植物光敏素a基因的轉基因表達的制作方法

專利名稱：植物光敏素a基因的轉基因表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼光不穩定的植物光敏素A蛋白的植物光敏素A基因的轉基因表達。
背景技術：
單位面積作物生產力是可利用的資源和如何劃分這些資源兩者的函數。能量在生長植物的不同部分的相對分配決定作物中有用生物量(biomass)的比例。這被稱作“收獲指數”。資源分配的模式是有可塑性的并且可對改變的環境條件作出反應而進行調節，所述環境條件如光和營養物的可利用性。然而，通過自然選擇進化的適應性競爭策略可能與所耕作植物的農業特性不一致。植物所顯示出的對競爭植物的反應稱為“避陰(shade-avoidance)”，且其特征是莖伸長增加、葉伸展減小，以及生殖發育早熟。Smith，H.，“Physiological andEcological Function Within the Phytochrome Family，”Ann.Rev.Plant Physiol.-Plant Mol.Biol.46289-315(1995)。由周圍植物所導致的光環境的變化引起避陰。全部日光包含等通量的紅光(“R”)和紅外光(“FR”)。Holmes等，“The Function of Phytochrome in PlantsGrowing in the Natural Environment，”Nature 254512-514(1975)。然而，當光線從作物株冠透過來時，大多數R被反射或者被吸收。Cumming，B.，“The Dependence of Germination on Photoperiod，Light Quality and Temperature in Chenopodium sp.，”Can.J.Bot.411211-1233(1963)。結果，R∶FR的比例從入射的陽光中的大約1降到地面水平的大約0.2。Holmes等，“The Function of Phytochromein Plants Growing in the Natural Environment，”Nature 254512-514(1975)。植物使用RFR比例的這種變化監控局部植物的接近。Holmes等，“The Function of Phytochrome in Plants Growing in the NaturalEnvironment，”Nature 254512-514(1975)；Holmes等，“TheFunction of Phytochrome in the Natural Environment IV，LightQuality and Plant Development，”Photochem.Photobiol.25551-557(1977)。盡管植物具有許多可介導鄰近感覺的光感受器系統，但是遺傳和生理學分析已經證明R∶FR比例的改變主要由植物光敏素家族的成員檢測。Quail等，“PhytochromesPhotosensory Perception andSignal Transduction，”Science 268675-680(1995)；Smith，H.，“Phytochromes and Light Signal Perception by Plants-An EmergingSynthesis，”Nature 407585-591(2000)；Nagy等，“PhytochromesControl Photomorphogenesis by Differentially Regulated，InteractingSignaling Pathways in Higher Plants，”Annu.Rev.Plant Biol.53329-355(2002)。
植物光敏素是最充分表征的光感受器家族，其介導植物對它們光環境變化的許多反應。Quail，P.，“Phytochrome PhotosensorySignaling Networks，”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.385-93(2002)。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，植物光敏素家族由5種基因組成植物光敏素A(“PHYA”)、植物光敏素B(“PHYB”)、植物光敏素C(“PHYC”)、植物光敏素D(“PHYD”)和植物光敏素E(“PHYE”)。Clack等，“The Phytochrome Apoprotein Familyin Arabidopsis is Encoded by Five GenesThe Sequences andExpression of PHYD and PHYE，”Plant Mol.Biol.25413-427(1994)。在包括水稻的禾本科植物中，該家族僅由三個成員組成PHYA、PHYB和PHYC。Dehesh等，“PHYB is EvolutionarilyConserved and Constitutively Expressed in Rice Seedling Shoots，”Mol.Gen.Genet.225305-313(1991)；Mathews等，“The PhytochromeGene Family in Grasses(Poaceae)A Phylogeny and Evidence ThatGrasses Have a Subset of the Loci Found in Dicot Angiosperms，”Mol.Biol.Evol.131141-1150(1996)。植物光敏素作用的基礎是吸收紅光型(“Pr”)和吸收紅外光型(“Pfr”)之間可逆的光轉變(photoconversion)。Quail，P.，“Phytochrome Photosensory SignalingNetworks，”Nat.Rev.Mol Cell Biol.385-93(2002)。盡管這種機理是所有植物光敏素共有的，但是擬南芥中的遺傳分析已經顯示在植物發育期間PHYA和PHYB同時具有截然不同的和重疊的作用。Whitelam等，“Phytochrome A Null Mutahts of Arabidopsis Display a Wild-typePhenotype in White Light，”Plant Cell 5757-768(1993)；Nagatani等，“Isolation and Initial Characterization of Arabidopsis Mutants thatare Deficient in Phytochrome A，”Plant Physiol.102269-277(1993)。
PHYA和PHYB之間的功能分歧部分是由于Pfr穩定性的差異。Quail，P.，“Phytochrome Photosensory Signaling Networks，”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.385-93(2002)。從Pr轉變到Pfr后PHYA迅速降解并且其在去黃化前最豐富。Clough等，“Phytochrome Degradation，”Plant Cell Environ.20713-721(1997)。相反，PHYB在Pr和Pfr兩型中相對地光穩定，并且在成熟植物中作為主要的植物光敏素蓄積。Wagner等，“Overexpression of Phytochrome B Induces a ShortHypocotyl Phenotype in Transgenic Arabidopsis，”Plant Cell 31275-1288(1991)。擬南芥PHYB突變體顯示對R∶FR比例減少的弱反應，且PHYB被確定為在誘導避陰反應中起主要作用。Whitelam等，“Retention of Phytochrome-mediated Shade Avoidance Responses inPhytochrome-deficient Mutants of Arabidopsis，Cucumber，andTomato，”J.Plant Physiol.139119-125(1991)。
考慮到PHYA的光不穩定特性，遺傳分析的一個更令人驚訝的結果已經證明PHYA是光生長(light-grown)植物正常發育所必需的。Johnson等，“Photoresponses of Light-grown PHYA Mutants ofArabidopsis，”Plant.Physiol.105141-149(1994)。有趣地是，PHYA在植物結構的調節中起作用，這似乎拮抗PHYB的作用。在幼苗生長的表征中，擬南芥PHYA突變體顯示對R∶FR比例減少的夸大反應，而表達高水平燕麥PHYA的轉基因煙草植物則顯示對R∶FR比例改變的靈敏度降低。Casal，J.，“Phytochrome A Enhances thePromotion of Hypocotyl Growth Caused by Reductions in Levels ofPhytochrome B in its Far-red-light-absorbing Form in Light-grownArabidopsis thaliana，”Plant Physiol.110965-973(1996)。相反，即使葉綠素a/b-結合蛋白(“CAB”)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)的小亞基(“RbcS”)的表達模式輕微改變，秈型(japonica)稻(Nipponbare)的PHYA突變體在成熟水稻植物中也不顯示顯而易見的形態學改變。Takano等，“Isolation and Characterization ofRice Phytochrome A Mutants，”Plant Cell 13521-534(2001)。類似地，水稻PHYA的超表達部分補充擬南芥中的PHYB缺乏，但是不能恢復對R∶FR低比例的反應。Halliday等，“Overexpression of RicePhytochrome A Partially Complements Phytochrome B Deficiency inArabidopsis，”Planta 207401-409(1999)。因此，PHYA和PHYB在調節成熟植物發育中的精確作用一直很難確定。
