Sars病毒抗原的細胞表面表達載體和用該載體轉化的微生物的制作方法

專利名稱：Sars病毒抗原的細胞表面表達載體和用該載體轉化的微生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種在微生物表面表達SARS抗原的載體，由該載體轉化的微生物，以及用于預防SARS的疫苗，該疫苗包括轉化的微生物或其提取物以及純化的物質。更具體而言，本發明涉及一種表面表達載體，其包括一種編碼誘導SARS的冠狀病毒的抗原蛋白的基因，以及一種或兩種或多種編碼微生物表面錨定序列(anchoring motif)的聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，還涉及被該載體轉化的微生物以及包括該轉化微生物作為有效成分的SARS疫苗。
背景技術：
嚴重急性呼吸性綜合征(SARS)是一種新型的流行性疾病，自從2002年11月在中國廣東省首次開始爆發，其已遍布全球，包括香港、新加坡、加拿大(多倫多)等地區。該流行病表現出呼吸性癥狀，如發燒38℃或更高、咳嗽、呼吸困難、非典型性肺炎。SARS的作用物就是變異性致病冠狀病毒。
通常，冠狀病毒家族成員是具有(+)RNA的很大的RNA病毒。染色體由約29,000至31,000堿基對組成，顯微鏡下可觀察到該病毒呈冠狀。能引起人類上呼吸道疾病，引起動物的呼吸系統、肝臟、神經和腸道疾病。自然界中存在三組冠狀病毒，其中組I和組II感染哺乳動物，組III感染鳥類。
已知的冠狀病毒有時會引起免疫體系能力較弱的人類發生與肺部有關的疾病，或引起動物如狗、貓、豬、鼠、鳥等的嚴重疾病。冠狀病毒突變率很高，重組率高達約25％。推測這些特點導致原始冠狀病毒發生變異，而形成新型的突變的冠狀病毒(SARS冠狀病毒)，該病毒從動物傳播至人類。
根據世界衛生組織(WHO)的統計，自2002年11月起，31個國家中有7,447名SARS疑似患者，其中有551名死亡。2003年的SARS感染危險區域包括中國的北京、廣東、香港、內蒙古、山西和天津，新加坡、加拿大的多倫多、臺灣、蒙古的烏蘭巴托、菲律賓等。然而，還有傳播到全世界的風險。
自從2002開始爆發以來，關于SARS冠狀病毒，德國熱帶醫學的研究所首先對SARS病毒的核苷酸序列進行破譯。該研究小組通過PCR(聚合酶鏈式反應)破譯了一部分基因的核苷酸序列。破譯結果提供給了一家德國生物工程公司Artus GmbH，用來開發檢測SARS病毒感染的試劑盒。該試劑盒通過將SARS疑似患者體內的病毒基因擴增來檢測出SARS的感染。
之后，到目前SARS病毒的全基因組已被破譯，已完全分析了超過12個分離出的毒株的序列。首先被分離出的Urbani株[取自死于SARS的WHO代表團醫生的名字，SARS-Cov株(Rota，PA，Science 1085952，2003；GenBankAccession AY278741)]的全部序列是美國CDC研究小組破譯的。加拿大大不列顛哥倫比亞癌癥研究中心(Canada British Columbia Cancer search center)小組分析了2003年4月12日從加拿大多倫多一名患者體內分離出的SARSTor2病毒株的全部序列(Marra，M.A.，Science 1085953，2003；GenBankAccession 274119)。
盡管這兩個研究小組分析了不同地區SARS感染者體內分離出的冠狀病毒，但這兩種病毒顯示出的區別僅是15個堿基對的不同。這暗示了SARS是從同一病毒被誘導產生的。還有，根據SARS冠狀病毒的基因分析結果，可以看出SARS冠狀病毒的蛋白質組成與現存冠狀病毒的蛋白質組成相同，但基因組以及基因組編碼的氨基酸同源性卻很低。鼠肝炎病毒和火雞支氣管病毒都與SARS冠狀病毒有相似性。但是，分子分類學分析提供了SARS冠狀病毒與其它冠狀病毒的相關性，結果說明SARS冠狀病毒與現存的組不同。
目前，SARS冠狀病毒的鑒定始于PCR，抗體檢測的陽性結果是由ELISA或IFA所確定的。病毒的分離是通過對PCR鑒定的患者進行細胞培養檢測，以確定SARS冠狀病毒的感染。
目前還沒有治療SARS的基本方法，只有輔助治療。對SARS冠狀病毒這種新的流行病的作用物的研究才剛剛起步，還沒有開發出預防SARS的疫苗。世界各地已開始了開發預防SARS的疫苗的多方面研究。
在微生物的細胞表面上附著并表達所需蛋白的技術被稱作細胞表面展示技術(cell surface display technology)。細胞表面展示技術采用微生物如細菌或酵母菌的表面蛋白作為表面錨定序列而在表面上表達外源蛋白，這種技術的應用范圍包括重組活疫苗的制備、肽/抗體庫的構建以及篩選、全細胞的吸附、全細胞的生物轉化催化劑等。該技術的應用范圍由細胞表面上表達的蛋白質所決定。因此，細胞表面展示技術具有巨大的工業應用潛力。
對于連續的細胞表面展示技術，表面錨定序列是至關重要的。本技術的核心是選擇并開發出能在細胞表面有效表達外源蛋白的結構。
因此，為了選擇表面錨定序列，應考慮以下特征(1)它應該具有分泌信號來幫助外源蛋白通過細胞內膜，從而使外源蛋白能轉運至細胞表面上。(2)它應具有靶信號來幫助外源蛋白穩定地固定到細胞外膜的表面上。(3)它可在細胞表面上大量地被表達，而不影響細胞的生長。(4)它與蛋白的大小無關，且能表達外源蛋白而不會改變蛋白的三維結構。然而，還沒有開發出滿足上述條件的表面錨定序列。
