基于gp160和人cd4蛋白共有的保守氨基酸序列的抗hiv－1化合物的制作方法

專利名稱：基于gp160和人cd4蛋白共有的保守氨基酸序列的抗hiv－1化合物的制作方法
I.聲明本申請要求2003年5月8日提交的美國臨時申請60/468,847的優先權權益。該申請在此通過援引的方式全文納入。
II.背景技術人類免疫缺陷病毒(HIV)至少存在兩種主要形式，HIV-1和HIV-2。HIV-1被認為在人類中的毒力比HIV-2更強，并且是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)這一主要公共健康問題的主要原因。盡管在許多病例中HIV-2最終是致命的，但是它的發展比較緩慢。在各種非人類靈長類動物中發現了猴免疫缺陷病毒(SIV)，該病毒在遺傳學上類似HIV-2；但是，來自黑猩猩的SIV-CZ被認為與HIV-1密切相關并且在諸如貓科動物的許多哺乳動物中發現了MIV(哺乳動物免疫缺陷病毒)。
HIV復雜的復制循環的特點在于其整個過程(overall outline)。該病毒至少包括12個基因，且這些基因的蛋白或核酸產物的功能基本已知。被認為在HIV的毒力中很重要的一個基因是env。該基因的產物被稱為糖蛋白(gp)160，gp160位于表面并且是病毒“被膜”或膜的一部分。gp160是一種前體，它被蛋白酶解(proteolyzed)成為兩個分離的但功能上仍然相聯系的產物專門負責與CD4受體蛋白以及諸如CCR5和CXCR4(原來被稱為融合素)的必需輔助受體結合的gp120，和控制隨后的病毒與細胞膜融合的gp41。gp41包括能夠插入宿主細胞或者病毒膜的被稱作跨膜(TM)結構域的兩條序列。靠近氨基末端的TM結構域被稱為融合結構域，因為大量的研究已經表明它對于融合過程來說是關鍵的。融合發生在病毒顆粒進入宿主細胞，以及在被稱為合胞體形成的過程中被病毒感染的細胞(在其表面表達gp160)與未被感染的易感細胞融合的時候。新形成的病毒核衣殼附著于細胞膜的內部，由被膜包被，并出芽成為游離病毒顆粒的過程可能也參與了融合過程。
對gp41的第二個TM結構域即大約676-706個氨基酸殘基(該區域根據HIV 1/2型在數目上有所變化，但總是存在)的功能，研究較少，但是該結構域似乎也在膜融合以及插入中發揮作用。(注意殘基的編號是指完整的gp160；不同出版物中的編號略有不同；除非另有說明，此處使用Helseth et al，Journal of Virology 646314，1990中的編號。)應注意696位的精氨酸殘基高度保守，且唯一已知的變異是也帶有正電荷的賴氨酸(Owens et al，Journal of Virology 68570，1994)。
所述(帶正電荷的)精氨酸被不帶電荷的氨基酸絲氨酸突變置換會稍微降低復制和融合(通過測定合胞體形成)的能力，并且被一個四個氨基酸的插入物置換會強烈降低所述活性(Helseth et al，同上)。687-689和697-699位的氨基酸置換同樣強烈抑制復制和合胞體的形成(Gabuzda et al，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes434，1991)。696位精氨酸被高度疏水性氨基酸亮氨酸置換或從696位精氨酸去掉氨基酸羧基末端的短截體，強烈降低合胞體的形成而不妨礙修飾后的蛋白與宿主細胞膜結合的能力；而從692位或683位去掉氨基酸羧基末端的短截體還消除后一能力(Owens et al，同上)。因此據認為，第二個TM結構域(下述我們的研究對象)對HIV來說在功能上很重要，但是對其結構基礎并不了解。除了由gp120識別的胞外結構域之外，CD4受體以及被稱為融合素的輔助受體還具有將其錨定于細胞膜上的TM結構域。
公開了結合或模擬此處所公開的缺口序列的組合物和方法，所述組合物和方法能夠抑制HIV分子gp160(gp120)的功能。
III.發明內容公開了一般而言涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)的組合物和方法，以及更具體而言，該組合物和方法涉及能夠干擾HIV-1糖蛋白160中的靶氨基酸序列與其配體結合的抗HIV試劑的試劑、其鑒別和用途。
例如，公開了能夠干擾HIV-1 gp41的第二個TM區域中的靶氨基酸序列與其配體結合的分子，其中所述的靶標是選自SEQ ID NO13、SEQ IDNO14和SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中X是能使所述序列形成螺旋并嵌入膜周的任何氨基酸，且這些序列代表HIV-1的gp41中形成α螺旋中的甘氨酸表面不連續或者缺口的結構上類似的共有序列的變化形式。這類分子包括通過與靶標結合干擾、通過與其配體結合干擾(這些分子模擬靶標)以及通過與編碼靶標的病毒核酸結合并阻止靶標合成而干擾的分子。
公開了包括本發明中的分子和適合載體的組合物，以及減少人類免疫缺陷病毒與宿主細胞間相互作用的方法，所述方法包括使所述病毒和宿主細胞兩者之一或者全都受所公開的分子的作用。
IV.


納入本說明書并構成本說明書的一部分的附圖，闡明一些實施方案并與文字說明一起闡明所公開的組合物和方法。
圖1顯示計算機產生的HIV-1gp41的第二個跨膜區某些部分的模型。
圖2顯示計算機產生的HIV-2gp41的第二個跨膜區某些部分的模型。
圖3顯示計算機產生的人CD4相應區域的第二個跨膜區某些部分的模型。
圖4顯示HIV-1和CD4的上述跨膜區結合在一起或“對接”。
V.具體實施方式
在本發明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法公開和敘述之前，應當理解的是除非特別說明，它們并不局限于特定的合成方法、特定的重組生物技術方法或具體的試劑，因而當然是可以變化的。還應當理解的是此處所使用的術語只是為了描述具體的實施方案，并非出于限制的意圖。
A.定義如在說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式的“一”、“一種”和“該”包括復數指代對象，除非上下文中另外明確指出。因此，例如，提及“一種藥物載體”包括兩種或更多種這類載體的混合物等等。
本文中范圍可以表示為從“大約”一個具體的數值，和/或至“大約”另一個具體的數值。當表示為這種范圍時，另一個實施方案包括從前述的一個具體的數值和/或至前述的另一個具體的數值。類似地，當通過在前面使用“大約”將數值表示為近似值時，應當理解的是，該具體的數值構成另一個實施方案。應當進一步理解的是，每個范圍的端點在相對于另一個端點相關以及獨立于另一個端點時都是顯著的(significant)。還應當理解的是此處公開了許多數值，除了數值本身外每一個數值還包括該具體數值左右的范圍。例如，如果公開了數值“10”，那么也公開了“大約10”。還應當理解的是，當公開了一個數值時，也公開了“小于或等于該數值”，“大于或等于該數值”以及數值間可能的范圍，如本領域技術人員所恰當理解的。例如，如果公開了數值“10”，也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。
在本說明書及其后的權利要求書中，將會提及許多術語，其含義如下“可選的”或“可選地”意即隨后所描述的事件或情況可以發生或不發生，以及該描述包括其中所述事件或情況發生的例子及其不發生的例子。
“引物”是能夠支持一些類型的酶處理并能夠與靶核酸雜交從而使酶處理得以發生的探針亞組。引物可以由本領域可用的不干擾酶處理的核苷酸或者核苷酸衍生物或類似物的任何組合制得。
“探針”是能夠與靶核酸相互作用的分子，通常以序列特異性方式，例如通過雜交。核酸雜交為本領域所熟知并在此處詳述。通常探針可以由本領域可用的核苷酸或者核苷酸衍生物或類似物的任何組合構成。
在整個申請中，參考了各種出版物。這些出版物的公開內容作為整體在此通過援引方式納入本申請，以便更充分地描述本發明所屬領域的狀況。公開的參考文獻還以其所屬語句所討論的、該參考文獻中所含有的內容，逐一地、具體地通過援引的方法納入本文。
盡管已經在此處描述并詳細敘述了實施方案，仍然可以做出各種修改、添加、替換等等。
公開了用來制備公開的組合物的組分以及用于此處公開的方法中的組合物本身。所述及其它物質在此處公開，應當理解的是在公開這些物質的組合、子集、相互作用和群組等的時候，盡管關于所述化合物的每種不同的個體和集體的組合和排列可能并未明確地公開，但每種都特別在此處考慮和敘述。例如，如果公開并詳述了具體的缺口結構基序，詳述了許多能夠對包括缺口結構基序在內的多種分子實施的修飾，特別考慮的是缺口結構基序的每種組合和排列以及可能的修改，除非特別指明情況相反。因此，如果公開了一類分子A、B和C以及一類分子D、E和F，并公開了組合分子A-D的實例，那么即使沒有每個逐一列舉，每個也各自和共同得到考慮，意即A-E，A-F，B-D，B-E，B-F，C-D，C-E以及C-F等組合也被認為公開了。同樣，所述分子的任何子集或組合也公開了。因此，例如，A-E，B-F和C-E的子群被認為公開了。將這一概念應用于本申請的所有方面，包括但不限于，制備和應用公開組合物的方法的步驟中。因此，如果有多個另外的步驟可以實施，應當理解的是，所述另外步驟的每一步都能夠對公開方法的任何具體實施方案或實施方案的組合實施。
B.組合物公開了包括合適的載體的組合物以及減少人類免疫缺陷病毒和宿主細胞相互作用的方法。該方法包括使所述病毒和宿主細胞兩者之一或者全都受所述分子的作用。可以實施鑒別和/或篩選所述分子的敘述和方法。還應當理解的是此處提供了包括原子坐標在內的許多結構上的信息，所述信息可以用來界定公開的組合物，包括缺口結合物、HIV感染性抑制劑以及CD4-gp160相互作用的抑制劑。公開了通過例如干擾gp160的功能，通過例如阻止HIV在gp160的協同下進入細胞，而干擾HIV感染性的組合物。
1.靶標或病毒的缺口序列此處公開的1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)包括被膜糖蛋白(gp160)的第二個跨膜片段中在結構上高度保守的氨基酸序列。這段高度保守的氨基酸序列在結構上類似于出現在易感宿主細胞中的病毒受體蛋白(在HIV-1的情況下是CD4蛋白)的跨膜片段中，以及與保守的甘氨酸有關、被稱為融合素的輔助受體(趨化因子受體家族)中的序列。在HIV-1gp160的情況下，該序列為SEQ ID NO1IVGGLVGL，并且對應于編號為688-697的殘基。(這也可以理解為由Ratner等人公開的gp160全序列中的第683-690位。應當理解的是可以使用不同的編號慣例來界定這一區域，這取決于出現gp160蛋白的哪個部分，而這一區域所代表的序列能夠容易地理解為此處所公開的。)在HIV-1gp160的情況下，所述序列還能夠擴展到SEQ ID NO35FMIVGGLVGLRIV，并且對應于編號為686-699的殘基。(這也可以理解為由Ratner等人公開的gp160全序列中的第681-692位。)此處所公開的這一序列及其結構等價物在所有被檢查的690種HIV-1分離物中全部出現，且結構上相似的序列SEQ IDNO2VLGGVAGL在人及其他靈長類動物CD4蛋白中出現，結構上相似的序列SEQ ID NO3IGYFGGIF在被稱為融合素的輔助受體家族中出現；結構上相似的序列SEQ ID NO4CVGGLLGN在腦中的蛋白OPRY-HUMAN中出現。(CD4，Maddon，P.J.，et al.，Cell 42(1)，93-104(1985)；fusins，Charo，I.F.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(7)，2752-2756(1994)；OPRY，Wick，M.J.，et al.，Brain Res.Mol.BrainRes.32(2)，342-347(1995)，至少對涉及所指明的蛋白包括序列和結構信息在內的資料而言，上述所有文獻在此處納入。)還在此處公開的SEQ ID NO1和35中的序列或其結構等價物在所有被檢查的690種HIV-1分離物中全部出現，且結構上相似的序列SEQ ID NO36ALVLGGVAGLLLF在人及其他靈長類動物CD4蛋白中出現。
所述八肽和十三肽(triskadecapeptide)序列位于每個蛋白的跨膜(脂雙層插入)區，并且如果此處所示的肽處于α螺旋構型中，通常可以在鏈內形成甘氨酸表面不連續或“缺口”。這與在膜插入和融合中至關重要的并由此形成HIV-1復制循環中關鍵結合位點的病毒缺口是一致的。因此該位點為抗病毒試劑種類提供了靶標。此處所公開的數據與在復制過程中病毒缺口區和受體蛋白缺口區相互作用，或者各種蛋白的缺口區具有共同配體是一致的。
2.結合缺口的組合物HIV-1的缺口是功能性位點。該缺口區是治療劑靶向的位點，例如，干擾病毒缺口的分子能夠用于抑制HIV-1的復制。
公開了在某些實施方案中可以是與缺口-缺口相互作用相競爭或者結合缺口區的任何物質的缺口抑制劑。例如，所述抑制劑可以是肽、抗體、蛋白、小分子或功能性核酸。公開了能夠干擾病毒生命周期的分子。
在某些實施方案中，缺口在物理上可以被描述為4-5A深、12-13A寬，深度8-9A。例如，在某些實施方案中缺口序列可以被描述為XXXXGGXXGXYXX，其中X為任何疏水殘基，Y為R或任何疏水殘基。所述13體界定了在CD4或HIV-1中發現的缺口的三維結構。該缺口在物理上可以被描述為疏水性排列的孔穴長(界定為從N到C末端原子)10-14A，寬～9.5A，具有一個由能夠形成氫鍵或者發生偶極相互作用的原子構成的5A的中央溝，深4-6A。這通過三維坐標對gp41中的第二個TM螺旋在空間上進行界定，如表3和表4中所詳述的。
所述缺口抑制劑能夠以10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或10-11M的Kd值結合。
所述分子可以是能夠結合上述“缺口”并抑制其生物學活性，或者能夠結合可能的靶點相互作用對象并阻止與靶點相互作用從而充當此處所述的缺口抑制劑的任何大小的分子。公開的肽可以在計算上與靶點對接，正如本文所公開，且如果所述肽能夠被有效運送至作用位點，它們可以充當缺口抑制劑。例如，所公開的起缺口抑制劑作用的肽可以是任何長度。公開的肽長度可以大于或等于8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，60，70，80 90或100個氨基酸。所述作為缺口抑制劑的肽也可以是任何長度的肽，但可以長約10至約50個氨基酸。所述肽可以小于或等于約200個氨基酸，150個氨基酸，125個氨基酸，100個氨基酸，75個氨基酸，50個氨基酸，40個氨基酸，30個氨基酸，25個氨基酸，20個氨基酸，15個氨基酸或10個氨基酸。其中所述肽起形成缺口結構的作用，這要求所述肽能夠形成α-螺旋，所述α-螺旋形成此處所詳述的缺口結構。還優選，所述缺口結構包括能夠插入膜區域的序列。
所公開的分子可以通過多種方式鑒定。例如，此處公開的結合缺口并干擾缺口的功能是所希望的這一信息，能被用來鑒別抑制HIV感染性的分子。
還應當理解的是，可以對所公開的分子進行修飾，從而能夠增加所述分子對缺口區域的親和力。例如，可以將帶負電的殘基加入所公開的分子中，從而使帶負電的殘基與緊鄰缺口的帶正電的精氨酸殘基相互作用。另一種增加缺口抑制劑的親和力的方法是，以i到i+7的間隔增加共價鍵從而穩定α-螺旋構象(Judice et al，Proc Nat Acad.Sci 9413426，1997)。還有其它的方法是增加肽“先導物”或進入序列(entrysequence)從而有利于膜穿入。已知有許多不同的這類肽。例如，能夠利用諸如多聚精氨酸的肽。
還可以對所公開的組合物進行修飾以改善其在生物膜中的溶解性，例如給末端氨基酸加帽以減少電荷。所公開的還有小分子，例如“類肽”化合物(Simon et al，Proceedings of the National Academy of Science，USA 899367，1992，至少對于涉及類肽分子及其用途和結構的資料而言，所述文獻在此通過援引的方式納入。)公開了設計用于減少降解的缺口抑制劑，所述降解例如宿主的蛋白水解性降解。例如，可以用D氨基酸代替L氨基酸以提高對蛋白水解性降解的抵抗力。還公開了缺口抑制劑，該缺口抑制劑具有相同側鏈序列但合成后含有后翻轉(retro-inversion)肽鍵，該缺口抑制劑也表現出相似的抗病毒活性但是對蛋白水解性降解具有改善的穩定性。
所公開的分子能夠與能增加特異性、親和力、膜溶解性或生物有效性(穩定性和生物利用度)的結構純化物(structural refinements)相結合。
a)肽公開了能夠結合缺口序列的肽。這些肽可以是缺口序列、模擬缺口序列的序列或者能夠與缺口序列結構構型適當接觸以使肽和缺口序列之間發生結合的序列。
公開了能夠干擾HIV-1gp160內的靶點與其正常配體的結合的分子，其中所述靶點是從13-15個中選出的氨基酸序列，或者結構相關的序列。在另一個實施方案中，靶點是從SEQ ID NO22，SEQ ID NO23和SEQ ID NO24中選出的氨基酸序列，或者結構相關的序列。在另一個實施方案中，靶點是從SEQ ID NO16，SEQ ID NO17和SEQ ID NO18中選出的氨基酸序列，或者結構相關的序列。在另一個實施方案中，靶點是從SEQ ID NO19，SEQ ID NO20和SEQ ID NO21中選出的氨基酸序列，或者結構相關序列。
所述序列代表被膜糖蛋白gp160(gp41部分)的第二個跨膜片段中高度保守(共有)序列，根據本發明該序列已被鑒定。甘氨酸基序或其結構等價物的共有序列在所有被檢查的690種HIV-1分離物中均被發現，但是在被檢查的29種HIV-2分離物(在人類中的毒力較弱)中均未發現。因此，所述序列，或者間接地，與之相互作用的宿主細胞配體，或者編碼所述氨基酸序列的核酸，代表了抗HIV-1分子的靶點，而這些抗HIV-1分子在治療和/或預防與HIV-1相關的疾病和/或障礙(包括獲得性免疫缺陷綜合征；AIDS)中是有用的。
公開了結合病毒缺口序列或者結合通常結合所述缺口的配體并從而阻止缺口-配體相互作用的分子。例如，公開了包括缺口序列(或其“鏡像”序列)的肽。這些類型的分子能夠通過例如競爭性抑制作用來抑制缺口-缺口相互作用或者缺口與其它類型蛋白的相互作用。此處顯示包括缺口序列或者其鏡像的分子能夠與HIV-1缺口序列對接。這與下述事實是一致的當所述分子接近缺口序列時，它們能夠與缺口序列相互作用并充當其它能夠與該缺口序列相互作用的序列的競爭性抑制劑。任何包括缺口序列的肽都能用來與缺口序列相互作用。例如，肽EGGIVGGVAGLLL(SEQ ID NO 7)和EGGIVGGVAGLLL[G]x[R]y(SEQ ID NO 34)代表缺口八肽的擴大形式。加在羧基末端的二肽LL是為了穩定螺旋結構，且也在CD4中存在。[G]x是柔性的甘氨酰接頭。[R]y是一系列精氨酸以便結合到磷脂膜的帶負電的表面上。在氨基末端加上EGG，即柔性的二甘氨酰接頭加谷氨酸(E)，其中E是能夠通過電荷-電荷結合到HIV-1中9位精氨酸上而增加親和力的帶負電的氨基酸。所述肽的α氨基末端通過酰化作用而被封閉，從而除有效電荷并藉此增加膜溶解性。
還公開了包括Z(X)n)IVGGVAGLLL(SEQ ID NO 25)或Z(X)n)IVGGVAGLLL[G]x[R]y，(SEQ ID NO34)的肽，所述肽為缺口八肽的擴大形式。在氨基末端加上Z(X)n，其中(X)n是柔性的接頭，Z是能夠優化與靶位中完全保守的帶正電的氨基酸(R/K)相互作用的部分，例如，谷氨酸(E)，即能夠通過電荷-電荷結合到SEQ ID NO6的9位R/K上而增加親和力的帶負電的氨基酸。此處所公開的編號系統為，其中1處于所述八肽序列的氨基末端，使精氨酸處于HIV-1的9位。所述肽的α氨基和羧基末端能夠分別通過酰化和酰胺化作用而被封閉。
還公開了包括QPMALIVGGVAGLLLFIGLGIFFCVR(SEQ ID NO8)的肽，所述肽代表SEQ ID NO7的擴大形式。然而，末端未封閉所以帶電荷，從而使所述肽跨越并被錨定于細胞膜。基于分子模擬研究所述肽能夠結合缺口結構。
還公開了作為所述缺口序列的鏡像序列的肽。例如，SEQ ID NO13-15和22-25以及SEQ ID NO7具有-G-G-X-X-G-基序，并且能被顛倒為-G-X-X-G-G-。存在于蛋白融合素中的這一基序，同樣包含有所述缺口結構。
公開了形成缺口類型序列但本身并不是共有缺口序列的肽。在某些實施方案中，所述缺口由甘氨酸及其互相之間的相對位置來界定，若它們處于穩定的結構，則所述缺口結構由該甘氨酸序列判定。缺口的維數基于該甘氨酸前后是何種氨基酸。這些序列能夠形成螺旋，通常不會包括例如脯氨酸。在某些實施方案中，公開了包含G-X-X-G-G或G-G-X-X-G并能夠形成螺旋的5個或更多個氨基酸的任何序列。所述缺口能夠由臨近的殘基界定。若需要對帶有缺口的序列的一般性描述，使用X-G-X-X-G-G-X或X-G-G-X-X-G-X，其中X為除甘氨酸外的任何氨基酸。在所述分子中可以包括丙氨酸，例如在每個序列的第一個或最后一個G。所述分子能夠形成合適的三維缺口結構并且能夠結合缺口序列。例如，公開了IVGGLVGL(SEQ ID NO 1)，即HIV-1缺口八肽。在SEQ ID NO1中，氨基和羧基末端能分別被酰基和酰胺封閉從而不帶電。
還公開了包括MIVGGLVGLR(SEQ ID NO9)的肽，該序列是由包括與其鄰接的能夠結合所述缺口結構的氨基末端蛋氨酸(M)以及與其鄰接的精氨酸(R)的HIV-1八肽所組成。所述氨基末端和羧基末端能夠被封閉從而不帶電。帶有電荷的殘基，例如D側鏈，例如SEQ ID NO9中的精氨酸，能夠增加所述分子在諸如可藥用載體的載體中的溶解性。
還公開了包括YIKIFMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNR(SEQ ID NO10)的肽，該序列代表gp160缺口肽的較長的擴大形式。
能夠合成此處所公開的肽。所公開肽的末端可以是封閉或者未封閉的。通常當末端被封閉時，相對于肽的末端而言該肽將不帶電。例如，羧基末端能夠通過酰化反應被封閉，而氨基末端能夠通過酰胺化反應被封閉。當末端未被封閉時，通過能夠將所述肽錨定于膜內的電荷相互作用而有助于跨膜。
對HIV而言，已經檢測了通過模擬病毒或細胞受體蛋白上的位點的寡肽對復制循環的干擾，但是這些肽不是α螺旋狀的且沒有對此處所公開的缺口沒有作用。(Jiang的有關分子SJ2176的美國專利5,444,044中，該分子是卷曲中的卷曲(coil of coils)，且不是此處所公開的功能性分子；以及Wild et al.，AIDS Research & Human Retroviruses11323，1995，其中DP178＝三聚體的T20，這二者均不與所述缺口相互作用，但是干擾可溶性gp160的構象改變。)應當理解的是在某些實施方案中，包括676-702加上KKKC的分子不是缺口抑制劑。Jiang等(Nature，365113，1993)檢測了被描述為“683-707KKKC”的肽，并發現其結合gp160但是并不能在此處所公開的使用p24的體外病毒細胞生長實驗中抑制病毒生長。可能因為kkkc帶正電，從而使進入雙層膜環境的部分減少，然而，正如此處所公開的，所述缺口可能需要處于雙層膜環境中才能發揮抗病毒作用。因此，至少對于認為分子中將會處于膜內的部分而言，優選不帶電的疏水性分子。由于精氨酸高度保守，且很可能將螺旋錨定于膜內并能夠與磷脂中的負電荷相互作用，因此它似乎是必需的。
此外，根據Helseth等人的編號，這對應于gp160的殘基676-702加上包括三個賴氨酸殘基(K)和一個半胱氨酸殘基(C)在內的(非天然的)接頭延長。對由氨基酸676-702加KKKC(SEQ ID NO29，TNWLWYIKLFIMIVGGLVGLRIVFAKKKC)組成的該肽的計算機模擬表明，該肽不形成穩定的α螺旋，從而不會形成穩定的缺口結構。該肽沒有此處所公開的作為缺口抑制劑的活性。這三個賴氨酸(K)和一個半胱氨酸(C)使得螺旋不穩定，導致該肽上較少出現與其它缺口區域相互作用的缺口。
b)抗體所公開的還有能夠結合到缺口區域并充當缺口抑制劑的抗體或者相關分子。應當理解的是在某些實施方案中，所述抗體是或其上包含疏水區域。公開了能夠結合靶序列的抗體(例如多克隆或單克隆抗體，包括嵌合或人源化抗體)。能夠結合靶點的合適分子可以通過任何方法鑒別。例如，能夠合成包括諸如代表缺口的序列的靶氨基酸殘基在內的肽。化學合成的肽能夠與牛血清白蛋白綴合并用來在兔體內產生多克隆抗體。可以應用標準程序來免疫兔并收集血清，如此處所述。可以檢測多克隆抗體結合gp160(或者所述肽段)的能力。對于顯示出與gp160的結合具有高親和力的多克隆抗體而言，可以隨后對gp160的減少進行功能研究。如果空間位阻有可能阻礙對所述抗體更具體的調節作用進行準確評價，可以制備所述多克隆抗體的片段(例如Fab，Fc，F(ab′)2)。例如，所述抗體能夠結合所述缺口結構基序。
或者，能夠采用BALB/c小鼠進行單克隆抗體的生產。對B細胞供體小鼠的免疫可以包括用混合在TiterMaxTM佐劑中的抗原按如下方法對其進行免疫50微克抗原/20微升乳劑×注射2次(在第一天通過在雙側后脅部(hind flank)肌內注射給予)。通過在28天和56天在尾部取血可以提取血液樣本，從而通過ELISA來檢查滴度。在峰值滴度(通常在56天)時，可以通過吸入CO2對小鼠實施安樂死，然后實施脾臟切除并收獲脾細胞，以通過標準方法制備雜交瘤。
此處所使用的術語“抗體”包括但不限于任何種類的完整免疫球蛋白(即完整的抗體)。天然抗體通常是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。通常，每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的個數有所不同。每條重鏈和輕鏈都還具有等距的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端具有可變區(V(H))，繼而有許多恒定區。每條輕鏈的一端具有可變區(V(L))，另一端具有一個恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一恒定區對齊，輕鏈可變區與重鏈可變區對齊。據認為，特定的氨基酸殘基構成輕鏈和重鏈可變區之間的分界面。來自任何脊椎動物物種的抗體的輕鏈可以歸屬為被稱為 (k)和λ(1)兩個明顯不同類型中的一種，這兩種類型是根據其恒定區的氨基酸序列劃分的。根據免疫球蛋白重鏈恒定區的氨基酸序列，它們可以歸屬為不同的種類。人類免疫球蛋白有五種主要的種類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中有幾種可以進一步被劃分為亞類(同種型)，例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本領域的技術人員能夠識別小鼠中相對應的種類。不同種類免疫球蛋白相應的重鏈恒定區分別被稱為α、Δ、ε、γ和μ。
在此處使用術語“可變”來描述可變區的某些部分，這些部分的序列在不同抗體之間不同，并且用在每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性中。然而，這種可變性通常并非在抗體的可變區中均勻地分布。它通常集中在輕鏈和重鏈可變區中三個被稱為互補決定區(CDR)或高變區的片段上。可變區中較為高度保守的部分被稱為骨架區(FR)。天然重鏈和輕鏈中的可變區均包括的四個大量采用β-片層構型的FR區，這四個FR區通過三個形成連接(在某些情況下部分形成)β-片層結構的回折的CDR相連。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地結合在一起，并與來自其他鏈的CDR一起幫助形成抗體中的抗原結合位點(參見Kabat E.A.etal.，″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987))。恒定區并不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出不同的效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒作用。
此處所使用的術語“抗體或其片段”包括具有兩種或多種抗原或表位特異性的嵌合抗體和雜合抗體，以及諸如F(ab′)2、Fab′、Fab等等包括雜合片段在內的片段。因此，提供保持結合其特異性抗原能力的抗體片段。例如，保持缺口結合活性的抗體片段包括在術語“抗體或其片段”的含義之中。這類抗體和片段可以通過本領域已知的技術制得，并能夠根據實施例和針對特異性和活性生產抗體和篩選抗體的常規方法中所提出的方法，針對特異性和活性進行篩選(參見Harlow and Lane.Antibodies，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988))。
抗體片段和抗原結合蛋白(單鏈抗體)的綴合物也包括在“抗體或其片段”的含義之中，例如在美國專利4,704,692中所述，其中的內容通過援引的方式納入。
可選地，抗體在其它物種中產生并被人源化以在人類中給藥。非人類(例如鼠類)抗體的人源化形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原結合序列)，所述片段包括來源于非人類免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(受體(recipient)抗體)，其中來自受體互補決定區(CDR)的殘基被來自諸如小鼠、大鼠或兔等具有所希望的特異性、親和力和性能的非人類物種(供體抗體)CDR的殘基所置換。在某些情況下，人類免疫球蛋白的Fv骨架殘基被相應的非人類殘基置換。人源化抗體還可以包括在受體抗體和輸入的CDR或骨架序列中均未發現的殘基。一般而言，人源化抗體基本上包括至少一個，通常兩個可變區的全部，其中所有或基本上所有的CDR區對應于非人類免疫球蛋白的CDR區，并且所有或基本上所有FR區都是人類免疫球蛋白共有序列的FR區。所述人源化抗體優選還包括至少免疫球蛋白恒定區(Fc)的一部分，通常為人類免疫球蛋白恒定區(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannet al.，Nature，332323-327(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992))。
使非人類抗體人源化的方法為本領域所熟知。一般而言，人源化抗體具有一個或多個由非人類來源引入的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基經常被稱作“輸入”殘基，它們通常來自“輸入”的可變區。人源化基本上可以遵循Winter及其同事的方法(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))，通過用嚙齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體的相應序列而實現。因此，這種“人源化”抗體為嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中基本上小于完整的人類可變區被來自非人類物種的相應序列所取代。事實上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基以及可能有一些FR殘基被來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基所取代的人類抗體。
