一種蛋白酶的抑制劑蛋白及其用途的制作方法

專利名稱：一種蛋白酶的抑制劑蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發明是關于一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該抑制劑蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對所述蛋白酶具有特異性的底物一酶相互作用位點的多肽序列。
本發明的其它另外的目的是提供一種已分離純化的DNA序列，該DNA序列編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白；提供一種特征在于其中包含所述已分離純化DNA序列的表達載體；提供一種轉化了所述表達載體的原核或真核宿主細胞；以及提供一種制備嵌合抑制劑蛋白的方法。
背景技術：
在活有機體表達的所有蛋白中，蛋白酶是其中調節細胞生死代謝途徑的最關鍵蛋白。事實上，蛋白酶和底物最初的相互作用和隨后的裂解，都以包括血栓形成、血凝固作用和細胞凋亡在內的廣泛而重要的生物現象為基礎。
調節異常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡可能是與蛋白酶有關的多種疾病(諸如癌癥、自身免疫性疾病、炎癥和感染性疾病)病理的關鍵因素。基于這樣的猜想，對調節異常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡進行了集中研究。在癌癥和炎癥疾病(例如風濕性關節炎和肺氣腫)模型中對抗蛋白酶解藥劑進行的不同研究也均表明，加強抗蛋白酶解的治療和蛋白酶及抗蛋白酶的平衡作用，結果可以得到引人注意的改善。
例如在美國人最常被診斷出的癌癥前列腺癌中，一般認為蛋白酶在包括腫瘤迅速增殖、侵入和轉移等腫瘤細胞的惡性表現中起重要作用。
人類腺激肽釋放酶(hK2)蛋白是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，主要在前列腺上皮中表達。最早從人精漿里分離的hK2目前已經成為前列腺癌的診斷標志(Deperthes等人，1995″Isolation of prostatic kallikrein hK2，alsoknown as hGK-1，in human seminal plasma″Biochim Biophys Acta，1245，311-6)。
除作為診斷標志外，hK2的蛋白酶解活性表明hK2在癌癥進程中起作用。現已提出該酶的幾個潛在功能，包括尿激酶型血纖蛋白溶酶原激活物的活化作用和血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑-1的滅活作用、前體前列腺特異抗原(pro-PSA)的活化作用、纖連蛋白的降解作用和胰島素樣生長因子結合蛋白的降解作用(IGF-BP)(詳見Cloutier等人，2004″Development ofrecombinant inhibitors specific to human kallikrein 2 using phase-displayselected substrates″Eur J Biochem 3，607-13)。
近來研究表明，在癌癥特別是前列腺癌中，激肽釋放酶hK2能與已知為蛋白酶抑制劑-6(PI-6)的蛋白酶抑制劑形成特異性復合體。基于對所述特異性復合體的發現，US 6284873和US 6472143提供了一種用于檢測是否存在癌癥或者有無組織壞死診斷方法。
考慮到hK2的前列腺組織特異性表達和在癌癥發展過程中其所有潛在底物的參與，也可以將hK2作為潛在的治療靶標(Darson等人，1997″Humanglandular kallikrein 2(hK2)expression in prostatic intraepithelial neoplasia andadenocarcinomaa novel prostate cancer marker″Urology 49，857-62)。因此，開發特異性長效蛋白酶抑制劑，特別是激肽釋放酶抑制劑會非常有用。
所述蛋白酶抑制劑可以選自絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)家族，該家族很大，是涉及調節復合體生理過程的蛋白質家族。所述蛋白的分子量在45千道爾頓左右，可以分成兩組一組有抑制作用，另一組沒有抑制作用。
絲氨酸蛋白酶抑制劑包括暴露的柔性反應位點環結構，或絲氨酸蛋白酶抑制劑反應環結構(RSL)，所述環結構涉及與推定的靶蛋白酶之間的相互作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑與所述靶蛋白酶結合，所述RSL的P1-P′1易裂鍵(P1-P′1scissile bond)斷裂之后，形成一種新的共價絡合物(Huntington等人，2000″Structure of a serpin-protease complex shows inhibition bydeformation″Nature 407，923-6)。所述絡合物的形成誘發主要構象重排，并因此不可逆地捕獲所述靶蛋白酶。所述絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制特異性主要歸結于P1-P′1位點殘基的屬性和所述RSL的長度。改變RSL結構域或絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應位點可以作為一種途徑，用于推定絲氨酸蛋白酶抑制劑與靶蛋白酶之間的抑制過程，并用于開發特異性的抑制劑(Dufour等人，2001″The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha1-antitrypsin to its reaction with furin″J Biol Chem 276，38971-9和Plotnick等人，2002″The effects of reactive site location on the inhibitory properties of theserpin alpha(1)-antichymotrypsin″J Biol Claem 277，29927-35)。
幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑如蛋白C抑制劑、α2抗纖溶酶、抗凝血酶-III、α1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、或蛋白酶抑制劑6，已經被鑒定為hK2的抑制劑(Saedi等人，2001″Human kallikrein 2(hK2)，but not prostate-specific antigen(PSA)，rapidly complexes with protease inhibitor 6(PI-6)released from prostatecarcinoma cells″Int J Cancer 94，558-63)。hK2和ACT之間形成絡合物的速度相對較慢，主要歸因于所述RSL的P1-P′1位點上的亮氨酸358-絲氨酸359(Leu 358-Ser 359)殘基，和不利于所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的肽鍵。
迄今為止，只公開了一些新的對血漿激肽釋放酶特異性抑制的激肽釋放酶抑制劑優選物及其在治療和診斷方法中的應用(專利US 6057287、US6333402、US 5994125和US 5795865)。然而這些專利所描述的抑制劑制品與牛胰胰蛋白酶抑制劑的Kunitz結構域同源，尤其是與脂蛋白相關的促凝劑抑制物(LACI)的Kunitz結構域同源。所述Kunitz結構域特異性抑制血漿激肽釋放酶。
除了對血漿激肽釋放酶有特異性外，這些抑制劑分子非常小，并以一種可逆的方式與血漿激肽釋放酶結合。上述方法的主要缺點之一是，應用上述蛋白以可逆的方式抑制靶蛋白酶有一定風險，即所述靶蛋白酶經解絡作用而恢復其活性。
因此如這里所述，應用較大分子抑制劑的一個優點是形成以不可逆的方式抑制蛋白酶靶標的共價絡合物。本發明的更大優點是眾所周知，所述大型共價絡合物能從循環中被快速消除。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種對所述蛋白酶具有高度特異性的蛋白酶抑制劑蛋白及其在藥用組合物中的應用。所述抑制劑蛋白是一種嵌合體，該嵌合體包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點的多肽序列。
本發明的另一個目的是提供一種已分離純化的DNA序列，該DNA序列編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白；提供一種特征在于其中包含所述已分離純化DNA序列的表達載體；以及提供一種轉化了所述表達載體的原核或真核宿主細胞。
本發明的再一個目的是提供一種制備蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇對對蛋白酶的底物-酶特異相互作用位點進行編碼的多核苷酸序列；b)將多核苷酸序列引入編碼絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制劑蛋白的序列中，由此得到嵌合序列；c)使所述嵌合序列在適合的條件下在細胞表達系統中表達；以及d)復性蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。


圖1顯示還原條件下純化重組體ACT的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，泳道1為變體6.1，泳道2為野生型ACT；圖2顯示ACT野生型重組體(rACTWT)及其變體對hK2抑制作用的化學計量(SI)；通過用線性回歸分析法外推I/E(抑制劑/hK2)的比率(即x軸的截距)，測定所述SI；圖3中，A和B表示hK2與重組體抑制劑形成絡合物；箭頭標明hK2(E)，抑制劑(I)及hK2-ACT絡合物(E-1)；圖4中，A和B表示ACT野生型重組體(rACTwT)及其變體在準一級條件下對hK2抑制作用；準一級條件下，使用進程曲線方法測量hK2和重組絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的相互作用；圖5表示通過SDS-PAGE分析法在還原條件下測定實施例1和實施例2中開發的抑制劑的純度；圖6中，A顯示重組體ACT與人激肽釋放酶(hK2)之間的抑制反應的蛋白質印跡分析；B顯示重組體ACT與前列腺特異性抗原(PSA)之間的抑制反應的蛋白質印跡分析；圖7A表示MD820的DNA及蛋白質序列；圖7B表示MD62的DNA及蛋白質序列；圖7C表示MD83的DNA及蛋白質序列；圖7D表示MD67的DNA及蛋白質序列；圖7E表示MD61的DNA及蛋白質序列；圖7F表示MD518的DNA及蛋白質序列；圖7G表示MDCI的DNA及蛋白質序列；圖8表示ACT和MD抑制劑的RSL序列比較；其中常規字體的殘基是野生型ACT(ACTWT)共有的，黑體和下劃線標注的殘基對應ACT變體在所述RSL上的突變；絲氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的斷裂位點用星號(*)標注在P1-P′1殘基之間；圖9表示pQE9表達載體圖譜；圖10A顯示MD62對腫瘤生長的抑制作用；將由人激肽釋放酶2轉染的前列腺癌細胞DU-145(3×106個細胞)，植入裸鼠體內，然后用MD62治療(5或25微克/注射劑)；圖10B顯示MD67對腫瘤生長的抑制作用；將由人激肽釋放酶2轉染的前列腺癌細胞DU-145(3×106個細胞)，植入裸鼠體內，然后用MD67治療(5或25微克/注射劑)；圖11顯示MDCI對腫瘤生長的抑制作用；將由人激肽釋放酶2轉染的前列腺癌細胞DU-145(3×106個細胞)，植入裸鼠體內，然后用MDCI治療(5或50微克/注射劑)；具體實施方式
本發明是關于一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該抑制劑蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點的多肽序列。
所述嵌合抑制劑蛋白是指含有兩種或兩種以上多肽的蛋白。所述多肽來源不同，即所述多肽在自然界中不共存。
