通道。激發/檢測對600設置在不透明的壁602的內部，這些不透明的壁提供與可能包括在檢測模件234中的其它激發/檢測對的光學隔絕，也提供與外部光源的光學隔絕。一個激發光路604包括發光二極管(LED)或者其它的光源606，濾光器608，透鏡610，以及分光器612。檢測光路620包括分光器612，濾光器624，透鏡626，以及光二極管或其它的光檢測器628。最好將分光器612選擇成對于激發光的波長高度透明，而對檢測(熒光響應)波長的光高度反射。
激發光路604設置成把所希望波長的激發光引導進入保持在樣品塊體202的樣品凹坑210中的一個反應容器616中。所希望的波長取決于在反應容器616中包括的具體的形成熒光標記的試劑，并且通過選擇適當的LED 606和濾光器608控制該波長。由不透明的壁602中的開孔502和穿過蓋加熱器204的孔220提供激發/檢測對600與反應容器616之間的光學連通，如上面描述過的那樣。為了傳輸到激發/檢測對600的光和由激發/檢測對600傳輸出的光達到最強，在運行過程中最好使得開孔502與蓋加熱器204之間的距離較小。
進入反應容器616的激發光激發其中的熒光標記或探針，這些標記或探針發出熒光，從而產生不同波長的光。這些光中的某些光沿著檢測光路620離開反應容器616，并且通過開孔502。分光器612引導熒光中的相當一部分通過濾光器624和透鏡626，其中，濾光器把激發頻率過濾掉，而透鏡把光聚焦到光二極管628的活性表面上。光二極管628對入射的光作出響應產生電信號。通過讀出信號路徑630將這個電信號傳輸到電路板634，線路板將信號發送到電連接器424，以便讀出。線路板634和/或信號路徑630也可以包括其它部件，比如前置放大器，為的是對來自光二極管628的電信號進行整形和加工。
可以通過經過連接器424接收到的信號控制LED606和光二極管628，如由相應的控制信號路徑636，638表示的那樣。用于LED606的控制信號可以在要求的時刻激活LED606和使LED606停止工作；用于光二極管628的控制信號可以在要求的時刻激活光二極管628和使光二極管628停止工作，調節增益參數，等等。
盡管圖6示出了一對激發/檢測對600，但是應當理解，檢測模件234的一個實施例可以包括任何數量的這樣的激發/檢測對，每一對最好與其它的對處于光學隔絕的狀態，并且有它自己的開孔，用來與樣品凹坑實現光學連通(例如圖5的開孔504，506，508)。獨立控制多個激發/檢測對，并且獨立讀出這些對，但是，可以把它們各自的控制和讀出路徑耦合到電路板634上。
激發/檢測對的構形可以與所示出的不同，激發和檢測光路可以包括附加的部件，包括較少的部件，或者包括所要求的部件的任何組合。可以改變光學系統使它適合特定的應用(例如在不包括蓋加熱器204的實施例中，光學路徑可以較短)，并且可以使用任何數目的部件和部件的組合，包括但不限于透鏡，分光器，反光鏡，以及濾光器。盡管LED提供了一種緊湊和可靠的光源，但是不排除使用其它類型的相干光源或者非相干光源，比如激光二極管，閃光燈，等等。類似地，檢測器不限于光二極管；且可以用任何類型的光探測器替代，這包括光電倍增管，以及電荷耦合裝置(CCD)。最好每個激發/檢測對構形成一個獨立的組件，為了使它工作僅只需要外部的電連接。因為由一個實施例到另一個實施例不能改變激發和檢測光路的長度，所以希望在制造過程中把每個激發/檢測對600的各種光學部件固定地安裝在檢測模件234內部，并且使它們達到最佳，從而在使用過程中不需要作進一步的調節。