已知的和目前使用的表面錨定序列通常分為四種類型的細胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、表面器官蛋白如鞭毛蛋白。在革蘭氏陰性菌中，已經使用了細胞外膜蛋白，諸如LamB、PhoE(Charbit et al.，J.Immunol.，1391658，1987；Agterberg et al.，Vaccine，885，1990)、OmpA等。采用的脂蛋白有諸如TraT(Felici et al.，J.Mol.Biol.，222301，1991)、PAL(與脂蛋白有關的肽聚糖)(Fuchsetal.，Bio/Technology，91369，1991)以及Lpp(Francisco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713，1992)。作為表面錨定序列來表達外源蛋白的有黏著在1型菌毛上的菌毛蛋白(fimbriae protein)，如FimA或FimH(Hedegaard etal.，Gene，85115，1989)，以及菌毛蛋白(pili protein)如PapA pilu亞單位。此外，還有報道能作為表面錨定序列的包括冰核蛋白(ice nucleation protein)(Jungetal.，Nat.Biotechnol.，16576，1998；Jung et al.，Enzyme Microb.Technol.，22348，1998；Lee etal.，Nat.Biotechnol.，18645，2000)，Klebsiela oxytoca的支鏈淀粉酶(Komacker et al.，Mol.Microl.，41101，1990)、Neiseria的IgA蛋白酶(Klauser et al.，EMBO J.，91991，1990)、附著在大腸桿菌上的AIDA-1、志賀菌屬的VirG蛋白，以及Lpp和OmpA的融合蛋白。據報道，在使用革蘭氏陽性菌的情況下，可利用金黃色葡萄球菌中的蛋白A和FnBPB蛋白為表面錨定序列、利用乳酸菌的表面殼蛋白進行表面表達、利用革蘭氏陽性菌的表面蛋白如化膿性葡萄球菌遺傳因子(Staphylococcus pyogenes)的M6蛋白(Medaglini，D et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，926868，1995)、炭疽熱細菌的S-層蛋白EA1、枯草芽孢桿菌CotB等作為錨定序列能有效表達瘧疾抗原。
本發明人開發了一種能在微生物細胞表面上有效表達外源蛋白的新型載體，該載體使用桿菌屬菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶復合物基因(pgsBCA)作為新型表面錨定序列，還開發了一種在被該載體轉化的微生物表面上大量表達外源蛋白的方法(韓國專利申請號10-2001-48373)。
研究人員已開始從事利用上述表面錨定序列通過基因工程方法在適于進行大量生產的細菌體內穩定表達致病性抗原或抗原決定部位的研究。尤其是，已有報道，與減毒致病菌或病毒疫苗相比，口服表面上表達外源免疫原的非致病活菌后，能誘導更持久、更強的免疫應答。免疫應答的誘導歸功于細菌表面結構的佐劑作用，從而增加了表面上表達的外源蛋白的抗原性以及活體對活菌產生的免疫應答。利用該表面表達體系開發非致病性細菌的重組活疫苗已引起了人們的注意。
因此，本發明人成功地通過選擇基因并對非致病性微生物表面上的蛋白質分析，來大量表達SARS冠狀病毒抗原，其中，食品安全得以保障，如通過源于桿菌菌株的聚-γ-谷氨酸合成復合物基因(pgsBCA)作為表面錨定序列而轉化的乳酸菌，并開發了經濟且穩定的疫苗，通過口服微生物來誘導血液中產生SARS冠狀病毒的抗體和粘膜免疫。

發明內容
因此，本發明的一個目的在于提供一種通過利用微生物表面表達體系來表達SARS冠狀病毒抗原的載體，以及被載體轉化的微生物。
本發明的另一個目的在于提供一種在表面表達SARS冠狀病毒抗原的轉化的微生物，用于預防SARS的疫苗，該疫苗包括從微生物中提取的SARS冠狀病毒抗原或從微生物中純化的SARS冠狀病毒抗原作為有效成分。
為了實現上述目的，本發明提供的表面表達載體包括一種或兩種或多種編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的pgsB，pgsC和pgsA基因以及一種編碼SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的基因。
根據本發明，任何編碼SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白的基因都可用作表面抗原蛋白基因。可單獨使用SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白基因或其兩種或多種復合物。編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因優選包括pgsA。刺突抗原蛋白可以是SARS SA，SARS SB，SARS SC，SARS SD或SARS SBC，核殼抗原蛋白可以是SARS NA，SARS NB或SARS N。
本發明提供了一種被表達載體轉化的微生物以及制備SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的方法，該方法包括培養所述微生物。
本發明適用的微生物可以是對生物體無毒的任何微生物或減毒微生物。例如，所述微生物適宜地選自革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌(E.coli)，傷寒桿菌(Salmonella typhi)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，志賀菌(Shigella)等，或革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和鏈球菌(Streptococcus)等。尤其優選的是可食用微生物，如乳酸菌。
本發明還提供了一種用于預防SARS的疫苗，其包括表面上表達抗原蛋白的微生物、從已破碎的該微生物細胞膜組成中提取的粗提物、或從微生物中純化的抗原蛋白作為有效成分。
本發明的疫苗可以作為藥物應用以預防由SARS冠狀病毒誘導產生的SARS(嚴重急性呼吸綜合征)。
本發明的疫苗可口服服用，或存在于食品中，或皮下或腹膜內注射或經鼻內途徑施用。
至今，SARS冠狀病毒的感染已知由傳染性飛沫感染呼吸器官所導致，推測在呼吸器官的粘膜表面發生。因此，通過粘膜免疫來預防感染是非常重要的。由于在表面上表達SARS冠狀病毒抗原的微生物能更有效地在粘膜上誘導抗體的形成，因此通過口服或鼻內途徑施用轉化的微生物得到的疫苗比胃腸外施用的疫苗在預防SARS冠狀病毒方面更有效。


通過結合下述附圖進行詳細說明，從而對本發明的進一步目的以及優點進行更充分的了解。
圖1為根據Kyte-Doolittle方法的親水圖、Jameson-wolf方法的抗原性指數和Emini方法的表面可能性圖所顯示出的豬的傳染性胃腸炎病毒的4種抗原位點(A，B，C，D)與SARS冠狀病毒的刺突蛋白之間的關系。