這里所用的術語“蛋白質”“多肽”“多肽的(polypeptidic)”“肽”和“肽的(peptidic)”可以互換，用以表示一系列通過相鄰殘基的α-氨基和羧基之間形成肽鍵而互相連接的氨基酸殘基。
本發明所述的嵌合蛋白是蛋白酶的抑制劑，包括起抑制作用的多肽序列和至少一段對所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點的多肽序列。所述底物-酶相互作用位點的多肽序列賦予抑制劑對某一特定蛋白酶表現高度選擇性，該多肽序列根據所要抑制的蛋白酶進行選擇。
典型的所述底物-酶相互作用位點的多肽序列可以是底物活性位點序列。所述“底物活性位點序列”是指底物的一段序列，該序列是蛋白酶優先識別的位點。蛋白酶對底物活性位點序列的識別可以導致底物的活化、鈍化或降解。大多數情況下，這種高度親合作用不僅包括對特異序列的識別，而且包括對該特異序列三維構象的識別。
本發明還包括底物活性位點序列的分子嵌合體。“分子嵌合體”指多核苷酸序列，該多核苷酸序列可以包含底物活性位點序列的功能部分，并且例如可以采用本領域技術人員公知的蛋白質化學技術得到。
本發明還考慮到了底物活性位點序列的特定組合、或其片段或亞組成部分。
所述“片段”是指與底物活性位點的相應序列在長度上至少共有40％的氨基酸的序列。所述序列只要顯示出與其來源的天然序列相同的性質就可以采用。優選所述序列為與底物活性位點的相應序列在長度上共有氨基酸超過70％的序列；優選共有氨基酸超過80％的序列；更優選共有氨基酸超過90％的序列。
所述片段可以用本領域公知的各種方法和技術(例如化學合成)制備。
本發明還包括底物活性位點序列的變體。術語“變體”是指具有在一定程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽，即經過保守氨基酸取代而與天然序列不同的氨基酸序列；因此一個或多個氨基酸可被其它具有相同特性和構象作用的氨基酸取代。氨基酸序列變體包括天然氨基酸序列的氨基酸序列的特定位點的取代、缺失和/或插入。保守的氨基酸取代在這里定義為下列五組之一范圍內的互換I、小分子脂肪族的非極性或弱極性的殘基丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)
II、帶正電的極性殘基組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)III、帶負電的極性殘基及其酰胺殘基天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)IV、大分子芳香族殘基苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)V、大分子脂肪族非極性殘基甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)本發明的底物優選為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，在此情況下底物活性位點序列可以是絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環序列本身、及該序列的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。
所述“絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環”或“反應位點環”或RSL指在絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白上發現的暴露的柔性反應位點環，該環與推定的靶蛋白酶相互作用有關。按照慣例，從所述易裂鍵氨基端的殘基開始，并向遠離該鍵的方向延伸，將殘基命名為P1、P2、P3等。所述易裂鍵之后的殘基被稱為P′1、P′2、P′3等。所述RSL通常包括6-12個氨基酸殘基。
所述RSL序列可以選自包含SEQ ID No 16、17、18、19、20、21、22序列的序列、以及它們的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。
所述RSL序列還可以選自如下列表1中所示的各種可能的序列。
表1RSL中可以變化的位點

對應于潛在的底物肽的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環(RSL)上的P4-P’3殘基的氨基酸序列空格代表為得到hK2的底物特異性而無需修飾的位點。
通常所述蛋白酶選自含有激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)的組中。所述蛋白酶優選為人激肽釋放酶，最優選的人激肽釋放酶是hK2(也公知為hGK-1)。
hK2屬于所述激肽釋放酶基因家族，該家族包括15個成員，但是只有前列腺特異性抗原(PSA或hK3)和hK2被前列腺高水平表達。hK2潛在的生理作用之一是對射精后立即形成的包埋精子的凝膠(sperm-entrapping gel)起蛋白水解作用，特別是對精子凝素(Semenogelin)和纖連蛋白進行裂解。此外，體外實驗證明通過IGF結合蛋白水解，hK2能提高胰島素樣生長因子(IGF)的促有絲分裂作用。體外實驗也表明hK2激活尿激酶原，使激肽原(可能通過B2緩激肽受體存在EGF-受體交叉激活作用)產生緩激肽樣物質，并使pro-PSA前體轉變為活性形式。所述hK2的活性存在爭議，爭議傾向于hK2可能有利于前列腺癌細胞的細胞外基質蛋白降解和隨之發生的前列腺癌細胞的脫附與轉移。另外，hK2能通過釋放促有絲分裂因子和激活生長受體，促進前列腺癌發展。
所要抑制的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的情況下，那么該蛋白酶選自含有組織蛋白酶(K、L和S亞型)、激素原硫醇蛋白酶和胱冬肽酶家族(Caspase)(Caspase-1、Caspase-3、Caspase-49和Caspase-8)的組中。
所述半胱氨酸蛋白酶是利用半胱氨酸殘基催化活性的蛋白水解酶，可以分成至少30個蛋白家族。每一個家族所包含的蛋白，具有相似的氨基酸序列和進化保守序列模體(motif)，所述模體反映了所述家族成員相似的三維結構。
抑制劑嵌合蛋白中起抑制作用的多肽序列通常為絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶。