圖7是一個方框圖，示出了蓋組件112的電連接。在蓋組件112中安裝一個主處理板702。主處理板702包括一個主信號處理器704，一個步進馬達驅動單元706，一個用于電源的連接件708，以及一個用于外部計算機(例如個人計算機，或者PC)的連接件710。主處理板702也提供用于電纜212的連接器214，其將電信號傳輸到蓋122、并且傳輸來自蓋122的電信號。
蓋122包括一塊次處理板720，其使主處理板702與步進馬達302，316之間以及與往復移動件232之間的連通變得容易。次處理板720包括用于電纜212的連接器722，把電纜726連接到往復移動件232上的連接器724，以及用于電纜736，738的連接器732和734，這些電纜將控制信號提供給x和y方向的步進馬達302，316。在次處理板720中的傳輸路徑(未示出)各種連接器之間建立適當的信號連接。
使用電纜726連通用于檢測模件234的控制信號，比如啟動單個的光源或者使單個的光源停止工作，并且接收來自包括在檢測模件234中的光檢測器的信號。在往復移動件232上設置電連接器730，用來把信號通到檢測模件234、并且傳輸來自檢測模件234的信號。當把檢測模件234安裝在往復移動件232上時，電連接器730接受在檢測模件234的頂表面上的配接的連接器424。在一個替代的實施例中，電纜726可以直接裝接到檢測模件234上。
如上面提到過的那樣，主處理板702提供了到外部計算機(未示出)的連接件710。可以使用外部計算機控制往復移動件232的運動和檢測模件234的工作，以及用來讀出和分析由檢測模件234獲得的熒光數據。
如上面提到過的那樣，檢測模件234設計成獨立整裝式的，并且可以從往復移動件232拆下。這可考慮一種可改變構形的熒光系統，在這種系統中，實驗人員可以如所想要的那樣改變檢測模件，以進行不同的測量。例如，可以使得不同的檢測模件對于不同的形成熒光標記的試劑(或試劑的組合)達到最佳。如果實驗人員希望研究一種不同的試劑，她可簡單地安裝適當的檢測模件。安裝是一件把所想要的檢測模件234的頂部上的電連接器424和機械連接器420裝接到往復移動件232的底側面上的對應的連接器上的事情。在某些實施例中，連接器設計成使得當把機械連接接合起來時自動地實現電連接。如上面注意的那樣，最好可移動地安裝蓋加熱器204，從而可以接近熒光組件230，使得實驗人員可以改變檢測模件。
將可理解的是，在這里描述的裝置是說明性的，變化和改進是可能的。例如，底座和樣品單元可設計成一個集成系統，或者進一步把它們分成較小的模塊部件。熒光計組件不需要安裝到蓋中或者以另外的方式集成到蓋中，只要可以把它安裝在相對于樣品凹坑的一個固定位置即可。可以使用任何機構使檢測模件可移動，從而使它的位置與樣品凹坑中的不同的凹坑處于光學連通狀態，而不限于平移臺或者步進馬達。檢測模件可以包括可作為獨立的檢測通道操作的任何數目(一對或多對)的激發/檢測對，并且不同的對可設計成檢測同一個熒光探針或者檢測不同的熒光探針。在一個替代的實施例中，檢測模件包括一排激發/檢測對，它們帶有布置成與一排樣品陣列對應的光學窗口，并且使得檢測模件可以在一個方向上移動，以訪問陣列中不同的列。
外部計算機也是可選的，可以將外部計算機功能中的任何功能集成到熱循環器裝置中；相反，可以通過在外部計算機上操作實現熱循環器的控制功能，從而對于整個設備提供一個單一的控制裝置。在一個實施例中，使用外部計算機控制檢測模件234相對于樣品凹坑的位置以及光源和檢測器的工作。此外，任何外部計算機可以是特殊目的的控制和信號處理裝置，也可以是通用目的的計算機，比如PC。