圖2為根據Kyte-Doolittle方法的親水圖，Jameson-wolf方法的抗原性指數和Emini方法的表面可能性圖所顯示出的豬的傳染性胃腸炎病毒的核殼蛋白與SARS冠狀病毒的核殼蛋白之間的關系。
圖3A是本發明的包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌為宿主的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA的基因圖，圖3B是本發明的pHCE2LBpgsA-SARS SC的基因圖，圖3C是本發明的pHCE2LBpgsA-SARS SBC的基因圖。
圖4A是本發明的載體pHCE2LBpgsA-SARS NB的基因圖，圖4B是本發明的pHCE2LBpgsA-SARS N的基因圖。
圖5A、5B和5C通過Western免疫印跡顯示pgsA的特異性抗體與融合蛋白間的特異性結合，來鑒定乳酸菌中與細胞外膜蛋白pgsA融合的SARSSA、SARS SC和SARS SBC抗原的表達。
圖6A和6B采用乳酸菌細胞的蛋白片段作為pgsA的特異性抗體進行Western免疫印跡，來識別與乳酸菌中細胞外膜蛋白pgsA融合的SARS SA和SARS SBC抗原的表面表達，圖6C為通過FACS掃描檢測乳酸菌中的SARS SBC抗原的表面表達。
圖7A和7B采用乳酸菌細胞的蛋白片段作為pgsA的特異性抗體進行Western免疫印跡，來識別與乳酸菌中細胞外膜蛋白pgsA融合的SARS NB和SARS N抗原的表面表達。
圖8為本發明的分別用進行表面表達的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA(酶聯免疫吸附檢測)鑒定出該轉化菌株具有抗原部分的表面表達，該轉化菌株經口服和鼻內給藥后，在小鼠血清中所測得的SARS SA和SARS SC抗原的IgG抗體值。
圖9為本發明的分別用進行表面表達的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA鑒定出該轉化菌株具有抗原部分的表面表達，該轉化菌株經口服和鼻內給藥后，在小鼠的洗腸液和支氣管和肺泡的洗液中所測得的SARS SA和SARS SC抗原的IgA抗體值。
圖10為本發明的分別用進行表面表達的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA鑒定出該轉化菌株具有抗原部分的表面表達，該轉化菌株經口服和鼻內給藥后，所測定的小鼠血清中SARS NB抗原部分的IgG抗體值。
圖11為本發明的分別用進行表面表達的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA鑒定出該轉化菌株具有抗原部分的表面表達，該轉化菌株經口服和鼻內給藥后，在小鼠的洗腸液和支氣管和肺泡的洗液中所測得的SARS NB抗原的IgA抗體值。
最佳實施方式通過下述實施例進一步詳細說明本發明。對于本領與普通技術人員而言，顯而易見，這些實施例僅用于對本發明進行具體解釋說明，而本發明的范圍并不局限于此。
尤其是，盡管下述實施例采用了SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點基因以及核殼蛋白的抗原位點基因，但任何抗原蛋白基因都可單獨使用或作為兩種或多種的復合物使用。
在下述實施例中，所采用的與聚-γ-谷氨酸的合成有關的細胞外膜蛋白的基因pgsBCA是從枯草芽孢桿菌chungkookjang變種(KCTC 0697BP)所獲得。然而，根據本發明，基因包括利用pgsBCA制備的載體，其中pgsBCA是從產生poly-γ-谷氨酸的所有桿菌屬菌株或被這些載體轉化的微生物中獲得的。例如，采用來源于其它菌株且與枯草芽孢桿菌chungkookjang變種中存在的pgsBCA基因序列有80％或更高同源性的pgsBCA基因制備用于疫苗的載體，以及載體使用的技術方案也包括在本發明的范圍之內。
以下實施例中，僅基因pgsBCA的pgsA用于構建表面表達載體。然而，可以從間接實施例推斷出，使用部分基因pgsBCA或者全部基因pgsBCA來構建疫苗用載體都包括在本發明的范圍之內。
在以下實施例中，革蘭氏陰性菌傷寒桿菌和革蘭氏陽性菌乳酸菌被用作載體的宿主。然而，任何一種通過本發明方法轉化的革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌都能獲得相同結果，這對于本領與技術人員而言是顯而易見的。
此外，在下述實施例中，僅用本發明的疫苗用載體所轉化的微生物作為活疫苗來施用到活體中。然而，根據與疫苗技術領域相關的知識，當將從微生物提取的粗提物表達蛋白(SARS冠狀病毒的抗原蛋白)或純化的表達蛋白用于活體中，很自然能獲得相同或相近的結果。
實施例1SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點基因的合成SARS冠狀病毒的刺突蛋白是一種由1256個氨基酸構成的糖蛋白。在其它已進行大量檢測的冠狀病毒中，刺突蛋白大多嵌入到覆蓋在病毒顆粒表面上的包膜蛋白中，而具有暴露在外面的結構。暴露位點和抗原位點已作為誘導病毒感染與預防感染的疫苗的靶抗原而被深入地研究。
因此，為了從SARS冠狀病毒的刺突蛋白的1256個氨基酸中選擇出能表現抗原性的位點，對其它已經研究了抗原性并合成了豬傳染性胃腸炎(TGE)冠狀病毒的刺突蛋白進行蛋白比較分析和結構比較分析，從而選擇抗原位點。具體而言，已知豬傳染性胃腸炎病毒的刺突蛋白的抗原位點為4個位點(A，B，C，D)(Enjuanes，L.，Virology，183225，1991)。根據Kyte-Doolittle方法的親水圖，Jameson-wolf方法的抗原性指數和Emini方法的表面可能性圖，分析這些位點和SARS冠狀病毒的刺突蛋白的關系，從SARS冠狀病毒Tor2分離物的刺突蛋白的序列中選擇出SARS SA，SARS SB，SARS SC和SARS SD(圖1)。
首先，基于SARS冠狀病毒Tor2分離物的刺突蛋白的序列(21492-25259個堿基對，1255個氨基酸)，其中全部序列都已被鑒定出，2至114氨基酸位點有望成為所選擇的抗原位點，稱其為SARS SA，選擇的375至470氨基酸，稱其為SARS SB，選擇的510至596氨基酸，稱其為SARS SC，選擇的1117至1197氨基酸，稱其為SARS SD。在這些抗原位點中，對SARS SA和SARS SC位點進行了合成。