所述起抑制作用的多肽序列選自絲氨酸蛋白酶的情況下，那么所述起抑制作用的多肽序列優選為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白序列本身、該序列的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。
所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白序列選自α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制劑(PCI)、α-1抗蛋白酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相關蛋白前體(ATR)、α-2-血纖蛋白溶酶抑制劑(AAP)、人抗凝血酶-III前體(ATIII)、蛋白酶抑制劑10(PI10)、人膠原蛋白結合蛋白2前體(CBP2)、蛋白酶抑制劑7(P17)、亮氨酸絲氨酸(leuserpin)蛋白酶抑制劑2(HLS2)、人血漿蛋白酶Cl抑制劑(C1INH)、單核細胞/中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑(M/NEI)、纖溶酶原激活物抑制劑-3(PAI3)、蛋白酶抑制劑4(PI4)、蛋白酶抑制劑5(PI5)、蛋白酶抑制劑12(PI12)、人內皮纖溶酶原激活物抑制劑-1前體(PAI-1)、人胎盤纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI2)、人色素上皮衍生因子前體(PEDF)、蛋白酶抑制劑6(PI6)、蛋白酶抑制劑8(PI8)、蛋白酶抑制劑9(PI9)、人鱗狀細胞癌抗原1(SCCA-1)、人鱗狀細胞癌抗原2(SCCA-2)、T4-結合球蛋白(TBG)、Megsin蛋白和蛋白酶抑制劑14(PI14)及其片段、分子嵌合體、組合和/或變體的組中。
鑒于大多數所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的名稱各異，我們在表2內總結了它們的詳細說明。
表2

根據本發明嵌合抑制劑蛋白的實施例，申請人意外地發現6種特異性抑制所述蛋白酶hK2的新嵌合抑制劑蛋白，所述新嵌合抑制劑蛋白如表3所示
表3

為了改變所述絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的特異性，可以通過修飾所述α1-抗胰凝乳蛋白酶(rACT)的RSL得到所述嵌合抑制劑蛋白。眾所周知，所述α1-抗胰凝乳蛋白酶(rACT)抑制一大組人類酶如胰凝乳蛋白酶、肥大細胞食糜酶、組織蛋白酶G、前列腺激肽釋放酶hK2和PSA(hK3)。利用實施例1中詳述的噬菌體展示技術選出的作為hK2酶的底物的所述肽序列已經用于取代所述易裂鍵及所述RSL的相鄰氨基酸殘基。重組抑制劑在細菌內制備，經親合層析純化。
野生型rACT對hK2的抑制很慢(12-16小時)；相比之下，被修飾了的rACTs在幾分鐘之內很快形成共價絡合物。所述6種rACT變體中的3種以高締合常數特異結合hK2(見表5和表6)。用過量的抑制劑([I]o/[E]o為100∶1)培養30分鐘，hK2被rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7和rACT6.1完全抑制；而rACT8.20抑制95％酶活性，rACT5.18抑制73％酶活性。在上述反應條件下，野生型rACT對hK2沒有表現出抑制作用。在所有變體中，兩種(rACT8.3和rACT5.18)只特異性抑制hK2，不抑制其它測試酶。另兩種變體也抑制PK活性，rACT6.7抑制率為36％，rACT6.2抑制率為100％。野生型rACT和變體rACT8.20抑制兩種胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Chtr和PSA活性；但是也能抑制PK和HNE活性。所有所述重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白都沒有抑制hK1和uPA的活性。
此外，申請人還發現用編碼蛋白C抑制劑的RSL的底物五肽序列取代野生型重組體ACT(rACTWT)所述RSL結構上的殘基P3-P’3，得的嵌合抑制劑(MDCI)產物能抑制激肽釋放酶hK2和hK3。
因此，所述蛋白酶嵌合抑制劑可以選自含有MD820、MD62、MD61、MD67和MDCI的組中。所述嵌合抑制劑優選為MD62或MD61。
眾所周知，抑制作用的化學計量(SI)值高于1，通常可以認為具有絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白底物性質。在本方案中，初始米氏(Michaelis)絡合物形成和所述RSL裂解之后，大多數所述絡合物裂解成具有活性的酶，而裂解后的抑制劑明顯失活。通過使抑制劑與蛋白酶的比達10∶1，即抑制劑過量，培養所述樣品，申請人分析了無絡合物形成和所述抑制劑裂解的ACT變體-hK2反應。上述接近或低于計算得出的所述被測ACT變體的SI值的條件通常利于絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白或絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白-蛋白酶絡合物的蛋白水解(見表6)。申請人意外地觀察到所述假說的矛盾之處，因為不管SI值如何高，始終未觀察到hK2對變體ACT的降解作用。不能用上述理論限定，一種可能的解釋是在測定SI的條件下，ACT沒有降解。在體外形成共價ACTs-hK2絡合物的速度很慢。這一點和我們觀察到的結果吻合25℃下培養30分鐘后，未檢測到野生型ACT對hK2的抑制作用(表5)，甚至在37℃下延長培育時間后，hK2只部分絡合了野生型ACT(圖3)。
申請人還評定了所述新抑制劑對其它蛋白酶的特異性。對所有蛋白酶的評定過程都在同樣條件(模擬生理條件)下進行，以確保更好地解釋進一步的體內應用。將噬菌體展示篩選出的底物hK2的RSL裂解位點，置換到野生型ACT中，使該野生型的ACT變成hK2的高靈敏抑制劑。此外，其中兩種所述抑制劑表現出對hK2的反應唯一性，對進行研究的其它類似公知的生物靶底物如血漿激肽釋放酶、hK1、PSA、尿激酶和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)沒有反應性。據申請人了解，本發明首次報道了開發hK2的特異性抑制劑。