II.使用方法可以通過檢測熒光的大小使用在這里描述的設備，以檢測在放大反應中產生的放大產物的量。可以使用多種放大技術確定在DNA或RNA樣品中存在的靶序列的數量。在本技術領域中已經很好地知道、并且廣泛地使用這樣的技術，這樣的技術包括核酸擴增子(拷貝)的酶合成，這些核酸拷貝包含與被放大的序列互補的序列。這些技術包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)，RT-PCR，鏈置換擴增(SDA)，基于放大反應的轉錄，連接酶鏈反應(LCR)，以及其它技術(例如見Dieffenfach & Dveksler，PCR PrimerA Laboratory Manual，1995；美國專利4683195和4683202；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，Innis等人，eds，1990；Walker，等人，Nucleic Acids Res.20(7)1691-6，1992；Wa1ker，PCR MethodsAppl 3(1)1-6，1993；Phyffer，等人，J.Clin.Microbiol.34834-841，1996；Vuorinen，等人，J.Clin.Microbiol.331856-1859，1995；Compton，Nature 350(6313)91-2，1991；Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)75-99，1999；Hatch等人，Genet.Anal.15(2)35-40，1999；以及Iqbal等人，Mol.Cell Probes13(4)315-320，1999)。當在樣品中存在的靶序列的數量非常少時，核酸放大特別有利。通過放大靶序列并檢測所合成的擴增子，可以顯著地改進檢驗的靈敏度，這是因為在檢驗的開始只需要靶序列的較少的拷貝，從而更好地確保在屬于器官和感興趣的病毒的樣品中核酸的檢測。
可以在反應完成之后或者實時地(即，基本上連續地)進行放大產物的測量。如果在放大反應完成之后進行累積的放大產物的測量，那么，可以在放大反應之后添加檢測試劑(例如，熒光探針)。替代地，可以在放大反應之前或者在放大反應期間添加熒光探針，因此可以或者在放大反應完成之后或者實時地進行放大產物的測量。如果實時地測量放大產物，可以通過在假設指數放大的條件下確定信號超過一定閾值、并且返回到初始的拷貝數的循環數估計出初始的拷貝數。
A.熒光探針有很多使用熒光探針的格式可供使用。這些格式常常以熒光共振傳能(FRET)為基礎，并且包括分子信標，以及TaqMan探針。FRET是供體分子與受體分子之間的一種與距離有關的相互作用。供體分子和受體分子是熒光團。如果熒光團有相互重疊的激發和發射光譜，那么，在非常近的距離內(典型地大約10-100埃)施主熒光團的激發可以傳遞到受體熒光團。結果，供體分子的壽命縮短，并且它的熒光猝滅，而受體分子的熒光強度會增強，并且熒光會去偏振。當供體分子的激發態的能量傳遞到非熒光團的受體分子上時，供體分子的熒光猝滅，而后面沒有跟著產生受體分子的熒光發射。在這種情況下，受體分子的功能是作為一種猝滅反應物。
用于實時的PCR的一種以PRET為基礎的格式采用被稱為“分子信標”的DNA探針(見例如Tyagi等人，Nat.Biotech.1649-53，1998；美國專利No.5925517)。分子信標有一種發夾結構，其中猝滅染料和報導基因染料在發夾的柱的端部彼此緊密接觸。當與一種互補的序列雜化時，發夾結構的環變成雙鏈的，并且迫使猝滅染料與報導基因染料分離開，因此產生熒光信號。一種有關的檢測方法采用發夾的引發劑作為熒光探針(Nazarenko等人，Nucl.Acid Res.252516-2521，1997；美國專利No.5866336；美國專利No.5958700)。可以以這樣的方式設計PCR的引發劑僅只當引發劑有線性結構即可以結合進PCR產物中時，才有熒光信號產生。
