專利名稱：磷酸化酶的制造方法
技術領域：
本發明是關于由磷酸化酶生產菌制造磷酸化酶的方法。
背景技術：
磷酸化酶是在無機磷酸的存在下對基質糖類加磷酸分解進行催化的酶，根據基質糖的種類，已知有麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、麥芽糖磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，海藻糖類磷酸化酶等。各種磷酸化酶類，可作為反應基質的無機磷酸和糖類的定量用酶試劑使用，或者利用反應的可逆性，作為在基質中利用磷酸化糖進行各種配糖物合成等的酶使用。
已知磷酸化酶在明串珠菌(Leuconostoc)屬等許多微生物的菌體內或細胞內被作為酶含有。
為了將磷酸化酶用于上述目的，最好是將酶調制物的純度提高到某種程度，為了得到這樣的酶調制物，培養磷酸化酶生產菌后，需要經過菌體(細胞)回收，菌體洗凈、菌體破碎、酶分回收、精制等復雜的工序(例如，參照專利文獻1～5)。此時，為了破碎菌體，需要添加溶菌酶和螯合劑等，此外，由于絕大部分的菌體成分被溶出，所以加大了為提高磷酸化酶純度的精制工序的負荷。
作為降低這種負荷的方法，已知有利用培養基組成最佳化等，提高磷酸化酶水平的方法(例如，參照專利文獻6～7)。通過使用遺傳重組體，生成高純度的目的磷酸化酶的方法，(例如，參照非專利文獻1，專利文獻3～5)、和簡單的精制方法(例如，參照專利文獻8)等。然而，并沒有變更工序的實質，未必就能滿足要求，專利文獻1日本特開平1-91778號公報專利文獻2日本特開平8-280382號公報專利文獻3日本特開平10-14580號公報專利文獻4日本特開平10-276785號公報專利文獻5日本特開平10-327887號公報專利文獻6日本特開平2-154686號公報專利文獻7日本特開平3-4785號公報專利文獻8日本特開平2002-345458號公報非專利文獻1Kitao等，J.Ferment.Bioeng.，73，179-184(1992)發明內容本發明涉及提供一種既簡單又有效地從磷酸化酶生產菌制造磷酸化酶的方法。
本發明者發現在高濃度磷酸培養基上培養磷酸化酶生產菌時，在培養上清液中以高效率生產磷酸化酶，不進行從菌體內回收酶等操作，就能有效地制造磷酸化酶。
即，本發明提供的磷酸化酶制造方法，其特征在于，在磷酸類或其鹽濃度為50mM以上的培養基中，培養磷酸化酶生產菌，提取培養基中生成的磷酸化酶。
本發明提供一種磷酸化酶類或其鹽濃度為50mM以上的磷酸產生用培養基。
根據本發明，培養磷酸化酶生產菌后，回收培養上清液(去除細胞)、精制，以極簡單的工序既簡單又有效地制造磷酸化酶。
具體實施例方式
作為本發明中使用的磷酸化酶生產菌，是菌體內或細胞內具有磷酸化酶的菌，只要是在一定濃度的磷酸類或其鹽存在下，在培養上清液中產生磷酸化酶就可以，例如有屬于以下屬的細菌，即埃希氏菌(Escherichia)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、克雷伯氏菌(Klebsiella)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、棒桿菌(Corynebacterium)屬、棲熱菌(Thermus)屬、熱球菌(Thermococcus)屬、棲熱孢菌(Thermotoga)屬、明串珠菌(Leuconostoc)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、梭菌(Clostridium)屬、醋桿菌(Acetobacter)屬、芽霉菌(Pullularia)屬、土壤桿菌(Agrobacterium)屬、Synecoccus屬、曲菌(Aspergillus)屬、念珠菌(Monilia)屬、Sclerotinea屬、Chlamydomonas屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、Neiserria屬、腸球菌(Enterococcus)屬、乳球菌(Lactococcus)屬、鄰單胞菌(Plesiomonas)屬、鏈孢菌(Catellatospora)屬、動孢囊菌(Kineosporia)屬、微球菌(Micrococcus)屬、節桿菌(Arthrobacter)屬、短狀桿菌(Brevibacterium)屬、黃桿菌(Flavobacterium)屬、沙雷氏菌(Seratia)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、黃單胞菌(Xanthomonas)屬、熱厭氧菌(Thermoanaerobium)屬、Rhizopus屬、毛殼菌(Chaetomium)屬、Acreomonium屬、Byssochilamys屬、Cercospora屬、Glomerella屬、Humicola屬、Myceliophthora屬、Rhizomucor屬、Rosellinia屬、Sclerotinia屬、Sporidiobolus屬、Sterigmatomyces屬、Thermoascus屬、Thielavia屬、Tyromyces屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、瘤胃球菌(Ruminococcus)屬、纖維弧菌(Cellvibrio)屬。
此類磷酸化酶生產菌，也可以是天然的或通過實施UV照射和化學突變劑，例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG))和甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate(EMS))(C.Guhrie & G.R.Fink，Methods inEnzymology vol.194，pp273-281 Academic Press Inc.等的處理，提高產生磷酸化酶能力的突變株。