為了減小抗原性，對用于制造人源化抗體的包括重鏈和輕鏈在內的人類可變區的選擇是非常重要的。根據“最優擬合(best-fit)”方法，對已知的人類可變區序列的完整文庫，篩選嚙齒類動物抗體可變區序列。然后，最接近于嚙齒類動物序列的人類序列被作為人源化抗體的人類骨架區(FR)(Sims et al.，J.Immunol.，1512296(1993)和Chothia etal.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法使用來源于輕鏈或重鏈特定亞群的所有人類抗體中的共有序列的特定骨架。相同的骨架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，1512623(1993))。
此外，使人源化的抗體保持對抗原的高親和力以及其它有利的生物學特性是很重要的。為了達到這一目標，根據優選的方法，通過使用親代和人源化序列的三維模型，分析親代序列和各種概念上的人源化產物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型可通過一般方法獲得并為本領域的技術人員所熟悉。可以獲得闡明并顯示選定的候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算機程序。檢查這些顯示結果使得能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原能力的殘基。這樣，可以從共有和輸入序列中選擇和組合FR殘基，從而獲得所希望的抗體特征，例如對靶抗原增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接地并最主要地參與影響抗原的結合(參見，WO 94/04679，1994年3月3日公開)。
可以使用在沒有內源性免疫球蛋白產生的情況下，免疫中能夠產生人類抗體所有組成成分的轉基因動物(例如，小鼠)。例如，已經敘述了在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(J(H))基因的純合子缺失會導致完全抑制內源性抗體的產生。在這種種系突變小鼠中，移入人類種系免疫球蛋白基因陣列會導致在受到抗原攻擊時產生人類抗體(參見，例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-255(1993)Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemannet al.，Year in Immuno.，733(1993))。人類抗體也可以在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks etal.，J.Mol.Biol.，222581(1991))。Cote等人和Boerner等人的技術也可以用于制備人類單克隆抗體(Coleetal.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。
公開了產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。此處所使用的術語“單克隆抗體”是指從主要為抗體的同類種群中，即除了可能自然發生的可以少量存在的突變之外構成種群的單個抗體是相同的，獲得的抗體。此處的單克隆抗體具體包括重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或屬于特定抗體種類或亞類的抗體中相應的序列相同或同源，而鏈的剩余部分與來自另一物種或屬于另一抗體種類或亞類的抗體中相應的序列相同或同源的“嵌合”抗體，以及這類抗體的片段，只要它們表現出所希望的活性(參見，美國專利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。
單克隆抗體可以采用雜交瘤方法來制備，例如Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)或者Harlow和Lane，Antibodies，A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)所敘述的方法。在雜交瘤方法中，通常將小鼠或其它合適的宿主動物用免疫試劑免疫，從而誘發產生或能夠產生特異性結合免疫試劑的抗體的淋巴細胞。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。優選地，免疫試劑包括SEQ ID NO1-25的一個或多個。傳統上，單克隆抗體的產生取決于用作免疫原的純化蛋白或肽的有效性。新近，基于DNA的免疫已經顯示出作為誘發強烈免疫應答并產生單克隆抗體的方法的希望。在這種方法中，根據本領域已知(例如，Kilpatrick KE，et al.Gene gun delivered DNA-basedimmunizations mediate rapid production of murine monoclonalantibodies to the Flt-3receptor.Hybridoma.1998Dec；17(6)569-76；Kilpatrick KE et al.High-affinity monoclonalantibodies to PED/PEA-15 generated using 5 microg of DNA.Hybridoma.2000 Aug；19(4)297-302，對于抗體產生方法而言，所述文獻在此通過援引的方式完整地納入)并在實施例中敘述的方法，可以使用基于DNA的免疫，其中向宿主動物中注射編碼諸如缺口結構基序的gp160一部分的DNA，所述gp160的部分和人類IgG1一起表達為融合蛋白。
另一種用純化的蛋白或DNA進行免疫的方法要使用桿狀病毒中表達的抗原。這種系統的優勢包括易于產生、高水平表達以及與哺乳動物系統極為相似的翻譯后加工。使用這種系統包括表達融合蛋白形式的缺口抗體的結構域。通過在缺口抗體核苷酸序列的信號序列和成熟蛋白結構域之間插入結構內基因片段而產生抗原。這會導致在病毒體表面呈現外源蛋白。這種方法使得能夠用全病毒免疫，不需要純化靶抗原。
一般而言，如果需要人源細胞，在產生單克隆抗體的方法中使用外周血淋巴細胞(“PBL”)；或者如果需要非人類哺乳動物來源，使用脾細胞或淋巴結細胞。然后將淋巴細胞與無限增殖細胞系用諸如聚乙二醇的合適的融合試劑融合，從而形成雜交瘤細胞(Goding，″MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice″Academic Press，(1986)pp.59-103)。無限增殖細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，包括嚙齒類動物、牛、馬以及人源的骨髓瘤細胞。通常采用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。可以在優選包含一種或多種抑制未融合的無限增殖細胞生長或存活的物質的合適培養基中培養雜交瘤細胞。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤細胞培養基通常會包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培養基”)，這些物質阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。優選能夠有效融合，支持選定的抗體產生細胞穩定地高水平表達抗體，并且對培養基(例如HAT培養基)敏感的無限增殖細胞系。更優選的無限增殖細胞系為可以從諸如SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.和theAmerican Type Culture Collection，Rockville，Md獲得的鼠骨髓瘤細胞系。人骨髓瘤和鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已被敘述用于產生人類單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，″Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications″Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63)。然后檢測培養雜交瘤細胞的培養基是否出現針對例如缺口結構基序的單克隆抗體。優選地，通過免疫沉淀作用或體外結合測定法，例如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)來判定由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。這類技術和測定法在本領域中已知并將在以下實施例或在Harlow和Lane的″Antibodies，A Laboratory Manual″Cold SpringHarbor Publications，New York，(1988)中進一步敘述。
在鑒定所需的雜交瘤細胞之后，通過有限稀釋或FACS揀選法將所述克隆亞克隆，并通過標準方法培養。適于該目的的培養基包括，例如Dulbecco的改良伊格爾氏培養基(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium)和RPMI-1640培養基。或者，可以在體內如哺乳動物的腹水中培養雜交瘤細胞。
通過常規免疫球蛋白純化方法，例如蛋白A-Sepharose、蛋白G、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜可以從培養基或腹水流體中分離或純化由亞克隆分泌的單克隆抗體。
還可以通過例如美國專利4,816,567中所敘述的重組DNA方法制得單克隆抗體。編碼單克隆抗體的DNA可以使用常規方法(例如，通過使用能夠特異性結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈基因的寡核苷酸探針)很容易地分離和測序。雜交瘤細胞可作為這種DNA的優選來源。一旦DNA被分離，就可以置于表達載體中，隨后將表達載體轉染到諸如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、漿細胞瘤細胞或骨髓瘤細胞等本身不產生免疫球蛋白的宿主細胞中，從而實現在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。所述DNA也可以是修飾過的，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區的編碼序列取代鼠的同源序列(美國專利4,816,567)，或者通過共價連接非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列至免疫球蛋白編碼序列。可選地，用這種非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒定區或取代抗體中一個抗原結合位點的可變區，從而產生包括一個對缺口結構基序具有特異性的抗原結合位點和另一個對諸如gp160的不同抗原具有特異性的抗原結合位點的嵌合二價抗體。
對于制備單價抗體而言，體外方法也是合適的。可以使用本領域已知的常規技術來實現抗體消化以產生其片段，特別是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶來實現消化。木瓜蛋白酶消化的實例在1994年12月22公開的WO 94/29348，美國專利4,342,566，以及Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York，(1988)中有所敘述。木瓜蛋白酶消化抗體通常產生兩個相同的被稱為Fab片段的抗原結合片段(各自具有一個抗原結合位點)以及剩余的Fc片段。胃蛋白酶處理產生稱為F(ab′)2片段的片段，該片段具有兩個抗原結合位點并仍能夠交聯抗原。
在抗體消化中產生的Fab片段也包括輕鏈的恒定區和重鏈的第一個恒定區。Fab′片段區別于Fab片段在于，在重鏈結構域的羧基末端增加包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱氨酸在內的幾個殘基。F(ab′)2片段是包括兩個在鉸鏈區通過二硫鍵連接的Fab′片段的二價片段。Fab′-SH在此處是指其中恒定區的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab′。抗體片段最初以二者間具有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab′片段產生。抗體片段的其它化學偶合也已知。
還提供了分離的免疫原上特異的抗體互補位或片段。所述抗體的特異免疫原性表位可以通過化學或機械破碎分子從完整抗體中分離。通過此處所講授的方法檢測所得到的純化片段，從而確定它們的免疫原性和特異性。可選地，直接合成抗體免疫反應性互補位。免疫反應性片段被定義為來自抗體氨基酸序列的至少約二至五個連續氨基酸的氨基酸序列。
一種產生包括所述抗體的蛋白的方法為通過蛋白質化學技術將兩個或多個肽或多肽連接在一起。例如，采用目前可以得到的實驗室設備使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化學法化學合成肽或多肽(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。本領域技術人員能夠容易地認識到相當于所述抗體的肽或多肽可以通過例如標準化學反應合成。例如，肽或多肽可以合成且不從其合成樹脂上斷裂，而抗體的另一個片段可以合成并隨后從該樹脂上斷裂，從而暴露了在另一個片段上功能被阻斷的末端基團。通過肽縮合反應，這兩個片段能夠分別在其羧基和氨基末端通過肽鍵共價連接，從而形成抗體或其片段。(Grant GA(1992)Synthetic PeptidesA User Guide.W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1992)；Bodansky M and Trost B.，Ed.(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.，NY)。或者，肽或多肽按上述在體內獨立合成。這些獨立的肽或多肽一旦被分離，就可以通過類似的肽縮合反應連接從而形成抗體或其片段。
例如，克隆或合成的肽片段的酶連接使得相對較短的肽片段能夠被連接從而產生較大的肽片段、多肽或完整的蛋白結構域(Abrahmsen Letal.，Biochemistry，304151(1991))。或者，可以利用合成肽的天然化學連接，從較短的肽片段來合成性地構建大的肽或多肽。這種方法包括一個兩步的化學反應(Dawson et al.Synthesis of Proteins byNative Chemical Ligation.Science，266776-779(1994))。第一步是未保護的合成肽的α硫酯與另一個包含氨基末端Cys殘基的未保護肽片段的化學選擇性反應，以產生硫酯連接的中間產物作為初始共價產物。不改變反應條件，該中間產物經過自發的快速分子內反應在連接位點形成天然肽鍵。通過制備人白細胞介素8(IL-8)對這種天然化學連接方法應用于蛋白質分子的全合成進行了說明(Baggiolini M et al.(1992)FEBS Lett.30797-101；Clark-Lewis I et al.，J.Biol.Chem.，26916075(1994)；Clark-Lewis I et al.，Biochemistry，303128(1991)；Rajarathnam K et al.，Biochemistry 336623-30(1994))。
或者，未保護的肽片段被化學連接，而由于化學連接而在肽片段之間形成的價鍵是非天然(非肽)價鍵(Schnolzer，M et al.Science，256221(1992))。這種技術已經用來合成蛋白結構域類似物以及大量相對純的具有全部生物學活性的蛋白(deLisle Milton RC et al.，Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press，New York，pp.257-267(1992))。
還公開了具有生物活性的抗體的片段。所述多肽片段可以是通過在能夠產生其多肽片段的表達系統中(例如腺病毒或桿狀病毒表達系統)，克隆編碼該多肽的核酸而得到的重組蛋白。例如，從能夠引起與抗體和缺口結構基序相互作用相關的生物學效應的特定雜交瘤，可以確定抗體的活性結構域。例如，被發現對抗體的活性、結合特異性或親和力均沒有幫助的氨基酸可以被除去而不使各自的活性受損。例如，在不同的實施方案中，氨基或羧基末端氨基酸從天然或被修飾的非免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子中連續除去，并且通過許多可用的測定方法中的一種來測定各自的活性。在另一個實施例中，抗體片段包括修飾抗體，其中在某一特定位置至少一個氨基酸取代了天然出現的氨基酸，并且氨基末端或羧基末端氨基酸的一部分或者連抗體的內部區域都已經被有助于修飾抗體純化的多肽片段或諸如生物素的其它部分所置換。例如，修飾抗體可以與麥芽糖結合蛋白融合，通過肽化學或者將分別編碼下述兩個多肽片段的核酸克隆到表達載體上，這樣編碼區的表達導致產生雜合多肽。通過將該雜合多肽加載到直鏈淀粉親和層析柱上而使其親和純化，然后通過用特異性蛋白酶因子Xa斷裂雜合多肽，可以使修飾抗體的受體從麥芽糖結合區解離下來。(參見，例如New England Biolabs ProductCatalog，1996，164頁.)。對于從真核細胞中分離雜合蛋白而言，也可以使用類似的純化方法。
倘若所述片段的活性與未修飾的抗體或抗體片段相比并不顯著改變或受損，那么所述片段(不管是否連有其它序列)包括對具體區域或具體氨基酸殘基的插入、缺失、置換或其它選定的修飾。這些修飾可以提供一些另外的特性，例如為了除去或增加能夠形成二硫鍵的氨基酸，延長其生物壽命，改變其分泌特性等。在任何情況下，所述片段必須具備生物活性，例如結合活性，結合結構域結合的調控等。抗體的功能區或活性區可以通過對蛋白特定區域的誘變，隨后表達并檢測所表達的多肽來鑒定。這種方法對本領域技術人員來說是顯而易見的，且所述方法包括對編碼抗原的核酸的定點誘變。(Zoller MJ et al.Nucl.Acids Res.106487-500(1982)。
可以使用多種免疫測定方式，來挑選選擇性結合特定蛋白、變異體或片段的抗體。例如，常規采用固相ELISA免疫測定法來挑選與蛋白、蛋白變異體或其片段發生選擇性免疫反應的抗體。對可用于確定選擇性結合的免疫測定方式和條件的敘述而言，參見Harlow and Lane.Antibodies，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。單克隆抗體的結合親和力可以通過，例如Munson etal.，Anal.Biochem.，107220(1980)中的Scatchard分析法來確定。
還提供了包括裝有單克隆抗體或其片段的容器，和一種或多種用于確定抗體或其片段與缺口結構基序結合的試劑的抗體試劑盒。所述試劑可以包括，例如熒光標記、酶標記或其它標記。所述試劑還可以包括，二抗或三抗或者用于酶促反應的試劑，其中所述酶促反應生成可見的產物。
c)功能性核酸功能性核酸是具有諸如結合靶分子或催化特定反應等特定功能的核酸分子。功能性核酸分子可以分為并非用來限制的以下類別。例如，功能性核酸包括反義分子、適體、核酶、形成三螺旋的分子、RNAi以及外部引導序列。所述功能性核酸分子可以充當靶分子所具有的特定活性的影響劑(affectors)、抑制劑、調節劑和刺激劑，或者所述功能性核酸分子可以具備不依賴于任何其它分子的新活性。
功能性核酸分子可以與諸如DNA、RNA、多肽或糖鏈等任何大分子相互作用。因而，功能性核酸可以與缺口結構基序的mRNA或缺口結構基序的基因組DNA相互作用，或者所述功能性核酸可以與缺口結構基序的多肽相互作用。功能性核酸常常被設計用來與其它基于靶分子和功能性核酸分子之間序列同源性的核酸相互作用。在其它情況下，功能性核酸分子和靶分子之間的特異性識別不是基于功能性核酸分子和靶分子之間的序列同源性，而是基于形成能夠產生特異性識別的三級結構。
應當理解的是，在某些實施方案中優選特異性靶向編碼缺口的mRNA的功能性核酸，因為缺口是高度保守的蛋白質基序。所述高度保守的蛋白質基序具有確定的一組能夠編碼該蛋白質基序的mRNA或RNA或DNA。因而，這一區域代表了優選的破壞mRNA或病毒基因組的靶點，因為病毒基因組或mRNA應該比在基因組的其它部分中更保守，所述其它部分中蛋白質序列可以變化，這使得在編碼該蛋白的核酸水平上可以有更大的變化。例如，可以使用諸如反義、核酶和RNAi等簡并(degenerate)靶分子，且簡并靶分子具有靶向更抗變異的區域的優點。快速進化的病毒通常需要保存高度保守的蛋白結構特征，這限制了在基因組水平上發生的變異。
還應當理解的是，所公開的核酸可以用于RNAi或RNA干擾。據認為，RNAi包括一個兩步的RNA干擾(RNAi)機制引發步驟和效應步驟。例如，在第一步中，導入的雙鏈(ds)RNA(siRNA)被處理成小片段，例如21-23個核苷酸的“引導序列”。RNA擴增似乎能夠在整個動物中發生。然后通常所述引導RNA可以摻入到能夠降解RNA的蛋白質RNA復合物中，所述復合物即被稱為RNA誘導沉默復合物(RISC)的核酸酶復合物。在第二個效應步驟中，所述RISC復合物破壞由引導RNA通過堿基配對相互作用而識別的mRNA。RNAi包括通過任何方式將雙鏈RNA引入細胞，這能夠觸發導致靶RNA降解的事件。RNAi是轉錄后基因沉默的一種方式。公開了能夠在RNAi中起作用的RNA發夾結構。
已經顯示RNAi能夠在包括哺乳動物細胞在內的多種細胞中起作用。對于在哺乳動物細胞中起作用而言，優選將用作RISC復合物中的靶向序列的RNA分子較短。例如，長度小于或等于50或40或30或29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11或10個核苷酸。相對于將被切割的目的RNA而言，所述RNA分子還可以具有3′或5′端的懸突。這些懸突的長度可以至少或小于或等于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15或20個核苷酸。RNAi可以在哺乳動物干細胞中起作用，例如小鼠ES細胞。對于制備和使用RNAi分子的敘述而言，參見例如，Hammondet al.，Nature Rev Gen 2110-119(2001)；Sharp，Genes Dev 15485-490(2001)，Waterhouse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(23)13959-13964(1998)，所述文獻全部在此通過援引的方式完整地納入，并至少構成涉及RNAi分子的運送和制備的資料。
對于高度保守的七肽序列V/I-G-G-L/I-V/I-G-L/I而言，RNAi分子的簡并組可以由表9所示的序列組成。
表9

在每個位置允許有所指出的變化形式。由于簡并寡核苷酸合成的機制，所述組可以象任何21聚體一樣很容易地合成。應當理解的是，RNAi分子可以象本領域所了解的一樣被運送和使用，包括通過載體以及伴有由PolIII啟動子表達的運送。應當理解的是表8中的序列可以由RNA得到，可以制成雙鏈RNA，可以制成DNA或雙鏈DNA，以及上述所有的化學合成變體。在某些實施方案中，siRNA可以制成短發夾結構，且通過加入環狀區以及該序列和互補序列，這些短發夾可以加入表8的序列中。例如，環狀區可以是5′-TTTTTTTTT-3′，5′-TATATATATA-3′，5′-TCTCTCT-3′，或其任何組合，直到形成例如，20聚體的環。還應當理解的是，表8中的所有分子都可以制成任何莖環或雙鏈分子，包括如此處所詳述的任何3′或5′懸突部分。RNAi分子可以以酶合成或化學合成的雙鏈RNA、單鏈RNA運送，且所述RNAi分子還可以由表達它們的載體產生。應當理解的是，如果表8中的序列是RNA，將T變成U。
通過標準或非標準的堿基配對設計反義分子以與靶核酸分子相互作用。設計反義分子和靶分子的相互作用，從而通過例如RNAseH介導的RNA-DNA雜合分子降解來促進對靶分子的破壞。或者設計反義分子，從而阻斷通常會在靶分子上發生的加工作用，例如轉錄或復制。可以基于靶分子的序列設計反義分子。存在多種通過查找靶分子中最易受作用的區域來優化反義效率的方法。示例性的方法有使用DMS(二甲亞砜)和DEPC(焦碳酸二乙酯)的體外選擇實驗和DNA修飾作用研究。優選反義分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解離常數(kd)結合靶分子。有助于設計和使用反義分子的方法和技術的代表性例子可以在以下非限制性的美國專利列表中找到5,135,917，5,294,533，5,627,158，5,641,754，5,691,317，5,780,607，5,786,138，5,849,903，5,856,103，5,919,772，5,955,590，5,990,088，5,994,320，5,998,602，6,005,095，6,007,995，6,013,522，6,017,898，6,018,042，6,025,198，6,033,910，6,040,296，6,046,004，6,046,319和6,057,437。應當理解的是還公開了具有表9中所公開的序列的反義分子，但是所述分子可以優化為脫氧核糖核酸分子以及RNA分子或它們的修飾形式。
適體是優選以特異性方式與靶分子相互作用的分子。通常適體是長度為15-50個堿基并折疊成諸如莖環或G四聚體等確定二級和三級結構的小核酸。適體能夠結合諸如ATP(美國專利5,631,146)和茶堿(美國專利5,580,737)等小分子以及諸如逆轉錄酶(美國專利5,786,462)和凝血酶(美國專利5,543,293)等大分子。適體能夠與靶分子以小于10-12M的kd值緊密結合。優選適體以小于10-6、10-8、10-10或10-12的kd值結合靶分子。適體能夠以極高程度的特異性結合靶分子。例如，已經分離出在靶分子和另一僅在分子上的一個位置不同的分子之間，結合親和力有大于10000倍差異的適體(美國專利5,543,293)。優選適體與靶分子的kd值與背景結合分子的kd值相比至少低10，100，1000，10,000或100,000倍。優選地，例如在對多肽進行比較時，所述背景分子為不同的多肽。例如，當確定缺口適體的特異性時，所述背景蛋白可以是血清白蛋白。如何制造和使用適體以結合各種不同的靶分子的代表性實例，可以在以下非限制性美國專利列表中找到5,476,766，5,503,978，5,631,146，5,731,424，5,780,228，5,792,613，5,795,721，5,846,713，5,858,660，5,861,254，5,864,026，5,869,641，5,958,691，6,001,988，6,011,020，6,013,443，6,020,130，6,028,186，6,030,776和6,051,698。
核酶是能夠催化分子內或分子間化學反應的核酸分子。因此，核酶是催化型的核酸。優選核酶催化分子間反應。有許多不同類型的催化核酸酶或核酸聚合酶型反應的核酶，所述反應基于在天然系統中發現的核酶，例如錘頭狀核酶(例如，但不限與以下美國專利5,334,711，5,436,330，5,616,466，5,633,133，5,646,020，5,652,094，5,712,384，5,770,715，5,856,463，5,861,288，5,891,683，5,891,684，5,985,621，5,989,908，5,998,193，5,998,203，Ludwig和Sproat的WO 9858058，Ludwig和Sproat的WO9858057，以及Ludwig和Sproat的WO 9718312)、發夾結構核酶(例如，但不限于以下美國專利5,631,115，5,646,031，5,683,902，5,712,384，5,856,188，5,866,701，5,869,339和6,022,962)以及四膜蟲核酶(例如，但不限于以下美國專利5,595,873和5,652,107)。還有許多不是在天然系統中發現但是已經被設計用于催化特定新型反應的核酶(例如，但不限于以下美國專利5,580,967，5,688,670，5,807,718和5,910,408)。優選的核酶切割RNA或DNA底物，并更優選切割RNA底物。核酶通常通過識別、結合靶核酸底物(伴隨隨后的切割)來切割核酸。這種識別通常主要基于標準或非標準堿基配對相互作用。該特性使核酶成為特別好的針對核酸靶特異性切割的候選物，因為對靶底物的識別是基于靶底物的序列。如何制造和使用核酶以催化各種不同反應的代表性實例可以在以下非限制性美國專利列表中找到5,646,042，5,693,535，5,731,295，5,811,300，5,837,855，5,869,253，5,877,021，5,877,022，5,972,699，5,972,704，5,989,906和6,017,756。
形成三螺旋的功能性核酸分子是能夠與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當三螺旋分子與靶區相互作用時，形成稱為三螺旋的結構，其中有三條DNA鏈依靠Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對構成復合物。優選三螺旋分子，因為它們能夠以高親和力和特異性結合靶區。優選形成三螺旋的分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的kd值結合靶分子。如何制造和使用形成三螺旋的分子以結合各種不同靶分子的代表性實例可以在以下非限制性美國專利列表中找到5,176,996，5,645,985，5,650,316，5,683,874，5,693,773，5,834,185，5,869,246，5,874,566和5,962,426。
外部引導序列(EGS)是結合形成復合物的靶核酸分子的分子，且所述復合物由切割靶分子的RNase P識別。可以設計EGS從而特異性靶向選定的RNA分子。RNase P有助于在細胞內處理轉運RNA(tRNA)。可以募集細菌RNase P，從而通過使用導致靶RNAEGS復合物模擬天然tRNA底物的EGS，來切割幾乎任何RNA序列。(WO 92/03566 by Yale，以及Forster and Altman，Science238407-409(1990))。