也可以使用一種熒光團的5′核酸酶化驗，一種TaqMan化驗在溶液中檢測放大產物。見Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887276-7280，1991；美國專利No.5538848，5723591，以及5876930。將TaqMan探針設計成與所要求的PCR產物內的一個序列雜化。TaqMan探針的5′端部包含熒光報告基因染料。把該探針的3′端部阻擋，防止探針伸展，并且該端部包含一種染料，此染料將使5’熒光團的熒光猝滅。在后來的放大過程中，如果在反應中存在帶有5’外切核酸酶活性的聚合酶，會使5’熒光標記分裂。5’熒光團的激發會導致熒光增強，可以檢測到這種增強。
除了發夾和5′核酸酶PCR化驗以外，也已經發展了采用FRET機制的其它的格式。例如，通過連接到兩種染料上形成供體/受體染料對已經對單鏈的信號引發劑實現了改進，其方式使得第一種染料的熒光被第二種染料猝滅。這種信號引發劑包含一個限制部位(美國專利No.5846726)，這使得當被雜化到一個靶上時適當的限制酶在引發劑上形成刻痕。這種分裂將兩種染料分開，并且由于猝滅的減弱將觀測到熒光的變化。也已經描述了把低聚核苷酸耦合到配位體上的非核苷酸連接反應劑(美國專利No.5696251)。
可以采用熒光測量讀數監測的其它放大反應包括通過測量結合到放大產物上的結合DNA的染料的量進行定量的那些反應。這樣的化驗使用熒光染料例如溴化乙錠或者SYBR Green I(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR；美國專利No.5436134和5658751)，當把它們添加進DNA中時熒光增強(例如見美國專利No.5994056和6171785)。在Morrison等人(Biotechniques 24，954-962，1998)的文章中也描述了為了這樣的目的使用SYBR Green I。熒光的增強反映出放大反應產生的雙鏈DNA的數量的增加。
其它的熒光探針包括無機分子，有機分子和/或無機分子的多分子混合物，晶體，雜聚合物，以及類似物。例如，為了耦合到生物分子上可以很容易地衍生出被包封在一個硅殼體中的CdSe-CdS芯殼納米晶體(Bruchez等人(1998)Science，2812013-2016)。類似地，為了在超靈敏生物檢測中使用，已經把高熒光量子點(用硫化鋅蓋住的硒化鎘)共價地耦合到生物分子上(Warren and Nie(1998)Science，2812016-2018)。
也可以采用設備100進行多重化驗(multiplexassays)。多重PCR造成在同一反應中多個聚核苷酸碎片的放大。例如見PCRPRIMER，A LABORATORY MANUAL(Dieffenbach，ed.1995)Cold SpringHarbor Press，157-171頁。例如，可以在同一反應容器中平行地添加和放大不同的靶模板。多重化驗典型地包括使用不同的熒光標記檢測被放大的不同靶序列。
B.PCR條件和部件示例性PCR反應條件典型地包括兩步驟循環或者三步驟循環。兩步驟循環有一個變形步驟，接著一個雜化/加長步驟。三步驟循環包括一個變形步驟，接著一個雜化步驟，再接著一個單獨的加長步驟。在把引發劑雜化到靶序列上并且用一種聚合酶延長引發劑的條件下進行聚合酶反應。選擇放大反應循環的條件使得引發劑專門雜化到靶序列上并且被延長。