為了合成SARS SA的113個氨基酸長度對應的基因，用SEQ ID NOs1至8為引物進行PCR，得到含有339bp的擴增的SARS SA基因。
SEQ ID NO15′-ggatcctttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccg-3′SEQ ID NO25′-tgagtgtaattaggagcttgaacatcatcaaaagtggtacaacggtcaaggtc-3′SEQ ID NO35′-aattacactcaacatacttcatctatgcgtggggtttactatcctgatgaaatttttc-3′
SEQ ID NO45′-aaaatggaagaaataaatcctgagttaaataaagagtgtctgaacgaaaaattt-3′SEQ ID NO55′-cttccattttattctaatgttactgggtttcatactattaatcatacgtttggcaac-3′SEQ ID NO65′-ggcagcaaaataaataccatccttaaaaggaatgacagggttgccaaacgtatg-5′SEQ ID NO75′-atttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttgg-3′SEQ ID NO85′-ggtaccaagcttattacacagactgtgacttgttgttcatggtagaaccaaaaaccc-3′為了合成SARS SC的87個氨基酸長度所對應的基因，用SEQ ID NOs9至14位引物進行PCR，得到含261bp的擴增的SARS SC基因。
SEQ ID NO95′-ggatccgtttgtggtccaaaattatctactgaccttattaagaaccagtgtgtcaat-3′SEQ ID NO105′-gaagaaggagttaacacaccagtaccagtgagaccattaaaattaaaattgacacact-3′SEQ ID NO115′-aactccttcttcaaagcgttttcaaccatttcaacaatttggccgtgatgtttctga-3′SEQ ID NO125′-ctaaaatttcagatgttttaggatcacgaacagaatcagtgaaatcagaaacat-3′SEQ ID NO135′-ctgaaattttagacatttcaccttgtgcttttgggggtgtaagtgtaattaca-3′SEQ ID NO145′-ggtaccaagcttattaaacagcaacttcagatgaagcatttgtaccaggtgtaattac-3′此外，通過合成獲得抗原位點基因，采用來自加拿大邁克爾史密斯基因學中心(Canada′s Michael Smith Genome Science Center)的SARS刺突cDNA克隆體(SARS冠狀病毒TOR2)為模板，以SEQ ID NOs15和16為引物，通過PCR擴增得到編碼264至596氨基酸的含966bp的基因，將其命名為SARSSBC[該基因包括能產生中和抗體的關鍵位點(PNAS，1012536，2004)]。
SEQ ID NO15(SBC正義)5′-cgcggatccctcaagtatgatgaaaat-3′SEQ ID NO16(SBC反義)5′-cggggtaccttaaacagcaacttcaga-3′實施例2SARS冠狀病毒的核殼蛋白的抗原位點基因的合成SARS冠狀病毒的核殼蛋白是一種由422個氨基酸構成的蛋白。據報道，大多數其它冠狀病毒的核殼蛋白都可作為抗原。這些抗原位點已經被深入研究，以用作預防冠狀病毒感染的疫苗的靶向抗原。
因此，通過與豬傳染性胃腸炎(TGE)的冠狀病毒的核殼蛋白進行蛋白比較分析，選擇SARS冠狀病毒的核殼蛋白的氨基酸中能表現出抗原性的位點，并進行合成。
具體而言，根據Kyte-Doolittle方法的親水圖，Jameson-wolf方法的抗原性指數和Emini方法的表面可能性圖，分析豬傳染性胃腸炎病毒的核殼蛋白和SARS冠狀病毒的核殼蛋白之間的關系，從SARS冠狀病毒Tor2分離物的核殼蛋白的序列中選擇出SARS NA和SARS NB(圖2)。
首先，基于SARS冠狀病毒Tor2分離物的核殼蛋白序列(28120-29388個堿基對，422個氨基酸)，其中全部序列都已被鑒定出，2至157氨基酸位點有望成為所選擇的抗原位點，稱其為SARS NA，選擇的163至305氨基酸位點，稱其為SARS NB。本發明合成了SARS NB位點的基因。
為了合成SARS NB的143個氨基酸長度所對應的基因，用SEQ IDNOs17至26為引物進行PCR，得到含有429bp的擴增的SARS NB基因。
SEQ ID NO175′-ggatcccctcaaggtacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggtagccgtgg-3′SEQ ID NO185′-accacgactacgtgatgaagaacgagaagaggcttgactgccgccacggctacc-3′SEQ ID NO195′-cacgtagtcgtggtaattcacgtaattcaactcctggcagcagtcgtggtaat-3′SEQ ID NO205′-gcgagggcagtttcaccaccaccgctagccatacgagcaggagaattaccacga-3′SEQ ID NO215′-gaaactgccctcgcacttttgctgcttgaccgtttgaaccagcttgagagcaa-3′SEQ ID NO225′-tagtgacagtttgaccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaa-3′SEQ ID NO235′-caaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgtcaaaaacgt-3′SEQ ID NO245′-ggaccacgacgcccaaatgcttgagtgacgttgtactgttttgtggcagtacgtttttg-3′SEQ ID NO255′-gggcgtcgtggtccagaacaaacccaaggtaatttcggggaccaagaccttatccgt-3′SEQ ID NO265′-ggtaccaagcttattaaatttgcggccaatgtttgtaatcagtaccttgacggataagg-3′此外，通過合成獲得抗原位點基因，采用來自加拿大邁克爾史密斯基因學中心的SARS核殼cDNA克隆體(SARS冠狀病毒TOR2)為模板，以SEQ IDNOs27和28為引物，通過PCR擴增得到編碼2至305位氨基酸的912bp的基因，將其命名為SARS N。