其中，優選明串珠菌(Leuconostoc)屬、棒桿菌(Corynebacterium)屬的細菌、在明串珠菌(Leuconostoc)屬中更優選腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、譎詐明串珠菌(Leuconostoc fallax)、檸檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、阿根廷明串珠菌(Leuconostocargetinum)、假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)，在棒桿菌(Corynebacterium)屬中更優選谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、美棒桿菌(Corynebacterium callunae)、霍氏棒桿菌(Corynebacterium hoagii)、Corynebacterium vitaeruminis、多毛棒桿菌(Corynebacterium pilosum)。其中，特別優選腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)KSM-SP1(FERM P-19737)及腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)KSM-SP78(FERM AP-20037(獨立行政法人產業技術總合研究所 專利生物寄托中心( 305-8566日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6)、平成16年4月28日受領))、Corynebacteriumvitaeruminis、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)KSM-MP669(FERM AP-20036(獨立行政法人產業技術總合研究所 專利生物寄托中心( 305-8566日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6)、平成16年4月28日受領)磷酸化酶的制造，是通過將上述磷酸化酶生產菌，在磷酸類或其鹽濃度50mM以上的培養基(磷酸化酶產生用培養基)中培養進行。
作為培養基中添加的磷酸類或其鹽，例如有磷酸、偏磷酸、三聚磷酸、聚磷酸、二磷酸、聚偏磷酸及它們的鹽。作為磷酸類的鹽，優選鈉鹽、鉀鹽。作為特別優選的磷酸類鹽，例如有磷酸一鉀、磷酸二鉀、磷酸一鈉、磷酸二鈉等。更優選將磷酸類和其鹽或多種磷酸類的鹽混合使用培養基中磷酸類或其鹽的濃度，一般從效果考慮，必須在50mM以上，優選50mM～1.5M，更優選50mM～1M，特別優選100mM～1M。在明串珠菌(Leuconostoc)屬的細菌中，優選為400mM～1.2M，在棒桿菌(Corynebacterium)屬中，優選100mM～600mM。
本發明中使用的培養基，只要是能產生磷酸化酶生產菌的就可以，除了上述磷酸和其鹽外，還可使用含有碳源、氮源、金屬礦物類、維生素等的液體培養基等。
作為培養基中添加的糖，有單糖，二糖，低聚糖，多糖。也可以混合這些的兩種以上使用。
作為糖以外的碳源，例如有乙酸鹽等有機鹽。作為氮源。例如有氨、氯化銨、硫酸銨，硝酸銨、碳酸銨、磷酸銨、乙酸銨等無機和有機銨鹽、尿素、胨，肉膏、酵母提取液，酪蛋白水分解物等含有氮有機物，甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸等氨基酸等。作為金屬礦物制類，例如有氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂，硫酸錳，硫酸鋅、硫酸鈣等，它們可單獨使用，或根據需要混合使用。
培養方法是適當調整pH和溫度，形成能能充分培育微生物的條件。培養方式，除了振蕩培養，厭氧培養，靜置培養，利用發酵槽的培養之外，還可使用休止菌體反應和固定化菌體反應。
這樣，在高濃度磷酸培養基中，培養磷酸化酶生產菌，以高收效在培養上清液中生產蓄積磷酸化酶，只要對其提取，就能很容易地獲得目的磷酸化酶。
從培養基中提取磷酸化酶的方法，按照公知的方法進行即可，例如通過以下組合進行，即，分離去除菌體、超濾、鹽折、離子交換、疏水色譜分析、凝膠過濾、干燥等。制作固定化酶時，利用向菌體外產生，可以不需要煩雜的作業。
對于所得的磷酸化酶的活性測定，可使用通常的磷酸化酶活性測定法，例如有Weinhausel(Enzyme Microb.Technol.，17，140-146(1995)的方法。
根據本發明，可直接在菌體外產生磷酸化酶，不必進行菌體破碎等煩雜的作業，就可以得到的酶。進而，向培養基中只添加低分子化合物的磷酸類，所以大大降低了精制工序的負荷，可以很容易地調制出高純度的磷酸化酶制品。
通過向培養液中直接加入二糖、低聚糖、多糖和磷酸類或其鹽等基質，不需要特殊作業就可以產生糖磷酸，進而，利用糖苷配基形成的化合物及糖磷酸與培養液直接作用，不用特別操作也可以得到配糖物。
實施例實施例1利用鏈球菌屬細菌產生磷酸化酶。