成功的PCR放大要求高產率，高選擇性，以及在每一步驟的可控的速率。產率，選擇性和反應速率一般取決于溫度，且最佳的溫度取決于聚核苷酸，酶和在反應系統中其它的成分的組成和長度。此外，不同的溫度可能對于不同的步驟是最佳的。最佳的反應條件可以變化，這取決于靶序列和引發劑的組成。熱循環器比如設備100提供了對反應條件的必要控制，從而對于一種特定的化驗使PCR過程達到最佳。例如，可以通過選定要保持的溫度，每個循環的時間長短，循環的數目，以及類似參數對設備100進行編程。在某些實施例中，可以對溫度梯度進行編程，從而可以將不同的樣品凹坑保持在不同的溫度，等等。
在本技術領域中已經很好地知道包含堿基連接的或者終端連接的熒光劑和猝滅劑的熒光低聚核苷酸(引發劑或探針)。例如可以由Life Technologies(Gaithersburg，MD)，Sigma-Genosys(TheWoodlands，TX)，Genset Corp.(La Jolla，CA)，或者SyntheticGenetics(San Diego，CA)等公司獲得這類低聚核苷酸。通過對與連接到基上的反應團合成的低聚核苷酸的合成后的改性把連接堿基的熒光劑結合到低聚核苷酸中。本領域技術人員將認識到，有大量不同的熒光團可供使用，包括可以由市場比如可以由MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR公司獲得的，以及本領域技術人員知道的其它熒光團。有用的熒光團包括熒光素，異硫氰酸酯熒光素(FITC)，羧基四氟熒光素(TET)，NHS-熒光素，5和/或6-羧基熒光素(FAM)，5-(或6-)碘乙酰氨基熒光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰巰基)-琥珀酰]氨基}熒光素(SAMSA-熒光素)，以及其它的熒光素衍生物，若丹明，Lissamine若丹明B硫酰氯，Texas紅硫酰氯，5和/或6羧基若丹明(ROX)，以及其它的若丹明衍生物，香豆素，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，以及其它的香豆素衍生物，BODIPYTM熒光團，Cascade BlueTM熒光團，比如8-甲氧基苯-1，3，6三磺酸三鈉鹽，Lucifer黃熒光團，比如3，6-二磺酸-4-氨基-萘亞酰胺，藻膽蛋白衍生物，Alexa熒光染料(可以由Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR公司獲得)，以及本領域技術人員知道的其它熒光團。對于有用的熒光團的一般目錄也參見Hermanson，G.T.，BIOCONJUGATE TECHNIQUES(Academic Press，San Diego，1996)。
按照已經知道的方法設計用于放大反應的引發劑。例如，可以使用在可以由市場獲得的軟件或者用戶軟件中實現的方法設計用于放大靶序列的引發劑。典型地，引發劑的長度至少有12個堿基，更經常有15，18或20個堿基。典型地把引發劑設計成使得參加特定反應的所有引發劑的熔化溫度彼此在5℃以內，最可取地在2℃以內。進一步把引發劑設計成避免在它們自己身上實現引發或者彼此引發。引發劑的濃度應該足以結合到要被放大的所有靶序列上，從而可以精確地測量被放大的序列的數量。本領域技術人員將認識到，將按照引發劑的結合親和力以及要被結合的序列的數量改變引發劑的濃度大小。典型的引發劑濃度的范圍將由0.01微摩爾到0.5微摩爾。
本領域技術人員還將認識到，希望設計緩沖條件，以滿足所有感興趣的反應的功能。因此，可以將緩沖條件設計成支持放大反應以及與由探針產生信號有關的任何酶反應。可以通過單獨地以及結合起來檢查反應對一種具體的反應緩沖液檢查它支持各種反應的能力。反應的成分比如鹽或者鎂的濃度也可能影響引發劑或者檢測探針處理靶核酸的能力。這些可以按照在技術中眾所周知的指導例如Innis等人(見上文)進行調節。