近些年，隨著預期應答減少可能對產量有積極效果，避陰已經成為植物基因修飾的靶。基于擬南芥中光-信號傳導的表征，這些嘗試已經打算使用轉基因超表達PHYA來抑制PHYB的作用。Clough等，“Expression of a Functional Oat Phytochrome A in TransgenicRice.”Plant Physiol.1091039-1045(1995)；Robson等，“GeneticEngineering of Harvest Index in Tobacco Through Overexpression ofa Phytochrome Gene，”Nat.Biotechnol.14995-998(1996)。Clough等在水稻中成功地表達了在花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子控制下的燕麥PHYA，并且在光生長的轉基因品系中檢測到總植物光敏素的活性增加4倍。然而，在標準生長條件下，成熟轉基因水稻植物的表型不能與非轉基因植物的表型區別。Clough等推斷，顯著改變轉基因水稻的表型將需要更加提高PHYA的水平或者在他們研究中所使用的秈型稻(Gulfmont)可能對PHYA水平增加不敏感。
水稻是全世界一半以上人口的主要食物，因而作為世界上最重要的農業作物。粳型(Indica)稻品種，包括香稻(aromatic rice)，代表全世界所生長水稻的80％。香稻品種，包括Basmati水稻，其特征是極好的芳香和谷粒質量。Rani等，“Current Status and FutureProspects for Improvement of Aromatic Rices in India，”在Chaudhary等，編輯，Specialty Rices of the World；Breeding Productionand Marketing，Science Publishers，Inc.，Enfield，NH，USA，pp.49-78(2000)，并且在全球農業市場中得到溢價。Bhasin，V.，“India and theEmerging Global Rice Market，”在Singh等，編輯，Aromatic Rices，Science Publishers，Inc.，Enfield，NH，USA，pp.257-276(2000)。
然而，到目前為止，一直很難通過常規水稻育種將傳統的Basmati栽培品種改良成進化的高產“優良”Basmati品系。這主要是由于品質性狀的復雜特性和Basmati的不良性狀的組合，所述不良性狀如其高的高度、低產量、軟弱的莖和下垂的葉、對光周期的敏感性以及對肥料的低反應。Khush等，“Developing Basmati Rices with High YieldPotential，”在Chaudhary等，編輯，Specialty Rices of the WorldBreeding Production and Marketing，Science Publishers，Inc.，Enfield，NH，USA，pp.49-78(2000)；Rani等，“Current Status and FutureProspects for Improvement of Aromatic Rices in India，”在Chaudhary等，編輯，Specialty Rices of the WorldBreedingProduction and Marketing，Science Publishers，Inc.，Enfield，NH，USA，pp.49-78(2000)。因此，具有改良的農學特征的基因工程改造的Basmati植物的開發提出了當前作物生物技術中的挑戰。
本發明涉及克服現有技術中的這些和其它不足。
發明概述本發明的一個方面涉及一種分離的核酸構建體，其包括編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子；位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子5’的光誘導型的啟動子；以及位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子3’的終止子區。本發明的另一個方面提供一種包括這種核酸構建體的表達系統。
本發明的另一個方面涉及細胞、轉基因植物和轉基因植物種子，其包括根據本發明的核酸構建體。
本發明的另一個方面涉及一種調節植物株冠結構的方法。該方法包括提供轉基因植物，或者轉基因植物種子，其包括根據本發明的核酸構建體，以及在有效調節植物株冠結構的條件下，種植該轉基因植物，或者從轉基因植物種子中長出的植物。
本發明的另一個方面涉及一種調節植物種子產量的方法。該方法包括提供轉基因植物，或轉基因植物種子，其包括根據本發明的核酸構建體，以及在有效調節植物種子產量的條件下，種植該轉基因植物，或者從轉基因植物種子中長出的植物。
本發明的原理提高進入植物中的異源PHYA的蓄積，如，所述植物例如，Basmati水稻植物，以最小化或克服植物避陰綜合征，并且合理改變其結構和提高其谷粒產量，而不影響其期望的品質性狀。根據本發明的一個實施方案，用在光調節的、組織特異性的水稻RbcS啟動子控制下的擬南芥PHYA轉化優良粳型稻，Pusa Basmati-1(“PBNT”)，得到了大量的獨立轉基因品系。第5代(“T4”代)純合轉基因品系的結果顯示在光生長植物的葉中PHYA高水平蓄積，以及與非轉基因植物相比谷粒產量增加。這些結果證明公開的轉基因方法在開發谷粒產量增加的新Basmati水稻栽培品種中的效用。
附圖簡述

圖1A是根據本發明用于水稻轉化的示例性表達載體的示意圖。所引入質粒pSBR 3.7的T-DNA區由連于擬南芥植物光敏素AcDNA(“Arab PHYA cDNA”)的水稻RbcS啟動子、馬鈴薯蛋白酶抑制劑Il基因的3’區(“3’pinII”)，以及含有35S啟動子(“35S”)/bar編碼區(“bar”)/胭脂堿合酶基因的3’區(“3’nos”)的bar基因表達盒組成。“RB”和“LB”描述右手和左手邊的T-DNA邊界。也顯示了重要的限制酶切位點和DNA探針片段。
圖1B提供DNA印跡雜交分析的結果。用HindIII消化非轉基因對照植物(“PBNT”)和三個獨立品系轉基因植物(“PA29”、“PA41”和“PA53”)的基因組DNA，并用如在圖1A中所示的PHYA編碼區的2.24kb HindIII/XbaI片段的探針與該印跡雜交。顯示DNA分子大小標記(kb)。
圖2提供擬南芥PHYA在轉基因水稻中表達的免疫印跡結果。從黃化的(“D”)和光生長(“L”)的非轉基因的(“PBNT”)和轉基因(“PA29”、“PA41”和“PA53”)幼苗中提取總蛋白并且通過免疫印跡進行分析。用與水稻和擬南芥PHYA都反應的抗體(“O73D”)，或者用單獨與水稻PHYA反應的抗體(“1.9B5A”)攻擊(challenge)印跡。
圖3A和3B顯示非轉基因植物(“PBNT”)和超表述PHYA的植物(“PA29”、“PA41”和“PA53”)之間的表型差異。圖3A舉例說明在溫室中生長約20周的有代表性的非轉基因品系和三個T4代純合轉基因品系的成熟水稻植物。圖3B舉例說明四種有代表性的水稻品系中每種的圓錐花序，顯示了圓錐花序的伸出和每個圓錐花序谷粒數目的差異。
圖4A和4B是比較非轉基因對照品系(“PBNT”)和T4代純合轉基因品系(“PA29”、“PA41”和“PA53”)的農業特性的圖示。圖4A比較植物高度(cm)，圖4B比較每個植物的谷粒產量(g)。值是平均數±SD(n＝65)。
發明詳述本發明涉及一種核酸構建體，其包括編碼光不穩定的植物光敏素A(“PHYA”)的核酸分子；位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子5’的光誘導型的啟動子；以及位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子3’的終止子區。
光不穩定的植物光敏素A可來自物種的任何一個成員。光不穩定的植物光敏素A可從下列物種獲得，例如，擬南芥(NCBI GenBank登記號No.CAA35221，GI16421)、辣根(Armoracia rusticana)(NCBIGenBank登記號No.BAA99408，GI9049364)、番茄(Lycopersiconesculentum)(NCBI GenBank登記號No.CAA05086，GI3492795)、西葫蘆(Cucurbita pepo var.melopepo)(NCBI GenBank登記號No.FKPUZ，GI65877)、豌豆(Pisum sativum)(NCBI GenBank登記號No.S06856，GI81937)、煙草(Nicotiana tabacum)(NCBI GenBank登記號No.CAA47284，GI297478)、歐洲山楊x美洲山楊(Populustremula x Populus tremuloides)(NCBI GenBank登記號No.CAA04679，GI2664190)、家山黧豆(Lathyrus sativus)(NCBIGenBank登記號No.AAB47994，GI1848273)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)(NCBI GenBank登記號No.P30733，GI464383)、大豆(Glycine max)(NCBI GenBank登記號No.AAA33957，GI515749)、長須銀柴胡(Stellaria longipes)(NCBI GenBank登記號No.AAQ11871，GI33333476)、皺葉歐芹(Petroselinum crispum)(NCBIGenBank登記號No.CAA53165，GI556667)、Sorghumarundinaceum(NCBI GenBank登記號No.AAR30893，GI39777247)、高梁(Sorghum bicolor)(NCBI GenBank登記號No.AAR30887，GI39777235)、稻(Oryza sativa)(粳型栽培品種組)(NCBI GenBank登記號No.CAA32375，GI20288)、擬高梁(Sorghum propinquum)(NCBI GenBank登記號No.AAR30899，GI39777259)、稻(秈型栽培品種組)(NCBI GenBank登記號No.AAM47309，GI21321786)、玉蜀黍(Zea mays)(NCBIGenBank登記號No.JQ0382，GI82715)、燕麥(Avena sativa)(NCBIGenBank登記號No.A29631，GI82338)、歐洲云杉(Picea abies)(NCBIGenBank登記號No.AAB03339，GI1399958)、風兜地錢(Marchantiapaleacea var.diptera)(NCBI