令人感興趣的是，rACT8.20(MD820)不僅抑制hK2，還抑制胰凝乳蛋白酶，并輕微地抑制血漿激肽釋放酶和人彈性蛋白酶，表現出一種廣泛的抑制作用特異性。
所述嵌合抑制劑蛋白的起抑制作用的序列還可以選自半胱氨酸蛋白酶，因為現有大量文獻記載的實例充分證明，絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白對半胱氨酸蛋白酶也有抑制作用(Gettins P.G.W.，2002″Serpin structure，mechanism，and function″in Chem.Rev，102，4751-4803)。這些實例包括絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白鱗癌細胞抗原對組織蛋白酶K、L及S的抑制作用；所述α-1抗胰凝乳蛋白酶對激肽原硫醇蛋白酶的抑制作用；病毒絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白crmA對胱冬肽酶家族成員的抑制作用，所述胱冬肽酶家族成員包括胱冬肽酶1(白細胞介素13轉化酶)、胱冬肽酶3和胱冬肽酶8；人絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白PI19對胱冬肽酶1、胱冬肽酶4和胱冬肽酶8的抑制作用。
按照本發明，將重組技術應用于制備蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白時，優選采用編碼所述多肽的核酸分子及其片段。
因此本發明還涉及一種分離和純化了的DNA序列，該序列編碼上述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
根據本發明“分離和純化了的DNA序列”是指所述編碼本發明蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的核酸分子，或能編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的核酸所處的狀態。所述核酸不含或基本不含與之天然相關的材料如其它的多肽或者核酸，所述與之天然相關的材料可以在其自然環境或在通過在體內或體外實施的重組DNA技術進行制備(例如細胞培養)的環境中找到。
這里能用的DNA是任何多脫氧核苷酸，例如包括雙鏈DNA、單鏈DNA、其中一條或者兩條單鏈由兩個或兩個以上片段組成的雙鏈DNA、其中一條或者兩條單鏈含有連續的磷酸二酯主鏈的雙鏈DNA、包含一個或多個單鏈部分和一個或多個雙鏈部分的DNA、兩條DNA鏈完全互補的雙鏈DNA、兩條DNA鏈只有部分互補的雙鏈DNA、環狀DNA、共價閉合DNA、線性DNA、共價交聯DNA、cDNA、化學合成DNA、半合成DNA、生物合成DNA、天然分離出的DNA、酶解后的DNA、剪切后的DNA、標記過的DNA例如放射性標記的DNA和熒光染料標記的DNA、包含一個或多個非自然發生種的核苷酸的DNA。
編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的DNA序列本身或其片段可用標準的化學技術合成，例如磷酸三酯法或通過自動合成方法和PCR方法。
根據本發明所述分離純化的編碼嵌合抑制劑蛋白的DNA序列還可以通過酶技術生產。這樣可以用在預先確定的核苷酸識別序列斷裂核苷酸分子的限制酶，去從包含所述核苷酸序列的更長的核苷酸分子中分離該核苷酸序列。所述核苷酸序列如編碼所述嵌合抑制劑蛋白的DNA(或RNA)，或其片段。
本發明還包括多核糖核苷酸(RNA)形式的核苷酸，例如包括單鏈RNA、雙鏈RNA、其中一條或者兩條單鏈由兩個或兩個以上片段組成的雙鏈RNA、其中一條或者兩條單鏈都含有連續的磷酸二酯主鏈的雙鏈RNA、包含一個或多個單鏈部分和一個或多個雙鏈部分的RNA、兩條RNA鏈完全互補的雙鏈RNA、兩條RNA鏈只有部分互補的雙鏈RNA、共價交聯RNA、酶解后的RNA、mRNA、剪切后的RNA、化學合成RNA、半合成RNA、生物合成RNA、天然分離出的RNA、標記過的RNA例如放射性標記的RNA和熒光染料標記的RNA、包含一個或多個非自然發生種的核苷酸的RNA。
所述分離純化的編碼蛋白酶嵌合抑制劑的DNA序列優選選自含有SEQID N°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQID N°11和SEQ ID N°13的組中。
本發明還包括上述序列的變體，即通過保守核苷酸取代作用從所涉及序列變化而來的核苷酸序列。所述保守核苷酸取代作用指一個或多個核苷酸被其它同樣性質的核苷酸取代。
而本發明還提供一種表達載體，該表達載體含有上述分離純化的編碼蛋白酶嵌合抑制劑蛋白的序列。本領域技術人員公知，表達載體的選擇直接有賴于想要得到的功能性質，例如嵌合抑制劑蛋白表達和所要轉化或轉染的宿主細胞。
此外，表達載體還可以含有可以與所述分離純化的DNA序列連接的啟動子。這意味著連接后的分離純化的編碼本發明蛋白酶嵌合抑制劑蛋白的DNA序列，可以在適合的調控序列控制下允許表達，即插入的所述分離純化的DNA序列得到轉錄和翻譯。
在此使用的術語“啟動子”指本領域公知的任何附加的調控序列如常用于多肽表達或可以包括附加的一個或多個單獨的靶序列的啟動子和/或增強子、聚腺苷酸化位點和剪接點，和任選的編碼選擇性標記的序列。可應用的啟動子選自與宿主細胞相容的啟動子，例如從病毒的基因組中得到的啟動子和從異源哺乳動物啟動子中得到的啟動子。所述病毒可以是多瘤病毒、腺病毒(如腺病毒2)、乳頭狀瘤病毒(牛乳頭狀瘤病毒)、鳥肉瘤病毒、細胞巨化病毒(如鼠或人細胞巨化病毒即時早期啟動子)、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(如猿猴病毒40早期和晚期啟動子)。所述異源哺乳動物啟動子可以是如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子或熱激啟動子。