SEQ ID NO27(N sense)5′-cgcggatcctctgataatggtccgcaa-3′SEQ ID NO28(N anti-sense)5′-cggggtaccttaaatttgcggccaatgttt-3′實施例3表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC的構建以革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌為宿主，利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構建能表面表達SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點SARS SA和SC的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC。
首先，用BamHI和KpnI消化pHCE2LBpgsA-HPVL1(KCTC 10349BP)，以將SARS冠狀病毒的刺突蛋白中的抗原位點SARS SA和SARS SC導入到能在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的宿主中表達人乳突瘤病毒的L1抗原的表面表達載體上(一種載體，其含有高表達啟動子HCE啟動子、參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白的基因(pgsBCA)中的pgsA，以及常用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的載體pAT中的HPV L1。)。
用限制酶BamHI和KpnI消化實施例1中合成的SARS SA和SARS SC抗原基因，然后連接到已制備的表面表達載體pHCE2LBpgsA上的參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白的基因pgsA的C末端上，根據翻譯密碼子制備載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC(圖3A和3B)。用制備得到的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC轉化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC質粒的存在。
實施例4表面表達載體pHCE2LBpgsASARS SBC的構建利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構建能表面表達SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點SARS SBC的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SBC。
首先，按照實施例3中的方法，制備表面表達載體pHCE2LBpgsA。根據實施例1所描述的方法，以SARS冠狀病毒的SARS刺突cDNA克隆體為模板，通過PCR擴增編碼264-596氨基酸位點的基因，得到含996bp的SARSSBC基因。然后將SARS SBC基因嵌入到表面表達載體pHCE2LBpgsA中，制備pHCE2LBpgsA-SARS SBC(圖3C)。用制備的pHCE2LBpgsA-SARSSBC轉化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS SBC質粒的存在。
實施例5表面表達載體pHCE2LBpgsASARS NB的構建利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構建能表面表達SARS冠狀病毒的核殼蛋白的抗原位點SARS NB的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS NB。
首先，按照實施例3中的方法，制備表面表達載體pHCE2LBpgsA。用限制酶BamHI和KpnI消化實施例2中合成的SARS NB抗原基因，然后連接到已制備的表面表達載體pHCE2LBpgsA上的參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白的基因pgsA的C末端上，根據翻譯密碼子制備載體pHCE2LBpgsA-SARS NB(圖4A)。再用制備得到的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS NB轉化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS NB質粒的存在。
實施例6表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS N的構建利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構建能表面表達SARS冠狀病毒的核殼蛋白的抗原位點SARS N的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS N。