類似地，可以利于真核EGS/RNAse P指導的RNA切割在真核細胞內切割所希望的靶點。(Yuan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898006-8010(1992)；WO 93/22434 by Yale；WO 95/24489 by Yale；Yuanand Altman，EMBO J14159-168(1995)，以及Carrara et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)922627-2631(1995))。如何制造和使用EGS分子從而便于切割各種不同靶分子的代表性實例可以在以下非限制性美國專利列表中找到5,168,053，5,624,824，5,683,873，5,728,521，5,869,248和5,877,162。
d)通過用公開的組合物組合化學和鑒定方法篩選而被鑒定的組合物此處所公開的信息為治療性分子提供了靶點。所述治療性分子可以采用包括諸如組合化學技術以及分子模擬在內的任何方法來鑒定。鑒定方法的一個方面為發現gp160中的某些序列是高度保守的，且這些序列形成與HIV的感染性相關聯的獨特結構。可以采用各種利用所述信息的方法。例如，由于已知所述保守缺口區域的三維結構，因此可以將該結構用于模擬候選結合分子能夠在其中對接的坐標。根據所公開的方法，鑒定方法可以用于任何分子。應當理解的是，通過例如反義或核酶技術，也能夠鑒定通過與病毒核酸相互作用而抑制病毒復制的，在編碼多肽缺口區域的核酸處發生特異性相互作用的分子，且所述分子已被公開。
例如，使用例如用來鑒定結合缺口區域的抑制劑的組合化學和分子庫，小分子缺口抑制劑可以按此處所詳述的的方法鑒定。例如，可以將“擬肽”化合物(Simon et al，Proceedings of the National Academyof Science，USA 899367，1992)用于篩選。篩選方法包括，例如，將缺口區域附著于諸如96孔板的支持物上，并分離結合缺口區域的分子。可以加入諸如三氟代乙醇等試劑以穩定α-螺旋特征。也可以加入試劑以增加塑料和缺口區域之間的親和力，例如通過諸如缺口序列氨基末端的化學性固定化作用-例如通過碳二亞胺活化并與缺口肽氨基末端孤立氨基的反應，COOH衍生塑料能夠固定缺口肽。
在其它方法中，可以將化合物庫以低濃度溶解在微團中，從而模擬病毒缺口在其中正常發揮作用的膜環境。可以將所述溶液加入用缺口模型化合物包被的孔中，孵育以產生可能的結合，然后重新檢測從而確定可能的濃度下降。
在另一個實施例中，還可以使用此處所詳述的分子模擬來鑒定分子。利用所述“缺口”的尺度，即大約5-6A深及10A寬，能夠實現對諸如小分子結構數據庫等分子結構數據庫的搜索，從而鑒定諸如有機小分子等能夠結合缺口的分子。疏水性也可加入到查詢之中。大部分“對接”程序通常假定一個水性環境，可以設置模擬膜環境的局部電解質。
(1)組合化學所公開的組合物可以用作任何組合技術中的靶點，從而鑒定以所希望的方式與所公開的組合物相互作用的分子或大分子。此處所公開的核酸、肽以及相關的分子可以用作組合方法中的靶點。還公開了通過組合技術或篩選技術而鑒定的組合物，其中在此處公開的任何序列或其部分的一種中所公開的組合物，在組合或篩選程序中用作靶點。應當理解的是，可以利用此處所詳述的缺口物理尺度來設計并實現所需的組合式方法。
應當理解的是當在組合技術或篩選方法中使用所公開的組合物時，將會鑒定出具有諸如抑制或興奮作用或者具有靶分子的功能等特別希望的特性的分子，例如大分子。還公開了在利用所公開的諸如此處所公開的任何序列之一的組合物時，鑒定并分離出的分子。因此，使用包括所公開的諸如此處所公開的任何序列之一的組合物在內的組合或篩選方法所得到的產物，也認為在此處公開了。
組合化學包括但不限于，分離通常在重復步驟中能夠結合小分子或另一種大分子的小分子或大分子的全部方法。大分子的實例有蛋白、寡核苷酸以及糖(低聚糖)。例如，在被稱為“體外遺傳學”(Szostak，TIBS1989，1992)中，可以從隨機寡核苷酸的復雜混合物中分離具有特定功能(催化或配體結合)的寡核苷酸分子。合成具有隨機和確定序列的大型分子庫，并對該復雜混合物，例如100μg 100個核苷酸的RNA中存在的約1015單個序列，進行選擇或富集處理。通過對結合到層析柱中配體上的分子進行親和色譜和PCR擴增的重復循環，Ellington和Szostak(1990)估計，每1010RNA分子中有1個折疊的方式可使之與不同的小分子染料結合。具有這種配體結合行為的DNA分子也已經被分離(Ellingtonand Szostak，1992；Bock et al，1992)。對于本領域技術人員所知的有機小分子、蛋白、抗體以及其它大分子而言，存在針對類似目的的技術。無論基于有機小分子庫、寡核苷酸或抗體，對所希望的活性進行成批分子的篩選都被廣義地稱為組合化學。組合技術尤其適合于界定分子間的相互作用以及分離具有特異性結合活性的分子，當大分子是核酸時通常被稱為適體。
有許多分離具有新生活性或改良活性的蛋白的方法。例如，噬菌體展示文庫已經被用于分離多種與特定靶點相互作用的肽。(參見，例如，美國專利No.6,031,071、5,824,520、5,596,079和5,565,332，對于至少與噬菌體展示相關的資料以及與組合化學相關的方法而言，所述專利在此通過援引的方式納入。)Roberts和Szostak敘述了一種優選的分離具有特定功能的蛋白的方法(Roberts R.W.and Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(23)12997-302(1997)。這種組合化學方法結合了蛋白質的功能力量和核酸的遺傳力量。產生一種RNA分子，其中博羅米星(puromycin)分子與該RNA分子的3′端共價連接。所述被修飾的RNA分子的體外翻譯產生由該待翻譯的RNA編碼的正確蛋白。另外，由于連接了博羅米星，即不能被延伸的肽酰受體，增長的肽鏈就連接到與RNA相連的博羅米星上。因此，蛋白分子連接到編碼它的遺傳物質上。這時可以進行正常的體外選擇操作，從而分離功能性肽。一旦完成對肽功能的選擇操作，就實施傳統的核酸處理操作以使編碼選定的功能性肽的核酸擴增。遺傳物質被擴增之后，新RNA和3′端的博羅米星一起被轉錄，新肽被翻譯并且實現了另一輪功能性選擇。因此，就像核酸選擇技術一樣，可以以重復的方式實現蛋白選擇作用。翻譯的肽由連接到博羅米星上的RNA序列控制。所述序列可以是來自構建用于最佳翻譯的隨機序列中的任何序列(即沒有終止密碼子等)或者可以是已知RNA分子的簡并序列，從而尋找已知肽的改善或改變的功能。核酸擴增和體外翻譯的條件為本領域技術人員所熟知，并且優選按Roberts和Szostak(Roberts R.W.and SzostakJ.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(23)12997-302(1997))中的方法實施。
另一種優選的設計用于分離肽的組合法的方法在Cohen等(Cohen B.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(24)14272-7(1998))中有所敘述。這種方法利用并改進雙雜交技術。酵母雙雜交系統對于檢測和分析蛋白-蛋白相互作用是有益的。最初在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中有所敘述的雙雜交系統，對于鑒定新的對感興趣的蛋白具有特異性的調控分子而言是強大的分子遺傳技術(Fields and Song，Nature 340245-6(1989))。Cohen等人改良了該技術，因而能夠鑒定合成或構建的肽序列之間新的相互作用，該序列結合選定的分子。這種類型技術的益處在于選擇在細胞內環境完成。所述方法利用連接到酸性激活結構域的肽分子文庫。選定的肽，例如缺口結構基序，結合到諸如Gal 4的轉錄激活蛋白中的DAN結合結構域上。通過對這種類型的系統實施雙雜交技術，可以鑒定出結合缺口結構基序的分子。
使用為本領域技術人員所熟知的方法學，結合各種組合文庫，能夠分離并鑒定與所需的靶點結合或相互作用的小分子或大分子。可以對這些化合物的相對結合親和力進行比較并利用為本領域技術人員所熟知的競爭性結合研究鑒定出最佳化合物。
建立組合文庫并篩選組合文庫以分離結合所需靶點的分子的技術為本領域技術人員所熟知。代表性的技術和方法可以在美國專利5,084,824，5,288,514，5,449,754，5,506,337，5,539,083，5,545,568，5,556,762，5,565,324，5,565,332，5,573,905，5,618,825，5,619,680，5,627,210，5,646,285，5,663,046，5,670,326，5,677,195，5,683,899，5,688,696，5,688,997，5,698,685，5,712,146，5,721,099，5,723,598 5,741,713，5,792,431，5,807,683，5,807,754，5,821,130，5,831,014，5,834,195，5,834,318，5,834,588，5,840,500，5,847,150，5,856,107，5,856,496，5,859,190，5,864,010，5,874,443，5,877,214，5,880,972，5,886,126，5,886,127，5,891,737，5,916,899，5,919,955，5,925,527，5,939,268，5,942,387，5,945,070，5,948,696，5,958,702，5,958,792，5,962,337，5,965,719，5,972,719，5,976,894，5,980,704，5,985,356，5,999,086，6,001,579，6,004,617，6,008,321，6,017,768，6,025,371，6,030,917，6,040,193，6,045,671，6,045,755，6,060,596，和6,061,636中找到，但并不限于所述專利。
可以利用許多不同的合成技術從一大批分子中建立組合文庫。例如，包括融合的2，4-嘧啶二酮(美國專利6,025,371)二氫苯并吡喃(美國專利6,017,768和5,821,130)，酰胺醇(美國專利5,976,894)，羥基氨基酸酰胺(美國專利5,972,719)碳水化合物(美國專利5,965,719)，1，4-苯二氮卓-2，5-二酮(美國專利5,962,337)，環狀化合物(美國專利5,958,792)，聯芳氨基酸酰胺(美國專利5,948,696)，噻吩類(美國專利5,942,387)，三環四氫喹啉類(美國專利5,925,527)，苯并呋喃類(美國專利5,919,955)，異喹啉類(美國專利5,916,899)，乙內酰脲和乙內酰硫脲(美國專利5,859,190)，吲哚類(美國專利5,856,496)，咪唑-吡啶并-吲哚和咪唑-吡啶并-苯并噻吩(美國專利5,856,107)，取代的2-亞甲基-2，3-二氫噻唑(美國專利5,847,150)，喹啉類(美國專利5,840,500)，PNA(美國專利5,831,014)，包括標記(美國專利5,721,099)，聚酮化合物(美國專利5,712,146)，嗎啉代亞基(美國專利5,698,685和5,506,337)，硫酰胺(美國專利5,618,825)，和苯二氮卓類(美國專利5,288,514)的文庫。
此處使用的組合方法和文庫包括傳統的篩選方法和文庫以及用在重復步驟中的方法和文庫。
(2)計算機輔助鑒定對于任何分子模擬技術而言，公開的組合物可以被用作靶點，從而鑒定所公開的組合物的結構或鑒定以希望的方式與所公開的組合物相互作用的假想的或實際的分子，例如小分子。此處所公開的核酸、肽以及相關的分子可以在任何分子模擬程序或方法中用作靶點。
應當理解的是，當在模擬技術中使用所公開的組合物時，具有特別希望的特性例如抑制或興奮或靶分子功能的、諸如大分子的分子將被鑒定出來。使用公開的組合物時所鑒定和分離的分子，例如缺口結構基序結構域也被公開。因此，也在此認為公開了應用涉及所公開組合物的分子模擬方法所產生的產物，如缺口結構基序。
因此，一種分離結合選定分子的分子的方法是通過合理設計。這通過結構信息和計算機模擬來實現。計算機模擬技術使得選定分子的三維原子結構能夠可視化，并且能夠對與所述分子相互作用的新化合物進行合理設計。三維結構通常取決于來自選定分子的x射線晶體衍射分析或核磁共振成像的數據。分子動力學需要力場數據。計算機制圖系統使得能夠預測新化合物怎樣結合到靶分子上，并允許對化合物和靶分子的結構進行實驗性操作，從而優化結合特異性。當分子和化合物其一或二者產生微小變化時，預測分子-化合物之間是什么樣的相互作用需要分子力學軟件和計算密集型計算機，通常結合有分子設計軟件和用戶之間的用戶友好、菜單驅動的界面。
分子模擬系統的實例有CHARMm和QUANTA程序(Polygen公司，Waltham，MA)。CHARMm實現能量最低化和分子動力學功能。QUANTA實現構建、圖形模擬和分子結構分析。QUANTA允許彼此交互的構建、修飾、可視化和分子行為分析。正如技術人員所了解的，被稱為HINT的程序也已經被用來檢查gp41和CD4的“缺口”序列之間的相互作用。
許多文獻綜述了藥物與特定蛋白相互作用的計算機模擬，例如Rotivinen，et al.，1988 Acta Pharinaceutica Fennica 97，159-166；Ripka，New Scientist 54-57(June 16，1988)；McKinaly andRossmann，1989 Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29，111-122；Perryand Davies，QSARQuantitative Structure-Activity Relationshipsin Drug Design pp.189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis andDean，1989 Proc.R.Soc.Lond.236，125-140 and 141-162；以及，關于核酸成分的模型酶，Askew，et al.，1989J.Am.Chem.Soc.111，1082-1090。其它篩選并圖形描述化學物質的計算機程序可以從諸如BioDesign公司(Pasadena，CA.)、Allelix公司(Mississauga，Ontario，Canada)和Hypercube公司(Cambridge，Ontario)等公司獲得。盡管所述程序主要是為應用于特別針對特定蛋白的藥物而設計的，但是它們可以適用于設計與DNA或RNA特定區域特異性相互作用的分子，只要所述區域被鑒定。
(a)坐標結構坐標確定了點在空間中的唯一性構型。本領域技術人員了解蛋白或蛋白/配體復合物或其部分的一組結構坐標確定了相對的一組點，所述點依次確定了三維空間中的構型。從坐標中獲得的關鍵信息是組成所述組合物的原子的位置。所述原子的位置以Cartesian形式被確定，這樣具有能夠確定兩個或更多個原子之間距離和角度的x-y-z位置。因此，如果坐標間的距離和角度基本上保持相同時，類似或相同的構型即結構，能夠由完全不同的一組坐標確定。以類似方式操作距離和角度，便可獲得可縮放的示意圖。
公開了可縮放的三維構型，該構型來自諸如在表3和4中列出的結構坐標或其部分，或來自產生原子間具有基本相同的角度和距離的構型的坐標。還公開了可縮放的三維構型，該構型來自從所公開的諸如缺口結構基序的分子中獲得的結構坐標。其它低能量結構可以利用所公開的坐標作為起始點而產生。表3和4中顯示的數據從按此處所公開的對坐標實施標準計算中獲得。應當理解的是，一旦在此處給定所述坐標集合，例如任何原子或原子子集的RMS(均方根)就能夠被計算且被認為在此處公開。此外，應當理解的是對于任何給定的單個原子而言，表3和4中列出的各種坐標代表的是所述原子能夠在缺口結構基序或其片段的坐標圖中發生的范圍。在表3和4中公開了代表所述缺口結構基序和缺口結合結構域復合物的低能量結構的坐標。
還公開了點的可縮放的三維構型以及包括范德華表面在內的結構等效構型，所述點來自與缺口結構基序和缺口結合結構域結構同源的分子或分子復合物的結構坐標。
來自結構坐標的點的空間構型能夠可視化，例如以全息圖像、立體圖表、模型或計算機顯示的圖像的方式，因而所述發明包括這些圖像、圖表或模型。
不同結構、相同結構的不同構型以及相同結構的不同部分之間的比較能夠以多種方式實現。例如，通常加載所述結構(坐標構成該結構)，確定所述結構中的原子等價物；組裝該結構，然后能夠觀察所得到的比較結果。
模擬程序通常還能夠確定所述各種結構的方差、均方根偏差(rootmean square deviations)和統計學顯著性。
術語“均方根偏差”意即偏差平方的算術平均值的平方根。它使得可以比較例如兩組數據或者兩種構型或結構中的同類位置。
此處所公開的包括結構數據的表遵從蛋白質數據庫的PDB格式。所述格式化和命名法是在整個領域中標準使用的。
(b)硬件根據本發明，用于結構分析和操作的硬件結構包括系統處理器，該處理器可能包括多處理單元，其中每個處理單元可由MIPS R10000或R4400處理器支持，就象SILICON GRAPHICS INDIGO2IMPACT工作站中所提供的；其它處理器諸如使用至少一個PENTIUM III或CELERON(Intel Corp.，Santa Clara，CA)類處理器的Intel兼容處理器平臺，UltraSPACE(Sun Microsystems，Palo Alto，CA)或能夠用于其它實施方案中的其它等效處理器。所述系統處理器可包括來自不同廠商的不同處理器的組合。在某些實施方案中，如下進一步所描述的分析和操作功能可以分配到多個處理單元上。術語處理單元可以指(1)在硬件的一個特定部分或跨越多個特定部分上運行的過程，(2)硬件的特定部分，或者上下文所允許的(1)或(2)。
所述硬件包括能夠包括多種一級和二級存儲單元在內的系統數據存儲器(system data store，SDS)。在一個優選的實施方案中，所述SDS會包括RAM作為一級存儲器的一部分；RAM的容量從32MB到640MB，盡管這些容量能夠變化且代表重疊使用。在某些實施方案中，一級存儲器可以包括其它存儲形式，例如高速緩沖存儲器、寄存器、非易失性存儲器(如FLASH、ROM、EPROM等)等。
所述SDS還可以包括具有單個、多個和/或各種各樣的服務器和存儲單元的二級存儲器。例如，所述SDS可以利用連接到系統處理器的固有存儲設備。在單個處理單元支持所有分析和操作功能的實施方案中，本地硬盤驅動器可作為所述SDS的二級存儲器，而且在這種單個處理單元上執行的磁盤操作系統可充當接收和服務數據請求的數據服務器。
根據本發明，在作為所述SDS的二級存儲器的單個設備中，或在可通過統一的管理系統存取的一起作為SDS的多個相關數據存儲器中，或在某些實施方案中可通過不同的管理系統存取的被集體視作SDS的多個獨立的數據存儲器中，用在處理和系統中的不同信息可在邏輯上或物理上分開。包括所述SDS物理結構的各種存儲單元可位于中心或者分布到各種不同的位置。
所述系統數據存儲器的二級存儲器的結構在不同的實施方案中可能顯著不同。在一些實施方案中，數據庫可用于存儲和操作數據；在某些這樣的實施方案中，諸如DB2(IBM，White Plains，NY)，SQL Server(Microsoft，Redmond，WA)，ACCESS(Microsoft，Redmond，WA)，ORACLE8i(Oracle Corp.，Redwood Shores，CA)，Ingres(ComputerAssociates，Islandia，NY)，MySQL(MySQL AB，Sweden)或AdaptiveServer Enterprise(Sybase Inc.，Emeryville，CA)等的一個或多個相關的數據庫管理系統可用于連接各種存儲設備/文件服務器，所述存儲設備/文件服務器可以包括利用任何合適的包括但不限于IDE、EISA和SCSI等接口的一個或多個標準的磁和/或光盤驅動器。在某些實施方案中可以使用磁帶庫，例如Exabyte X80(Exabyte Corporation，Boulder，CO)，諸如獲自(EMC，Inc.，Hopkinton，MA)的連接存儲器的網絡(SAN)解決方案，諸如NetApp Filer 740(Network Appliances，Sunnyvale，CA)的連接網絡的存儲器(NAS)解決方案，或其組合。
在其它實施方案中，數據存儲器可以使用具有諸如面向對象的、空間的、對象相關的或繼承的等其它結構的數據庫系統，或者可以使用諸如雜湊表或平面文件或這類結構的組合的其它存儲器工具。這類備選方法可以使用諸如雜湊表查詢服務器、程序和/或過程，或/和平面文件檢索服務器、程序和/或過程的數據服務器而不是數據管理系統。此外，所述SDS可以在組織其二級存儲結構中使用任何這種方法的組合。
在一個優選的實施方案中，根據標準化的格式將坐標數據存儲于平整型ASCII文件中。在一個這樣的實施方案中，所述標準化的格式是在整個蛋白質結構領域中通用的PDB格式。此處公開的包含坐標數據的表的欄目內容遵循PDB格式化和命名法。
所述硬件平臺將具有合適的諸如WINDOWS/NT，WINDOWS 2000或WINDOWS/XP Server(Microsoft，Redmond，WA)，Solaris(SunMicrosystems，Palo Alto，CA)，或IRIX(或其它UNIX/LINUX變體)的操作系統。在一個優選的實施方案中，所述硬件平臺包括在SILICONGRAPHICS INDIGO2IMPACT工作站上運行的IRIX操作系統。
(c)結構坐標及其存儲本發明中諸如原子坐標的結構坐標能夠以機器可讀的形式存儲于機器可讀的存儲介質上。這類介質的實例包括但不限于計算機硬盤驅動器、軟磁盤、DAT帶、CD-ROM等等。存儲在這類介質上的信息能夠用于顯示三維形態或其示意圖，或用于基于結構坐標、結構坐標所描述的原子間的空間關系或它們所確定的三維結構的其它用途。這種應用可以包括能夠從所述存儲介質中讀取數據和執行指令從而產生和/或操作由該數據所界定的結構的計算機的應用。對于觀看或操作結構而言，普遍使用的的指令集即計算機程序包括但不限于Midas(UCSF)，MidasPlus(UCSF)，MOIL(University of Illinois)，Yummie(Yale University)，Sybyl(Tripos，Inc.)，Insight/Discover(Biosym Technologies)，MacroModel(Columbia University)，Quanta(Molecular Simulations，Inc.)，Cerius(Molucular Simulations，Inc.)，Alchemy(Tripos，Inc.)，Lab Vision(Tripos，Inc.)，Rasmol(Glaxo Research andDevelopment)，Ribbon(University of Alabama)，NAOMI(OxfordUniversity)，Explorer Eyechem(Silicon Graphics，Inc.)，Univision(Cray Research)，Molscript(Uppsala University)，Chem-3D(Cambridge Scientific)，Chain(Baylor College ofMedicine)，O(Uppsala University)，GRASP(Columbia University)，X-Plor(Molecular Simulations，Inc.；Yale University)，Spartan(Wavefunction，Inc.)，Catalyst(Molecular Simulations，Inc.)，Molcadd(Tripos，Inc.)，VMD(University ofIllinois/Beckman Institute)，Sculpt(Interactive Simulations，Inc.)，Procheck(Brookhaven National Laboratory)，DGEOM(QCPE)，RE_VIEW(Brunel University)，Modeller(Birbeck College，University of London)，Xmol(Minnesota Supercomputing Center)，Protein Expert(Cambridge Scientific)，HyperChem(Hypercube)，MDDisplay(University of Washington)，PKB(National Center forBiotechnology Information，NIH)，ChemX(Chemical Design，Ltd.)，Cameleon(Oxford Molecular，Inc.)，以及Iditis(Oxford Molecular，Inc.)。
(d)機器可讀的存儲介質公開了機器可讀的包括使用機器可讀數據編碼的數據存儲材料的存儲介質。此外，可使用配置為可以讀取存儲在機讀存儲介質上的數據的機器，對上述數據進行提取和操作，而且實際上，當實施諸如顯示此處所詳述的公開組合物的構型的分子模擬時，通常所述數據將被取回或貯存于機器可讀存儲介質上。
還公開了機器可讀存儲介質，其包括表3和4中所列出的坐標，或可產生此處所詳述的公開組合物或其變異體的等效構型的坐標。還公開了機器可讀存儲介質，它包括表3和4所列出的坐標或這些坐標的子集，或此處公開的任何坐標表的坐標或其子集，或產生此處所詳述的公開組合物或其變異體的等效構型的坐標。
表3是代表性坐標全長26氨基酸包含缺口序列的TM肽(來自人CD4)







在25℃下，將混合溶液與光刻膠材料以3∶1的比例(300cc100cc)進行混合，觀察二者混合后是否產生光刻膠沉淀，以選擇能夠溶解ToyoInk系列光刻膠材料的混合溶液。表4為光刻膠材料與各種混合溶液經混合后的結果，其中“○”表示無沉淀，“×”表示沉淀。
表4

由表4可得知，當環己酮/丙二醇單甲基醚乙酯/烷基苯的重量比為20/70/10、30/60/10、40/40/20以及45/45/10時，可以將ToyoInk系列的光刻膠材料溶解，并同時溶解光刻膠材料4。由上述可知，上述比例的混合溶液可以取代ToyoInk系列所使用的特定光刻膠稀釋劑與光刻膠材料4所使用的光刻膠稀釋劑。
綜上所述，本發明利用韓森模式選出多種溶劑進行混合，并藉由調整混合溶液中各種溶劑的重量比例，來快速找出對人體較為安全、且更便宜更環保的光刻膠稀釋劑。此外，還可以更進一步的找出能夠同時溶解一種以上光刻膠材料的光刻膠稀釋劑，以解決以往只能單一光刻膠材料對應單一種光刻膠稀釋劑的問題，進而節省生產成本。






表4是gp41截短的HIV1缺口序列的代表性坐標





公開的坐標和數據可以在任何合適的具有諸如處理器、存儲器和監視器的機器上操作。所述數據還可以通過多種包括諸如打印機和LCD等的連接設備操作和存取。
公開了利用分子置換來獲取關于未知結構的分子或分子復合物的結構信息的方法，所述方法包括以下步驟(a)產生結構未知的分子或分子復合物的坐標，以及(b)將在公開的坐標表中列出的結構坐標的至少一部分應用于未知結構的坐標，從而產生該未知結構的構型。
(e)變體的模擬變體缺口結構基序的結構，例如可以不需得到該變體的個體坐標就產生。本質上而言，此處所公開的分子的坐標或產生結構類似物的坐標被用作起點，并且所公開的變體分子的原子或變體原子被替換到模擬的結構中，且它們對于最初未替換原子的相對位置即坐標可以通過各種能量最小化函數中的任何一種得到確定。因而，序列比對、二級結構預測、對諸如gp160或任何其它所公開的從所公開坐標中產生的分子的結構文庫的篩選，或其任何組合能夠用于覆蓋所述的變體結構。例如，所述變體原子也能夠從任何具有類似或相同原子坐標的結構文庫中模擬。因而，根據給定原子的已知坐標模擬能夠得到將要進行能量最小化的初始結構。可以篩選這些結構文庫以得到最佳結構。側鏈旋轉異構體文庫能夠用于給定側鏈或側鏈集合的模擬。在最初的能量最小化之后，如果在能量最小化之后產生的結構違背了諸如正確的立體化學的實際約束，可能還需要進行重復或新的能量最小化。
(f)計算機藥物設計計算機技術能夠用于篩選、鑒定、選擇和設計能夠結合諸如缺口結構基序，或者結構同源分子，或者其復合物的化學實體。公開的坐標和產生結構同源分子的坐標能夠用于模擬CD4-gp120相互作用的調節劑例如抑制劑的潛在配體。該潛在配體的原子可包含在包括缺口結構基序和此處公開的其它分子在內的模擬中，并且可以研究處于各種位置的潛在配體與所公開組合物、或與某一區域(如CD4缺口結合結構域)之間所發生的接觸。所述潛在配體和所公開分子間的這些接觸的能量最小化，能夠指示具有例如所希望的親和力或所希望的特異性的潛在配體。能夠選出被鑒定為與由此處所公開的坐標或類似物定位的、諸如CD4-gp41相互作用mimix等公開的組合物的原子之間具有希望數量接觸的配體，然后通過合成或制備所述配體和公開的組合物并實施標準生物化學方法以檢測結合活性或功能性活性，所述配體可以被任選地進一步檢測，所述生物化學方法例如利用動力學或熱力學的方法學，例如平衡透析、微量量熱法、圓二色性、毛細管區帶電泳、核磁共振分光檢定法、熒光光譜學及其組合。
藥物設計通常包括對與所述缺口結構基序、其類似物或其部分相結合的化學實體的計算機輔助設計。化學實體能夠以一次一個片段的分步方式設計，或者作為整體或從頭設計。
此處所公開的諸如缺口結構基序或缺口結合結構域的CD4和gp160的結合位點，闡明了靶原子與能夠結合或抑制所公開相互作用的配體相互作用的位置。缺口結構基序和缺口結構基序結合位點的構象使得能夠對合理設計的分子進行精確的三維作圖，所述分子例如將會與確定此處所公開的結合區的原子之間形成固定數量的接觸。
此處所使用的接觸的意思是當兩個原子通過能量最小化程序被定位時，這兩個原子間的任何位置相距例如小于5A°、3A°、2A°、2A°或1A°，所述兩個原子通常為配體的一個原子和所公開的諸如缺口結構基序或缺口結合結構域的組合物的一個原子。因而，接觸可以(例如)以兩個原子之間的(例如)諸如氫鍵、范德華相互作用、疏水相互作用和靜電相互作用的非共價相互作用相聯系。通常接觸將會增加兩個原子之間的結合能，但是它也可以是互斥的，通常兩個原子越接近就越互斥。盡管接觸在此處定義為兩個原子的關系，但是原子為其中一部分的分子、組分和化合物也能夠被認為相互之間具有“接觸”。因而，例如，具有與缺口結構基序形成接觸的原子的配體，能夠被說成具有與所述缺口結構基序的接觸(并且，更廣泛而言，與包括缺口結構基序的蛋白的接觸)。另外例如，具有與蛋白(例如gp160)的氨基酸中的原子形成接觸的原子的抑制劑，能夠被說成具有與所述蛋白的氨基酸的接觸。所涉及的接觸是如上所述原子間的接觸。應當被理解的是，對于將成為潛在治療候選物的配體而言，它必須具有合適水平或性質的接觸，從而發生相互作用，但是它不能引起空間上和能量上的問題。通常在有利的接觸和不利的接觸之間存在平衡，而且在某些實施方案中該平衡偏向于有利的接觸以產生合適的親和力。構象上的考慮包括總的三維結構，化學實體相對于結合口袋的定向，以及與缺口結構基序或缺口結合結構域或其類似物直接相互作用的化學實體的各種功能性基團之間的間距。