GenBank登記號No.BAB39687，GI13429830)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)(NCBIGenBank登記號No.AAM94952，GI25986843)、鐵線蕨(Adiantumcapillus-veneris)(NCBI GenBank登記號No.BAA33775，GI3724346)、卷柏(Selaginella martensii)(NCBIGenBank登記號No.CAA43698，GI22603)、角齒蘚(Ceratodonpurpureus)(NCBI GenBank登記號No.AAB67863，GI1314837)、普通小麥(Triticum aestivum)(NCBI GenBank登記號No.CAC82798，GI18076430)、歐洲赤松(Pinus sylvestris)(NCBIGenBank登記號No.CAA65510，GI1237084)、Mesotaeniumcaldariorum(NCBI GenBank登記號No.AAC49128，GI1125699)、Nicotiana plumbaginilolia(NCBI GenBank登記號No.CAA74992，GI2370331)、Populus balsamifera subsp.trichocarpa(NCBI GenBank登記號No.AAG25725，GI10954091)、Mougeotia scalaris(NCBIGenBank登記號No.CAA64796，GI1419681)、Sorghum x drummondii(NCBI GenBank登記號No.AAR30915，GI39777291)、稻(NCBIGenBank登記號No.S14065，GI100695)、牽牛(Ipomoea nil)(NCBIGenBank登記號No.AAA84970，GI1145714)、松葉蕨(Psilotumnudum)(NCBI GenBank登記號No.CAA52883，GI400480)、大麥(Hordeum vulgare)(NCBI GenBank登記號No.AAK97634，GI15425967)、蕺菜(Houttuynia cordata)(NCBIGenBank登記號No.AAK20969，GI13383412)、鐮葉天門冬(Asparagusfalcatus)(NCBI GenBank登記號No.AAK20957，GI13383388)、水青樹(Tetracentron sinense)(NCBI GenBank登記號No.AAK20991，GI13383456)、Pachysandra americana(NCBIGenBank登記號No.AAK20977，GI13383428)、Heuchera Canadensis(NCBI GenBank登記號No.AAK20967，GI13383408)、Xanthorhizasimplicissima(NCBI GenBank登記號No.AAK20993，GI13383460)、Coptis trifolia(NCBI GenBank登記號No.AAK20961，GI1338396)、木通(Akebia quinata)(NCBI GenBank登記號No.AAK20953，GI13383380)、Lardizabala biternata(NCBI GenBank登記號No.AAK20973，GI13383420)、草珊瑚(Sarcandra glabra)(NCBI GenBank登記號No.AAK20984，GI13383442)、雪香蘭屬物種SM-2000(Hedyosmum sp.SM-2000)(NCBI GenBank登記號No.AAK20965，GI13383404)、大花馬兜鈴(Aristolochia grandiflora)(NCBI GenBank登記號No.AAK20955，GI13383384)、Pseudowinteraaxillaris(NCBI GenBank登記號No.AAK20980，GI13383434)、Pteridophyllum racemogsum(NCBI GenBank登記號No.AAK20982，GI13383438)、箭根薯(Tacca chantieri)(NCBIGenBank登記號No.AAK20990，GI13383454)、金魚藻(Ceratophyllumdemersum)(NCBI GenBank登記號No.AAK20959，GI13383392)、Hypecoum imberbe(NCBI GenBank登記號No.AAK20970，GI13383414)、Idiospermum australiense(NCBIGenBank登記號No.AAF26335，GI6715235)、Quiina pteridophylla(NCBI GenBank登記號No.AAR30494，GI39753893)、Pleea tenuifolia(NCBI GenBank登記號No.AAK20979，GI13383432)、蓮(Nelumbonucifera)(NCBI GenBank登記號No.AAF26342，GI6715242)、單心木蘭(Degeneria vitiensix)(NCBI GenBank登記號No.AAF26324，GI6715224)、昆欄樹(Trochodendron aralioides)(NCBI GenBank登記號No.AAF26354，GI6715254)、耬斗菜屬物種SM-1999(Aquilegia sp.SM-1999)(NCBI GenBank登記號No.AAF26312，GI6715212)、美洲三白草(Saururus cernuus)(NCBIGenBank登記號No.AAF26352，GI6715252)、Lilium superbum(NCBIGenBank登記號No.AAK20975，GI13383424)、馬蹄香(Sarumahenryi)(NCBI GenBank登記號No.AAF26350，GI6715250)、Smilaxrotundifolia(NCBI GenBank登記號No.AAK20986，GI13383446)、美國夏臘梅(Calycanthus floridus)(NCBI GenBank登記號No.AAF26318，GI6715218)、Spathiphyllum clevelandii(NCBIGenBank登記號No.AAK20988，GI13383450)、Eupomatia laurina(NCBI GenBank登記號No.AAF26328，GI6715228)、慈姑屬物種(Sagittaria sp.Mathews 383)(NCBI GenBank登記號No.AAF26348，GI6715248)、金錢蒲(Acorus gramineus)(NCBI GenBank登記號No.AAF26306，GI6715206)、Hernandia lychnifera(NCBIGenBank登記號No.AAF26332，GI6715232)、香睡蓮(Nymphaeaodorata)(NCBI GenBank登記號No.AAF26344，GI6715244)、胡椒(Piper nigrum)(NCBI GenBank登記號No.AAF26346，GI6715246)、金粟蘭(Chloranthus spicatus)(NCBI GenBank登記號No.AAF26322，GI6715222)、番荔枝屬物種SM-1999(Annonasp.SM-1999)(NCBI GenBank登記號No.AAF26310，GI6715210)、二喬木蘭(Magnolia x soulangeana)(NCBI GenBank登記號No.AAF26340，GI6715240)、Lactoris fernandeziana(NCBI GenBank登記號No.AAF26337，GI6715237)、莼菜(Brasenia schreberi)(NCBIGenBank登記號No.AAF26316，GI6715216)、Amborella trichopoda(NCBI GenBank登記號No.AAF26308，GI6715208)、Drimys winteri(NCBI GenBank登記號No.AAF26326，GI6715226)、少藥八角(Illicium oligandrum)(NCBI GenBank登記號No.AAK20972，GI13383418)、龜甲龍(Dioscorea elephantipes)(NCBIGenBank登記號No.AAK20964，GI13383402)、Dissiliaria muelleri(NCBI GenBank登記號No.AAR30464，GI39753833)、Maytenusarbutifolia(NCBI GenBank登記號No.AAR30480，GI39753865)、Leonia glycycarpa(NCBI GenBank登記號No.AAR30479，GI39753863)、Peridiscus lucidus(NCBI GenBank登記號No.AAR30489，GI39753883)、Austrobuxus megacarpus(NCBIGenBank登記號No.AAR30453，GI39753811)、Dichapetalummacrocarpum(NCBI GenBank登記號No.AAR30462，GI39753829)、Acmanthera latilolia(NCBI GenBank登記號No.AAM34150，GI21069983)、Coleostachys genipifolia(NCBI GenBank登記號No.AAM34149，GI21069981)、福木(Elaeodendron orientale)(NCBI GenBank登記號No.AAR30467，GI39753839)、Androstachysjohnsonii(NCBI GenBank登記號No.AAM34144，GI21069971)、Tristellateia madagascariensis(NCBI GenBank登記號No.AAM34141，GI21069965)、Balanops vieillardii(NCBI GenBank登記號No.AAR30454，GI39753813)、Petalostigma pubescens(NCBIGenBank登記號No.AAR30490，GI39753885)、Tristellateia africana(NCBI GenBank登記號No.AAM34170，GI21070023)、白睡蓮(Nymphaea alba)(NCBI GenBank登記號No.AAF26345，GI6715245)、Dovyalis rhamnoides(NCBI GenBank登記號No.AAR30465，GI39753835)、Atuna