可以使用的增強子例如已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強子序列，或真核細胞病毒中的增強子如所述猿猴病毒40(SV40)增強子、所述細胞巨化病毒早期啟動子的增強子、多瘤病毒和腺病毒的增強子。
多種宿主/表達載體組合都可以應用于表達本發明所述的DNA序列。例如有用的表達載體可以包括染色體片段、非染色體片段和合成的DNA序列片段。合適的載體包括SV40的衍生物和公知的細菌質粒如大腸桿菌質粒col E1、pCR1、pBR322和pMB9以及它們的衍生物；質粒如RP4；噬菌體DNA，如噬菌體X(phage X)眾多的衍生物(如NM9899)和其它噬菌體(如M13和單鏈絲狀噬菌體DNA)；酵母質粒如2μ質粒或其衍生物；用于真核細胞的載體如可用于昆蟲和哺乳動物細胞中的載體；源于質粒和噬菌體DNA組合的載體如經修飾應用于噬菌體DNA的質粒或其它表達控制序列；及上述物質的類似物。
最優選的表達質粒是pQE-9。
本發明還提供一種被所述表達載體轉化或轉染的真核或原核宿主細胞。
術語“轉染的細胞”或“轉化的細胞”或“轉染/轉化的細胞”是指其中導入有胞外DNA并因此為所述胞外DNA提供場所的細胞。所述DNA被導入細胞中，因此所述核苷酸能作為染色體的一部分或者作為額外染色體組分被復制。
可以采用眾所周知的方法將含有根據本發明的已分離純化的DNA序列的表達載體轉化或轉染到合適的真核或原核細胞中，所述方法的選用通常取決于所用載體的類型。有關這些方法見于例如Maniatis等人，1982，MolecularCloning，A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，以及商業上提供的方法。
在此公開的所述嵌合抑制劑蛋白優選在細胞表達系統里重組制備。
多種單細胞的宿主細胞可用于表達本發明所述的DNA序列。所述宿主包括公知的真核和原核宿主如大腸桿菌、假單胞菌、枯草桿菌、鏈霉菌等細菌菌株；真菌如酵母；動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M細胞、非洲綠猴(African Green Mobkey)腎細胞(如COS1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆蟲細胞(如Sf9)；以及人細胞和組織培養植入細胞。優選宿主細胞為細菌細胞，更優選大腸桿菌細胞。
本發明還關于含有所述嵌合抑制劑蛋白作為活性成分并選擇性地含有一種或多種適合的藥物載體的藥物組合物。
除含有至少一種所述嵌合抑制劑蛋白，藥物組合物還優選含有一種或多種適合的藥物載體如賦形劑。載體和/或輔劑有助于將活性化合物制備成藥用劑型。
可選用的載體、賦形劑或穩定劑以一定的劑量和濃度應用于受試者時必須無毒。所述載體、賦形劑或穩定劑包括緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸(citrate)及其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲苯基氯化銨、氯化六甲銨、氯化芐烷銨、苯索氯銨、苯酚、丁醇或芐醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(約少于10個殘基)多肽；蛋白質，如血清蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)；食糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；金屬絡合物(如鋅蛋白絡合物)；和/或非離子表面活性劑，如吐溫(TWEEN)、PLURONICS、或聚乙二醇(PEG)。
藥物組合物的劑型可以是全身系統型的，也可以是局部型的。比如，此類組合物的劑型可以是各種非腸道給藥途徑，如皮下、靜脈內、皮內、肌肉、腹膜內、鼻內、透皮、口腔途徑，或經過植入裝置，還可以通過蠕動的給藥方式。
所述含有上述嵌合抑制劑蛋白作為活性成分的藥物組合物還可以加入或注入到生物可吸收基質中；所述基質的給藥形式包括基質懸浮體、凝膠或固相載體。此外，所述基質可以由生物高聚物組成。
可以制備出常釋劑型。常釋劑型的合適的例子包括含抗體的固態疏水聚合物半透性基質。所述基質的形態為成型粒子，如膜劑或微膠囊劑。常釋劑型基質的例子包括聚酯、水凝膠(如聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯、或聚乙烯醇)、聚交酯(US 3773919)、L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸鹽共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT(TM)(包括乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林的可注射用微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
應用于體內給藥的制劑必須無菌。此要求可以很容易地通過如無菌濾膜過濾達到。
很容易理解，本發明嵌合抑制劑蛋白的適當劑量取決于受試者的年齡、性別、健康狀況和體重、以及受試者同時接受治療的種類和預期效果的性質。
最適劑型取決于疾病、嵌合抑制劑蛋白、給藥方式；可能包括片劑、膠囊、糖錠、牙膏、栓劑、吸入劑、液劑、膏劑和注射劑。
本發明還包括對所述嵌合抑制劑蛋白氨基酸的氨基酸修飾作用。所述氨基酸修飾作用用于將所述嵌合抑制劑蛋白交聯到水不溶性基質、或所述其它大分子載體上，或提高所述嵌合抑制劑蛋白的溶解度、改善所述嵌合抑制劑蛋白的吸收、及所述嵌合抑制劑蛋白穿過血腦屏障的滲透性。這類修飾為本領域公知，可以選擇性地消除或削弱任何所述蛋白可能存在的不良副作用及類似作用。
本發明優選的藥物組合物含有作為活性成分的嵌合抑制劑蛋白；選擇性的藥物組合物可以含有分離純化的編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的DNA序列作為活性成分。該藥物組合物既可以含有單獨的分離純化的DNA序列以及含有所述分離純化的DNA序列的表達載體，也可以含有事先轉染了表達載體的所述宿主細胞。在含有事先轉染了表達載體的所述宿主細胞時，為避免任何抗原性問題，宿主細胞優選從接受治療的病人身上分離。這種基因和細胞治療途徑特別適用于需要反復給予藥物組合物的病人，因為所述分離純化的基因、表達載體或事先轉染了表達載體宿主細胞能并入病人的細胞，從而內源產生所述蛋白。