首先，按照實施例3中的方法，制備表面表達載體pHCE2LBpgsA。根據實施例2所描述的方法，以SARS冠狀病毒的SARS核殼cDNA克隆體為模板，通過PCR擴增編碼2-305氨基酸位點的基因，得到含912bp的SARS N基因。然后將SARS N基因嵌入到表面表達載體pHCE2LBpgsA上，制備pHCE2LBpgsA-SARS N(圖4B)。用制備的pHCE2LBpgsA-SARS N轉化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS N質粒的存在。
實施例7乳酸菌上的SARS病毒刺突抗原蛋白的表面表達的確定用表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉化乳酸菌，檢測各抗原蛋白的表達。用pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉化酪乳酸桿菌，轉化的菌株在MRS培養基(乳酸菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中培養至靜止期，37℃下進行擴增，誘導與基因pgsA合成的聚-γ-谷氨酸的C末端融合的SARS病毒刺突抗原的抗原位點的表達。
通過Western免疫印跡法，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和pgsA的特異性抗體檢測各刺突抗原的表達。對已被誘導表達的酪乳酸桿菌的全細胞進行變性，得到相同細胞濃度的蛋白來制備樣本。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析這些蛋白，并將分離的蛋白轉移至PVDF膜(聚二氟偏二乙烯膜，Bio-Rad)上。將其上帶有蛋白的PVDF膜放在封閉緩沖液(50mM TrisHCl，5％脫脂乳，pH 8.0)中，振搖1個小時進行封閉，與pgsA的兔源多克隆一級抗體反應12個小時，其中該抗體已用封閉緩沖液稀釋1000倍。
反應結束后，用緩沖液清洗膜，再與兔的結合生物素的二級抗體反應4小時，其中該二級抗體已用封閉緩沖液稀釋了1000倍。反應結束后，用緩沖液清洗膜，再與抗生物素蛋白-生物素試劑反應1個小時，然后再清洗。用H2O2和DAB溶液處理清洗后的膜，將其用作底物，用著色劑確定pgsA的特異性抗體和融合蛋白之間的特異性結合(圖5)。圖5A中，泳道1是未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2，3和4是被pHCE2LBpgsA-SARS SA轉化的酪乳酸桿菌。圖5B中，泳道1是未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2，3，4，5和6是被pHCE2LBpgsA-SARS SC/轉化的酪乳酸桿菌。圖5C中，泳道1是未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2是被pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉化的酪乳酸桿菌。
如圖5所示，在所有乳酸菌的細胞中檢測到特異性融合蛋白[約54kDa的pgsA-SARS SA(圖5A)，約51kDa的pgsA-SARS SC(圖5B)和約78kDa的pgsA-SARS SBC(圖5C)]。
為了確定經pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARSSBC表面表達載體所轉化的乳酸菌的表面上是否與pgsA一起表達了各抗原蛋白，通過超高速離心機將各載體轉化的乳酸菌破碎成細胞壁和細胞質，通過Western blot法，使用pgsA的特異性抗體檢測各融合蛋白的位置。
具體而言，收集由上述方法誘導融合蛋白質表面表達的乳酸菌，配置成與未轉化的乳酸菌相同的細胞濃度。用TES緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)清洗細胞數次，將細胞懸浮于含5mg/ml溶菌酶、1mM PMSF和1mM EDTA的蒸餾水中，在-60℃下冷凍，室溫下解凍幾次，用DNase(0.5mg/mQ)和RNase(0.5mg/m)處理，然后進行超聲處理使細胞破碎。然后，在4℃、10,000Xg下對細胞溶解物離心20分鐘，使未溶解的乳酸菌細胞(顆粒；全細胞部分)和細胞碎片(上清液)分離開。在4℃、21,000Xg下對分離出的細胞碎片離心1個小時，得到上清液(溶解部分)，上清液中含有乳酸菌和顆粒的細胞質蛋白。所得顆粒懸浮于含1％SDS的TE溶液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH 7.4)中，得到乳酸菌的細胞壁蛋白質(細胞壁部分)。
利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和pgsA抗原的抗體，對上述各部分進行Western免疫印跡分析，以確定各乳酸菌部分中與細胞壁上pgsA融合的SARS病毒的刺突抗原(圖6)。在圖6A中，泳道1為未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS SA轉化的酪乳酸桿菌的全細胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS SA轉化的菌株的溶解部分和細胞壁部分。在圖6B中，泳道1為未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉化的酪乳酸桿菌的全細胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉化的菌株的溶解部分和細胞壁部分。
如圖6所示，在乳酸菌的全細胞和細胞壁部分識別出了與pgsA融合的約54kDa的SARS SA蛋白以及與pgsA融合的約78kDa的SARS SBC蛋白。從這些結果可以看出，與pgsA融合的各個SARS抗原蛋白被表達并被pgsA遷移到乳酸菌表面上。
通過熒光激活細胞分選(FACS)流式細胞術可以鑒定出，SARS病毒的刺突抗原的抗原部分通過與聚-γ-谷氨酸合成蛋白pgsA的C末端融合，而在乳酸菌的表面上表達。