原子、分子、組分或化合物之間的接觸是參與所述接觸的原子、分子、組分和化合物之間相互作用的形式。因而，原子、分子、組分或化合物能夠被說成與另外的原子、分子、組分或化合物“相互作用”。這種相互作用可以是指處于任何水平的。因此，例如，兩個不同分子中兩個原子之間的相互作用(或接觸)導致這兩個分子之間形成能夠被稱為包括所述原子的兩個分子之間的相互作用的關系。類似地，例如抑制劑和蛋白的氨基酸之間的相互作用導致該抑制劑和該蛋白之間形成能夠被稱為該抑制劑和該蛋白之間的相互作用的關系。除非上下文明確指出，否則提及原子、分子、組分或化合物之間的相互作用，并不意圖排除存在其它未聲明的所討論的原子、分子、組分或化合物之間或與其它原子、分子、組分或化合物的相互作用。因此，例如提及抑制劑和蛋白的一個具體氨基酸的相互作用并不表示該抑制劑和該蛋白之間，或者與其它原子、分子、組分或化合物沒有其他相互作用或接觸。
除非上下文明確指出，否則提及原子、分子、組分或化合物與其它原子、分子、組分或化合物相互作用的能力是指這種應該使所述原子、分子、組分或化合物接觸的相互作用的的可能性，而并不是指任何實際上當前存在的相互作用。因此，例如，抑制劑能夠與蛋白的氨基酸相互作用的陳述是指若使該抑制劑和氨基酸接觸則它們將會發生相互作用，而不是指該抑制劑和氨基酸當前正在相互作用。
對公開的組合物的模擬和顯示能夠用任何諸如QUANTA，SYBYL，CHARMM和AMBER，Insight II/Discover(Molecular Simulations，Inc.，San Diego，Calif.92121)；DelPhi(Molecular Simulations，Inc.，San Diego，Calif.92121)；以及AMSOL(Quantum Chemistry ProgramExchange，Indiana University)的模擬程序來完成。這些程序可以利用，例如具有“IMPACT”制圖技術的諸如Indigo2的Silicon Graphics工作站來完成。其它硬件系統和軟件包為本領域技術人員所知曉。還可以利用藥物設計程序，例如GRID(P.J.Goodford，J.Med.Chem.28849-857(1985)；獲自Oxford University，Oxford，UK)；MCSS(A.Miranker et al.，ProteinsStruct.Funct.Gen.，1129-34(1991)；獲自Molecular Simulations，San Diego，Calif.)；AUTODOCK(D.S.Goodsell et al.，ProteinsStruct.Funct.Genet.8195-202(1990)；獲自Scripps Research Institute，La Jolla，Calif.)；以及DOCK(I.D.Kuntz et al.，J.Mol.Biol.161269-288(1982)；獲自University of California，San Francisco，Calif.)，LUDI(H.-J.Bohm，J.Comp.Aid.Molec.Design.661-78(1992)；獲自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Calif.)；LEGEND(Y.Nishibata et al.，Tetrahedron，478985(1991)；獲自MolecularSimulations Inc.，San Diego，Calif.)；LeapFrog(獲自TriposAssociates，St.Louis，Mo.)；以及SPROUT(V.Gillet et al.，J.Comput.Aided Mol.Design 7127-153(1993)；獲自the Universityof Leeds，UK)。
潛在配體與所公開組合物的相互作用的效率能夠得到評估和優化。例如，通常優選的配體會對所公開組合物的原子的三維定位引起極小的微擾，該原子處于相互作用的附近或稍微受到變構效應的影響。微擾的水平可以通過比較所公開結構的結合和未結合狀態的構象的能量狀態來確定。通常變化越小則微擾就越小，微擾越小則該配體被描述為例如競爭性抑制劑的可能性就越高。這種微擾可以例如小于或等于約30kcal/mole，20kcal/mole，15kcal/mole，10kcal/mole，8kcal/mole，6kcal/mole，5kcal/mole，4kcal/mole，3kcal/mole，2kcal/mole，或1kcal/mole。缺口結構基序或缺口結合結構域的配體能夠以總結合能相似的一種以上構象與gp160或CD4分子相互作用。在那些情況下，結合的微擾能能夠被視作游離實體的能量和當配體結合gp160或CD4或缺口結構基序或缺口結合結構域時所觀察到的構象的平均能量之間的差異。
作為結合缺口結構基序或缺口結合結構域而被設計或選擇的實體，可以被進一步計算優化，從而使其在結合狀態時會優選地缺少與靶酶和周圍水分子的排斥性靜電相互作用。這種非補充性的靜電相互作用包括排斥性的電荷-電荷、偶極-偶極和電荷-偶極相互作用。
能夠獲得本領域內特定的計算機軟件從而評估化合物變形能和靜電相互作用。為這類用途而設計的程序的實例包括Gaussian 94，revision C(M.J.Frisch，Gaussian，Inc.，Pittsburgh，Pa.15106)；AMBER，version 4.1(P.A.Kollman，University of California atSan Francisco，94143)；QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations，Inc.，San Diego，Calif.92121)。
公開的結構和坐標還可以被用于篩選潛在配體，例如與缺口結構基序或缺口結合結構域相互作用即與其形成接觸的候選藥物。諸如結構數據庫的小分子數據庫能夠用于此目的，不僅能夠篩選完整的分子，而且還能夠篩選分子的亞組分(subparts)，例如也能夠篩選各種功能性基團以發現優選的與此處所公開的缺口結構基序或缺口結合結構域形成接觸的功能性基團。然后，可以將例如與缺口結構基序或缺口結合結構域中所希望的或特定的區域形成所希望的一組接觸的功能性基團，用于進一步構建所述的和其它類型功能性基團的組合，從而設計包含該功能性基團或功能性基團的組合的配體。
應當理解的是，還公開了利用連續執行此處公開的各種步驟，以優化分子和/或從多組分子中分離分子的重復方法(iterativeapproaches)。這也能夠對例如從包含一個配體的結構或包含系列配體的系列結構的解析中得到的多個坐標集合進行。例如，能夠在輔助結構(co-structure)中解析已知具有諸如結合此處公開的缺口結構基序或缺口結合結構域等所希望的生物化學性質的分子，然后能夠將從其中得到的結構信息用來選擇功能性的潛在配體。
能夠得到(或合成)任何所述方法所鑒定或設計的化合物，并且檢測其生物學活性，例如抑制CD4-gp160相互作用的活性。
還公開了來自至少分子或分子復合物中一部分的結構坐標的點的可縮放的三維集合，該部分與可選地包括它們的復合物在內的缺口結構基序或缺口結合結構域在結構上是同源的。如果兩個點具有小于5A°、4A°、3A°、2A°或1.0A°的RMS，則認為它們是結構同源的。結構同源的結構將會具有平均值小于5A°、4A°、3A°、2A°或1.0A°的RMS。
類似結構是具有不同的化學組成，但是具有與所涉及的結構(例如缺口結構基序或缺口結合結構域的結構)具有同源結構的結構。
盡管上述了關于設計和產生能夠改變與例如所述缺口結合或抑制缺口功能的化合物，但是還能夠從包括天然產物或合成的化學物質的已知化合物庫和包括蛋白質的生物活性物質中，篩選例如改變底物結合或HIV感染性的化合物。例如，生物素能夠加到諸如SEQ ID NO6的缺口序列上。然后，該分子能夠與例如破碎的T細胞膜一起孵育。該混合物可以在能夠與生物素反應的柱如鏈親和素或抗生物素抗體柱上收集。然后例如以pH中性的溶液洗柱，隨后結合的分子能夠通過例如低pH值的溶液或加熱來收集。所收集的分子能夠例如通過其它諸如SDS-PAGE或HPLC的色譜方法來分析。通過例如在用鏈親和素-過氧化物酶顯影的Western型點印跡中使用肽-生物素綴合物，能夠進一步分析所鑒定的分子。對照和比較樣品可以包括缺少CD4的膜。也能夠用已知的抑制劑和相互作用劑來進行這類分析。作為對照的樣品可以包括缺少CD4的膜。也可以檢驗諸如合成的CD4肽的已知候選分子。要求之一是在可再現假定的膜環境的溶液中進行此項工作。
能夠鑒定結合所述缺口區域的分子。此處所公開的缺口區域與例如SEQ ID NO1和2中列出的螺旋結構域相關。
公開的方法能夠利用能量轉移供體和受體分子對，從而在高通量檢測中鑒定缺口抑制劑。例如包含缺口區域的分子能夠被連接到能量轉移供體。另一個包含缺口區域的分子能夠被連接到能量轉移受體，然后這些分子可以在一起孵育。當受體缺口區域和供體缺口區域相互作用時，熒光會升高(RET[共振能量轉移])。能夠與此缺口-缺口相互作用競爭的分子會減低這種熒光，并且所述分子在此基礎上能夠被鑒定出來。
3.組合物的性質a)序列相似性應當理解的是，正如此處所詳述的，使用術語同源性和同一性表示與相似性一樣的意思。因而，例如，如果在兩條非天然序列間使用單詞同源性，應當理解的是，這并不必然表示這兩條序列之間的進化關系，而是著眼于它們的核酸序列或蛋白序列的相似性或相關性。出于測量序列相似性而不管它們是否進化上相關的目的，許多確定兩個進化相關分子之間的同源性的方法常規應用于任何兩個或多個核酸或蛋白。
一般而言，應當理解的是，定義此處公開基因和蛋白的任何已知的或可能出現的變異體或衍生物的方法是通過與特定已知序列同源性的方式來定義該變異體和衍生物。此處公開的具體序列的這種同一性在此處的其它部分也有所詳述。一般而言，在此公開的基因和蛋白的變異體通常與規定序列或天然序列具有至少約百分之70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同源性，但是在許多情況下，因為具有很低的同源性的所要求的序列仍然能夠形成螺旋缺口結構，所以所述基因和蛋白的變異體能夠具有低至百分之10、15、20、25、30、35、40、55、60或65的同源性。本領域技術人員易于理解如何確定兩個蛋白或核酸如基因之間的同源性。例如，能夠在比對兩條序列之后計算同源性，從而使同源性處于其最高水平。
其它計算同源性的方法可以通過公開的算法來實施。要比較的序列的最佳比對可以通過Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源算法、Needleman和Wunsch，J.MoL Biol.48443(1970)的同源比對算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)搜索相似性方法、這些算法的計算機化工具(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過檢查來進行。
對核酸而言，能夠通過例如在Zuker，M.Science 24448-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867706-7710，1989，Jaegeret al.Metlaods Enzymol.183281-306，1989中公開的算法獲得相同類型的同源性，對于至少與核酸比對相關的資料而言，所述文獻在此通過援引的方式納入。應當理解的是，通常能夠利用任何所述方法，而且在某些情況下，這些不同方法的結果可能不一樣，但是技術人員了解如果用至少這些方法之一發現同一性，所述序列就可說成具有規定的同一性，且在此公開。
例如，如同在此應用的一樣，被敘述為與其它序列具有特定百分比同源性的序列，是指象上述計算方法中的一種或多種方法計算的一樣具有所敘述的同源性的序列。例如，如果利用Zuker計算方法計算得出第一條序列與第二條序列具有80％的同源性，那么即使用任何其它計算方法計算得出第一條序列與第二條序列不具有80％的同源性，該第一條序列與第二條序列仍然具有此處界定的80％的同源性。如另一個實例，如果利用Zuker計算方法以及Pearson和Lipman計算方法計算得出第一條序列與第二條序列具有80％的同源性，那么即使用Smith和Waterman計算方法、Needleman和Wunsch計算方法、Jaeger計算方法或任何其它計算方法計算得出第一條序列與第二條序列不具有80％的同源性，該第一條序列與第二條序列仍然具有此處界定的80％的同源性。如另一個實例，如果利用每一種計算方法計算均得出第一條序列與第二條序列具有80％的同源性(盡管實際上不同的計算方法通常將導致不同的計算出的同源性百分比)，那么該第一條序列與第二條序列具有此處界定的80％的同源性。
b)雜交/選擇性雜交術語雜交通常是指，至少兩個諸如引物或探針和基因的核酸分子之間的序列驅動的相互作用。序列驅動的相互作用是指，以核苷酸特異性的方式在兩個核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸衍生物之間發生的相互作周。例如，G與C相互作用或者A與T相互作用是序列驅動的相互作用。序列驅動的相互作用通常發生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面上。兩個核酸的雜交受到許多為本領域技術人員所知曉的條件和參數的影響。例如，反應的鹽濃度、pH和溫度均可影響兩個核酸分子是否會雜交。
兩個核酸分子之間的選擇性雜交的參數為本領域技術人員所熟知。例如，在某些實施方案中，選擇性雜交條件可限定為嚴格雜交條件。例如，雜交的嚴格性受雜交和洗滌步驟其一或二者中的溫度和鹽濃度的控制。例如，獲得選擇性雜交的雜交條件可包括在高離子強度溶液(6×SSC或6×SSPE)中和低于Tm值(一半的分子從其雜交鏈上解離的融解溫度)約12℃-25℃的溫度下雜交，隨后在結合選定的溫度和鹽濃度的條件下洗滌，從而洗滌溫度低于Tm值約5℃到20℃。在預實驗中可以容易地經驗性地確定溫度和鹽條件，其中固定在濾器上的參考DNA樣本與標記過的感興趣的核酸雜交，然后在不同嚴格條件下洗滌。對DNA-RNA和RNA-RNA雜交而言，雜交溫度通常較高。能夠利用上述的或者如同本領域內已知的條件以獲得嚴格性。(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，1989；Kunkel et al.Methods Enzymol.1987154367，1987對于至少與核酸雜交相關的材料而言，所述文獻通過援引的方式納入)。DNADNA雜交的優選嚴格雜交條件能夠在約68℃(在水溶液中)6XSSC或6XSSPE中，隨后于68℃洗滌。如果需要，當所希望的互補程度降低時，以及進而取決于所尋找的變異性所在的任何區域的G-C或A-T富集程度，雜交和洗滌的嚴格性能夠相應地減少。同樣地，如果需要，當所希望的同源性升高時，以及進而取決于所希望的高同源性所在的任何區域的G-C或A-T富集程度，雜交和洗滌的嚴格性能夠相應地增高，這些均為本領域所熟知。
另一種確定選擇性雜交的方法是通過觀察一種核酸與另一種核酸結合的量(百分比)。例如，在某些實施方案中選擇性雜交的條件為當至少約百分之60，65，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100的有限量核酸結合到無限量核酸上的時候。通常，無限量引物過量例如10或100或1000倍。這種類型的檢測能夠在下列條件下實施有限量和無限量引物都例如低于其Kd值10倍或100倍或1000倍，或者只有一種核酸分子低于其Kd值10倍或100倍或1000倍或一種核酸分子或兩種核酸分子都大于其Kd值。
另一種確定選擇性雜交的方法是通過觀察在需要雜交來促進所需的酶處理的條件下被酶處理過的引物的百分比。例如，在某些實施方案中選擇性雜交的條件為當至少約百分之60，65，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100的引物在促進酶處理的條件下被酶處理過，例如，如果酶處理是DNA延伸，那么選擇性雜交條件為當至少約百分之60，65，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100的引物分子被延伸。優選的條件還包括制造商所建議或本領域指明的適合于酶處理的條件。
正如同源性一樣，應當理解的是此處公開了多種用于確定兩個核酸分子之間的雜交水平的方法。應當理解的是，所述方法和條件可以提供兩個核酸分子之間不同百分比的雜交，但是除非另有指明，滿足任何所述方法的參數就足夠了。例如，如果需要80％雜交并且在任何所述方法中只要在需要的參數范圍內出現雜交，就認為在此處公開。
應當理解的是，本領域技術人員了解如果組合物或方法滿足任何所述用于共同或單獨確定雜交的標準，所述組合物或方法就是此處所公開的組合物或方法。
C)核酸有多種此處所公開的分子是以核酸為基礎的，包括例如，編碼諸如缺口結構基序或結合缺口結構基序的分子的核酸，以及各種功能性核酸。所公開的核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物所組成。所述以及其它分子的非限制性實例在此處公開。應當理解的是，例如當載體在細胞中表達時，所表達的mRNA通常由A、C、G和U組成。同樣應當理解的是，如果，例如，反義分子通過例如外源性運送被引入細胞或細胞環境，反義分子由減少反義分子在細胞環境中降解的核苷酸類似物組成是有利的。
(1)核苷酸和相關分子核苷酸是含有堿基部分、糖部分和磷酸酯部分的分子。核苷酸能夠通過其磷酸酯部分和糖部分而連接在一起，形成核苷間鍵合。核苷酸的堿基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)，胞嘧啶-1-基(C)，鳥嘌呤-9-基(G)，尿嘧啶-1-基(U)，和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脫氧核糖。核苷酸的磷酸酯部分是磷酸酯。核苷酸的非限制性實例有3′-AMP(3′-腺苷一磷酸)或5′-GMP(5′-鳥苷一磷酸)。
核苷酸類似物是包含對堿基、糖或磷酸酯部分進行某種類型的修飾的核苷酸。對堿基部分的修飾包括A、C、G和T/U以及不同嘌呤和嘧啶堿基，例如尿嘧啶-5-基(.psi.)、次黃嘌呤-9-基(I)以及2-氨基腺嘌呤-9-基的天然或合成的修飾。修飾過的堿基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-巰基胸腺嘧啶和2-巰基胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-氮雜尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基以及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代尤其是5-溴代，5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-去氮雜鳥嘌呤和7-去氮雜腺嘌呤以及3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺嘌呤。其它的堿基修飾能夠在例如美國專利3,687,808，Englisch et al.，AngewandteChemie，International Edition，1991，30，613，以及Sanghvi，Y.S.，15章，Antisense Research and Applications，289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ed.，CRC Press，1993中找到。某些核苷酸類似物，例如包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶在內的5-取代嘧啶，6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代嘌呤，能夠增加雙鏈體結構的穩定性。堿基修飾經常能夠與例如，諸如2′-O-甲氧乙基的糖修飾相結合，從而獲得諸如增加的雙鏈體穩定性等獨特的特性。有許多列舉和敘述堿基修飾范圍的美國專利，例如4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；以及5,681,941。所述專利均在此通過援引的方式納入。
核苷酸類似物也可以包括糖部分的修飾。對糖部分的修飾包括核糖和脫氧核糖的天然修飾以及合成修飾。糖修飾包括但不限于以下在2′位置的修飾OH，F，O-、S-或N-烷基，O-、S-或N-鏈烯基，O-、S-或N-炔基，或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、鏈烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10的烷基或C2至C10的鏈烯基和炔基。2′糖修飾還包括但不限于-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3，-O(CH2)n-ONH2以及-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m從1到大約10。
其它2′位置的修飾包括但不限于C1至C10低級烷基，取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、異環烷基、異環烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、切割RNA的基團、報告基團、插入劑、改善寡核苷酸的藥物代謝動力學特性的基團、或改善寡核苷酸的藥物效應動力學特性的基團以及其它具有類似特性的取代基。還可以在糖的其它位置，尤其是3′端核苷酸或2′-5′連接的寡核苷酸上的糖的3′位置以及5′端核苷酸的5′位置進行類似的修飾。修飾過的糖還包括含有在橋環氧上的修飾，例如CH2和S。核苷酸糖類似物也可以具有例如用環丁基部分代替五元呋喃糖的糖模仿物。有許多講授制備所述修飾過的糖結構的美國專利，例如4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920，所述專利均在此通過援引的方式全文納入。
核苷酸類似物也能夠在磷酸酯部分進行修飾。修飾過的磷酸酯部分包括但不限于磷酸酯部分能夠被修飾而使兩個核苷酸之間的連接包括磷硫酰、手性磷硫酰、二硫代磷酸酯，磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、包括3′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯在內的甲基和其它烷基膦酸酯、磷化氫、包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯在內的氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯，硫羰基烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯以及磷酸硼。應當理解的是，兩個核苷酸之間的所述磷酸酯或修飾過的磷酸酯連接，能夠通過3′-5′連接或2′-5′連接，且所述連接可以包括極性翻轉，例如從3′-5′到5′-3′或者從2′-5′到5′-2′。還包括各種鹽類、混合鹽類和游離酸形式。許多美國專利講授如何制備和使用包括修飾過的磷酸鹽的核苷酸且所述美國專利包括但不限于3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，所述專利在此通過援引的方式納入。
應當理解的是，核苷酸類似物只需要包括一處修飾，但是也可以包括一個部分中或不同部分之間的多處修飾。
核苷酸替代物是具有與核苷酸類似的功能特性的分子，但是核苷酸類似物不包括磷酸酯部分，例如核酸肽(PNA)。核苷酸替代物是能夠以Watson-Crick or Hoogsteen方式識別核酸的分子，但是核酸類似物通過除磷酸酯部分之外的部分連接在一起。當與合適的靶核酸相互作用時，核苷酸替代物能夠符合雙螺旋類型的結構。
核苷酸替代物是磷酸酯部分和/或糖部分被取代的核苷酸或核苷酸類似物。核苷酸替代物不含有標準的磷原子。磷酸酯的替代物可以是，例如短鏈烷基或環烷基的核苷間鍵合，混合雜原子和烷基或環烷基的核苷間鍵合，或者一種或多種短鏈雜原子或雜環的核苷間鍵合。這包括具有嗎啉代鍵合(部分是從核苷的糖部分形成)的物質，硅氧烷骨架，硫化物、亞砜和砜骨架，甲十六(烷)基(formacetyl)和硫甲十六(烷)基(thioformacetyl)骨架，亞甲基甲十六(烷)基和硫甲十六(烷)基骨架，包括鏈烯烴的骨架，氨基磺酸鹽骨架，亞甲基氨基和亞甲基肼基骨架，磺酸鹽和磺胺骨架，酰胺骨架，以及含有混合的N、O、S和CH2組成部分的其它物質。許多美國專利公開了如何制備和使用所述類型的磷酸鹽置換，并且包括但不限于5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，所述專利均在此通過援引的方式納入。
還應當理解的是，在核苷酸替代物中，通過例如酰胺類型的鍵合(氨基乙基甘氨酸)(PNA)，核苷酸的糖和磷酸酯部分都能夠被置換。美國專利5,539,082；5,714,331；和5,719,262講授了如何制備和使用PNA分子，所述專利均在此通過援引的方式納入。(還參見Nielsenet al.，Science，1991，254，1497-1500)。
還可以將其它類型的分子(綴合物)與核苷酸或核苷酸類似物相連接，從而增強例如細胞攝取。能夠將綴合物與核苷酸或核苷酸類似物化學連接。這種綴合物包括但不限于脂質部分，例如膽固醇部分(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)，膽酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)，諸如己基-S-三苯甲基硫醇的硫醚(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)，硫代膽固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，諸如十二烷基二醇或十一烷基的脂肪族鏈(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanovet al.，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49-54)，諸如二-十六烷基-rac-甘油或三乙銨1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯的磷脂(Manoharanet al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969-973)，或醋酸金剛烷胺(Manoharan et al.，TetrahedronLett.，1995，36，3651-3654)，棕櫚基部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或十八胺或己胺基-羰基-羥膽固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。許多美國專利講授這類綴合物的制備且包括但不限于美國專利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,2-14,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941，所述專利均在此通過援引的方式納入。
Watson-Crick相互作用是至少一種與核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Watson-Crick表面的相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Watson-Crick表面包括嘌呤堿基核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置和嘧啶堿基核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、N3和C4位置。
Hoogsteen相互作用是在雙鏈DNA大溝中暴露的、核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen表面發生的相互作用。所述Hoogsteen表面包括嘌呤核苷酸的N7位置和C6位置的反應基團(NH2或O)。
(2)序列有各種與CD4和gp160基因相關的具有此處所公開的以下Genbank檢索號(Genbank Accession Number)的序列。所述及其它序列的整體及其中所包括的單個序列在此通過援引的方式納入。
SEQ ID NO26中列出的并在此使用的一個具體序列作為實例來舉例說明所公開的組合物和方法。應當理解的是除非特別指明，關于該序列的敘述適用于任何與SEQ ID NO26相關的序列。本領域技術人員了解如何解析序列差異和不同以及如何使與具體序列相關的組合物和方法適用于其它相關序列(即例如CD4或gp160的序列)。給定此處公開的和本領域所知曉的信息，能夠設計針對任何CD4或gp160序列的引物和/或探針。
d)組合物向細胞的運送有許多能夠用來在體內或體外將核酸運送至細胞的組合物和方法。所述方法和組合物可以主要劃分為兩類基于病毒的運送系統和基于非病毒的運送系統。例如，核酸能夠通過許多直接運送系統來運送，例如電穿孔術、脂質轉染法、磷酸鈣沉淀、質粒、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體和粘粒，或經細胞或諸如陽離子脂質體等載體的遺傳物質的轉運。包括病毒載體、化學轉染子或諸如電穿孔和DNA直接擴散等物理-機械方法在內的合適的轉染方法已由例如Wolff，J.A.，etal.，Science，247，1465-1468，(1990)；和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)敘述。這類方法為本領域所熟知并易于修改以與此處敘述的組合物和方法一起使用。在某些情況下，可以修改所述方法以與大分子DNA特異性作用。此外，通過使用載體的靶向特征，所述方法能夠用來靶向某些疾病和細胞群。
(1)基于核酸的運送系統轉運載體可以是任何用于將基因運送至細胞的核苷酸構建體(例如質粒)，或者作為運送基因的一般方法的一部分，例如作為重組逆轉錄病毒或腺病毒的一部分(Ram et al.Cancer Res.5383-88，(1993))。