本發明還提供了對哺乳動物體內與蛋白水解相關紊亂的治療或預防方法，該方法包括給予所述哺乳動物上述藥物組合物。
這里對哺乳動物體內與蛋白水解相關紊亂的治療或預防方法，適用于hK2激肽釋放酶活性有害的紊亂情況，包括諸如癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂如良性前列腺肥大，或傳染性紊亂。
所述術語“癌癥”指代或描述一種哺乳動物生理狀況，其典型特征是無節制的細胞增殖。可以治愈的癌癥例子包括但不僅限于前列腺癌、乳腺癌或轉移瘤。
在優選的方法中，所述哺乳動物為人類，所述用于給藥的嵌合抑制劑蛋白選自表3中所列的特異性抑制所述hK2蛋白酶的重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白實例。
本發明的范圍還包括上述藥用組合物用于制備治療或預防哺乳動物體內與蛋白水解相關紊亂的藥劑的用途。所述紊亂hK2激肽釋放酶活性有害的紊亂情況，包括諸如癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂如良性前列腺肥大，或傳染性紊亂。
癌癥的實例包括但不限于前列腺癌、乳腺癌或轉移瘤。
一般情況下，本發明所述嵌合抑制劑蛋白以達預期目的量使用。用于治療和預防紊亂時，所述嵌合抑制劑蛋白或其藥物組合物以治療有效量給藥或涂敷。所述治療有效量是指可以改善或防止被治療主體的癥狀、或延長被治療主體的存活時間的有效量。治療有效量的確定在本領域技術人員的能力范圍內，尤其是根據本發明公開提供的細節。
對全身系統給藥方式而言，可以根據體外試驗初步估計治療有效總量或劑量。例如，在動物模型中用公式計算出所要達到的循環濃度范圍包括細胞培養測定的半數有效劑量(IC50)的劑量。上述信息可以應用于更精確地確定人體使用劑量。
應用本領域公知的技術，初始劑量也可以從體內試驗數據中估算，例如動物模型。本領域普通技術人員能夠很容易地根據動物試驗數據對人體給藥進行優化，并且理所當然地會參考被治療主體本身、該主體的體重、該主體的紊亂嚴重程度、給藥方式和處方醫生的診斷。
本發明還包括制備蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇對對蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點進行編碼的多核苷酸序列，b)將所述多核苷酸序列引入編碼絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制劑蛋白序列中，由此得到嵌合序列，c)使所述嵌合序列在適合的條件下在細胞表達系統中表達，以及d)復性蛋白酶的所述嵌合抑制劑蛋白。
選擇編碼對蛋白酶具有特異性的酶-底物相互作用位點的多核苷酸序列，可以由以下不同技術完成。例如，展示底物用蛋白酶選擇，如鼠白血病逆轉錄病毒直接從活細胞上展示肽，這樣可避免細菌表達(Buchholz等人，1998)或類似的方法應用嵌合辛德比斯病毒(Sindbis virus)庫，該庫也可以應用于蛋白酶斷裂位點的體內選擇；應用轉染了感興趣的酶的哺乳動物細胞(Pacini等人，2000″In vivo selection of protease cleavage sites by usingchimeric Sindbis virus libraries″J Virol.74，2210563-70)。
還可預見的是酵母系統，特異蛋白水解位點的基因檢驗(GASP)包括將隨機底物融合在完整膜蛋白中，使所述膜酵母附帶有底物；該膜酵母中，細胞質轉錄因子可以結合報告基因的啟動子(Kang等人，2001″An improvedstrategy for a genetic assay for site-specific proteolysis″Mol.Cell.30；11(2)263-6)。
近來出現了許多檢測蛋白酶底物特異性的組合化學庫。其中包括組合熒光底物庫和位置掃描-合成組合庫。
另外一種名為固定肽庫的方法，通過測量液相的熒光強度來檢測庫中每個成員的相關底物特異性，并用Edman測序法鑒別所述易裂鍵(Hu等人，2002″Rapid determination of substrate specificity of clostridium histolyticumbeta-collagenase using an immobilized peptide library″J.Biol.Chem.8，277(10)8366-71)。
如果用噬菌體展示技術測定蛋白酶底物特異性，會產生具有毫無遺漏的多樣性的噬菌體-展示隨機肽庫，并經純化蛋白酶篩選。此公知技術適于所述特異性的情況，目的在于建立噬菌體-展示隨機肽庫，該庫包括氨基酸長度一定的所有可能的氨基酸序列組合。這樣大型庫通過在絲狀噬菌體末端上展示隨機序列而建立，并擴增后通過蛋白酶快速檢驗其特異性。
根據實施例1和2，申請人已經建立了五聚物庫，該庫包括1.8×108獨立轉化株，可以視為完整，因為理論上所有可能的3.2×106個隨機五聚物序列都被展示出來了。噬菌體序列進一步證實了所述五聚物插入體的隨機性。然后將展示有隨機五肽的噬菌體融合到配體中去(6×His)并使之固定在親合支持物上。所述支持物為Ni-NTA基質。用所述蛋白酶(在實施例1和2中所述蛋白酶是hK2)培養之后，表達靈敏底物的噬菌體從固相中釋放出來。釋放出來的噬菌體用于感染F+(F-positiv)細菌，可以檢驗出其滴度，并進行擴增。然后通過沉淀將所述噬菌體純化，擴增然后固定在親合支持物上進行下一輪的篩選。為了得到高特異性的多核苷酸序列，所述五肽的選擇總共重復了8次。將最后一輪篩選出的噬菌體克隆涂布到培養皿上，每種噬菌體的DNA編碼底物活性位點的區域都得到了擴增，通過所述酶裂解檢驗所述序列。
然后將編碼底物活性位點的多核苷酸序列引入到編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列中，如引入到編碼rACT的序列中，得到嵌合序列。所述rACT的RSL結構域中P1密碼子上游18bp位置，事先引入了兩個沉默限制位點Sac II和Mlu I；所述P1密碼子下游18bp位置，分配所述篩選出的編碼底物活性位點的多核苷酸序列的亞克隆。