進行免疫熒光染色，收集相同細胞濃度的誘導表達的乳酸菌。用緩沖液(PBS緩沖液，pH 7.4)洗滌細胞數次，再將細胞懸浮于含有1％牛血清白蛋白的1ml緩沖液中，與鼠源的SARS病毒刺突抗原的多克隆一級抗體在4℃反應12個小時，其中該抗體被稀釋1000倍。反應完成后，用緩沖液清洗細胞數次，將細胞懸浮于含有1％的牛血清白蛋白的0.1ml緩沖液中，與結合生物素的二級抗體在4℃反應3個小時，其中該抗體被稀釋1000倍。反應完成后，用緩沖液清洗細胞數次，將細胞懸浮于含有1％的牛血清白蛋白的0.1ml緩沖液中，與生物素特異性的鏈霉親和素-R-藻紅蛋白染色試劑結合，其中該染色試劑被稀釋1000倍。
反應完成后，清洗乳酸菌數次，用熒光激活細胞分選(FACS)流式細胞術進行檢測。可以看出，與未轉化的乳酸菌不同，SARS病毒的SBC刺突抗原蛋白在乳酸菌表面上被表達(圖6C)。在圖6C中，灰色部分源于未轉化的酪乳酸桿菌，而白色部分源于pHCE2LBpgsA-SARS SBC/轉化的酪乳酸桿菌。如圖6C所示，可清晰地看出，在由pHCE2LBpgsA-SARS SBC載體轉化的乳酸菌上，表面表達出了SBC刺突抗原蛋白，而在未轉化的酪乳酸桿菌中并未觀察到熒光表達。
實施例8乳酸菌上的SARS病毒核殼抗原蛋白的表面表達的確定用表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N轉化乳酸菌，并檢測各抗原蛋白的表達。
用pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N分別轉化酪乳酸桿菌，轉化的菌株在MRS培養基(乳酸菌MRS，Becton Dickinson andCompany Sparks，USA)中培養至靜止期，37℃下進行擴增，誘導分別與基因pgsA合成的聚-γ-谷氨酸的C末端融合的SARS病毒核殼抗原的抗原位點的表達。
為了確定經pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N表面表達載體所轉化的乳酸菌的表面上是否與pgsA一起表達了各抗原蛋白，用實施例7相同的方法，通過超高速離心機將各載體轉化的乳酸菌破碎成細胞壁和細胞質，通過Western blot法，使用pgsA的特異性抗體檢測各融合蛋白的位置。
結果是，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和pgsA抗原的抗體，對上述各部分進行Western免疫印跡分析，以確定各乳酸菌部分存在著與細胞壁上pgsA融合的SARS病毒的核殼抗原(圖7)。在圖7A中，泳道1為未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS NB轉化的酪乳酸桿菌的全細胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS NB轉化的菌株的溶解部分和細胞壁部分。在圖7B中，泳道1為未轉化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS N轉化的酪乳酸桿菌的全細胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS N轉化的菌株的溶解部分和細胞壁部分。
如圖7所示，從乳酸菌的全細胞和細胞壁部分中識別出了與pgsA融合的約57kDa的SARS NB蛋白以及與pgsA融合的約75kDa的SARS N蛋白。從這些結果可以看出，表達了與pgsA融合的各個SARS抗原蛋白，并且被pgsA遷移到了乳酸菌表面上。
實施例9具有表面表達SARS病毒的刺突抗原和核殼抗原蛋白的乳酸菌疫苗效果的分析用前述實施例中制備出的表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB轉化革蘭氏陽性菌酪乳酸桿菌，誘導酪乳酸桿菌表面上的抗原的表達。用小鼠模型檢測與涉及聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白pgsA相融合的SARS病毒刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的抗原性。
具體而言，根據本發明，用表面表達載體pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB轉化酪乳酸桿菌。收集細胞，得到相同的細胞濃度，用緩沖液(PBS緩沖液，pH 7.4)清洗細胞數次。給4-6周BALB/c小鼠每日3次隔日口服5X109具有表面表達的抗原的乳酸菌，一周后隔日服用每日3次，兩周后隔日服用每日3次，4周后隔日服用每日3次。給小鼠每日3次隔日通過鼻內給予1×109具有表面表達的抗原的乳酸菌，一周后隔日每日3次給藥，兩周后每兩日給藥每日2次，4周后每兩日給藥每日2次。口服和鼻內給藥后，每兩周取各小鼠的血清①，用ELISA檢測血清中的刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的IgG抗體值，并檢測②清洗各小鼠腸道的懸浮液和清洗各小鼠支氣管和肺泡的懸浮液中的刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的IgA抗體值。
每組分有10只BALB/c小鼠(4-6周)。將分別表達SARS SA和SARS SC的乳酸菌的混合物分為一組，表達SARS NB的乳酸菌分為一組，分別表達SARS SA、SARS SC和SARS NB的乳酸菌混合物分為一組。將這三組分成口服給藥組和鼻內給藥組，包括對照組共8個組。
圖8示出小鼠血清中SARS病毒的刺突抗原蛋白SARS SA和SARS SC抗原的IgG抗體值。圖9是在清洗小鼠腸道的懸浮液和清洗小鼠支氣管和肺泡的懸浮液中，用ELISA檢測到的刺突抗原蛋白SARS SA和SARS SC抗原的IgA抗體值，其中A是口服組的IgA抗體值，B是鼻內給藥組的IgA抗體值。
圖10示出小鼠血清中SARS病毒的核殼抗原蛋白SARS NB抗原的IgG抗體值。圖11是在清洗小鼠腸道的懸浮液和清洗小鼠支氣管和肺泡的懸浮液中，用ELISA檢測到的SARS病毒核殼抗原蛋白SARS NB抗原的IgA抗體值，其中A是口服組的IgA抗體值，B是鼻內給藥組的IgA抗體值。