racemosa(NCBI GenBank登記號No.AAR30452，GI39753809)、Spachea correae(NCBIGenBank登記號No.AAM34197，GI21070077)、Hirtella bicornis(NCBI GenBank登記號No.AAR30473，GI39753851)、Maytenussenegalensis(NCBI GenBank登記號No.AAR30481，GI39753867)、Canella winterana(NCBI GenBank登記號No.AAF26321，GI6715221)、Glandonia macrocarpa(NCBI GenBank登記號No.AAM34195，GI21070073)、Acridocarpus macrocalyx(NCBIGenBank登記號No.AAM34154，GI21069991)、Triopterys rigida(NCBI GenBank登記號No.AAM34156，GI21069995)、Ptilochaetanudipes(NCBI GenBank登記號No.AAM34190，GI21070063)、Byrsonima crassifolia(NCBI GenBank登記號No.AAM34148，GI21069979)、Lophopterys floribunda(NCBIGenBank登記號No.AAM34201，GI21070085)、Diacidia ferruginea(NCBI GenBank登記號No.AAM34126，GI21069935)、Micrantheumhexandrum(NCBI GenBank登記號No.AAR30483，GI39753871)、Dillenia philippinensis(NCBI GenBank登記號No.AAR30463，GI39753831)和Thryallis longifolia(NCBI GenBank登記號No.AAM34173，GI21070029)。根據國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(“NCBI”)GenBank登記號和GenInfo標識符(“GF”)，這些植物光敏素A的序列信息在現有技術中是已知的。這種信息例如可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/blink.cgi？pid＝15217562&cut＝100&org＝1得到，在此將其整體引入作為參考。
優選地，光不穩定的植物光敏素A來自雙子葉植物，如，例如，擬南芥。擬南芥PHYA基因的蛋白和DNA序列在現有技術中是已知的，(NCBI GenBank登記號No.CAA35221，GI16421)。該信息例如可在http//www.nchi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？dh＝protein&val＝15217562中得到，在此將其整體引入作為參考。
光誘導型的啟動子包括，例如，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子，或者葉綠素a/b結合蛋白啟動子。優選地，光誘導型的啟動子是RbcS啟動子。
本發明進一步涉及包括根據本發明的核酸構建體的表達系統。優選地，該核酸構建體位于正確有義的方向。
根據本發明的核酸構建體例如，可以整合到宿主細胞中。優選地，該宿主細胞是細菌細胞或者植物細胞。
根據本發明的核酸構建體例如，可以整合到轉基因植物或者轉基因植物種子中。該轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物可以是單子葉植物。單子葉植物，包括，單不限于，例如，水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、洋蔥、大蒜和甘蔗。該轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物可以是，例如，水稻植物。該水稻植物可以是，例如，粳型或秈型品種。該水稻植物可以是，例如，芳香品種。該水稻植物可以是，例如，Basmati水稻。
本發明也提供一種調節植物株冠結構的方法。該方法包括提供轉基因植物或者轉基因植物種子，其已經用根據本發明的核酸構建體轉化。該轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物，在有效調節植物株冠結構的條件下生長。
優選地，轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物，是生產谷粒的植物，且調節植物株冠結構包括與同類型的非轉基因植物相比，降低植物高度、增加植物圓錐花序部分的伸出或推出，和/或增加植物圓錐花序部分的分蘗或分支。優選地，調節產谷粒植物的株冠結構包括增加每個植物飽滿谷粒的數目。
本發明的另一個方面提供一種調節植物種子產量的方法。該方法包括提供轉基因植物或者轉基因植物種子，其已經用根據本發明的核酸構建體轉化。該轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物，在有效調節植物種子產量的條件下生長。優選地，植物的種子產量增加。
該轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物，優選地是生產谷粒的植物，且調節植物種子的產量包括通過提高每個植物飽滿谷粒的數目來增加植物的谷粒產量。
根據本發明的方法，轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物，優選是單子葉植物，如，例如，水稻植物。更優選地，水稻植物是粳型水稻品種，特別是，香稻品種。最優選地，轉基因植物或者從轉基因植物種子中長出的植物，是Basmati水稻植物。
本發明的另一個方面是含有根據本發明核酸構建體的表達系統。可使用現有技術中公知的試劑將編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子插入到許多可利用的表達載體和細胞系統中的任何一種。
適當的載體包括，但不限于，下列病毒載體，如λ載體系統gt11、gt WES.tB、Charon 4，和質粒載體如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUCl9、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(見Stratagene，La Jolla，CA，美國的“Stratagene Cloning Systems”目錄(1993)，在此將其整體引入作為參考)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(見F.W.Studier等，“Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of ClonedGenes，”Gene Expression Technology vol.185(1990)，在此將其整體引入作為參考)，及其任意衍生物。
在制備用于表達的DNA載體中，可將各種DNA序列正常地插入或者替代到細菌質粒中。可使用任何方便的質粒，其特征將是具有細菌復制系統、允許在細菌中選擇的標記以及通常地一個或多個唯一的、方便地設置的限制位點。許多稱作轉化載體的質粒可用于植物轉化。載體的選擇將依賴于優選的轉化技術和用于轉化的靶物種。使用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，即一種導致根癌的土傳細菌，許多載體可用于穩定轉化。根癌的特征是在受感染植物的較低莖和主根上長出的腫瘤或菌癭。這些腫瘤是由于細菌質粒DNA的一部分轉移并整合到植物染色體DNA中造成的。這種轉移DNA(T-DNA)與植物細胞的正常基因一起表達。所述質粒DNA、pTI或Ti-DNA，“誘導腫瘤的質粒”，含有T-DNA運動到植物中所必需的vir基因。該T-DNA攜帶編碼參與植物調節因子和細菌營養物(冠癭堿)的生物合成的蛋白的基因。T-DNA由兩個稱作“邊界序列(border sequence)”的25bp長的不完全同向重復序列界定。通過除去癌基因和冠癭堿基因，并且用目標基因替代它們，可能將外源DNA轉移到植物中而不形成腫瘤或根癌土壤桿菌的增殖。Fraley，等，“Expression of Bacterial Genes in Plant Cells，”Proc.Nat′l Acad.Sci.，804803-4807(1983)，在此將其整體引入作為參考。
該技術的進一步改良導致產生二元載體系統。Bevan，M.，“BinaryAgrobacterium Vectors for Plant Transformation，”Nucleic Acids Res.128711-8721(1984)，在此將其整體引入作為參考。在這個系統中，從pTI中除去所有T-DNA序列(包括邊界)，并將含有T-DNA的第二載體引入到根癌土壤桿菌中。該第二載體具有能在大腸桿菌(E.coli)和根癌土壤桿菌中復制的優點，并且含有便于轉基因克隆的多克隆位點。通常使用的載體的實例是pBin19。Frisch，等，“CompleteSequence of the Binary Vector Bin19，”Plant Molec.Biol.27405-409(1995)，在此將其整體引入作為參考。現在已知的或者后來描述的用于遺傳轉化的任何適當的載體都適合用于本發明。
授予Cohen和Boyer的美國專利No.4,237,224描述了使用限制性內切酶切割和用DNA連接酶連接生產重組質粒形式的表達系統，在此將其整體引入作為參考。這些重組質粒然后通過轉化的方式引入并在包括原核生物和在組織培養物中生長的真核細胞的單細胞培養物中復制。
在本發明的一個方面，將編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子以有義方向整合到適當的載體中，從而可讀框正確地定向以在所選啟動子的控制下表達所編碼的蛋白。
將某種“控制元件”或“調節序列”也整合到載體-構建體中。載體的那些非翻譯區、啟動子、5’和3’非翻譯區與宿主細胞蛋白相互作用以實現轉錄和翻譯。這些元件可能在它們的長度和特異性上有變化。根據所利用的載體系統和宿主，可使用任意數目的適當的轉錄和翻譯元件，包括組成型和誘導型啟動子。