此處所使用的質粒或病毒載體是將所公開的諸如編碼缺口結構基序的核酸或結合缺口結構基序的分子的核酸轉運至細胞而不被降解的媒介，并且包括在所轉運進入的細胞中產生基因表達的啟動子。在某些實施方案中，所述載體來自DNA病毒或逆轉錄病毒。病毒載體是，例如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰質炎病毒、艾滋病毒、神經營養病毒(neuronal trophic virus)、辛德畢斯(Sindbis)及其它RNA病毒、包括具有基本HIV骨架的所述病毒。還優選，任何與所述病毒具有相同的使其適于用作載體的特性的病毒家族。逆轉錄病毒包括鼠馬羅尼白血病病毒(Murine Maloney Leukemia virus)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)以及表達所希望的MMLV作為載體特性的逆轉錄病毒。逆轉錄病毒與其它病毒載體相比能夠攜帶較大的遺傳有效負載，即轉基因或標志基因，并且由于這種原因逆轉錄病毒是通常所使用的載體。然而，它們在非增殖性細胞中并不實用。腺病毒載體相對穩定且具有高滴度因而易于操作，而且能夠以氣溶膠形式運送，能夠轉染不分裂的細胞。痘病毒載體很大且具有一些可以插入基因的位點，它們具有熱穩定性并能夠在室溫下貯存。優選的實施方案是為了抑制由病毒抗原誘發的宿主生物免疫應答而設計的病毒載體。優選的此類載體攜帶白細胞介素8或10的編碼區。
與用化學或物理方法向細胞中引入基因相比，病毒載體可以具有較高的處理(引入基因的能力)能力。通常，病毒載體包括復制和殼體化所必需的非結構性早期基因、結構性晚期基因、RNA聚合酶III轉錄本、末端反向重復序列，以及控制病毒基因組的轉錄和復制的啟動子。當病毒被設計用作載體時，通常除去其一個或多個早期基因，并且將基因或基因/啟動子表達盒插入病毒基因組中取代被除去的病毒DNA。這種類型的構建體能夠攜帶高達約8kb的外源遺傳物質。除去的早期基因的必要功能通常由被設計來表達早期基因的基因產物的細胞系來反向提供。
(a)逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒是包括任何類型、亞科、屬或向性在內的屬于逆轉錄病毒科的動物病毒。一般而言，Verma，I.M.，Retroviral vectors forgene transfer In Microbiology-1985，American Society forMicrobiology，pp.229-232，Washington，(1985)敘述了逆轉錄病毒，所述文獻在此通過援引的方式納入。將逆轉錄病毒用于基因治療的方法的實例在美國專利4,868,116和4,980,286，PCT申請WO 90/02806和WO89/07136，以及Mulligan，(Science 260926-932(1993))中有所敘述，其中的講授內容在此通過援引的方式納入。
逆轉錄病毒本質上是其中包裝有核酸負載的包(package)。核酸負載攜帶有確保復制的子代分子能夠被有效地包裝在包裝衣殼(package coat)內的包裝信號。除包裝信號之外，還有許多在復制中以及在復制好的病毒的包裝中順式所需的分子。通常逆轉錄病毒基因組包括參與產生蛋白衣殼的gag、pol和env基因。gag、pol和env基因通常由要轉移到靶細胞的外源DNA所取代。逆轉錄病毒載體通常包括用于納入包裝衣殼的包裝信號、對gag轉錄單位的起始發出信號的序列、包括逆轉錄中結合tRNA引物的引物結合位點在內的逆轉錄必需的元件、在DNA合成過程中指導RNA鏈交換的末端重復序列、作為DNA合成中第二鏈合成的引發位點的富含嘌呤序列的5′到3′長末端重復(LTR)以及使逆轉錄病毒中DNA態的插入物能夠插入宿主基因組中的靠近LTR末端的特殊序列。gag、pol和env基因的刪除使得約8kb的外源序列能夠插入病毒基因組，被逆轉錄，并在復制時被包裝入新的逆轉錄病毒顆粒。取決于每個轉錄本的大小，所述量的核酸對于運送一個至多個基因而言是足夠的。優選插入物中包括陽性或陰性選擇性標記以及其它基因。
由于大部分逆轉錄病毒載體中的復制工具和包裝蛋白都已經被除去(gag、pol和env基因)，所述載體通常通過將其置于包裝細胞系來產生。包裝細胞系是用含有復制和包裝工具但是沒有任何包裝信號的逆轉錄病毒轉染或轉化的細胞系。當攜帶所選DNA的載體轉染到所述細胞系中時，通過由輔助細胞順式提供的工具，含有感興趣的基因的載體被復制并包裝成新的逆轉錄病毒顆粒。用作工具的基因組不被包裝，因為它們缺少必需的信號。
(b)腺病毒載體復制缺陷型腺病毒的構建體已經有所敘述(Berkner et al.，J.Virology 611213-1220(1987)；Massie et al.，Mol.Cell.Biol.62872-2883(1986)；Haj-Ahmad et al.，J.Virology 57267-274(1986)；Davidson et al.，J.Virology 611226-1239(1987)；Zhang″Generation and identification of recombinant adenovirus byliposome-mediated transfection and PCR analysis″BioTechniques15868-872(1993))。使用所述病毒作為載體的益處在于它們在能夠傳播到其它細胞類型的程度上是受到限制的，因為它們能夠在開始被感染的細胞內復制，但是不能形成新的感染性病毒顆粒。重組腺病毒已經顯示在體內直接運送至氣道上皮、肝細胞、血管上皮、中樞神經系統(CNS)薄壁組織以及許多其它組織部位之后，達到了高效的基因轉移(Morsy，J.Clin.Invest.921580-1586(1993)；Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92381-387(1993)；Roessler，J.Clin.Invest.921085-1092(1993)；Moullier，Nature Genetics 4154-159(1993)；La Salle，Science 259988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.26725129-25134(1992)；Rich，Human Gene Therapy 4461-476(1993)；Zabner，Nature Genetics 675-83(1994)；Guzman，Circulation Research 731201-1207(1993)；Bout，Human GeneTherapy 53-10(1994)；Zabner，Cell 75207-216(1993)；Caillaud，Eur.J.Neuroscience 51287-1291(1993)；以及Ragot，J.Gen.Virology 74501-507(1993))。重組腺病毒通過與特定細胞表面受體結合，然后病毒以與野生型或復制缺陷型腺病毒相同的方式通過受體介導的內吞作用內化，實現基因轉導(Chardonnet and Dales，Virology40462-477(1970)；Brown and Burlingham，J.Virology 12386-396(1973)；Svensson and Persson，J.Virology 55442-449(1985)；Seth，et al.，J.Virol.51650-655(1984)；Seth，et al.，Mol.Cell.Biol.41528-1533(1984)；Varga et al.，J.Virology 656061-6070(1991)；Wickham et al.，Cell 73309-319(1993))。
病毒載體可以是基于E1基因被刪除的腺病毒的載體，這種病毒在諸如人293細胞系的細胞系中產生。在另一個優選的實施方案中，E1和E3基因都從腺病毒基因組中刪除。
(c)腺伴隨病毒載體另一種類型的病毒載體基于腺伴隨病毒(AVV)。這種缺陷型細小病毒組是優選的載體，因為它能夠感染許多細胞類型且對人類沒有致病性。AAV型載體能夠轉運約4至5kb，且野生型AAV被認為能夠穩定地插入19號染色體。優選具有這種位點特異性整合特性的載體。這種類型載體的特別優選的實施方案是由Avigen，San Francisco生產的P4.1C載體，所述載體可以包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和/或標記基因，例如編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因。
在另一種類型的AAV病毒中，所述AAV包括一對末端反向重復(ITR)，所述ITR側翼與至少一個含有與異源基因有效相連的、指導細胞特異性表達的啟動子的表達盒相接。本說明書中的異源性指非AAV或B19細小病毒組所固有的任何核苷酸序列或基因。
通常所述AAV和B19的編碼區已經被刪除，產生安全的無細胞毒性的載體。所述AAV的ITR或其變體具有感染性和位點特異性整合作用，但是不具有細胞毒作用，且所述啟動子指導細胞特異性表達。對于與AAV載體相關的資料而言，美國專利6,261,834在此通過援引的方式納入SP。
因而公開的載體提供了能夠整合到哺乳動物染色體上而基本上沒有毒性的DNA分子。
在病毒和逆轉錄病毒中插入的基因通常包括啟動子和/或增強子，以幫助控制所需基因產物的表達。啟動子通常是當處在對于轉錄起始位點來說相對固定的位置時起作用的一段或多段DNA序列。啟動子包括RNA聚合酶和轉錄因子的基本相互作用所需的核心元件，且可以包括上游元件和反應元件。
(d)高載量病毒載體對大型人皰疹病毒的分子遺傳學實驗已經提供了使外源DNA大片段在允許皰疹病毒感染的細胞中被克隆、擴增并定居的方法(Sun et al.，Nature genetics 833-41，1994；Cotter and Robertson，.Curr OpinMol Ther 5633-644，1999)。所述大型DNA病毒(單純皰疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV))具有將大于150kb的人異源DNA片段運送至特定細胞的潛力。EBV重組體能夠以游離基因DNA保持受感染B-細胞中的DNA大片段。單個克隆攜帶的高達330kb的人基因組插入物在遺傳學上似乎是穩定的。這些游離基因的保持需要在用EBV感染的過程中，組成型地表達的特定的EBV核蛋白(EBNA1)。另外，這些載體可以被用于能夠在體外短暫地產生大量蛋白的轉染。皰疹病毒擴增子系統也正被用來包裝＞220kb的DNA片段以及感染能夠以游離基因穩定保持DNA的細胞。
其它有用的系統包括，例如，復制性的和宿主限制的非復制性的痘苗病毒載體。
(2)基于非核酸的系統所公開的組合物能夠以各種途徑運送至靶細胞。例如，所述組合物能夠通過電穿孔或通過脂質轉染或通過磷酸鈣沉淀運送。選擇的運送機制部分取決于靶細胞的類型和運送發生在例如體內還是體外。
因此，除了公開的核酸或載體實例外，所述組合物可以包括諸如脂質體，諸如陽離子脂質體(例如DOTMA，DOPE，DC-膽固醇)或陰離子脂質體，的脂類。如果需要，脂質體可以進一步包括幫助靶向特定細胞的蛋白。包括化合物和陽離子脂質體的組合物的給藥可以給至向靶器官輸送的血液中，或吸入呼吸道而靶向呼吸道的細胞。關于脂質體參見，例如Brigham et al.Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.195-100(1989)；Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 847413-7417(1987)；美國專利4,897,355。此外，所述化合物可以作為能夠靶向諸如巨噬細胞的特定細胞類型的，或其中所述化合物從微膠囊的擴散或釋放被設計為具有特定的速率或劑量的，微膠囊的組分給藥。
在上述包括外源DNA的給藥并攝取進入受試者的細胞的方法中(即基因轉導或轉染)，所述組合物可以通過各種機制運送至細胞。例如，可以通過脂質體運送，采用市售脂質體制品，例如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)，SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及其它根據本領域操作標準開發的脂質體。另外，所公開的核酸或載體能夠在體內通過電穿孔(該技術獲自Genetronics，Inc.(San Diego，CA))，以及通過SONOPORATION機(ImaRxPharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)的方法來運送。
原料可以存在于溶液或懸浮液中(例如，摻入微粒、脂質體或細胞中)。所述原料可以通過抗體、受體或受體配體靶向特定的細胞類型。以下參考文獻為應用這種技術來使特定蛋白靶向腫瘤組織的實例(Senter，et al.，BioconjugateChem.，2447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60275-281，(1989)；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58700-703，(1988)；Senter，et al.，BioconjugateChem.，43-9，(1993)；Battelli，et al.，Cancer Immunol.Immunother.，35421-425，(1992)；Pietersz and McKenzie，Immunol.Reviews，12957-80，(1992)；以及Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol，422062-2065，(1991))。所述技術能夠用于各種其它特定的細胞類型。諸如“隱形”(″stealth″)和其它抗體綴合的脂質體(包括對結腸癌的脂質介導的藥物尋靶)的載體，通過細胞特異性配體的受體介導的DNA尋靶，淋巴細胞定向的腫瘤尋靶以及體內對鼠神經膠質瘤細胞的高度特異性治療性逆轉錄病毒尋靶。以下參考文獻為應用該技術來使特定蛋白靶向腫瘤組織的實例(Hughes et al.，Cancer Research，496214-6220，(1989)；以及Litzinger and Huang，Biochimica etBiophysica Acta，1104179-187，(1992))。一般而言，受體參與組成型的或者配體誘導的內吞作用途徑。這些受體簇集于網格蛋白小窩之中，通過網格蛋白小泡進入細胞，通過受體被分類處于其中的酸化內涵體，然后重新循環到細胞表面，儲存于細胞內或者于溶酶體中降解。所述內化途徑具有各種功能，例如養分攝入、活化蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的條件性進入、配體的解離與降解，以及受體水平的調節。取決于細胞類型、受體濃度、配體類型、配體價態和配體濃度，許多受體遵循一條以上的胞內途徑。受體介導的內吞作用的分子和細胞機制已經得到綜述(Brown and Greene，DNA and Cell Biology106，399-409(1991))。
被運送至細胞中的將被整合到宿主細胞基因組的核酸，通常包括整合序列。這些序列通常是病毒相關序列，尤其在使用基于病毒的系統時。這些病毒整合系統還能夠被納入將要用諸如脂質體的基于非核酸的運送系統運送的核酸中，所以包含在運送系統中的核酸能夠被整合到宿主基因組中。
其它整合到宿主基因組中的通用方法包括，例如，設計以促進與宿主基因組同源重組的系統。這些系統通常依靠側翼與要表達的核酸相連的序列，所述序列與宿主細胞基因組中的靶序列具有足夠的同源性，載體核酸和靶核酸之間能夠發生重組，導致所運送的核酸被整合到宿主基因組之中。這些促進同源重組所需的系統和方法為本領域技術人員所知曉。
(3)體內/離體(ex vivo)正如以上所述，所述組合物可以在藥學上可接受的載體中給藥并能夠通過各種本領域所熟知的機制(例如，裸露DNA的攝取、脂質體融合、通過基因槍的DNA肌內注射、內吞作用等等)在體內和/或離體運送至受試者的細胞。
如果采用離體方法，細胞或組織可以根據本領域所熟知的標準規程除去并保存在體外。所述組合物可以通過任何基因轉移機制導入細胞內，例如磷酸鈣介導的基因傳遞、電穿孔法、顯微注射法或脂蛋白體法。然后根據針對細胞或組織類型的標準方法，轉導的細胞可以被注入(例如，在藥學可接受的載體中)或等位移植回受試者中。已知將各種細胞移植或注入受試者的標準方法。
(e)表達系統運送至細胞的核酸通常包括表達控制系統。例如，病毒和逆轉錄病毒系統中的插入基因通常包括啟動子和/或增強子來幫助控制所需基因產物的表達。啟動子一般是當處在對于轉錄起始位點來說相對固定的位置時起作用的一段或多段DNA序列。啟動子包括RNA聚合酶和轉錄因子的基本相互作用所需的核心元件，且可以包括上游元件和反應元件。
(1)病毒啟動子和增強子控制從哺乳動物宿主細胞中的載體轉錄的優選啟動子可以從各種來源獲得，例如，諸如多瘤、猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒和最優選的巨細胞病毒的病毒基因組，或諸如β肌動蛋白啟動子的異源哺乳動物的啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以以還包括SV40病毒的復制起點的SV40限制性酶切片段方便地得到(Fierset al.，Nature，273113(1978))。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以以HindIIIE的限制性酶切片段方便地得到(Greenway，P.J.et al.，Gene18355-360(1982))。當然，來自宿主細胞或相關物種的啟動子在此處也同樣適用。
增強子一般是指在與轉錄起始位點不固定的距離處起作用的DNA序列，它可以位于轉錄單位的5′(Laimins，L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或3′(Lusky，M.L.，et al.，Mol.Cell Bio.31108(1983))。此外，增強子可以位于內含子中(Banerji，J.L.etal.，Cell33729(1983))以及編碼序列自身中(Osborne，T.F.，et al.，Mol.CellBio.41293(1984))。它們的長度通常在10-300bp之間，且順式作用。增強子起增加臨近啟動子轉錄的作用。增強子還經常包括介導轉錄調控的反應元件。啟動子也可以包括介導轉錄調控的反應元件。增強子經常決定基因表達的調控。盡管現在已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)的增強子序列，但是對于一般表達而言，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。優選的實例是處于復制起點后側(bp100-270)SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子的增強子、處于復制起點后側的多瘤增強子以及腺病毒增強子。
啟動子和/或增強子可以通過觸發其功能的光或特定化學事件而被特異性激活。系統可以通過諸如四環素和地塞米松的試劑來調節。還有通過暴露于諸如γ輻射等輻射或烷化的化療藥物來增強病毒載體基因表達的途徑。
在某些實施方案中，所述啟動子和/或增強子區能夠以組成型啟動子和/或增強子使要轉錄的轉錄單位區域的表達最大化。在某些構建體中，啟動子和/或增強子區域在所有的真核細胞類型中都是有活性的，即使所述啟動子和/或增強子區域只在特定的時間在特定類型的細胞中表達。這種類型優選的啟動子是CMV啟動子(650個堿基)。其它優選的啟動子為SV40啟動子、巨細胞病毒(全長啟動子)以及逆轉錄病毒載體LTF。
已顯示，所有特定的調控元件都能夠被克隆并用于構建選擇性地在諸如黑色素瘤細胞的特定細胞類型中表達的表達載體。膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子已經被用于選擇性地在來源于神經膠質的細胞中表達基因。
用在真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或有核細胞)中的表達載體還可以包括會影響到mRNA表達的轉錄終止所必需的序列。在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中，這些區域被轉錄為多聚腺苷酸片段。3′非翻譯區還包括轉錄終止位點。優選轉錄單位還包括多聚腺苷酸化的區域。所述區域的一個益處在于增加被轉錄的單位能象mRNA一樣被處理和運輸的可能性。已經完全建立了鑒別和使用表達構建體中的多聚腺苷酸信號的方法。優選在轉基因構建體中使用同源的多聚腺苷酸化信號。在某些轉錄單位中，多聚腺苷酸化區域來自SV40早期多聚腺苷酸化信號并由約400個堿基組成。還優選的是，被轉錄的單位只包括其它標準序列或者同時包括上述序列，以改善構建體的表達或穩定性。
(2)標記病毒載體可以包括編碼標記產物的核酸序列。這種標記產物用于確定基因是否被運送至細胞及一旦被運送是否得到表達。優選的標記基因是編碼β-半乳糖苷酶和綠色熒光蛋白的大腸桿菌(E.Coli)lacZ基因。
在某些實施方案中，所述標記可以是選擇性標記。對于哺乳動物細胞而言，合適的選擇性標記的實例有二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素以及博羅霉素。當這類選擇性標記成功轉移到哺乳動物宿主細胞中時，被轉化的哺乳動物宿主細胞能夠在選擇壓力下存活。有兩種廣泛使用的選擇方式的不同分類。第一類是基于細胞的代謝以及使用缺少不依賴于補給性培養基的生長能力的突變細胞系。兩個實例為CHO DHFR-細胞和鼠LTK-細胞。在沒有例如胸苷或次黃嘌呤等營養素的情況下，這些細胞不具備生長的能力。由于這些細胞缺少完整的核苷酸合成途徑所必需的某些基因，因此除非在補給性培養基中提供所缺少的核苷酸，否則它們不能生存。補給培養基的另一種備選方法是將完整的DHFR或TK基因引入分別缺少所述基因的細胞中并因此而改變它們的生長條件。沒有用DHFR或TK基因轉化的個體細胞不能在非補給性培養基中存活。
第二類是指任何細胞類型均可使用的選擇策略且不需要使用突變細胞系的優勢選擇。這些策略通常使用藥物來使宿主細胞的生長停止。具有新基因的細胞會表達攜帶抗藥性的蛋白并能在選擇中存活。這類優勢選擇的實例使用藥物新霉素，(Southern P.and Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1327(1982))，霉酚酸，(Mulligan，R.C.and Berg，P.Science 2091422(1980))或者潮霉素，(Sugden，B.et al.，Mol.Cell.Biol.5410-413(1985))。這三個實例采用真核生物控制下的細菌基因來分別提供對合適藥物G418或新霉素(遺傳霉素)，xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其它藥物包括新霉素類似物G418和博羅霉素。
f)肽(1)蛋白變異體正如此處所詳述的，有許多缺口結構基序和相關蛋白(例如gp160和CD4)的變異體，這些都是已知的并在此處得到考慮。除了已知的功能性gp160毒株變異體和其它變異體之外，還有諸如還在所公開的方法和組合物中起作用的所述缺口結構基序的衍生物。蛋白變異體和衍生物為本領域技術人員所熟知并能夠參與氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾通常屬于置換、插入或缺失變異體這三類中的一類或多類。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及單個或多個氨基酸殘基的內部序列插入。插入通常是與氨基或羧基末端融合式的插入相比較小的插入，例如，數量級為一至四個殘基的插入。通過體外交聯或通過編碼該融合物的DNA轉化的重組細胞培養物，將大得足以將免疫原性轉達給靶序列的多肽進行融合，從而制備例如實施例中所述的免疫原性的融合蛋白衍生物。缺失的特征是一個或多個氨基酸殘基從蛋白序列中除去。通常，不超過約2至6個殘基在蛋白分子中的任何一個位置被刪除。這些變異體通常通過在編碼蛋白的DNA中的核苷酸的位點特異性誘變來制備，從而產生編碼變異體的DNA，且此后在重組細胞培養物中表達所述DNA。已經熟知在具有已知序列的DNA中預先設定的位點上產生置換型突變的技術，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換通常為單個殘基，但是能夠在許多不同的位置同時發生；插入的數量級通常為約1至10個氨基酸殘基；缺失范圍為約1至30個殘基。缺失或插入優選在鄰近對中產生，即2個殘基的缺失或2個殘基的插入。置換、缺失、插入或其任何組合可以相結合以得到最終的構建體。所述突變不得將序列置于閱讀框之外且優選不會形成能夠產生二級mRNA結構的互補區。置換型變異體是指其中至少一個殘基被除去而在其位置上插入不同的殘基。這類置換通常依照以下表1和2產生且所述置換被稱為保守置換。
表1氨基酸縮寫



通過低于表2中的保守性的選擇置換，即選擇對維持(a)置換區的多肽骨架結構，例如片層或螺旋構象，(b)位于靶點的分子的電荷和疏水性或者(c)側鏈的大小方面的影響上差別更顯著的殘基，可以產生功能或免疫識別上的重大改變。一般希望在蛋白特性上產生最大改變的置換是這樣的置換，其中(a)諸如絲氨酰基或蘇氨酰基等親水殘基置換(或被置換成)諸如亮氨酰基、異亮氨酰基、苯丙氨酰基、纈氨酰基或丙氨酰基等疏水性殘基；(b)半胱氨酸或脯氨酸置換(或被置換成)任何其它殘基；(c)諸如賴氨酰基、精氨酰基或組氨酰基等具有帶有正電荷側鏈的殘基置換(或被置換成)諸如谷氨酰基或天冬氨酰基等帶負電的殘基；或(d)諸如苯丙氨酸的具有龐大側鏈的殘基置換(或被置換成)諸如甘氨酸的沒有側鏈的殘基，在此情況下，(e)通過增加硫酸化和/或糖基化(作用)位點的數目，使蛋白特性上產生改變。
例如，本領域技術人員知曉一個氨基酸殘基被另一個在生物學和/或化學上相似的殘基置換是保守置換。例如，保守置換用一個疏水性殘基置換另一個疏水性殘基，或者用一個極性殘基置換另一個極性殘基。所述置換包括諸如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr的組合。各種明確公開序列的這種保守置換的變體包括在此處所提供的嵌合體多肽中。
置換型或缺失型突變可以用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位點。半胱氨酸或其它不穩定的殘基的缺失也是所希望的。諸如Arg等蛋白水解位點的缺失或置換，例如通過缺失一個堿性殘基或用谷氨酰胺酰基或組氨酰基殘基置換一個堿性殘基而實現。
一定的翻譯后衍生是重組宿主細胞對所述被表達的多肽進行作用的結果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基殘基常常在翻譯后脫去酰胺基變成相對應的谷氨酰基和天冬酰基殘基。或者，這些殘基在溫和的酸性條件下脫去酰胺基。其它的翻譯后加工包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酸或蘇氨酸或酪氨酸殘基上羥基基團的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈o-氨基基團的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco pp 79-86 )，N末端胺的乙酰化，以及某些情況下C末端羧基的酰胺化。
應當理解的是，定義此處所公開蛋白的變異體和衍生物的方法是根據與特定已知序列同源性/同一性來定義變異體和衍生物的。例如，SEQID NO1列出缺口結構基序的詳細序列。特別公開了在此所公開的這些和其它蛋白的變異體，其與所述序列有至少10％或15％或20％或25％或30％或35％或40％或45％或50％或60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％的同源性。本領域技術人員容易理解如何確定兩種蛋白的同源性。例如，同源性可在對這兩條序列比對后使其同源性達到最大值進行計算。
其它計算同源性的方法能以發表的算法執行。用于比較的序列最佳比對可以通過Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源算法、Needleman和Wunsch，J.MoL Biol.48443(1970)的同源比對算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)的搜索相似性方法、這些算法的計算機化工具(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過檢查的方式來進行。
對核酸而言，能夠通過例如在Zuker，M.Science 24448-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867706-7710，1989，Jaegeret al.Metlaods Enzymol.183281-306，1989中公開的算法獲得相同類型的同源性，對于至少與核酸比對相關的資料而言，所述文獻在此通過援引的方式納入。
應當理解的是，保守突變和同源性的描述能以任何組合方式結合起來，如與特定序列具有至少70％同源性的實施方案，其中該變異為保守突變。
由于本說明書詳述了各種蛋白和蛋白序列，應當理解的是，能編碼這些蛋白序列的核酸也被公開了。這可包括與特定蛋白序列相關的所有簡并序列，即含有編碼一個特定蛋白序列的序列的所有核酸，以及包括簡并核酸的編碼該蛋白序列的所公開變異體和衍生物的所有核酸。因而，盡管各條特定核酸序列沒有在此列出，應當理解的是，通過所公開的蛋白序列每條序列實際上都在此得到公開和描述。例如，能編碼在SEQ IDNO26中所列出的蛋白序列的眾多核酸序列中的一條在SEQ ID NO27中列出。還應當理解的是，盡管氨基酸序列沒有指出何種特定DNA序列編碼有機體內的這種蛋白，其中所公開蛋白的特定變異體在此得到公開，已知的編碼從特定有機體內產生的該蛋白的核酸序列也是已知的并在此得到公開和描述。
應當理解的是，有許多氨基酸和肽類似物能夠納入所公開的組合物中。例如，有許多D氨基酸或者與表1和表2中所示的氨基酸具有不同功能性取代基的氨基酸。自然存在的肽的相對的立體同分異構體以及肽類似物的立體同分異構體也得到公開。通過以選定的氨基酸使tRNA分子帶電，以及對可利用如三聯體密碼子的遺傳構建體進行操作以將模擬的氨基酸以位點特異性的方式插入到肽鏈中，這些氨基酸能輕易整合到多肽鏈中(Thorson et al.，Methods in Molec.Biol.7743-73(1991)，Zoller，Current Opinion in Biotechnology，3348-354(1992)；Ibba，Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13197-216(1995)，Cahill et al.，TIBS，14(10)400-403(1989)；Benner，TIB Tech，12158-163(1994)；Ibba and Hennecke，Bio/technology，12678-682(1994)至少對氨基酸類似物相關的資料而言，所有這些文獻在此處以援引的方式納入)。包含d-氨基酸的肽的化學合成也能輕易完成，并且例如包含所有d-氨基酸的肽能用本領域熟知的方法制備。