如圖8至圖11所示，可以看出，與對照組相比，單獨施用或聯合施用pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB轉化的乳酸菌的BALB/c小鼠的血清、腸洗液和支氣管-肺泡洗液中，SARS病毒的刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的IgG抗體值和IgA抗體值明顯高。
因此，根據本發明，含有表面表達SARS病毒的刺突和核殼抗原蛋白的抗原部分的微生物能有效用作活疫苗。
雖然本發明參照具體示例性實施方式進行說明與描述，但本發明并不僅限于這些實施方式，而由權利要求限定。可以理解，本領域技術人員在不背離本發明的范圍和精神而改變或調整實施方式。
工業實用性如上所述，根據本發明，在表面上能表達誘導SARS的冠狀病毒的抗原蛋白的轉化的微生物，以及從微生物中提取和純化的抗原蛋白可有效用作預防和治療SARS的疫苗。尤其是，本發明使得采用表達SARS冠狀病毒抗原的重組菌株來經濟地制備口服疫苗成為可能。
序列表<110>生物領先公司M.D.實驗室生物領先日本公司韓國生命工學研究院<120>SARS病毒抗原的細胞表面表達載體和用該載體轉化的微生物<130>PCF052440C<150>KR10-2003-0035993<151>2003-06-04<160>28<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物(N sense)<400>27cgcggatcct ctgataatgg tccgcaa 27<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(N anti-sense)<400>28cggggtacct taaatttgcg gccaatgttt 30
權利要求
1.一種表面表達載體，其包括編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的pgsB、pgsC和pgsA基因中的任意一種或兩種或多種，以及一種編碼SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的基因。
2.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中所述的刺突抗原蛋白為SARS SA、SARS SB、SARS SC、SARS SD或SARS SBC。
3.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中所述的核殼抗原蛋白為SARS NA、SARS NB或SARS N。
4.根據權利要求2所述的表面表達載體，其中所述的載體為pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC或pHCE2LBpgsA-SARS SBC。
5.根據權利要求3所述的表面表達載體，其中所述的載體為pHCE2LBpgsA-SARS NB或pHCE2LBpgsA-SARS N。
6.一種被權利要求1至5任意一項所述的表達載體轉化的微生物。
7.根據權利要求6所述的微生物，其中所述的微生物選自下述微生物的組中大腸桿菌、傷寒桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、牛分枝桿菌、志賀菌、芽孢桿菌屬、乳酸菌、葡萄球菌、李斯特氏菌和鏈球菌。
8.一種制備SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的方法，其包括培養權利要求6的微生物。
9.一種預防SARS病毒的疫苗，其包括以權利要求8的方法所制備的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白作為有效成分。
10.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述的抗原蛋白為微生物表面的表達形式、粗提形式或純化形式。
11.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗通過口服施用或存在于食物中。
12.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗用于皮下或腹膜內注射。
13.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗用于鼻內給藥。
14.根據權利要求8所述的方法，其中所述的微生物為乳酸菌。
15.權利要求14所述方法制備的乳酸菌，該乳酸菌表面上表達SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白。
16.一種用于預防SARS的疫苗，其包括權利要求15的乳酸菌、從所述乳酸菌中提取的抗原蛋白、或從所述乳酸菌中純化的抗原蛋白作為有效成分。
17.根據權利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗通過口服施用或存在于食物中。
18.根據權利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗用于皮下或腹膜內注射。
19.根據權利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗用于鼻內給藥。
全文摘要
本發明涉及一種SARS冠狀病毒抗原的表面表達載體，該載體包括一種編碼誘導SARS的冠狀病毒的抗原的基因，以及一種或兩種或多種編碼聚－γ－谷氨酸合成酶復合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，還涉及被表面表達載體轉化的微生物以及包括該微生物的SARS疫苗。本發明使得采用表達SARS冠狀病毒抗原的重組菌株來經濟地制備預防和治療SARS的疫苗成為可能。
文檔編號C12N9/00GK1798844SQ200480015275
公開日2006年7月5日 申請日期2004年6月4日 優先權日2003年6月4日
發明者成文喜, 金哲仲, 鄭昌敏, 洪承杓, 李宗洙, 催在哲, 金光, 黑田俊一, 夫夏玲 申請人:生物領先公司, M.D.實驗室, 生物領先日本公司, 韓國生命工學研究院