組成型啟動子是一種在生物的整個發育和一生中指導基因表達的啟動子。一些廣泛用于誘導轉基因表達的組成型啟動子的實例包括根癌土壤桿菌的胭脂堿合酶(NOS)基因啟動子，(授予Rogers等的美國專利5,034,322，在此將其整體引入作為參考)、花椰菜花葉病毒(CaMV)35S和19S啟動子(授予Fraley等的美國專利No.5,352,605，在此將其整體引入作為參考)、那些來自幾種肌動蛋白基因中任何一種的啟動子，其已知在絕大多數細胞類型中表達(授予Privalle等的美國專利No.6,002,068，在此將其整體引入作為參考)，以及遍在蛋白啟動子，其是一種已知在許多細胞類型中蓄積的基因產物。
誘導型啟動于是一種對誘導物反應能直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因轉錄的啟動子。在不存在誘導物時，DNA序列或基因將不被轉錄。誘導物可以是化學試劑，如代謝產物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物、或者直接施加給植物的生理應激如冷、熱、鹽、毒素、或者通過病原體或致病因子如病毒或真菌的作用。可通過在外部將誘導物應用到細胞或植物上使含有誘導型啟動子的植物細胞暴露于誘導物，如通過噴霧、灑水、加熱、或者通過暴露于有效的病原體。在本發明中使用的適當的誘導型啟動子的實例是糖皮質激素誘導型啟動子。Schena等，“A Steroid-Inducible Gene Expression Systemfor Plant Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.8810421-5(1991)，在此將其整體引入作為參考。當將轉基因植物與納摩爾濃度的糖皮質激素接觸，或者通過與地塞米松，一種糖皮質激素類似物接觸時，在用植物光敏素A基因轉化的植物中誘導了植物光敏素A基因的表達。Schena等，“A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421-5(1991)；Aoyama等，“AGlucocorticoid-Mediated Transcriptional Induction System inTransgenic Plants，”Plant J.11605-612(1997)，和McNellis等，“Glucocorticoid-Inducible Expression of a Bacterial AvirulenceGene in Transgenic Arabidopsis Induces Hypersensitive Cell Death，Plant J.14(2)247-57(1998)，在此將其整體引入作為參考。另外，誘導型啟動子包括在植物的所選組織內以組織特異性方式起作用以調節目標基因的啟動子。這種組織特異性啟動子的實例包括本領域中公知的種子、花或者根特異性啟動子。授予Shewmaker等的美國專利No.5,750,385，在此將其整體引入作為參考。
本發明的核酸構建體也包括可操作的3’終止子區，選自那些能在所選宿主細胞中提供mRNA的正確轉錄終止和聚腺苷化的3’終止子區，其可操作地連接到編碼所選蛋白的DNA分子上。許多3’終止子區已知在植物中是可操作的。示范性的3’終止子區包括，但不限于，胭脂堿合酶3’調節區(Fraley，等，“Expression of BacterialGenes in Plant Cells，”Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 804803-4807(1983)，在此將其整體引入作為參考)和花椰菜花葉病毒3’調節區。Odell，等，“Identification of DNA Sequences Required for Activity ofthe Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter，”Nature 313(6005)810-812(1985)，在此將其整體引入作為參考。實際上已知在植物中可操作的任何3’終止子區都將足以正確表達本發明核酸構建體的編碼序列。
使用如在Sambrook等，Molecular CloningA Laboratoty Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，NY(1989)，以及Ausubel，F.M.等(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.中所描述的公知的分子克隆技術，在此將其整體引入作為參考，可將所選載體、啟動子和適當的3’終止子區連接在一起以生產本發明的質粒。
一旦制備了本發明的DNA構建體，則很容易將其整合到宿主細胞中。可通過轉化，特別是轉導、接合、轉移或電穿孔將重組分子引入到細胞中。使用現有技術中已知的標準克隆方法，如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，ColdSprings Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)所描述的方法，在此將其整體引入作為參考，將DNA序列克隆到宿主細胞中。適當的宿主細胞包括，但不限于，細菌、病毒、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲、植物等。優選地，宿主細胞是細菌細胞或植物細胞。
因此，本發明的另一個方面涉及制備重組細胞的方法。主要地，本方法是在植物細胞中有效進行核酸分子轉錄的條件下，通過用本發明的核酸構建體轉化植物細胞來完成的。優選地，將本發明的核酸分子穩定地插入到轉化得到的重組植物細胞的基因組中。
用本發明核酸分子轉化植物細胞的一種方法是宿主細胞的粒子轟擊(也被認為是生物彈射擊法(biolistic)轉化)。這可以通過幾種方式中的一種來完成。第一種方式包括將惰性或生物活性顆粒推進到細胞中。這種技術在美國專利Nos.4,945,050、5,036,006和5,100,792中公開，所有專利都授予Sanford等，在此將其整體引入作為參考。通常，該方法包括在有效穿透細胞外表面并在其內部整合的條件下將惰性或生物活性顆粒推進到細胞中。當利用惰性顆粒時，可通過用含有異源DNA的載體覆蓋顆粒來將載體引入到細胞中。可選擇地，可用載體圍繞靶細胞以便通過尾隨顆粒將載體輸送到細胞內。也可將生物活性顆粒(例如，含有載體和異源DNA的干燥細菌細胞)推進到植物細胞中。也可使用現在已知的或此后發展的粒子轟擊的其它變異。
由于細胞群體非常大(在106的數量級)，所以原生質體中的瞬時表達允許基因表達的定量研究。為了向原生質體中遞送DNA，已建議了幾種方法，但最常用的是電穿孔(Fromm等，“Expression ofGenes Transferred Into Monocot and Dicot Plants byElectroporation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825824-5828(1985)，在此將其整體引入作為參考)和聚乙二醇(PEG)介導的DNA攝入。Krens等，“In Vitro Transformation of Plant Protoplasts with Ti-Plasmid DNA，”Nature 29672-74(1982)，在此將其整體引入作為參考。在電穿孔期間，通過由于暴露到電場所導致的細胞膜的通透性可逆變化的方法將DNA引入到細胞中。PEG轉化通過改變膜的彈性引入DNA。和電穿孔不同，PEG轉化不需要任何特殊的裝置并且轉化效率可同樣高。將本發明的基因構建體引入到宿主細胞中的另一種適當的方法是原生質體與其它實體的融合，所述實體為小細胞、細胞、溶酶體或者含有嵌合基因的其它可融合的脂質表面體。Fraley，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，在此將其整體引入作為參考。
本發明方法優選穩定的轉化體。將核酸構建體穩定地引入到植物細胞中的適當方法是在用以前用DNA構建體轉化的根癌土壤桿菌或發根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物細胞。在現有技術中已知的適當條件下，使轉化的植物細胞生長形成莖或根，并進一步發育成植物。在本發明的一個實施方案中，使用Frary等，PlantCell Reports 16235(1996)的方法產生轉化體，在此將其整體引入作為參考，以轉化幼苗外植體。
適于轉化的植物組織包括，但不限于，花芽、葉組織、根組織、分生組織、合子胚和體細胞胚、大孢子以及花藥。
轉化后，可選擇并再生轉化的植物細胞。優選地，使用與本發明的核酸構建體一同引入到宿主細胞內的選擇標記首先鑒定轉化的細胞。基因融合實驗最廣泛使用的報告基因一直是uidA，一種大腸桿菌的基因，其編碼β-葡糖醛酸糖苷酶蛋白，也稱作GUS。Jefferson等，“GUS FusionsβGlucuronidase as a Sensitive and VersatileGene Fusion Marker in Higher Plants，”EMBO Journal 63901-3907(1987)，在此將其整體引入作為參考。GUS是一種68.2kd蛋白，以其天然型四聚物起作用。其不需要輔因子或特定的離子條件，盡管其可能被二價陽離子如Cu2+或Zn2+抑制。GUS在存在巰基還原劑如β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)時有活性。
為了評價GUS活性，可利用幾種底物。最常使用的是5溴-4-氯-3吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)和4甲基-傘形酮酰(umbelliferyl)-葡糖苷酸(MUG)。與X-Gluc的反應產生在基因活性的組織化學檢測中有用的藍色。對于定量目的，優選MUG，因為在UV刺激下傘形酮酰自由基發射熒光，因此提供更好的靈敏度并且更容易通過熒光測定法測量。Jefferson等，“GUS FusionsβGlucuronidase as aSensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants，”EMBOJournal 63901-3907(1987)，在此將其整體引入作為參考。
其它合適的選擇標記包括，但不限于，編碼抗生素抗性的標記，如賦予卡那霉素抗性的nptII基因(Fraley，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804803-4807(1983)，在此將其整體引入作為參考)和dhfr基因，其賦予對氨甲蝶呤的抗性。Bourouis等，EMBO Journal 21099-1104(1983)，在此將其整體引入作為參考。現有技術中已知許多抗生素抗性標記并且其它標記也正在被不斷地鑒定出來。根據本發明，可使用任何已知的抗生素抗性標記轉化并選擇轉化的宿主細胞。使細胞或組織在含有抗生素的選擇培養基上生長，由此通常只有表達抗生素抗性標記的那些轉化體才能繼續生長。類似地，提供用于生產可通過發光鑒定的化合物的酶是有用的，如螢光素酶。所使用的選擇標記將取決于靶物種；對于某種靶物種來說，優選不同的抗生素、除草劑或者生物合成選擇標記。