可生產與肽類似的分子，但是其不是通過天然肽鍵連接的。例如，氨基酸或氨基酸類似物的連接鍵可包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(順式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--以及--CHH2SO-(這些及其它可在Spatola，A.F.in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue 3，Peptide BackboneModifications(general review)；Morley，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468；Hudson，D.et al.，Int J Pept Prot Res14177-185(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola et al.Life Sci 381243-1249(1986)(--CHH2--S)；Hann J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314(1982)(--CH--CH--，cis and trans)；Almquist et al.J.Med.Chem.231392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White et al.TetrahedronLett 232533(1982)(--COCH2--)；Szelke et al.European Appln，EP 45665CA(1982)9739405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladayet al.Tetrahedron.Lett 244401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；以及Hruby Life Sci 31189-199(1982)(--CH2--S--)等中找到；所述文獻均在此通過援引的方式納入。特別優選的非肽連接鍵是--CH2NH--。應當理解的是，所述肽類似物在鍵原子之間可有多個原子，如b-丙氨酸，g-氨基丁酸等等。
氨基酸類似物和肽類似物常常具有增強的或所希望的性質，例如更經濟的產量、更好的化學穩定性、增強的藥理學性質(半衰期、吸收率、效價強度和效能等)、改變的特異性(例如較寬的生物學活性作用譜)、減低的抗原性等等。
D-氨基酸能夠用來產生更加穩定的肽，因為D氨基酸不為肽酶等所識別。將共有序列中的一種或多種氨基酸系統性地替換為同類型的D氨基酸(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)能夠用來產生更穩定的肽。半胱氨酸殘基能夠用來環化或將兩個或多個肽連接在一起。這有利于將肽約束于特定的構象(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992)，在此以援引的方式納入)。
g)藥物載體/藥品的釋放如上所述，所述組合物也能夠通過藥學上可接受的載體在體內給藥。所謂“藥學上可接受的”是指并非在生物學上或者在其它方面不合需要的物質，也即該物質可與所述核酸或者載體一起給予受試對象，而并不導致任何不合需要的生物學效應或者并不以有害的方式與包含該物質的藥學組合物的任何其它成分相互作用。正如本領域內技術人員所熟知，可容易地選擇載體以將對活性成分的降解最小化，以及將該受試對象的任何不利的副作用最小化。
所述組合物可以以口服的、非腸道的(例如靜脈內的)、肌內注射的、腹膜內注射的、穿過表皮的、身體外的、局部的或類似的方式給藥，包括局部鼻內給藥或者吸入給藥。正如在此所應用的，“局部鼻內給藥”是指所述組合物通過一個或兩個鼻孔釋放入鼻和鼻通道，并且能夠包括通過噴射機制或者飛沫機制釋放，或者通過所述核酸和載體的噴霧的方式。所述組合物通過吸入方式的給藥能夠通過噴射或者飛沫機制釋放而通過鼻和口。通過插管法也能夠直接釋放到呼吸系統的任何區域(例如肺)。所述組合物所需要的的精確量因受試者而異，取決于物種、年齡、體重和受試對象的綜合情況，所治療的過敏性疾病的嚴重性，所利用的特定核酸或者載體，及其給藥模式等等。因而，不可能為每個組合物指定精確的量。然而，利用此處的示教，本領域技術人員僅利用常規實驗即能夠確定合適的量。
若使用所述組合物的非腸道給藥，其通常以注射為特征。注射劑能夠以常規的形式準備，作為液體溶液或者懸液，適合于注射前懸浮溶于液體中的固體形式，或者作為乳狀液。非腸道給藥的更新的修訂過的方法包括利用緩釋或者持續釋放體系，因而可維持不變的劑量。參見例如美國專利3,610,795，在此以援引的方式納入。
該物質可以是溶液、懸液(例如，整合到微粒、脂質體或者細胞之中)的形式。這些可以通過抗體、受體或受體配體靶向到特定的細胞類型。下面的參考文獻是利用此技術將特定蛋白靶向到腫瘤組織的實例(Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，2447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60275-281，(1989)；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58700-703，(1988)；Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，43-9，(1993)；Battelli，et al.，CancerImmunol.Immunother.，35421-425，(1992)；Pietersz and McKenzie，Immunolog.Reviews，12957-80，(1992)；以及Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol，422062-2065，(1991))。諸如“隱形”(″stealth ″)和其它抗體綴合的脂質體(包括對結腸癌的脂質介導的藥物尋靶)的載體，通過細胞特異性配體的受體介導的DNA尋靶，淋巴細胞定向的腫瘤尋靶以及體內對鼠神經膠質瘤細胞的高度特異性治療性逆轉錄病毒尋靶。下面的參考文獻是利用此技術將特定蛋白靶向到腫瘤組織的實例(Hughes et al.，Cancer Research496214-6220，(1989)；以及Litzinger and Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104179-187，(1992))。一般而言，受體參與組成型的或者配體誘導的內吞作用途徑。這些受體簇集于網格蛋白小窩之中，通過網格蛋白小泡進入細胞，通過受體被分類處于其中的酸化內涵體，然后重新循環到細胞表面，儲存于細胞內或者于溶酶體中降解。所述內化途徑具有各種功能，例如養分攝入、活化蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的條件性進入、配體的解離與降解，以及受體水平的調節。取決于細胞類型、受體濃度、配體類型、配體價態和配體濃度，許多受體遵循一條以上的胞內途徑。受體介導的內吞作用的分子和細胞機制已經得到綜述(Brown和Greene，DNA and Cell Biology106，399-409(1991))。
(1)藥學上可接受的載體所述組合物，包括抗體，能夠結合藥學上可接受的載體在治療上得到應用。
合適的載體及其制劑在RerningtonThe Science and Practiceof Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995中得到描述。通常，在制劑中使用合適量的藥學上可接受的鹽，以使制劑具有等滲性。藥學上可接受的載體的實例包括但不限于生理鹽水、任氏液和葡萄糖溶液。所述溶液的pH值優選約5-8，并且更優選約7-7.5。載體進一步包括緩釋制劑，例如包括抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，所述基質的形式為成形的物品，例如薄膜、脂質體或微粒。對本領域技術人員顯而易見的是，某些載體可能是更優選的，這取決于給藥途徑和所給組合物的濃度。
藥物的載體為本領域技術人員所知曉。最通常的情況下所述載體是對人類給藥的標準載體，包括諸如無菌水、生理鹽水和生理pH緩沖溶液等溶液。所述組合物可以肌內或皮下給藥。根據本領域技術人員所采用的標準操作，可以給予其它化合物。
除了選定的分子外，藥物組合物可以包括載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等等。藥物組合物還可以包括一種或多種活性組分，例如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等等。
所述藥物組合物可以以多種途徑給藥，取決于是否需要局部或全身治療以及要治療的區域。給藥可以通過局部用藥(包括眼部、陰道內、直腸內、鼻內)，口服，吸入，或者諸如通過靜脈滴注、皮下、腹膜內或肌內注射的非胃腸道給藥。所公開的抗體可以通過靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、腔內或經皮給藥。
用于非胃腸道給藥的制品包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油的植物油以及諸如油酸乙酯的注射用有機酯。水性載體包括水、含醇/含水溶液、乳液或包括生理鹽水和緩沖介質的懸浮液。非胃腸道載體包括氯化鈉溶液、任氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸任氏液或不揮發油。靜脈內載體包括流體和營養補充劑、電解質補充劑(例如基于任氏葡萄糖的電解質補充劑)等等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等等。
用于局部給藥的制劑可以包括膏劑、洗劑、霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規的藥物載體，含水、粉末或含油基質，增稠劑等等可能是必需或希望的。局部給藥的制劑可以包括透皮貼劑。有涂層的避孕套、手套等等也是有益的。
用于口服給藥的組合物包括粉末或顆粒、水或非水介質中的懸浮液或溶液、膠囊劑、囊劑或片劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是所希望的。
某些組合物有可能以藥學可接受的酸或堿加成鹽的形式給藥，所述酸或堿加成鹽通過與無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，以及有機酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸反應或通過與無機堿，例如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀，和有機堿，例如一，二，三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺反應形成。
用于腸胃外、鞘內或心室內給藥的組合物可以包括也可以包含緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑在內的無菌水溶液。
除了這類藥物載體之外，陽離子脂類也可以包括在制劑中以促進攝取。一種顯示促進攝取的這種組合物是Lipofectin(BRL，BethesdaMD)。
(2)治療性用途公開了減少人免疫缺陷病毒與宿主細胞相互作用的方法。所述組合物給藥的有效劑量和方案可以根據經驗來決定，而作出這種決定是在本領域的技術范圍之內。所述組合物給藥的劑量范圍應大到足以產生所需的能夠影響表征病癥的效應。所述劑量不應當大到以至于引起有害的副作用，例如不想要的交叉反應、過敏性反應等等。一般而言，所述劑量會根據年齡、健康狀況、性別和患者的患病程度、給藥途徑或者是否還使用其它藥物而變化，并且能夠為本領域技術人員所決定。如果出現任何禁忌癥，所述劑量可以由各個醫生來調整。劑量可以變化并能夠以每日一劑或多劑給藥，給藥一天或多天。用藥指導可以在關于給定藥物類別的合適劑量的文獻中找到。例如，在選擇合適的劑量的抗體上的指導可以在關于抗體的治療性用途的文獻中找到，例如Handbook ofMonoclonal Antibodies，Ferrone et al.，eds.，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，(1985)ch.22 and pp.303-357；Smith et al.，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，以及Haber et al.，eds.，Raven Press，New York(1977)pp.365-389。單獨使用的抗體的通常日劑量在每日每公斤體重1μg至高達100mg或更高，這取決于上述的因素。
用量取決于待治療疾病的嚴重性和反應性，療程持續幾天至幾個月，或直至實現痊愈或達到疾病狀態的減輕。在健康受試者的情況下，只要有接觸的風險，療程就可以持續。
最佳給藥方案可以從藥物在體內蓄積的測量值來計算。最適劑量可以使用劑量方法學和重復率來確定。最適劑量可以根據個體組合物的相對功效而改變，且一般可以基于IC50或EC50的體外或體內動物研究來計算。例如，給定化合物的分子量和有效量，例如IC50，例如(實驗來源的)，可以按常規方法計算出以mg/kg為單位的劑量。
下述的諸如抗體或肽等公開組合物為治療、抑制或預防HIV感染給藥后，治療性抗體的效力能夠以各種為本領域技術人員所熟知的方法評估。例如，本領域技術人員了解，通過觀察到此處公開的諸如抗體的組合物降低病毒載量或防止病毒載量的進一步增加，所述組合物即在治療或者阻止受試者體內HIV感染方面是有效的。病毒載量可以通過本領域已知的方法來測定，例如采用聚合酶鏈式反應來檢測HIV核酸的存在，或者采用抗體分析來檢測HIV蛋白在來自受試者或患者的樣本(例如但不限于血液)中的存在，或者通過測定患者體內循環抗HIV抗體的水平。公開組合物給藥的效力還可以通過測定感染HIV的受試者體內CD4+T細胞數目來確定。抑制HIV陽性受試者或患者體內CD4+T細胞的初期或進一步下降，或引起HIV陽性受試者體內CD4+T細胞的數目增加的抗體治療是有效的抗體治療。
此處所公開的抑制CD4-gp160相互作用的組合物可以預防性地給予有感染HIV風險的患者或受試者，例如正暴露于HIV，或者新近曾暴露于HIV。在新近曾暴露于HIV但在血液或其它體液中仍未顯示出現該病毒(如通過PCR或其它檢測病毒的分析方法所測定的)的患者中，用抗體進行的有效治療能夠部分或完全抑制該病毒在血液或其它體液中的出現。
能夠與缺口結構域或缺口結合結構域相互作用從而抑制CD4-gp160相互作用的其它分子不具有特定藥物功能但是可以用來示蹤細胞染色體內的變化或用來運送診斷工具，所述分子例如可以以與針對藥物所作敘述類似的方法運送。
公開的組合物和方法還能夠用作，例如分離和檢測用于各種HIV相關疾病的新候選藥物的工具。
能夠干擾HIV-1的糖蛋白160內的靶點與推測的針對該靶點的宿主細胞配體相結合的分子、組織或細胞能夠與該分子的組合物接觸，從而減少人免疫缺陷病毒與宿主細胞的相互作用。使組織或細胞“接觸”組合物意即體外或在體向細胞懸液或組織樣本中添加通常存在于合適液態載體中的組合物，或將所述組合物給予至動物(包括人)體內的細胞或組織。通過將組織或細胞與所述分子的組合物接觸，gp160蛋白和/或組織或細胞中的配體藉此暴露于所述分子。
4.芯片和微陣列公開了其上至少有一處是此處所公開的任何核酸序列所闡明的序列或其部分的芯片。還公開了其上至少有一處是此處所公開的任何肽序列所闡明的序列或其部分的芯片。
還公開了其上至少有一處是此處所公開的任何核酸序列所闡明的序列或其部分的變異體的芯片。還公開了其上至少有一處是此處所公開的任何肽序列所闡明的序列或其部分的變異體的芯片。
5.試劑盒此處公開了裝有能夠被用在實施此處所公開的方法中的試劑的試劑盒。所述試劑盒能夠包括此處詳述的任何試劑或試劑組合，或可理解為在所公開的方法的實施過程中所需的或有益的試劑或試劑組合。例如，所述試劑盒可以包括實施在所述方法的某些實施方案中所詳述的擴增反應的引物，以及要使用引物所必需的緩沖液和酶。
C.制備該組合物的方法此處所公開的組合物和執行所公開的方法所必需的組合物能夠以所述特定試劑或化合物領域技術人員已知的任何方法制備，除非另有特別說明。
1.核酸合成例如，諸如用作引物的寡核苷酸的核酸能以標準化學合成方法制備或以酶法或其它已知方法生產。這類方法包括從先用標準的酶消化然后分離核酸片段(例如參見Sambrook et al.，Molecular cloningALaboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)Chapters 5，6)，到完全的合成法，例如利用Milligen或Beckman System 1 Plus DNA合成儀(例如，位于馬薩諸塞州伯林頓的Milligen-Biosearch的Model 8700自動化合成儀，或ABI Model 380B)的氰乙基亞磷酰胺法。對于制備寡核苷酸有用的合成法也為Ikuta等人(Ann.Rev.Biochem.53323-356(1984)，磷酸三酯和亞磷酸三酯法)和Narang等人(Methods Enzymol.，65610-620(1980)，磷酸三酯法)所描述。蛋白質核酸分子能用已知的方法如Nielsen等人(Bioconjug.Chem.53-7(1994))所描述的那樣來制備。
2.肽合成生產諸如SEQ ID NO1的所公開蛋白的一種方法是用蛋白質化學技術將兩個或更多的肽或多肽或氨基酸連在一起。例如，肽或多肽能以當前可用的實驗室設備用Fmoc(9-芴甲氧羰基，9-fluorenylmethyloxycarbonyl)或Boc(叔丁氧羰基，tert-butyloxycarbonyl)化學方法化學合成(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。本領域技術人員容易理解與所公開的蛋白相應的肽或多肽例如能夠以標準的化學反應合成。例如，肽或多肽能被合成且并不從其合成樹脂上分離，而肽或蛋白的其它片段能被合成并隨后從樹脂上分離，從而暴露在其它片段中被功能性封閉的末端基團。通過肽縮合反應兩片段能通過肽鍵分別在其羧基和氨基末端共價連接以形成抗體或其片段。(Grant GA(1992)Synthetic PeptidesA User Guide[合成肽用戶指南]，W.H.Freeman和Co.，N.Y.(1992)；Bodansky M和Trost B.，Ed.(1993)Principles of Peptide Synthesis[肽合成原理].Springer-Verlag Inc.，NY(對于至少與肽合成相關的資料而言，所述文獻在此通過援引的方式納入))。或者，所述肽或多肽按此處所述在體內獨立合成。一旦這些獨立的肽或多肽被分離，就可以通過類似的肽縮合反應連接起來從而形成肽或其片段。
例如，克隆的或合成的肽片段的酶連接反應使得相對較短的肽片段能夠被連接起來以產生較大的肽片段，多肽或整個蛋白結構域(Abrahmsen L等，Biochemistry，304151(1991))。或者，合成肽的天然化學連接能用來從較短的肽片段合成構建較大的肽或多肽。此方法包括兩步化學反應(Dawson et al.Synthesis of Proteins by NativeChemical Ligation.Science，266776-779(1994))。第一步是一個無保護的合成肽-硫酯與另外一個包含氨基末端Cys殘基的無保護的肽片段的化學選擇性反應，產生硫酯連接的中間產物作為最初的共價產物。反應條件不變，此中間產物經歷自發的、迅速的分子內反應以在該連接位點形成天然的肽鍵(Baggiolini M et al.(1992)FEBS Lett.30797-101；Clark-Lewis I et al.，J.Biol.Chem.，26916075(1994)；Clark-Lewis I et al.，Biochemistry，303128(1991)；Rajarathnam K et al.，Biochemistry 336623-30(1994))。
或者，未保護的肽片段以化學方法連接，其中作為化學連接反應結果的于肽片段間形成的鍵是非天然的鍵(非肽鍵)(Schnolzer，M et al.Science，256221(1992))。此技術已被用來合成蛋白質結構域和大量的具有完全生物學活性的相對純的蛋白的類似物(deLisle Milton RCet al.，Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press，NewYork，pp.257-267(1992))。
3.制備細胞和動物的方法公開了用所公開的任何核酸或肽轉化細胞所產生的細胞。公開了用所公開的任何非天然存在的核酸或肽接觸細胞所產生的細胞。
公開了表達任何所公開的核酸而產生的任何所公開的肽。公開了表達任何所公開的核酸而產生的任何非天然存在的所公開的肽。公開了表達任何非天然的所公開的核酸而產生的任何所公開的肽。
公開了用此處所公開的任何核酸分子轉染所述動物體內細胞而產生的動物。公開了用任何此處所公開的核酸分子轉染所述動物體內細胞而產生的動物，這里所述動物是哺乳動物。還公開了用任何此處所公開的核酸分子轉染所述動物體內細胞而得到的動物，此處所述哺乳動物是小鼠、大鼠、兔、牛、羊、豬或靈長類。
還公開了將任何此處所公開的細胞加入所述動物體內而得到的動物。
D.使用該組合物的方法1.將所述組合物作為研究工具來使用的方法所公開的組合物可以多種方式作為研究工具應用。例如，所公開的組合物，如SEQ ID NO1-25，比方說其可作為結合抑制劑而能夠被用來研究CD4和gp160之間的相互作用。
在分離具有想要的與CD4和gp160結合相關的功能性性質的分子的組合化學程序或其它篩選程序中，所述組合物能被用來例如作為靶標。
通過例如確定在HIV分離物中存在有缺口序列，所公開的組合物還能用作如HIV的疾病相關的診斷工具。
如此處所詳述的那樣，所公開的組合物能用作微陣列中的試劑或者用作探測或分析現有微陣列的試劑。所公開的組合物能用于任何已知的分離或確定單核苷酸多態性的方法中。該組合物還能用于確定例如HI V分離物的株系分析的任何方法中。該組合物還能用于與芯片/微陣列相關的任何已知篩選分析的方法中。該組合物還能夠用于利用所公開組分的計算機可讀的具體形式的任何方法中，例如，與所公開組合物相關的關聯性研究或分子模擬分析中。
E.實施例提出下面的實施例以提供給本領域普通技術人員關于如何制得和評價此處所主張的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法的完全公開和描述，并且這些實施例是純粹作為示例性的而不限于所公開的內容。已努力確保關于數字方面(如數量和溫度等)的準確性，但是某些誤差和偏差是可以解釋的。除非另有說明，比份是重量比份，溫度在℃或者處于環境溫度，壓力為大氣壓或者接近大氣壓。
實施例1a)材料與方法(1)序列比較首先，gp41，特別是其TM結構域中保守的序列以PC/GENE程序的PALIGN和CLUSTAL進行確定。然后，利用來自蛋白序列數據庫SWISS-PROT版本33的序列，用PC/GENE程序的PALIGN和CLUSTAL比對T細胞表面糖蛋白CD4(人類CD4)和被膜多聚蛋白gp160前體(ENV-HV1-A2)的可用序列以尋找CD4和gp41間可能的序列相似性。一旦所述八肽序列SEQID NO1IVGGLVGL或者其結構等價物被確定為CD4和HIV蛋白所共有，則用PESEARCH程序來確定數據庫中包含該序列的所有其它序列。gp160和CD4序列也都被用來以FSTPSCAN程序確定所有相關序列。從表5中顯示的共有序列，用PESEARCH確定包含相關序列的所有序列。接著利用巴斯德研究所(Pasteur Institute，Paris)的資源運行BLAST2搜索以更新gp160和CD4序列的數據庫。
(2)預測跨膜螺旋用Rao和Argos的方法預測跨膜螺旋序列。Rao & Argos，EuropeanJ Biochemistry 128565-575，1982用來顯示從不同物種預測得到的序列。這些序列如表8所示。
(3)構建跨膜螺旋模型為了使所述CD4和HIV-1八肽區域的結構可視化，以及為了評估以不同方式替換HIV-2和SIV gp41分子中八肽的保守甘氨酸殘基所產生的結構上的影響，構建了模型(例如參見表8中八肽的保守序列)。
表8(需要在文中引用，或許在第268段中)采用Rao&Argos的方法預測跨膜螺旋

利用運行在SGI工作站(Silicon Graphics Indigo)上的SYBYL軟件來進行這項工作-對跨膜螺旋區域大體上進行，對CD4、來自HIV-1的gp41、來自SIV-CZ的gp41以及來自各種HIV-2毒株的gp41則詳細進行。使用標準的計算機程序，將全部所顯示的結構構建成螺旋，然后經歷全局能量最低化過程。
(4)對CD4和HIV-1而言跨膜螺旋和八肽模型的對接。
為了檢查CD4和gp41的八肽位點之間直接相互作用的可能性，用SYBYL操作CD4和HIV-1的gp41的跨膜肽以使他們緊密鄰近，既考慮螺旋偶極相互作用也考慮空間相互作用。
b)結果首先，可得到來自26個HIV-1分離株的gp41的氨基酸序列，其代表了廣闊的時間上的和地理上的不同來源。某些地區的株間變異很大，而其它地區間則相對保守。表5顯示了來自26個HIV-1分離株的gp41的八肽序列的比對情況，這些分離株代表了廣闊的時間上的和地理上的不同來源。
表5gp41序列的比較HIV-1類型


顯示這些26株HIV-1的序列，從gp160的約688位殘基開始。1位、2位和6位包含功能上保守的疏水殘基異亮氨酸(I)和纈氨酸(V)，其中異亮氨酸在1位占優勢，纈氨酸在2位占優勢，但是二者在6位均不占優勢。亮氨酸(L)在整個5位和8位均是保守的。甘氨酸(G)在整個3、4和7位均是保守的。9位主要包含精氨酸(R)，其在HIV-1RH中被另外一個帶正電的殘基賴氨酸(K)所替換。表5還顯示了于HIV-1中發現的序列與遺傳上相關的猴病毒(simian virus)SIV-CZ中序列的相關性。除了1位和5位是例外情況之外，SIV-CZ與HIV-1共有序列并無不同；然而，這些位置被其它疏水性殘基保守地替代。檢查了另外664個HIV-1分離株，得到類似的結果(沒有列表)在所檢查的總共690條序列的243條中，7位的甘氨酸總是保守的，且在3位或4位(但不同時在3位和4位)發現只有丙氨酸(除甘氨酸外最小)。
表6顯示了HIV-2株和遺傳上相關的SIV的相應序列(以SIV-CZ序列和所述HIV-1序列的共有序列作為比較和對比)。在全部HIV-2中，1位包括疏水性殘基；然而，SIV-AG在1位具有天冬氨酸(D)，其為帶負電的殘基。
表6gp41序列的比較

2、5和6位包含功能上保守的疏水性殘基，其中在2位上纈氨酸占優勢，在5位為異亮氨酸和纈氨酸，在6位異亮氨酸占優勢。然而，與HIV-1和SIV-CZ不同的是，HIV-2的3、4和7位沒有完全保守的甘氨酸。僅在SIV的4位上是保守的甘氨酸。疏水性殘基常出現于3位。HIV2-RO的4位含有丙氨酸而不是甘氨酸，且SIV A1的4位含有異亮氨酸而不是甘氨酸。7位含有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸的排列。8位和9位分別具有完全保守的亮氨酸和精氨酸殘基。另外檢查了9株HIV-2(沒有列表)發現其在3位和7位都沒有甘氨酸。沒有觀察到任何HIV2序列在所述三個保守的3、4和7位上包含有單個丙氨酸殘基，在這個基序的3位上大多數替換為龐大的纈氨酸。
表7顯示了在人類和幾種其它感興趣的物種的CD4蛋白的TM結構域中的序列。
表7CD4序列的比較

在1位上纈氨酸是完全保守的，在2位上亮氨酸也是如此。與HIV-1和SIV-CZ相似的是，在3、4和7位上甘氨酸是保守的，但大鼠CD4例外，其4位和7位以絲氨酸取代。5位顯示有保守的疏水性殘基，但小鼠CD4例外，其為絲氨酸。6位和8位顯示完全為疏水性殘基。因此，人類和至少其它兩種靈長類的CD4的1-8位與HIV-1和SIV-CZ的gp41的1-8位的高度保守的八肽序列(盡管不是9位上保守的帶正電的殘基)是相似的。表7還顯示了來自人腦的融合素輔助受體和潛在的HIV受體(可能的阿片樣受體，OPRY-HUMAN)的TM序列。注意所述同樣的序列既在CCR5又在CXCR4中。融合素受體具有3個甘氨酸殘基，其間距與CD4的TM區域相似，但是順序上相反，而假定的腦受體具有與CD4相同順序的保守甘氨酸殘基。因此，HIV的已知的或假定的受體具有結構上與被發現存在于CD4的TM區域中的序列類似的序列。
由于在所述螺旋(此處所描述的)中“缺口”的存在依賴于該螺旋的結構，該保守的TM區域的結構以實驗方法確定，并包入去垢劑膠粒中以模仿脂質膜的疏水性內部環境。對應于CD4中這些保守性殘基的八肽用標準的fmoc技術化學合成，并用反相高壓液相色譜法(reverse-phasehigh-pressure liquid chromatography)進行純化。接著該肽整合到氘化的去垢劑膠粒中，其三維結構用600MHz的質子核磁共振波譜(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)確定。質子NMR NOESY頻譜的NH區域顯示i到i+3和i到i+4交叉峰，其說明了該TM肽的這個區域的α螺旋結構。
圖1、2和3分別顯示了計算機產生的HIV-1和HIV-2代表株和人CD4的跨膜序列的范德華(Van der Waals)表面。可在HIV-1(圖1)和CD4(圖3)的螺旋中看到類似“缺口”的甘氨酸表面。可用融合素和OPRY-HUMAN相應的序列產生相似的缺口(本文沒有顯示)。
如圖2所示，由于有一個突出的纈氨酸側鏈，在HIV-2株HV2D1中沒有所述缺口。(Kuhnel，H.，et al.，Nucleic Acids Res.18(20)，6142(1990))。在其它HIV2序列中的最小波動是至少一個丙氨酸和一個纈氨酸。HV2D1是該缺口序列中受到干擾最小的，只在3位是纈氨酸而不是甘氨酸。HV2S2在3位和7位缺少甘氨酸，且HV2RO在3、4和7位缺少甘氨酸；正如所預期的那樣，模擬顯示這些株的缺口位點也被封閉了(本文沒有顯示)。這樣，當1個、2個或3個甘氨酸以比丙氨酸大的疏水性殘基替換時，缺口就消失了(注意丙氨酸也能位于1位或3位)。
HIV-1gp 160和CD4的缺口序列能通過缺口位點互相直接結合。因而，圖4顯示了HIV-1和CD4八肽對接，其溝槽以十字形構型被定向到彼此相對。這種定向使得偶極相互作用和空間相互作用均最大化。用受到干擾最小的HIV-2株HV2131做了類似的嘗試以顯示對接到CD4上在3位(其包含纈氨酸)缺少甘氨酸破壞了兩個螺旋的對接。據認為，當所公開的組合物處于膜內時，所述膜不會阻止進行x樣定位的能力，因為該結構是疊加于缺口配合上的螺旋偶極相互作用導致產生的，其在膜內將被最大化。