C.示例性的PCR過程圖8是使用設備100進行核酸放大和測量過程800的流程圖。在這個示例中，設備100控制一個PCR放大過程，并且在核酸樣品中檢測多個靶序列的存在。
在步驟802，準備反應容器616。準備包括將反應成分放入容器中，并且將容器密封，以防止溢出或交叉污染。反應成分包括緩沖液，靶核酸，適當的引發劑和探針，核苷酸，聚合酶，以及可選的附加成分。在一個實施例中，包括四個熒光探針，每個探針適宜于檢測一種不同的靶序列，并且一個具體的反應容器可以包括任何一個或者多個熒光探針。每個熒光探針最好對不同入射波長的光作出響應，并且發射出不同波長的光。
在步驟806，檢測模件234安裝在往復移動件232上。如上面所要求的那樣，檢測模件234可以包括任何數目的檢測通道(即，激發/檢測對)。在一個實施例中，檢測模件234包括四個檢測通道。使每個通道對于在反應容器616中包括的熒光探針中不同的一個探針達到最佳。
在步驟808，將反應容器616放置到樣品單元202的樣品凹坑210中。在步驟810，關閉蓋組件112，并且將蓋組件放置在底座單元110中。
在步驟812，校準檢測模件234的每個通道。通過使步進馬達302，316工作將檢測模件234定位，使得它的通道中的至少一個通道與校準位置222處于光學連通狀態進行校準。如上面描述過的那樣，每個校準位置提供已知的熒光響應。因此，可以使用校準測量對于檢測器響應的變化或起伏校正后來的樣品測量。在本技術領域中已經知道大量的校準技術。在檢測模件234有多個通道的情況下，可以獨立地對每個通道進行校準。
在步驟814，進行PCR循環。一般說來，步驟814包括使底座單元110工作，以調節樣品單元202的溫度，從而將反應容器在所要求的溫度保持所要求的時間長度，完成兩步驟或者三步驟PCR循環。可以通過接口116或者通過一臺外部計算機控制底座單元110。
在步驟816，熒光計組件206掃描并訪問反應容器616。最好由一臺外部計算機控制熒光計組件206的工作，并且與底座單元110的工作同步，從而可以將測量確切地與PCR過程中特定的時間相對應。
更具體地說，在步驟816a，使步進馬達302，316或者其它的運動裝置工作，以將檢測模件234定位，使得四個檢測通道中的每個通道通過各自的光學窗口502，504，506，508與樣品凹坑210中一個不同的凹坑處于光學連通狀態。在步驟816b，啟動對于每個通道的LED或者其它的光源(閃光一個很短的時間)，激發熒光。在一個實施例中，使不同通道的LED平行地工作；在一個替代的實施例中，使它們順序地工作，從而避免由一個通道反射的LED光在另一個通道的光探測器中產生錯誤的信號。
在步驟816c，用對應的光二極管或者通道中其它的檢測器檢測產生的熒光，把熒光信號讀出到外部計算機中。可以以多種方式讀出檢測器。例如，可以檢測峰值信號，可以在一定的時間間隔內將信號積分，或者可以測量在LED已經關斷后熒光信號的衰減。
最好重復步驟816a-c，每次改變檢測模件的位置，從而檢測模件234的每個通道逐漸地訪問樣品凹坑210中的每個凹坑。在一個實施例中，對于樣品凹坑96中的每個凹坑掃描、并訪問四個通道花費大約15秒鐘。外部計算機最好執行一個程序(例如由MJResearch，Inc.公司銷售的the Opticon Monitor程序)，這使得使用者在收集數據時可以以圖像的形式和/或數據表格的形式看到測量數據。在本技術領域中已經知道這樣的程序。一個示例包括由MJ Research，Inc.公司銷售的the Opticon MonitorTM程序。