一旦獲得重組植物細胞或組織，則可能從那里再生發育完全的植物。再生的方法隨著植物的物種而變，但是通常首先提供經轉化的原生質體懸浮液或者含有經轉化的外植體的培養皿。形成愈傷組織并可從愈傷組織中誘導出莖以及隨后形成根。可選擇地，可在愈傷組織中誘導胚形成。這些胚與天然胚一樣發芽以形成植物。培養基通常將含有各種氨基酸和激素，如生長素和細胞分裂素。向培養基中添加谷氨酸和脯氨酸也是有利的，尤其是對如玉米和苜蓿這樣的物種而言。有效的再生將依賴于培養基、基因型以及培養物史。如果控制這三種變量，那么再生通常是可再現和可重復的。
在Evans，等，Handbook of Plant Cell Cultures，Vol 1(MacMillan Publishing Co.，New York，1983)；和Vasil I.R.(編)，CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants，Acad.Press，Orlando，Vol.I，1984，和Vol.III(1986)中描述了從培養的原生質體中的植物再生，在此將其整體引入作為參考。
已知實際上所有植物都可從所培養的細胞或組織中再生，包括但不限于，水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣(chicory)、萵苣、菊苣(endive)、甘藍、花椰萊、嫩莖花椰萊、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、草莓、葡萄、覆盆子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗的所有主要物種。
本發明的核酸分子在轉基因植物中穩定整合后，其可通過有性雜交或通過制備栽培品種轉移到其它植物中。關于有性雜交，可根據將要雜交的物種使用許多標準育種技術中的任何一種。可根據本領域技術人員已知的常用農業方法繁殖栽培品種。可選擇地，從轉基因植物中回收轉基因種子。然后可將該種子種植在土壤中并使用常規方法培養以生產轉基因植物。
實施例實施例1-質粒構建使用標準克隆和質粒操作方法，在pSB11載體中構建含有全長擬南芥PHYA cDNA(Sharrock等，“Novel Phytochrome Sequences inArabidopsis thalianaStructure，Evolution，and DifferentialExpression of a Plant Regulatoty Photoreceptor Family，”Genes Dev.31745-1757(1989)，在此將其整體引入作為參考)的二元質粒pSBR 3.7(Komari等，“Vectors Carrying Two Separate T-DNAs for Co-transformation of Higher Plants Mediated by Agrobacteriumtumefaciens and Segregation of Transformants Free From SelectionMarkers，”Plant J.10-165-174(1996)，在此將其整體引入作為參考)。在圖1A中顯示T-DNA區內質粒的成分，以及所選的限制酶切位點。pSBR 3.7中的表達盒由連接到擬南芥PHYA編碼區(3.7kb)上的1.3kb水稻RbcS啟動子(Kyozuka等，“Light-regulated and Cell-specific Expression of Tomato RbcS-gusA and Rice RbcS-gusA FusionGenes in Transgenic Rice，”Plant Physiol.102991-1000(1993)，在此將其整體引入作為參考)，以及馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因3’區(3’pinII)非編碼序列(1.0kb)組成。該選擇盒包括花椰菜花葉病毒(“CaMV”)35S啟動子(0.74kb)、膦絲菌素乙酰轉移酶基因(bar，0.59kb)以及胭脂堿合酶基因3’非編碼序列(3’-nos，0.28kb)。使用輔助質粒pRK2013通過三親株交配，將質粒pSBR 3.7轉移到含有pSB1的根癌土壤桿菌LBA4404株中(Komari等，“VectorsCarrying Two Separate T-DNAs for Co-transformation of HigherPlants Mediated by Agrobacterium tumefaciens and Segregation ofTransformants Free From Selection Markers，”Plant J.10-165-174(1996)，在此將其整體引入作為參考)。對于共培養，使來自單一菌落的細菌在30℃，含有50mg/L壯觀霉素的液體AB培養基中生長3天，并以3 109細胞/ml的密度在AAM培養基中懸浮(Hiei等，“Efficient Transformation of Rice(Oryza sativa L.)Mediated byAgrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA，”Plant J.2271-282(1994)，在此將其整體引入作為參考)用于水稻轉化。
實施例2-產生轉基因水稻植物根據以前所描述的方法進行土壤桿菌介導的粳型水稻品種PusaBasmati-1(“PBNT”)的轉化。Garg等，“Trehalose Accumulation inRice Plants Confers High Tolerance Levels to Different AbioticStresses，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9915898-15903(2002)，在此將其整體引入作為參考。簡要地，使用小盾片(scutella)來源的胚發生的愈傷組織用于與含有pSBR 3.7的根癌土壤桿菌LBA4404株共培養。共培養3天后，在含有6mg/L雙丙氨酰膦(bialaphos)和250mg/L頭孢噻肟的愈傷組織培養基上選擇愈傷組織。進一步，將在新鮮選擇培養基上增殖的微愈傷組織(兩輪選擇)轉移到含有4mg/L雙丙氨酰膦的再生培養基中。將再生的小植物在Yoshida營養物溶液中水培順應，轉移到罐中并檢驗草銨膦除草劑抗性。Roy等，“ArginineDecarboxylase Transgene Expression and Analysis of EnvironmentalStress Tolerance in Transgenic Rice，”Plant Sci.160869-875(2001)，在此將其整體引入作為參考。使最初的轉基因植物在溫室中生長到成熟并稱作T0-代植物。該T0植物連續自交4代以獲得用于表型分析的純合T4轉基因種子。
實施例3-DNA-印跡雜交分析使用研缽和研杵將非轉基因對照(“PBNT”)植物，以及用質粒pSBR 3.7轉化的43個獨立推定的T0轉化體的葉子在液氮中研磨。使用DNAzolES(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH，美國)，根據生產商的使用說明，通過胍-去污劑溶解法分離水稻基因組DNA。將5微克基因組DNA用HindIII限制酶過夜消化，通過0.8％瓊脂糖凝膠分級分離，堿轉移到Hybond N+尼龍膜(AmershamPharmacia，Piscataway，NJ，美國)上并與α-32P-標記的，作為探針的2.24kb擬南芥PHYA編碼區(HindIII和XbaI片段)雜交。根據所描述的方法進行DNA探針制備、雜交和膜的洗滌。Roy等，“ArginineDecarboxylase Transgene Expression and Analysis of EnvironmentalStress Tolerance in Transgenic Rice，”Plant Sci.160869-875(2001)，在此將其整體引入作為參考。將α-32P-標記的膜暴光在放射自顯影照片上。
實施例4-植物光敏素的免疫檢測將幼苗(T4-代)在液氮中冷凍，研磨成細粉末并在由37.5％(v/v)乙二醇、75mM Tris-HCl(pH 8.3)、7.5mM Na2EDTA、15mMNaS2O5，、0.11％(v/v)聚乙烯亞胺、1.5mM苯甲基磺酰氟組成的提取緩沖液(2ml g-1)中懸浮。Davis等，“The Heme-oxygenase FamilyRequired for Phytochrome Chromophore Biosynthesis is Necessaryfor Proper Photomorphogenesis in Higher Plants，”Plant Plysiol.126656-669(2001)，在此將其整體引入作為參考。提取液通過在4℃，3000g離心30分鐘進行澄清，通過SDS-PAGE(7.5％丙烯酰胺凝膠)分級分離并轉移到硝酸纖維素膜上(Schleicher and Schuell BioScience，Inc.，Keene，NH，美國)。向凝膠的每個泳道上樣使用Bio-Rad DC蛋白測定抗體(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美國)測定的50μg來自暗或光生長幼苗的總蛋白。將蛋白通過SDS-PAGE分級分離并轉移到硝酸纖維素膜上。用與擬南芥PHYA和水稻PHYA都反應的單克隆抗體O73D(1∶500稀度)，或者用僅與水稻PHYA反應的單克隆抗體1.9B5A(1∶1000稀度)攻擊完全相同的印跡。用與山羊-抗小鼠第二抗體綴合的辣根過氧化物酶和Bio-Rad Opti-4CN底物試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美國)處理后顯示濾器上的蛋白。使用預染的標記(見BluePlus 2，InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)測定分子量(kD)。