宿主的CD4和上面述及的已知和假定的輔助受體分子具有結構上相似的八肽位點。在進化到對人類具有高毒力的過程中，HIV-1可能模仿了這些位點。所述CD4八肽在膜環境中以二維NMR技術顯示出來，以設想α螺旋結構。因而，基于計算機模擬的這個序列和結構上相關的八肽序列在膜內將有缺口結構，與該區域具有分離的功能性結構域相一致。此處所公開的計算機模擬顯示HIV-1和宿主缺口位點能夠在功能上相互作用，且能夠相似地功能性地結合到公共配體上。HIV-1和HIV-2(其缺少缺口)在9位均具有精氨酸(偶爾會是賴氨酸)。
實施例2抗病毒實驗根據實驗或者根據假定而具有結合靶標或其配體的能力的候選分子，可以進一步檢驗其抗病毒活性和(缺少)在體外細胞培養體系中的細胞毒性。例如，在暴露于HIV-1的臨床分離株的無細胞病毒顆粒的人外周血單核細胞(PBMC)中病毒蛋白P24的產量反映了該病毒經歷整個復制循環的能力，且P24的數量用Jiang等人(Jiang et al，Journal ofExperiraental Medicine 1741557，1991.)描述的免疫測定方法可以很容易地在培養物中檢測到。因為候選物的純粹細胞毒活性能夠減少P24產量(在沒有特異性的抗病毒效應情況下)，所以可對細胞進行諸如MTT的檢查以得到毒性的精細指數和排除活體染料的能力。
若考慮對復合物進行更加深入的體內實驗，則抗病毒效應(IC90)應超過細胞毒效應(IC30)約100倍。候選物，例如，通過分子模擬確定的分子，該分子能以從小于4，或3，或2，或1埃的能量最低化結合缺口序列，能夠以代表HIV-1的已知A-F亞型的毒株在P24測定法中進行檢測。還公開了這樣的分子，其具有一定范圍內的結合到所述缺口序列或其靶標的親和力，解離常數從10-3M到10-15M，在此范圍之間的每個量均被公開。
候選分子較難抑制整個復制循環，而更容易抑制上面述及的融合過程。因而，候選物也能檢測其在體外抑制HIV-1介導的細胞融合的能力；如H-9的可培養品系的病毒感染細胞能夠用熒光染料BCECF-AM標記，與過量的未被感染的細胞混合并孵育，且標記的聚集物能夠用熒光顯微鏡打分，如Jiang等人所描述的那樣(Jiang et al，Biochemical andBiophysical Research Communications 195533，1993.)。或者，合胞體的形成能夠用簡單的顯微鏡檢查進行打分。融合實驗和其它體外操作將被用來確定復制循環的已知步驟中的哪一步被候選分子所抑制。例如，在融合實驗中缺乏效應的情況下，核從“假病毒體”攝取病毒RNA的過程受到的抑制，如Thomas等所描述的那樣(Thomas et al，ViralImmunology 973，1996)，將表明細胞核中在病毒RNA反轉錄之前的融合后過程受到干擾。對候選分子的抗病毒功能機制的定位在提示已知抗HI V藥物的哪一類可能與候選物協同作用上是有益的。體外具有高比率的抗病毒/細胞毒活性的候選分子對在體內具有活性的分子具有預示作用。體內實驗能以SCID小鼠進行由于對HIV的宿主范圍的限制，容易得到的實驗動物種類并不適用；然而，具有嚴重聯合免疫缺陷(SCID)的小鼠能夠以人免疫系統細胞重建，這些雜合體(hybrid)能用來對有希望的候選分子進行最初的體內檢驗-在黑猩猩或人中進行檢驗之前。實施例3對基于HIV-1“缺口”序列而設計的包于SDS膠粒內以模仿膜環境的肽而言，對其600MHz NMR頻譜的NH“螺旋”信號區域進行分析。這些實驗直接說明了，在處于疏水性環境如細胞膜中(這里以SDS膠粒模仿)時，包繞此處描述的以甘氨酸為表面的“缺口”的肽區域實際上是螺旋狀的。通過這里描述的針對HIV1和HIV2型中適當的HIV區域進行分子建模方法，圖形化地顯示出這個區域，說明了該“缺口”將在所有的HIV2變異體中均被封閉，但是在迄今所描述的所有HIV1變異體中均存在。這些建模結果顯示了某些HIV2變異體中發現的甚至單個纈氨酸替換都會封閉該“缺口”區域。建模還在CD4缺口和HIV-1缺口之間執行，且這些結果顯示HIV1的這個缺口區域和細胞表面受體CD4中所發現的保守缺口區域之間能夠發生相互作用。在圖4中可見到HIV-1缺口和CD4缺口的分子模型的實例。
F.序列SEQ ID NO1IVGGLVGL病毒缺口SEQ ID NO2VLGGVAGL CD4缺口SEQ ID NO3IGYFGGIFSEQ ID NO4CVGGLLGNSEQ ID NO5IVGGVAGLLLSEQ ID NO6IVGGLVGLRSEQ ID NO7EGGVLGGVAGLLLSEQ ID NO8QPMALIVGGVAGLLLFIGLGIFFCVRSEQ ID NO9MIVGGLVGLRSEQ ID NO10YIKIFMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRSEQ ID NO11GAVIGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVGARSEQ ID NO12GFLAAGSTMGSEQ ID NO13XXGGXXGX其中X為除甘氨酸之外的任何氨基酸SEQ ID NO14XXAGXXGX其中X為除甘氨酸之外的任何氨基酸SEQ ID NO15XXGAXXGX其中X為除甘氨酸之外的任何氨基酸SEQ ID NO16I/V V/I G G X I/V G XSEQ ID NO17I/V V/I A G X I/V G XSEQ ID NO18I/V V/I G A X I/V G XSEQ ID NO19I/V V/I G G L I/V G LSEQ ID NO20I/V V/I A G L I/V G LSEQ ID NO21I/V V/I G A L I/V G LSEQ ID NO22XXGGXXGX，其中X為帶有疏水性側鏈的任何氨基酸SEQ ID NO23XXAGXXGX，其中X為帶有疏水性側鏈的任何氨基酸SEQ ID NO24XXGAXXGX，其中X為帶有疏水性側鏈的任何氨基酸SEQ ID NO25Z(X)n)VLGGVAGLLLSEQ ID NO26索取號CAD59666 GP160完全蛋白序列
1 mrakgirrny qrlwrwgmml lgmlmicsat eklwvtvyyg vpvwkeaitt lfcasdakay61 dtevhnvwat hacvptdpnp qevilenvte nfnmgknnmv eqmhediisl wdqslkpcvk121 ltplcvtlnc tglkknatnt tssnkgamee gemkncsfnv ttsigdrmqr eyalfykldi181 vpvdgdnstr yrliscntsv itqacpkvsf epipihycap agfailkcnn kkfngtgpct241 nvstvqcthg irpvvstqll lngslaeeev virstnlsdn aktiivqlkd pveikctrpn301 nntrksipig pgrafyatgd iigdirqahc nlsstnwtna lkqigkelrk qfknktiifn361 qssggdpeiv mhsfncggef fycdstqlfn ntwngtewpd ddititlpcr ikqiinmwqe421 vgkamyappi rgriecssni tgllltrdgg inntngsetf rpgggdmrdn wrselykykv481 vkieplgvap tkakrrvvqr ekraalgavf lgflgaagst mgaasmtltv qarlllsgiv541 qqqnnllrai eaqqhllqlt vwgikqlqar vlavekylkd qqllgiwgcs gklictttvp601 wnaswsnksl seiwdnmtwm ewereinnyt sliysliees qnqqekneqe lleldkwasl661 wnwfnitqwl wyikifimiv gglvglrivf avlsivnrvr qgysplsfqt hlpiprgpdr721 pegieeegge rdrdrsirlv ngslaliwdd lrslclfsyh rlrdlllivt rivellgrrg781 wealkyrwnl lqywsqelkn savnllnata iavaegtdrv ievlqaayra irhiprrirq841 glerillSEQ ID NO27索取號AJ535619 GP160完全cDNA序列1 atgagagcga aggggatcag gaggaattat cagcgcttgt ggagatgggg catgatgctc61 cttgggatgt tgatgatctg tagtgctaca gaaaaattgt gggtcacagt ctattatggg121 gtacctgtgt ggaaagaagc catcaccact ctattttgtg catcagatgc taaagcatat181 gatacagagg tacataatgt ttgggccaca catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca241 caagaagtaa tattggaaaa tgtgacagaa aattttaaca tggggaaaaa taacatggta301 gaacagatgc atgaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcctaaagcc atgcgtaaaa361 ttaaccccac tctgtgttac tttaaattgc actggtctga agaagaatgc tactaatacc421 actagtagta acaagggagc gatggaggaa ggagaaatga aaaactgctc tttcaatgtc481 accacaagca taggagatag gatgcagaga gaatatgcac ttttttataa acttgatata541 gtaccagtag atggtgataa tagtaccaga tataggttga taagttgcaa cacctcagtc601 attacacagg cttgtccaaa ggtatccttt gagccaattc ccatacatta ttgtgccccg661 gctggttttg cgattctaaa gtgtaacaat aagaagttca atggaacagg accatgtaca721 aatgtcagca cagtacaatg tacacatgga attaggccag tagtatcgac tcaactgctg781 ttaaatggca gtctagcaga agaagaggta gtaattagat ctaccaatct ctcggacaat841 gctaaaacca taatagtaca gctaaaagac cctgtagaaa ttaagtgtac aagacccaac901 aacaatacaa gaaaaagtat acctatagga ccagggagag cattttatgc aacaggagac961 ataataggag atataagaca agcacattgt aaccttagtt caacaaactg gactaacgct1021 ttaaaacaga taggtaaaga attaagaaaa cagtttaaga ataaaacaat aatctttaat1081 caatcctcag gaggggaccc agaaattgta atgcacagct ttaattgtgg aggggaattt1141 ttctactgtg attcaacaca actgtttaat aatacttgga atggtactga atggccagat1201 gacgatataa ctatcacact cccatgcaga ataaaacaaa ttataaacat gtggcaggaa1261 gtaggaaaag caatgtatgc ccctcccatc agaggacgaa ttgaatgttc atcaaatatt1321 acaggactac tactaacaag agatggtggt attaataaca cgaatgggag cgagaccttc1381 agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta1441 gtaaaaatag aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga1501 gaaaaaagag cagcattagg agctgtgttc cttgggttct taggagcagc aggaagcact1561 atgggcgcag cgtcgatgac gctgacggta caggccagac tattgttgtc tggtatagtg1621 caacagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca1681 gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga gtcctggctg tggaaaaata cctaaaggat1741 caacagctcc tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tactgtgccc1801 tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg agtgagattt gggataacat gacctggatg1861 gagtgggaaa gagaaattaa caattacaca agcttaatat acagcttaat tgaagaatcg1921 caaaaccaac aagagaagaa tgaacaagaa ttattagaat tggataaatg ggcaagtctg1981 tggaattggt ttaacataac acaatggctg tggtatataa aaatattcat aatgatagta2041 ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt gctgtactct ctatagtgaa tagagttagg2101 cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa tcccgagggg acccgacaggSEQ ID NO28EGG(VL)GG(VA)GLLL(與SEQ ID NO1相關)(SEQ ID NO29)676-702加KKKC，(TNWLWYIKLFIMIVGGLVGLRIVFAKKKC)SEQ ID NO30QPMALIVGGLVGLLLFIGLGIFFCVR(與SEQ ID NO1相關)
SEQ ID NO31 HIGFGGIFSEQ ID NO32VGGLLGNCSEQ ID NO33IVGGLVGLLL，完全來自1]SEQ ID NO34EGGIVGGVAGLLL[G]x[R]y(SEQ ID NO 34)，[G]x是柔韌的甘氨酰接頭，可為任何長度，如1、2、3、4、5、6、7、8或9。[R]y是精氨酸，可為任何長度，如1、2、3、4、5、6、7、8或9。
SEQ ID NO35 FMIVGGLVGLRIVSEQ ID NO36ALVLGGVAGLLLF
序列表<110>波特.W.安德森<120>基于GP160和人CD4蛋白共有的保守氨基酸序列的抗HIV-1化合物<130>01194.0001P1<140>PCT/US2004/014650<141>2004-05-10<150>60/468,847<151>2003-05-08<160>36<170>FastSEQ，Windows Version 4.0<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>1Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>2Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu1 5<210>3<211>8
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>3Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>4Cys Val Gly Gly Leu Leu Gly Asn1 5<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>5Ile Val Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu1 5 10<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>6Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg1 5
<210>7<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>7Glu Gly Gly Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu1 5 10<210>8<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>8Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe1 5 10 15Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg20 25<210>9<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>9Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg1 5 10<210>10<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>10Tyr Ile Lys Ile Phe Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile1 5 10 15Val Phe Ala Val Leu Ser Ile Val Asn Arg20 25<210>11<211>33<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>11Gly Ala Val Ile Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala1 5 10 15Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gly Ala20 25 30Arg<210>12<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>12Gly Phe Leu Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly1 5 10<210>13<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體
<221>變異體<222>1，2，5，6，8，<223>Xaa＝除甘氨酸外的任何氨基酸<400>13Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>14<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，5，6，8<223>Xaa＝除甘氨酸外的任何氨基酸<400>14Xaa Xaa Ala Gly Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>15<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，5，6，8<223>Xaa＝除甘氨酸外的任何氨基酸<400>15Xaa Xaa Gly Ala Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>16<211>8<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，6<223>Xaa＝Val或Ile<221>變異體<222>5，8<223>Xaa＝任何氨基酸<400>16Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，6<223>Xaa＝Val或Ile<221>變異體<222>5，8<223>Xaa＝任何氨基酸<400>17Xaa Xaa Ala Gly Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>18<211>8<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，6<223>Xaa＝Val或Ile<221>變異體<222>5，8<223>Xaa＝任何氨基酸<400>18Xaa Xaa Gly Ala Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>19<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，6<223>Xaa＝Val或Ile<400>19Xaa Xaa Gly Gly Leu Xaa Gly Leu1 5<210>20<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體
<221>變異體<222>1，2，6<223>Xaa＝Val或Ile<400>20Xaa Xaa Ala Gly Leu Xaa Gly Leu1 5<210>21<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，6<223>Xaa＝Val或Ile<400>21Xaa Xaa Gly Ala Leu Xaa Gly Leu1 5<210>22<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，5，6，8<223>Xaa＝具有疏水側鏈的任何氨基酸<400>22Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>23<211>8
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，5，6，8<223>Xaa＝具有疏水側鏈的任何氨基酸<400>23Xaa Xaa Ala Gly Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>24<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1，2，5，6，8<223>Xaa＝具有疏水側鏈的任何氨基酸<400>24Xaa Xaa Gly Ala Xaa Xaa Gly Xaa1 5<210>25<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>1<223>Xaa＝能夠優化與靶點中完全保守的帶正電荷的氨基酸R/K相互作用的部分<221>變異體<222>2
<223>Xaa＝柔性接頭<400>25Xaa Xaa Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu1 5 10<210>26<211>847<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>26Met Arg Ala Lys Gly Ile Arg Arg Asn Tyr Gln Arg Leu Trp Arg Trp1 5 10 15Gly Met Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu Lys20 25 30Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Ile35 40 45Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val50 55 60His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro65 70 75 80Gln Glu Val Ile Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Gly Lys85 90 95Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp100 105 110Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu115 120 125Asn Cys Thr Gly Leu Lys Lys Asn Ala Thr Asn Thr Thr Ser Ser Asn130 135 140Lys Gly Ala Met Glu Glu Gly Glu Met Lys Asn Cys Ser Phe Asn Val145 150 155 160Thr Thr Ser Ile Gly Asp Arg Met Gln Arg Glu Tyr Ala Leu Phe Tyr165 170 175Lys Leu Asp Ile Val Pro Val Asp Gly Asp Asn Ser Thr Arg Tyr Arg180 185 190Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val195 200 205Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala210 215 220Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Lys Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr
225 230 235 240Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser245 250 255Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile260 265 270Arg Ser Thr Asn Leu Ser Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu275 280 285Lys Asp Pro Val Glu Ile Lys Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg290 295 300Lys Ser Ile Pro Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp305 310 315 320Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Leu Ser Ser Thr Asn325 330 335Trp Thr Asn Ala Leu Lys Gln Ile Gly Lys Glu Leu Arg Lys Gln Phe340 345 350Lys Asn Lys Thr Ile Ile Phe Asn Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu355 360 365Ile Val Met His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asp370 375 380Ser Thr Gln Leu Phe Asn Asn Thr Trp Asn Gly Thr Glu Trp Pro Asp385 390 395 400Asp Asp Ile Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn405 410 415Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Gly420 425 430Arg Ile Glu Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp435 440 445Gly Gly Ile Asn Asn Thr Asn Gly Ser Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly450 455 460Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val465 470 475 480Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg485 490 495Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Gly500 505 510Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu515 520 525Thr Val Gln Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn530 535 540Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr545 550 555 560Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Lys565 570 575Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys
580 585 590Leu Ile Cys Thr Thr Thr Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys595 600 605Ser Leu Ser Glu Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg610 615 620Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Ser Leu Ile Glu Glu Ser625 630 635 640Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys645 650 655Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Gln Trp Leu Trp Tyr660 665 670Ile Lys Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile675 680 685Val Phe Ala Val Leu Ser Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser690 695 700Pro Leu Ser Phe Gln Thr His Leu Pro Ile Pro Arg Gly Pro Asp Arg705 710 715 720Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser725 730 735Ile Arg Leu Val Asn Gly Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg740 745 750Ser Leu Cys Leu Phe Ser Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile755 760 765Val Thr Arg Ile Val Glu Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu770 775 780Lys Tyr Arg Trp Asn Leu Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn785 790 795 800Ser Ala Val Asn Leu Leu Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly805 810 815Thr Asp Arg Val Ile Glu Val Leu Gln Ala Ala Tyr Arg Ala Ile Arg820 825 830His Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu835 840 845<210>27<211>2544<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>27atgagagcga aggggatcag gaggaattat cagcgcttgt ggagatgggg catgatgctc60
cttgggatgt tgatgatctg tagtgctaca gaaaaattgt gggtcacagt ctattatggg120gtacctgtgt ggaaagaagc catcaccact ctattttgtg catcagatgc taaagcatat180gatacagagg tacataatgt ttgggccaca catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca240caagaagtaa tattggaaaa tgtgacagaa aattttaaca tggggaaaaa taacatggta300gaacagatgc atgaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcctaaagcc atgcgtaaaa360ttaaccccac tctgtgttac tttaaattgc actggtctga agaagaatgc tactaatacc420actagtagta acaagggagc gatggaggaa ggagaaatga aaaactgctc tttcaatgtc480accacaagca taggagatag gatgcagaga gaatatgcac ttttttataa acttgatata540gtaccagtag atggtgataa tagtaccaga tataggttga taagttgcaa cacctcagtc600attacacagg cttgtccaaa ggtatccttt gagccaattc ccatacatta ttgtgccccg660gctggttttg cgattctaaa gtgtaacaat aagaagttca atggaacagg accatgtaca720aatgtcagca cagtacaatg tacacatgga attaggccag tagtatcgac tcaactgctg780ttaaatggca gtctagcaga agaagaggta gtaattagat ctaccaatct ctcggacaat840gctaaaacca taatagtaca gctaaaagac cctgtagaaa ttaagtgtac aagacccaac900aacaatacaa gaaaaagtat acctatagga ccagggagag cattttatgc aacaggagac960ataataggag atataagaca agcacattgt aaccttagtt caacaaactg gactaacgct1020ttaaaacaga taggtaaaga attaagaaaa cagtttaaga ataaaacaat aatctttaat1080caatcctcag gaggggaccc agaaattgta atgcacagct ttaattgtgg aggggaattt1140ttctactgtg attcaacaca actgtttaat aatacttgga atggtactga atggccagat1200gacgatataa ctatcacact cccatgcaga ataaaacaaa ttataaacat gtggcaggaa1260gtaggaaaag caatgtatgc ccctcccatc agaggacgaa ttgaatgttc atcaaatatt1320acaggactac tactaacaag agatggtggt attaataaca cgaatgggag cgagaccttc1380agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta1440gtaaaaatag aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga1500gaaaaaagag cagcattagg agctgtgttc cttgggttct taggagcagc aggaagcact1560atgggcgcag cgtcgatgac gctgacggta caggccagac tattgttgtc tggtatagtg1620caacagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca1680gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga gtcctggctg tggaaaaata cctaaaggat1740caacagctcc tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tactgtgccc1800tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg agtgagattt gggataacat gacctggatg1860gagtgggaaa gagaaattaa caattacaca agcttaatat acagcttaat tgaagaatcg1920caaaaccaac aagagaagaa tgaacaagaa ttattagaat tggataaatg ggcaagtctg1980tggaattggt ttaacataac acaatggctg tggtatataa aaatattcat aatgatagta2040ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt gctgtactct ctatagtgaa tagagttagg2l00cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa tcccgagggg acccgacagg2160cccgaaggaa tagaagaaga aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg2220aacggatcct tagcacttat ctgggacgat ctgcggagcc tgtgcctctt cagctaccac2280cgcttgagag acttactctt gattgtaacg aggattgtgg aacttctggg acgcaggggg2340tgggaagccc tcaaatatcg gtggaatctc ctacagtatt ggagtcagga actaaagaat2400agtgctgtta acttgctcaa tgccacagcc atagcagtag ctgaggggac agatagggtt2460atagaagtat tacaagcagc ttatagagct attcgccaca tacctagaag aataagacag2520ggcttggaaa ggattttgct ataa 2544<210>28
<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>4<223>Xaa＝Val或Leu<221>變異體<222>7<223>Xaa＝Val或Ala<400>28Glu Gly Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly Leu Leu Leu1 5 10<210>29<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>29Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met1 5 10Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Lys Lys Lys15 20 25Cys<210>30<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體
<400>30Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Leu Leu Phe1 5 10 15Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg20 25<210>31<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>31His Ile Gly Phe Gly Gly Ile Phe1 5<210>32<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>32Val Gly Gly Leu Leu Gly Asn Cys1 5<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>33Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Leu Leu1 5 10<210>34
<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<221>變異體<222>14<223>Xaa＝任何長度，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9的柔性甘氨酸接頭<221>變異體<222>15<223>Xaa＝任何長度，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9的精氨酸<400>34Glu Gly Gly Ile Val Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Xaa Xaa1 5 10 15<210>35<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>35Phe Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val1 5 10<210>36<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝合成構建體<400>36Ala Leu Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe1 5 10
權利要求
1.一種用于降低HIV感染性的組合物，所述組合物包括與由SEQ ID NO1中列出的氨基酸形成的缺口結構相結合的分子。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物是多肽。
3.權利要求2的組合物，其中所述多肽形成缺口結構。
4.權利要求3的組合物，其中所述組合物是與SEQ ID NO1-6，10-24具有至少90％同源性的多肽。
5.權利要求3的組合物，其中所述組合物包括SEQ ID NO1，2，5或6中列出的分子。
6.權利要求1-5的組合物，其中所述組合物進一步包括末端賴氨酸或精氨酸殘基。
7.一種降低CD4和HIV gp160相互作用的方法，所述方法包括將CD4和gp160之間相互作用的抑制劑與CD4和gp160一起孵育，其中所述抑制劑能夠與具有與由SEQ ID NO1中列出的氨基酸產生的結構同源的結構的結構域相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
8.一種抑制HI V感染性的方法，所述方法包括給予CD4和HIV gp160之間相互作用的抑制劑，其中所述抑制劑能夠與SEQ ID NO1中的氨基酸相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
9.一種對受試者進行治療的方法，所述方法包括對受試者給予HIV感染性的抑制劑，其中所述抑制劑減少CD4和HIV gp16O之間相互作用，且其中所述受試者需要進行所述的治療，其中所述抑制劑能夠與SEQ IDNO1中的氨基酸相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
10.權利要求1-3的方法，其中所述HIV-gp160包括缺口結構域，且其中所述抑制劑破壞CD4和HIV gp160缺口結構域之間的相互作用。
11.權利要求1-3的方法，其中所述HI V-gp160包括缺口結構域，且其中所述抑制劑破壞與HIV gp160缺口結構域的相互作用。
12.權利要求1-3的方法，其中所述抑制劑能夠與CD4缺口結合結構域相互作用。
13.權利要求6的方法，其中所述缺口結合結構域具有SEQ ID NO2中列出的序列。
14.權利要求13的方法，其中所述缺口結構域具有SEQ ID NO1中列出的序列。
15.一種鑒定CD4和gp160之間相互作用的抑制劑的方法，所述方法包括將一組分子與CD4缺口結構域-gp160缺口結構域復合物共同培育，并分離能夠破壞CD4缺口結構域和gp160缺口結構域之間相互作用的分子，其中所述被破壞的相互作用包括CD4缺口結構域和gp160缺口結構域的氨基酸之間的相互作用。
16.權利要求15的方法，其中所述CD4缺口結構域-gp160缺口結構域復合物包括能量傳遞對，其中所述能量傳遞對包括能量供體和能量受體。
17.權利要求16的方法，其中所述分離步驟進一步包括檢測能量傳遞對的熒光。
18.權利要求17的方法，其中所述分離步驟進一步包括選擇抑制所述熒光的分子。
19.權利要求17的方法，其中所述能量傳遞對包括一種供體分子，該分子發射波長與受體分子的吸收譜帶的波長相重疊的熒光，導致供體分子熒光的淬滅和/或受體分子熒光的敏化。
20.一種鑒別CD4和gp160之間相互作用的抑制劑的方法，所述方法包括在計算機媒體上顯示所述缺口結構域的結構。
21.權利要求20的方法，其中進一步包括用所述結構和配體或潛在配體實施分子模擬。
22.權利要求15-21的方法，其中進一步包括合成所述抑制劑。
23.一種通過權利要求15-22的方法鑒定的組合物。
24.一種能夠通過權利要求15-22的方法來鑒定的組合物。
25.一種制造抑制CD4和gp160之間相互作用的組合物的方法，所述方法包括合成權利要求15-21的抑制劑。
26.權利要求25的方法，其中進一步包括混合藥物載體和抑制劑。
27.一種制造抑制CD4和gp160之間相互作用的組合物的方法，所述方法包括混合抑制劑和藥物載體。
28.一種鑒定CD4缺口和gp160缺口相互作用的抑制劑的方法，所述方法包括a)對系統給予組合物，其中所述系統支持CD4缺口-gp160缺口相互作用，b)測定所述組合物對系統中CD4缺口-gp160缺口相互作用量的影響，以及c)選擇與未添加所述組合物的系統相比，導致存在于系統中的CD4缺口-gp160缺口相互作用的量下降的組合物。
29.一種鑒別HIV感染性抑制劑的方法，所述方法包括a)對系統給予組合物，其中所述系統支持通過CD4缺口-gp160缺口相互作用的HIV感染性，b)測定所述組合物對系統中HIV感染性的量的影響，以及c)選擇與未添加所述組合物的系統相比，由于CD4缺口-gp160缺口相互作用的抑制而導致存在于系統中HIV感染性的量下降的組合物。
30.一種抑制HIV感染性的方法，所述方法包括給予組合物，其中所述組合物阻止HIV感染性，其中所述組合物被定義為能夠通過下述步驟而被鑒定的組合物對系統給予該組合物，其中所述系統經CD4缺口-gp160缺口相互作用而支持HIV-感染性；測定所述組合物對系統中HIV感染性的量的作用；以及選擇與沒有添加所述組合物的系統相比，由于CD4缺口-gp160缺口相互作用被抑制，而引起存在于系統中的HIV感染性的量下降的組合物。
31.一種抑制HIV感染性的方法，所述方法包括給予減少CD4-gp160之間相互作用的組合物。
32.一種制備能夠抑制HIV感染性的組合物的方法，所述方法包括將化合物與藥學可接受的載體相混合，其中所述化合物通過下述步驟鑒定對系統給予所述化合物，其中所述系統經CD4缺口-gp160缺口相互作用而支持HIV-感染性；測定化合物對系統中HI V感染性的量的作用；以及選擇與沒有添加所述化合物的系統相比由于CD4缺口-gp160缺口相互作用被抑制，而引起存在于系統中的HI V感染性的量下降的化合物。
33.一種制造HIV感染性抑制劑的方法，所述方法包括a)對系統給予組合物，其中所述系統經CD4缺口-gp160缺口相互作用而支持HIV-感染性；b)測定所述組合物對系統中HIV感染性的量的作用；c)選擇與沒有添加所述組合物的系統相比由于CD4缺口-gp160缺口相互作用被抑制，而引起存在于系統中的HIV感染性的量下降的組合物；以及d)合成所述組合物。
34.權利要求33方法，進一步包括將所述組合物與藥學可接受的載體相混合的步驟。
35.一種鑒定CD4-gp160之間相互作用的抑制劑的方法，所述方法包括a)對系統給予組合物，其中所述系統包括CD4；b)測定所述組合物對CD4缺口-gp160缺口相互作用的作用；以及c)選擇抑制CD4缺口-gp160缺口相互作用的組合物。
36.權利要求28-35的方法，其中所述CD4缺口包括SEQ ID NO2中列出的序列。
37.權利要求36的方法，其中所述gp160缺口包括SEQ ID NO1中列出的序列。
38.一種減少CD4和HIV gp160之間相互作用的方法，所述方法包括將CD4和gp160之間相互作用的抑制劑與CD4和gp160共同培育，其中所述抑制劑能夠與至少一種從表3和4列出的原子中選出的原子相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
39.一種抑制HIV感染性的方法，所述方法包括給予CD4和HIV gp160之間相互作用的抑制劑，其中所述抑制劑能夠與至少一種從表3和4列出的原子中選出的原子相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
40.一種治療患者的方法，所述方法包括對患者給予HIV感染性的抑制劑，其中所述抑制劑減少CD4和HIV gp160之間相互作用，且其中所述患者需要這種治療，其中所述抑制劑能夠與至少一種從表3和4列出的原子中選出的原子相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
41.權利要求38-40中的方法，其中所述HIV gp160包括缺口結構域，其中所述抑制劑破壞CD4和HIV gp160的缺口結構域之間的相互作用。
42.權利要求38-40中的方法，其中所述CD4包括缺口結構域，其中所述抑制劑破壞gp160和缺口結構域之間的相互作用。
43.一種降低HIV感染性的方法，所述方法包括孵育gp160缺口分子和伴侶之間相互作用的抑制劑，其中所述抑制劑能夠與至少一種從表3和4列出的原子中選出的原子相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
44.一種抑制HIV感染性的方法，所述方法包括給予gp160缺口分子和伴侶之間相互作用的抑制劑，其中所述抑制劑能夠與至少一種從表3和4列出的原子中選出的原子相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
45.一種治療受試者的方法，所述方法包括對受試者給予HIV感染性的抑制劑，其中所述抑制劑減少gp160缺口分子和伴侶之間相互作用，且其中所述受試者需要這種治療，其中所述抑制劑能夠與至少一種從表3和4列出的原子中選出的原子相互作用，且其中所述抑制劑在p24測定法中具有活性。
46.權利要求43-45的方法，其中所述HIV-gp160包括缺口結構域，其中所述抑制劑破壞CD4和HIV gp160的缺口結構域之間的相互作用。
47.權利要求43-45的方法，其中所述CD4包括缺口結構域，其中所述抑制劑破壞gp160和缺口結構域之間的相互作用。
48.一種包括gp160缺口結合結構域中的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽長度小于100個氨基酸。
49.一種鑒定蛋白質結構的方法，所述方法包括以下步驟(a)確定gp160缺口結構域的三維結構；(b)確定實驗蛋白質的三維結構；(c)比較實驗蛋白質的三維結構與gp160缺口結構域的三維結構；以及(d)記錄gp160缺口結構域的三維結構和實驗蛋白質的三維結構之間的差異。
50.權利要求49的方法，其中所述gp160缺口結構域的三維結構來自包括SEQ ID NO1中列出的序列的任何多肽的結構。
51.權利要求50的方法，其中所述gp160缺口結構域的三維結構通過表5中的原子結構坐標或產生同源結構的坐標來確定。
52.一種評估兩個或更多個關于gp160缺口結構域的實驗蛋白質的方法，所述方法包括(i)對第一個實驗蛋白質而言，評估權利要求5的(d)的方差；(ii)對第二個實驗蛋白質而言，評估權利要求5的(d)的方差；以及(iii)將與gp160缺口結構域具有最小方差的實驗蛋白列為最相似的。
53.一種顯示gp160缺口結構域圖像的方法，所述方法包括確定gp160缺口結構域的原子的三維坐標；提供具有存儲裝置、數據輸入裝置、顯示裝置的計算機，所述存儲裝置包括能從存儲裝置中取回坐標數據并在顯示裝置上顯示分子的三維圖像的可操作三維分子模擬軟件并可操作以產生響應操作者選擇的對分子的化學結構的改變而形成的所述分子類似物的圖像，并顯示所述類似物的圖像；將gp160缺口結構域原子的三維坐標數據輸入所述計算機并將該數據存儲在存儲裝置中；在顯示裝置上顯示gp160缺口結構域的圖像。
54.一種顯示gp160缺口結構域類似物圖像的方法，所述方法包括a)確定gp160缺口結構域的原子的三維坐標；b)提供具有存儲裝置、數據輸入裝置、顯示裝置的計算機，所述存儲裝置包括能從存儲裝置中取回坐標數據并在顯示裝置上顯示分子的三維圖像的可操作三維分子模擬軟件并可操作以產生響應操作者選擇的對分子的化學結構的改變而形成的所述分子類似物的圖像，并顯示所述類似物的圖像；c)將gp160缺口結構域原子的三維坐標數據輸入所述計算機并將該數據存儲在存儲裝置中；d)在顯示裝置上顯示gp160缺口結構域的圖像；e)將至少一種操作者選擇的形成gp160缺口結構域類似物結構的gp160缺口結構域的化學結構的改變輸入計算機的數據輸入裝置；f)執行所述分子模擬軟件以產生所述類似物結構的修飾的三維分子圖像；以及g)在顯示裝置上顯示所述類似物結構的圖像，借此由于化學結構改變而引起的gp160缺口結構域的三維結構的改變能夠在視覺上確定。
55.權利要求54的方法，進一步包括重復形成第二個gp160缺口結構域類似物結構的步驟d，并重復步驟f-g。
56.權利要求55的方法，進一步包括選擇一種類似物結構，得到所選擇的類似物的結構，其中所述選擇類似物結構包括在顯示裝置上顯示gp160缺口結構域類似物和第二個gp160缺口結構域類似物的三維結構，在視覺上比較gp160缺口結構域的構型和空間排列，并選擇其中所述結構域基本相同的類似物結構。
57.一種鑒定所述gp160缺口結構域類似物的方法，所述方法包括通過權利要求11中的方法產生大量的gp160缺口結構域的類似物結構，并用缺口結合結構域的結構來選擇基本類似于gp160缺口結構域的類似物結構。
58.權利要求54的方法，進一步包括以下步驟通過重組DNA技術合成所選的類似物；確定合成的gp160缺口結構域功能類似物的gp160缺口結構域的功能，據此具有所述活性的類似物為gp160缺口結構域三維結構的模仿物。
59.一種鑒定包括gp160缺口結構域的蛋白的潛在配體的方法，所述方法包括a)使用由gp160缺口結構域的原子坐標形成的gp160缺口結構域功能的三維結構或其部分；b)采用三維結構來設計或選擇潛在配體。
60.權利要求59的方法，進一步包括鑒定包括gp160缺口結構域的蛋白的潛在配體的方法，所述方法包括c)合成所述潛在配體；以及d)使所述潛在配體與包含gp160缺口結構域功能的蛋白接觸；以及e)確定潛在配體是否結合包含gp160缺口結構域的蛋白。
61.權利要求58的方法，其中所述采用三維結構來設計或選擇配體的步驟包括鑒定能夠結合gp160缺口結構域的化學功能；并將所鑒定的化學功能集合到一個分子中，從而提供gp160缺口結構域潛在配體的結構。
62.權利要求58的方法，其中所述潛在配體是從頭設計的。
63.權利要求58的方法，其中所述潛在配體是從已知化合物設計的。
64.權利要求58的方法，其中所述原子坐標集合在表5中列出。
65.一種通過權利要求52-59的方法制備的gp160缺口結構域類似物。
66.一種根據權利要求52-59產生的結構域的類似物結構。
67.一種通過權利要求52-59任一項的方法制備的包含gp160缺口結構域的多肽配體。
68.一種確定化合物是否會與包含gp160缺口結構域的蛋白相互作用的儀器，所述儀器包括a)存儲共同形成溶劑可到達表面的gp160缺口結構域原子的坐標和身份集合的存儲器，以及可執行指令，以及b)處理器，其中所述處理器執行指令以接收候選化合物的結構信息；確定所述候選化合物的結構是否與gp160缺口結構域的溶劑可到達表面的結構互補；并且輸出所述確定的結果。
69.權利要求68的儀器，其中所述gp160缺口結構域原子的坐標和身份集合來自SEQ ID NO1中列出的氨基酸殘基的結構。
70.權利要求69的儀器，其中所述gp160缺口結構域原子的坐標和身份集合來自解析。
71.權利要求70的儀器，其中所述gp160缺口結構域原子的坐標和身份集合是表3-4中列出的原子坐標或其部分。
72.一種計算機可讀的存儲介質，所述存儲介質包括數字編碼結構數據，其中所述數據包括SEQ ID NO1中列出的至少2個氨基酸的身份和三維坐標，或者提供結構同源物的坐標。
73.權利要求72的介質，其中所述數據包括SEQ ID NO1中列出的至少6個氨基酸的坐標集合，或者提供結構同源物的坐標。
74.權利要求72的介質，其中所述數據包括SEQ ID NO1中列出的至少8個氨基酸的坐標集合，或者提供結構同源物的坐標。
75.權利要求72的計算機可讀存儲介質，其中所述數據包括表5中的原子坐標或其部分，或者提供結構同源物的坐標。
76.一種包括計算機可讀存儲介質和軟件的儀器，其中所述儀器能夠a)接收受試結構的受試坐標集合；b)將受試坐標集合和與gp160缺口結構域相關的參考坐標集合相比較；c)計算受試坐標集合與參考坐標集合的均方根偏差；并且d)比較均方根偏差和極限值，借此，如果均方根偏差小于或等于極限值，那么基于受試結構和參考結構的相似性對受試結構賦予功能。
77.權利要求76的儀器，其中所述參考坐標集合包括表2中的坐標或其部分。
78.權利要求77的儀器，其中所述極限值相當于小于或等于3，2.0，1.5，1.0，0.5的值。
79.一種確定兩個或更多個多肽結構之間關系的方法，所述方法包括a)獲得參考結構，其中所述參考結構是包括gp160缺口結構域或其部分的多肽的結構；b)獲得至少一個受試結構；c)確定參考結構拓撲圖和受試結構拓撲圖；d)比較參考結構拓撲圖和受試結構拓撲圖；并且e)基于參考結構和受試結構之間的偏差，賦予參考結構和任何受試結構之間的關系。
80.權利要求79的方法，其中所述參考結構是通過表3和4中的原子坐標或其部分所確定的結構。
81.權利要求79的方法，其中所述確定步驟考慮二級結構單元，折疊內空間毗鄰以及近似取向。
82.權利要求79的方法，其中所述確定步驟忽略環單元的長度。
83.權利要求79的方法，其中所述確定步驟忽略環單元的結構。
84.權利要求79的方法，其中所述確定步驟忽略二級結構單元的空間取向。
85.權利要求79的方法，其中所述確定步驟包括應用TOPS蛋白拓撲搜索，找到模式并且比較結構。
86.一種鑒定與CD4缺口相互作用的抑制劑的方法，所述方法包括將一組分子和CD4缺口結構域一起孵育，并且分離結合CD4缺口的分子。
87.權利要求86的方法，進一步包括將結合所述CD4缺口的分子與CD4缺口區域進行競爭。
88.一種鑒定與gp160缺口相互作用的抑制劑的方法，所述方法包括將一組分子和gp160缺口結構域一起孵育，并且分離結合gp160缺口的分子。
89.權利要求86的方法，進一步包括將結合所述gp160缺口的分子與gp160缺口區域進行競爭。
全文摘要
公開了組合物和方法，所述組合物和方法通常與人類免疫缺陷病毒(HIV)相關，更具體而言，與所述試劑及其鑒定，以及干擾HIV－1糖蛋白160內靶蛋白序列和其配體結合的抗HIV－1試劑的應用有關。進一步公開了包括所述分子和合適載體的組合物，以及降低人類免疫缺陷病毒與宿主細胞相互作用的方法，所述方法包括使病毒和宿主細胞其一或二者接觸所述分子。
文檔編號C12Q1/70GK1829524SQ200480019556
公開日2006年9月6日 申請日期2004年5月10日 優先權日2003年5月8日
發明者波特·W·安德森, 埃利斯·J·貝爾 申請人:波特·W·安德森, 埃利斯·J·貝爾