可以對于任何數目的反應循環重復步驟814和816。本領域技術人員將認識到，可以使用過程800的實時熒光測量檢測每種靶序列的存在，并且將它們定量。也可以使用這樣的測量用于一些目的，比如確定反應速率和為了改進效率調節反應參數，以及在一種特別的實驗中(例如當已經產生出足夠數量的靶序列時)確定什么時間不再需要附加的反應循環。
將會認識到，過程800是說明性的，它的變化和改進是可能的。被描述為順序進行的步驟可以平行地進行，步驟的次序可以改變，可以改變這些步驟，或者把它們結合起來。例如，可以在PCR循環期間的任何一點進行熒光測量，也可以在每個PCR循環期間進行多次測量(包括基本上連續地對樣品凹坑進行掃描)，或者一直到某個數目的PCR循環之后不進行測量。在單一的反應容器中可以使用任何數目的可以區分的熒光探針，并且，可以使得檢測模件適宜于至少包括與使用的探針數目那樣多的通道。在某些實施例中，檢測模件包括對于同一探針達到最佳的多個通道。這樣可以縮短掃描時間，這是因為為了訪問一個特定的樣品凹坑僅只需要使用這些通道中的一個通道。
此外，如上面提到過的那樣，在一個替代的實施例中，可以把檢測模件234的各個通道布置成當它的通道之一與一個樣品凹坑210處于光學連通狀態時，其它通道不處于這種狀態。這種安排可以實現運行的一種“跨過(flyover)”模式，在這種模式中，在凹坑上描述通過期間檢測模件234基本上連續地運動。因為一次僅只一個樣品凹坑能夠接收到激發光，所以減小了通道之間的交叉干擾。
結論盡管已經關于具體的實施例描述了本發明，但是，本領域技術人員將認識到，大量的改型是可能的。例如，可以使得在這里描述的熒光檢測組件適宜于與范圍廣泛的熱循環系統一起使用，并且可以按照特定儀器的設計由任何方向(例如由上面或者由下面)訪問樣品凹坑。此外，可以使得系統適宜于檢測很寬范圍的有生物興趣的分子，這些分子可以被一種熒光標記或探針鑒別；不限于核酸，也不限于任何特定的放大過程。
因此，雖然已經關于具體的實施例描述了本發明，但是將會認識到希望本發明覆蓋在下面的權利要求書的范圍以內的所有改型和等價物。
權利要求
1.一種用來分析位于熱循環器中的多個凹坑中的樣品的熒光檢測設備，所述設備包括可安裝到所述熱循環器上的支承結構；以及可移動地安裝在所述支承結構上的檢測模件，所述檢測模件包括設置在所述檢測模件內部的激發光發生器；以及設置在所述檢測模件內部的發射光檢測器；其中，當所述支承結構安裝到所述熱循環器上、并且所述檢測模件安裝在所述支承結構上時，所述檢測模件可移動，從而使它的位置與多個凹坑中的不同的凹坑處于光學連通狀態。
2.按照權利要求1所述的熒光檢測設備，其特征在于，所述檢測模件包括多個所述激發光發生器和多個所述發射光檢測器，把它們布置成形成多個激發/檢測對。
3.按照權利要求2所述的熒光檢測設備，其特征在于，每個所述發射光檢測器構形成檢測不同的波長范圍。
4.按照權利要求2所述的熒光檢測設備，其特征在于，每個所述激發光發生器構形成產生不同波長范圍的光。
5.按照權利要求2所述的熒光檢測設備，其特征在于，多個所述激發/檢測對布置成使得可以同時使每個所述激發/檢測對的位置與多個凹坑中的不同的凹坑處于光學接觸狀態。
6.按照權利要求2所述的熒光檢測設備，其特征在于，多個所述激發/檢測對布置成使得當把所述激發/檢測對中的第一對的位置與多個凹坑中的任何一個凹坑處于光學接觸狀態時，所述激發/檢測對中的任何其它對的位置不與多個凹坑中的任何一個凹坑處于光學接觸狀態。
7.按照權利要求1所述的熒光檢測設備，其特征在于，所述檢測模件可拆卸地安裝在所述支承結構上，從而使得使用者可以用一個不同的檢測模件替換所述檢測模件。
8.按照權利要求1所述的熒光檢測設備，其特征在于，其還包括校準件，它設置成使得所述檢測模件可移動，從而使它的位置與校準件處于光學連通狀態，其中，所述校準件提供已知的熒光響應。