實施例5-在溫室中生長的轉基因水稻植物的表型分析播種非轉基因品系(“PBNT”)和T4代純合轉基因品系(“PA29”、“PA41”和“PA53”)的種子，并使其在含有元菌上層土的小罐中發芽，然后將三周齡的幼苗移植到Cornell University，Ithaca，NY，美國的溫室中的更大的罐中(20×20cm，每個罐中一個植物)。使植物在金屬鹵化物白光下，10小時光照/14小時黑暗的光周期、50-60％相對濕度和28℃白天/24℃夜晚溫度的條件下生長。每日一次灌溉所有植物并且根據需要定期應用肥料。使植物生長到成熟并且評價常見的農業性狀(包括，植物高度、1000顆谷粒的重量以及谷粒產量/植物)。從罐的內邊緣(莖的基部)到最高圓錐花序(“p”)的尖端測量植物的高度。種子在37℃干燥10天后測量谷粒產量/植物和1000顆谷粒的重量。使用Minitab軟件(Minitab，Inc.，State College，PA，美國)依據每個檢驗的要求(Stell和Torries，CITATION(1980))，使用一般線性模型(“GLM”)分析研究植物高度的變異。品系內產量變異為正態分布，從而允許通過GLM分析研究品系間的變異。使用ANOVA和兩個樣本的t檢驗評價分布的正態性。對沒有顯示正態分布的數據集進行平方根轉化以符合ANOVA分析的假設。將集中的變異的評價用于t檢驗。通過線性回歸研究產量和其它測量的性狀之間的關系。
實施例6-產生表達擬南芥植物光敏素A的轉基因水稻品系在拮抗避陰反應的嘗試中，生產表達擬南芥PHYA的Basmati轉基因水稻品系。用含有在光調節的和組織特異性RbcS啟動子控制下的擬南芥PHYA編碼區的質粒(pSBR 3.7)轉化胚發生的愈傷組織(圖1A)。該質粒也含有在組成型CaMV 35S啟動子控制下的膦絲菌素乙酰轉移酶(bar)基因的編碼區，從而使得能夠在對基于膦絲菌素的除草劑草銨膦的抗性的基礎上選擇轉化體。從與含有pSBR 3.7的根癌土壤桿菌共培養的120個愈傷組織中再生出51個植物，其中的46個具有草銨膦抗性。在T0-代品系中，92％是可育的并且結出正常的種子。在最高到T4-代的幾種純合轉基因植物上進行詳細的分子和表型表征，因為已經報道了在T3-代發生基因沉默，即使T2-代和T1-代植物不沉默。Iyer等，“Transgene Silencing in Monocots，”PlantMol.Biol.43323-346(2000)，在此將其整體引入作為參考。
實施例7-轉基因品系的DNA印跡分析使用DNA印跡分析進一步證實轉基因整合并測定轉基因拷貝數。從草銨膦抗性轉基因植物和非轉基因對照植物中分離基因組DNA并用HindIII消化，以用于T-DNA連接片段分析(圖1A)。將得到的DNA印跡與通過HindIII/Xba1消化pSBR 3.7獲得的標記的2.24kb擬南芥PHYA片段雜交(圖1A)。依賴于轉基因拷貝數，該PHYA探針與轉基因植物的一個或多個消化的DNA片段雜交。該PHYA探針與從所分析的43個草銨膦抗性植物中的39中提取的DNA雜交。在這些DNA中，8個含有單一轉基因拷貝，10個含有兩個拷貝，且10個含有三個拷貝。在圖1B中顯示了選擇用于進一步研究的三個品系的DNA印跡分析。沒有見到與從非轉基因植物中所提取的DNA的雜交。PA29品系含有3個獨立插入的轉基因拷貝，而PA41和PA53品系每個都含有單一拷貝。在T1-代中12個獨立轉基因品系的草銨膦抗性分析顯示在包括PA41和PA53的8個水稻品系中草銨膦-除草劑抗性標記基因3∶1的分離型。
實施例8-轉基因水稻幼苗中植物光敏素A的免疫檢測使用免疫印跡分析進一步證實全長擬南芥PHYA在轉基因水稻品系PA29、PA41和PA53中的蓄積。從黃化的和白光生長的幼苗中提取總葉蛋白，通過SDS-PAGE分級分離并轉移到硝酸纖維素膜上。用與擬南芥PHYA和水稻PHYA都反應的單克隆抗體(“O73D”)或者用與單子葉植物PHYA特異性反應的單克隆抗體(“1.9B5A”)攻擊完全相同的印跡。結果與PHYA蓄積的已知模式一致，在黃化的非轉基因幼苗中O73D和1.9B5A都檢測到了大約124kD的蛋白，而該蛋白在白光生長的植物中不存在。在轉基因植物中，在白光生長的植物中沒有檢測到內源性PHYA的異位蓄積(圖2B)。然而，在所有檢驗的轉基因品系中都檢測到了擬南芥蛋白的蓄積(圖2A)。在黃化的轉基因幼苗中總的PHYA蓄積不與非轉基因植物中的PHYA蓄積顯著不同。該結果與在光生長的葉組織中驅動表達的RbcS啟動子的已知活性一致。Kyozuka等，“Light-regulated and Cell-specificExpression of Tomato RbcS-gusA and Rice RbcS-gusA Fusion Genesin Transgenic Rice，”Plant Physiol.102991-1000(1993)，在此將其整體引入作為參考。
實施例9-在溫室中生長的轉基因水稻植物的結構和谷粒產量當在溫室中在周期性白光下生長時，表達擬南芥PHYA的轉基因水稻植物高度降低并且顯示分蘗(分支)增加，從而導致比非轉基因植物更濃密的外觀(圖3A)。在PA29的極端情形中，即一種攜帶3個轉基因拷貝并蓄積最高水平的PHYA(如通過免疫印跡測定的)品系，植物明顯變矮(圖3A)。如在圖4A中所示，品系之間高度有顯著差異(ANOVA，F＝161.48，p＜0.001)。PA29和PA41品系比非轉基因對照植物顯著更短(PA29t＝15.9，p＜0.001；PA41t＝8.10，p＜0.001)。PA53品系高度上與對照沒有顯著差別(t＝1.132，p＝0.2)。所有3個表征的轉基因品系都顯示圓錐花序伸出的程度比非轉基因對照植物更大(圖3B)。在非轉基因植物中，圓錐花序(“p”)的基礎部分部分地由旗葉鞘(“s”)圍繞。相反，在轉基因品系中，圓錐花序和外苞結間部(subtending internode)(“i”)完全暴露。
根據每個植物的總的谷粒重量定量谷粒產量(圖4B)。品系之間產量測量值顯著不同(ANOVA，F＝64.46，p＜0.001)。估計PA29品系產量低于非轉基因對照植物(t＝5.6，p＜0.001)，而估計PA41和PA53品系產量都高于非轉基因植物(PA41t＝4.4，p＜0.001；PA53t＝4.0，p＜0.001)。與非轉基因對照植物相比，轉基因品系PA41和PA53產量分別增加27％和25％。PA41和PA53品系的產量之間沒有顯著差別。測量了1000個谷粒的重量，且在轉基因的和非轉基因品系之間沒有發現顯著差別(例如，對于PBNT是21.0±0.5，對于PA53是21.7±0.4)。因此，PA41和PA53品系中增加的產量可歸因于每個植物中飽滿谷粒數目的增加。
在溫室中在周期性白光下生長至成熟的轉基因Basmati水稻植物顯示生長模式發生了改變。重要地是，發現表征的2個品系(PA41和PA53品系)的每個植物的谷粒產量高于非轉基因的對照植物。這些觀察與在秈型水稻(Gulfmont)中PHYA的超表達不導致成熟植物形態改變的先前研究形成對照。Clough等，“Expression of aFunctional Oat Phytochrome A in Transgenic Rice，”Plant Physiol.1091039-1045(1995)，在此將其整體引入作為參考。
光誘導型的啟動子能通過多個光感受器系統對寬光譜的光作出反應。Martinez-Hernandez等，“Functional Properties and RegulatoryComplexity of a Minimal RbcS Light-responsive Unit Activated byPhytochrome，Cryptochrome，and Plastid Signals，”Plant Physiol.(2002)，在此將其整體引入作為參考。光合作用相關核基因的啟動子區，尤其是那些編碼RbcS和CAB的啟動子區的缺失和誘變分析，已經導致許多參與由光控制轉錄的順式作用元件的鑒定。Kyozuka等，“Light-regulated and Cell-specific Expression of Tomato RbcS-gusAand Rice RbcS-gusA Fusion Genes in Transgenic Rice，”Plant Physiol.102991-1000(1993)；Martinez-Hernandez等，“Functional Propertiesand Regulatory Complexity of a Minimal RbcS Light-responsive UnitActivated by Phytochrome，Cryptochrome，and Plastid Signals，”PlantPhysiol.(2002)，在此將其整體引入作為參考。然而，完全不了解RbcS啟動子內這些順式作用光反應元件如何激活不同信號轉導途徑和靶向不同的轉錄因子和/或指定的基因。Gilmartin等，“Localization of aPhytochrome-responsive Element Within the Upstream Region of PeaRbcS-3A，”Mol.Cell Biol.105565-5568(1990)；Kyozuka等，“Light-regulated and Cell-specific Expression of Tomato RbcS-gusAand Rice RbcS-gusA Fusion Genes in Transgenic Rice，”Plant Physiol.102991-1000(1993)，在此將其整體引入作為參考。
光活化的PHYA全植物光敏素(holophytochrome)由共價附著到線性四吡咯(膽汁三烯)發色團上的PHYA脫輔基蛋白組成。Terry，M.，“Phytochrome Chromophore-deficient Mutants，”Plant CellEnviron.20740-745(1997)，在此將其整體引入作為參考。在許多物種之間已經證明了發色團合成和全植物光敏素裝配所必需的活性的進化保守(Boylan等，“Oat Phytochrome is Biologically Active inTrahsgenic Tomatoes，”Plant Cell 1765-773(1989)；Boylan等，“Phytochrome A Overexpression Inhibits Hypocotyl Elongation inTransgenic Arabidopsis，”Proc.Natl.Acad.Sci USA 8810806-10810(1991)；Clough等，“Expression of a Functional OatPhytochrome A in Transgenic Rice，”Plant Physiol.1091039-1045(1995)；Kay等，“Rice Phytochrome is Biologically Active inTransgenic Tobacco，”Plant Cell 1775-782(1989)，在此將其整體引入作為參考)，并且預測擬南芥PHYA將在水稻中正確加工以形成活性全蛋白。這樣的研究也已經提示異源PHYA蛋白保留與光信號轉導鏈下游組分相互作用的能力。然而，應當注意到以前的報告檢查了在單子葉植物和雙子葉植物兩者中超表達單子葉植物PHYA的效果，且沒有進行單子葉植物中擬南芥PHYA活性的定量測量。在不存在這些數據時，轉基因引入的表型結果提供擬南芥植物光敏素在水稻品系PA29、PA41和PA53中有生物活性的最強證據。