將利用MNNG處理(C.Guhrie & G.R.Fink，Methods in EnzymologyVol 194，pp273-281Academic Press Inc.)對腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、JCM9693肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)JCM9695、阿根廷明串珠菌(Leuconostoc argetinum)JCMll052、假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)JCMl1045和腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)JCM9693株進行處理，得到的磷酸化酶高生產突變株腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)KSM-SPl(FERM P-19737)和腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)KSM-SP78(FERM AP-20037)，涂抹在MR瓊脂培養基(Oxoid社制)上，在厭氧條件下，以30℃培養。將一白金線圈的該菌接種到液體培養基上(1％酵母提取液(Difco社制)、1％聚胨(日本制藥制)、0.04％硫酸鎂七水合物、0.02％氯化錳四水合物、0.0002％硫酸鐵四水合物、400、800、1000mM的磷酸緩沖液，5％、10％ 15％的蔗糖)，在30℃靜置培養2天，利用離心分離除去菌體，測定培養上清液的蔗糖磷酸化酶活性。
上清液的蔗糖磷酸化酶活性，將Weinhausel(Enzyme Microb.Technol.，17，140-146(1995)的方法作了部分改變進行的，向96穴微型板上適宜稀釋的20μL培養上清液樣品中，加入180μL酶反應液(200mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、90mM蔗糖、100mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.8)、2mM EDTA、10mM硫酸鎂、2mM NAD、10μM葡萄糖-1，6-二磷酸、1.2unit/ml磷酸葡糖變位酶(來自兔肌肉，Rochediagnostics社制)、1.2unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(來自腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Rochediagnostics社制))，在37℃下測定引起340nm的G1P生成的吸光度上升。1個單位(U)的酶，作為1分鐘內生成1μmol葡萄糖-1-磷酸(G1P)的量，結果如表1所示。
表1菌體外蔗糖磷酸化酶活性(U/L)
由表1可以確認，通過提高培養基中的磷酸濃度，提高了菌體外產生磷酸化酶的量。
實施例2利用棒狀桿菌屬細菌生產磷酸化酶利用MNNG處理，對Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、美棒桿菌(Corynebacterium callunae)IFO15359、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)JCM1321和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)JCM1321進行處理，將得到的磷酸化酶高生產突變株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)KSM-MP669(FERM AP-20036)涂敷在SCD瓊脂培養基(日本制藥株式會社)上，30℃下進行培養。將一白金線圈的該菌接種到液體培養基(0.67％的Yeast Nitrogen Base(Difco社)、50，100，200mM的磷酸緩沖液(pH7)、15％的糊精(Sigma社來自Potato))，30℃下振蕩培養6天。利用離心分離除去菌體，測定培養液上清液的麥芽糊精磷酸化酶活性。
上清液的麥芽糊精磷酸化酶活性，是將Weinhausel(EnzymeMicrob.Technol.，17140-146(1995)的方法作了部分改變進行的，在96穴微型板上，向20μL適宜稀釋的培養上清液加入180μL酶反應液(200mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、2％糊精、100mM Tris-乙酸緩沖液(pH6.8)、2mM EDTA，10mM硫酸鎂、2mM NAD、10μM葡萄糖-1，6-二磷酸、1.2unit/ml磷酸葡萄糖變位酶(來自兔肌肉，Rochediagnostics社制)、1.2unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(來自腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Rochediagnostics社制))，在37℃下測定引起340nmGIP生成的吸光度上升。1個單位(U)酶是1分中內生成1μmol葡萄糖-1-磷酸(GIP)的量。結果如表2所示。
表2菌體外麥芽糊精磷酸化酶活性(U/L)
由表2可以確認，通過提高培養基中的磷酸濃度，提高了菌體外產生的磷酸化酶量。
權利要求
1.一種磷酸化酶的制造方法，其特征在于在磷酸類或其鹽濃度為50mM以上的培養基中，培養磷酸化酶生產菌，提取培養基中生成的磷酸化酶。
2.如權利要求1所述的磷酸化酶制造方法，其特征在于磷酸化酶生產菌是明串珠菌(Leuconostoc)屬或棒桿菌(Corynebacterium)屬的細菌。
3.一種磷酸類或其鹽濃度在50mM以上的磷酸化酶生產用培養基。
全文摘要
本發明提供一種以高純度，且簡便地從磷酸化酶生產菌制造磷酸化酶的方法。即，本發明的磷酸化酶制造方法是在磷酸類或其鹽濃度為50mM以上的培養基中培養磷酸化酶生產菌，提取培養基中生成的磷酸化酶的制造方法。
文檔編號C12R1/15GK1802431SQ200480015729
公開日2006年7月12日 申請日期2004年6月4日 優先權日2003年6月6日
發明者五十嵐一曉, 瀧澤修一, 檜垣紀彥, 人見潤 申請人:花王株式會社