9.按照權利要求8所述的熒光檢測設備，其特征在于，所述校準件設置在多個凹坑中的兩個凹坑或多個凹坑之間。
10.按照權利要求1所述的熒光檢測設備，其特征在于，由一臺外部計算機控制所述檢測模件關于凹坑的定位。
11.按照權利要求8所述的熒光檢測設備，其特征在于，所述校準件設置在多個凹坑的周邊區域。
12.按照權利要求1所述的熒光檢測設備，其特征在于，由一臺外部計算機控制所述激發光發生器和所述發射光檢測器的工作。
13.一種用來檢測靶分子在溶液中存在的方法，所述方法包括制備多個樣品，每個所述樣品包含適宜于結合到靶分子上的熒光探針；把每個所述樣品放置在熱循環設備的多個樣品凹坑中的相應的一個凹坑中，所述熱循環設備有可移動地安裝在其中的檢測模件，所述檢測模件包括激發/檢測通道，所述激發/檢測通道包括設置在所述檢測模件內部的激發光發生器，以及設置在所述檢測模件內部的發射光檢測器；采用所述熱循環設備激發反應；并且對多個樣品凹坑進行掃描，通過移動所述檢測模件、并且啟動所述激發/檢測通道檢測熒光響應，其中，在進行掃描步驟的過程中，使得所述檢測模件移動，從而順序地使所述激發/檢測通道的位置與多個凹坑中的每個凹坑處于光學連通狀態。
14.按照權利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶分子是核酸序列。
15.按照權利要求14所述的方法，其特征在于，所述反應是一種聚合酶鏈反應(PCR)。
16.按照權利要求13所述的方法，其特征在于，進行掃描的步驟包括將所述檢測模件定位，使得所述激發/檢測通道的位置與樣品凹坑中的一個凹坑處于光學連通狀態；短時間地啟動所述激發/檢測通道的所述激發光發生器；采用所述激發/檢測通道的所述發射光檢測器檢測熒光響應；并且將所述檢測模件重新定位，使得所述激發/檢測通道的位置與樣品凹坑中的一個不同的凹坑處于光學連通狀態。
17.按照權利要求16所述的方法，其特征在于，所述檢測模件包括至少兩個所述激發/檢測通道。
18.按照權利要求17所述的方法，其特征在于，當將所述檢測模件定位，使得它的激發/檢測通道中的第一通道的位置與樣品凹坑中的一個凹坑處于光學連通狀態時，它的激發/檢測通道中的第二通道的位置與樣品凹坑中的一個不同的凹坑處于光學連通狀態。
19.按照權利要求17所述的方法，其特征在于，當將所述檢測模件定位，使得它的激發/檢測通道中的第一通道的位置與樣品凹坑中的一個凹坑處于光學連通狀態時，它的激發/檢測通道中的第二通道的位置與樣品凹坑中的任何一個凹坑處于光學連通狀態。
20.按照權利要求16所述的方法，其特征在于，在進行所述掃描步驟的過程中，所述檢測模件基本上處于連續運動的狀態。
全文摘要
一種用來分析位于熱循環器中多個樣品凹坑中的樣品的熒光檢測設備和使用該設備的方法。在一個實施例中，該設備包括可以安裝到該熱循環器上的一個支承結構，以及可移動地安裝在該支承結構上的一個檢測模件。該檢測模件包括一個或多個通道，每個通道有一個激發光發生器和一個發射光檢測器，它們兩個都設置在檢測模件內。當把支承結構安裝到熱循環器上、并且把檢測模件安裝在支承結構上時，檢測模件可移動，從而使它的位置與多個凹坑中不同的凹坑處于光學連通狀態。檢測模件可以由支承結構移開，使得可以容易地進行替換。
文檔編號C12P19/34GK1820082SQ200480019572
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月10日 優先權日2003年5月8日
發明者I·科頓斯基, J·A·戈德曼, M·J·芬尼 申請人:生物-拉德實驗室公司