當在周期性白光下在溫室中長到成熟時，在抑制伸長生長后，PA29和PA41品系顯示矮小。在許多物種中以前表征的PHYA超表達的品系顯示類似表型。在番茄(Lycopersicon esculentum cv VF36)中燕麥PHYA的表達導致變矮以及葉和果實兩者著色增加。Boylan等，“Oat Phytochrome is Biologically Active in Transgenic Tomatoes，”Plant Cell 1765-773(1989)，在此將其整體引入作為參考。類似地，表達水稻PHYA的煙草植物(Nicotiana tabacum cv Xanthi)顯示更短的莖和深綠色的葉。Nagatani等，“Rice Type I PhytochromeRegulates Hypocotyl Elongation in Transgenic Tobacco Seedlings，”Proc.Natl.Acad.Sci.ISA 885207-5211(1991)，在此將其整體引入作為參考。然而，煙草品種SRi中表達水稻PHYA的比較研究沒有發現與轉基因表達相關的形態學表型。Kay等，“Rice Phytochrome isBiologically Active in Transgenic Tobacco，”Plant Cell 1775-782(1989)，在此將其整體引入作為參考。這些數據提示遺傳修飾基因可能顯著影響植物光敏素反應途徑。這種背景不同可解釋由Clough等(“Expression of a Functional Oat Phytochrome A in TransgenicRice，”Plant Physiol.1091039-1045(1995)，在此將其整體引入作為參考)表征的PHYA超表達的秈型水稻品系和粳型水稻品系PA29、PA41和PA53的不同表型。
PHYA超表達植物的成熟植物表型的詳細研究已經證明環境影響的重要性，并暗示在調節改變的植物結構中避陰反應的破壞。發現由表達燕麥PHYA的煙草植物(Nicotiana tabacum cv Xanthi)所顯示的變矮的程度取決于種植密度。Robson等，“Genetic Engineering ofHarvest Index in Tobacco Through Overexpression of a PhytochromeGene，”Nat.Biotechnol.14995-998(1996)，在此將其整體引入作為參考。由于以更高密度種植植物，所以轉基因植物的高度以稱作“鄰近-條件變矮”的現象降低。與莖伸長減少偶聯的是與葉生長相似的生長分配，結果收獲指數增加。將轉基因植物中資源的再分配稱作“反向避陰”，并解釋為PHYA和PHYB拮抗作用的結果。在標準種植密度下，水稻品系PA29和PA41的部分變矮與反向避陰反應一致。
在商業上重要的Basmati水稻品種中擬南芥PHYA的表達使得能夠選擇顯示在溫室生長條件下總谷粒產量明顯提高的品系。仍然要看在田間試驗中是否能維持這些提高以及在何種田間條件下轉基因品系具有性能優勢。然而，這些攜帶單一和多個PHYA轉基因拷貝的品系的分析已經證明了PHYA表達的變異可對產量有顯著影響。據信轉基因水稻品系PA29、PA41和PA53的進一步表征將導致增加對光信號傳導在植物發育中作用的理解，并且有助于提高作物生產力。
盡管已經描述并且在此詳細描述了優選的實施方案，但是可不偏離本發明的精神來作出各種修改、添加、取代等，這對于相關技術領域的技術人員來說將是顯而易見的，這些因此被認為是在下面權利要求中所限定的本發明的范圍內的。
權利要求
1.一種分離的核酸構建體，其包括編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子；位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子5’的光誘導型的啟動子；和位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子3’的終止子區。
2.根據權利要求1的核酸構建體，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自雙子葉植物。
3.根據權利要求1的核酸構建體，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自擬南芥。
4.根據權利要求1的核酸構建體，其中所述光誘導型的啟動子選自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子和葉綠素a/b-結合蛋白啟動子。
5.根據權利要求4的核酸構建體，其中所述光誘導型的啟動子是RbcS啟動子。
6.包括根據權利要求1的核酸構建體的表達系統。
7.根據權利要求6的表達系統，其中所述核酸構建體位于正確有義的方向。
8.包括根據權利要求1的核酸構建體的細胞。
9.根據權利要求8的細胞，其中該細胞選自植物細胞和細菌細胞。
10.包括根據權利要求1的核酸構建體的轉基因植物。
11.根據權利要求10的轉基因植物，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自雙子葉植物。
12.根據權利要求10的轉基因植物，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自擬南芥。
13.根據權利要求10的轉基因植物，其中所述光誘導型的啟動子選自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子和葉綠素a/b-結合蛋白啟動子。
14.根據權利要求10的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
15.根據權利要求10的轉基因植物，其中所述植物是水稻。
16.根據權利要求15的轉基因植物，其中所述植物是Basmati水稻植物。
17.根據權利要求12的轉基因植物，其中所述植物是Basmati水稻植物。
18.包括根據權利要求1的核酸構建體的轉基因植物種子。
19.根據權利要求18的轉基因植物種子，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自雙子葉植物。
20.根據權利要求18的轉基因植物種子，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自擬南芥。
21.根據權利要求18的轉基因植物種子，其中所述光誘導型的啟動子選自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子和葉綠素a/b-結合蛋白啟動子。
22.根據權利要求18的轉基因植物種子，其中所述植物是單子葉植物。
23.根據權利要求18的轉基因植物種子，其中所述植物是水稻。
24.根據權利要求23的轉基因植物種子，其中所述植物是Basmati水稻植物。
25.根據權利要求20的轉基因植物種子，其中所述植物是Basmati水稻植物。
26.一種調節植物株冠結構的方法，所述方法包括提供包括根據權利要求1的核酸構建體的轉基因植物或轉基因植物種子；和使轉基因植物或從轉基因植物種子中長出的植物在有效調節植物株冠結構的條件下生長。
27.根據權利要求26的方法，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自雙子葉植物。
28.根據權利要求26的方法，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自擬南芥。
29.根據權利要求26的方法，其中所述光誘導型的啟動子選自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子和葉綠素a/b-結合蛋白啟動子。
30.根據權利要求26的方法，其中所述植物是單子葉植物。
31.根據權利要求26的方法，其中所述植物是水稻。
32.根據權利要求31的方法，其中所述植物是Basmati水稻植物。
33.根據權利要求28的方法，其中所述植物是Basmati水稻植物。
34.根據權利要求26的方法，其中所述植物是生產谷粒的植物，且調節植物的株冠結構增加飽滿谷粒的數目。
35.一種調節植物種子產量的方法，所述方法包括提供包括根據權利要求1的核酸構建體的轉基因植物或轉基因植物種子，和使轉基因植物或從轉基因植物種子中長出的植物在有效調節植物種子產量的條件下生長。
36.根據權利要求35的方法，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自雙子葉植物。
37.根據權利要求35的方法，其中所述編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子來自擬南芥。
38.根據權利要求35的方法，其中所述光誘導型的啟動子選自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子和葉綠素a/b-結合蛋白啟動子。
39.根據權利要求35的方法，其中所述植物是單子葉植物。
40.根據權利要求35的方法，其中所述植物是水稻。
41.根據權利要求40的方法，其中所述植物是Basmati水稻植物。
42.根據權利要求37的方法，其中所述植物是Basmati水稻植物。
43.根據權利要求35的方法，其中增加所述植物種子產量。
全文摘要
公開了一種分離的核酸構建體，其包括編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子、位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子5’的光誘導型的啟動子，以及位于編碼光不穩定的植物光敏素A的核酸分子3’的終止子區。也公開了調節植物株冠結構(architecture)和調節植物種子產量的方法，其涉及包括根據本發明的分離的核酸構建體的轉基因植物或轉基因植物種子。
文檔編號C12N15/09GK1813067SQ200480018293
公開日2006年8月2日 申請日期2004年4月29日 優先權日2003年4月29日
發明者R·吳, A·J·加格, J·－K·金 申請人:康乃爾研究基金會有限公司