重組嵌合抑制劑在適當的培養條件下，在例如大腸桿菌TG1菌株中產生。所述適當的培養條件取決于所要表達的所述重組嵌合抑制劑，可以包括在10-40℃培養10-30小時。
正如申請人在實施例1和實施例2中所示，令人驚訝的是16℃培養16小時可實現表達，并且得到rACT完全完整的變體產物。
最后，當重組嵌合抑制劑分泌出來時，可以在培養基中復性；當沒有分泌出來時，可以從細胞表達系統中提取；然后用本領域公知技術如高效液相色譜、凝膠電泳、親合層析、超濾、離子交換等進行純化。本領域技術人員明顯知道，用于純化特定重組嵌合抑制劑的實際條件部分取決于下列因素如靜電荷、疏水性、親水性等。
就親合層析純化而言，可以使用任何特異結合重組嵌合抑制劑或His標簽的抗體。其它親合性分子如Ni2+-氨三乙酸交聯瓊脂糖珠，和特異結合His標簽的親合性分子也包括在本發明范圍內。
然后可以根據嵌合抑制劑蛋白抑制蛋白酶的活性來進一步得到檢驗。任何常規的方法如斯卡查德法(Scatchard method)(Scatclzard，1949 Ann NYAcadSci 51660-669)都可完成該檢驗。斯卡查德法描述了一種經典的測量和分析蛋白之間結合的方法，該法要求相對純凈的蛋白和區分結合蛋白和未結合蛋白的能力。
另一種適合測量嵌合抑制劑蛋白與酶親合性的方法是，測量所述嵌合抑制劑蛋白減緩酶作用的能力。取決于所述酶裂解底物的速度和發色或產生熒光底物的可用性，此法要求相對純凈的嵌合抑制劑蛋白。
本發明優選的所述嵌合抑制劑蛋白抑制所述蛋白酶活性，具有比它們的野生型對應體更高的親合性。
這里公開的所述嵌合抑制劑蛋白優選在細胞表達系統里重組產生。所述表達系統可以是真核或者原核宿主細胞。
多種單細胞宿主細胞應用于表達本發明所述嵌合體抑制劑蛋白。所述宿主可以包括公知的真核和原核宿主，如細菌菌株大腸桿菌、大腸桿菌、假單胞菌、枯草桿菌、鏈霉菌等細菌菌株；真菌如酵母；動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M細胞、非洲綠猴腎細胞(如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆蟲細胞(如Sf9)、以及人細胞和組織培養植入細胞。所述宿主細胞優選為選自分類屬枯草桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌和解糖腸球菌(Erwinia)的細菌細胞。細菌宿主細胞更優選為大腸桿菌細胞。
根據本發明，用含分離純化的DNA序列的表達載體轉化或轉染合適的真核或原核宿主細胞，通常可以根據所選用載體的類型使用公知的方法予以實現。有關這些方法見于例如Maniatis等人，1982，Molecular Cloning，Alaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，以及商業上提供的方法。
本發明的另外一個目的是提供一種檢測體內或體外樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，該試劑盒包括分離純化的DNA序列。所述DNA序列選自SEQ IDN°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQ IDN°11和SEQ ID N°13及它們的互補序列，以及它們的片段和/或它們的變體。
本發明還選擇性地預見了一種檢測樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，該試劑盒可以包括根據本發明的蛋白酶嵌合抑制劑蛋白。所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白可以是如選自MD820、MD62、MD61、MD67和MD CI。
上述術語“樣品”指任何合適的標本，可以含有蛋白酶或編碼蛋白酶的序列、或可以結合所述嵌合抑制劑蛋白或所述編碼所述嵌合抑制劑蛋白的分離純化的DNA序列。
所述診斷試劑盒可以包括能檢測蛋白酶的系統，其中檢測信號取決于蛋白的存在量。所述信號可以通過目測或儀器檢測。可能的信號包括有色產物、熒光或發光產物、檢驗成分或產物的吸收或發射輻射性質變更、組成產物的沉淀或凝集。所述檢驗成分可以是標記，如放射性同位素、熒光團、酶、輔酶、酶的底物、電子密集化合物、可凝集離子。所述試劑盒中的所述檢驗成分可以結合嵌合抑制劑蛋白，或者結合分離純化的DNA序列。
最后，本發明還公開提供了一種對哺乳動物體內與蛋白水解相關紊亂的治療或預防方法，該方法包括給予所述哺乳動物服用含有重組野生型絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白作為活性成分的藥物組合物。
以上所述對哺乳動物體內與蛋白水解相關紊亂的治療或預防方法，適用于hK2激肽釋放酶活性有害的紊亂情況，包括諸如癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂如良性前列腺肥大或傳染性紊亂。
通過參考以下實施例，可以對上述描述進行更全面的理解。然而這些實施例是實施本發明的典型方法，并不限制本發明的范圍。
實施例1應用噬菌體展示篩選底物來開發特異抑制人hK2的重組ACT抑制劑材料按已有方法從人精液中純化出hK2和hK3(PSA)(Frenette G，Gervais Y，Tremblay RR，Dube JY.1998″Contamination of purified prostate-specific antigenpreparations by kallikrein hK2″J Urol 159，1375-8)，抗hK2和抗PSA單克隆抗體由加拿大Laval大學RR Tremblay教授惠贈。人胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)、人激肽釋放酶hK1、人血漿激肽釋放酶(PK)、人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)和商品ACT(人血漿α1-抗胰凝乳蛋白酶)購自Calbiochem公司。Z-Phe-Arg-AMC、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC、Z-Gly-Gly-Arg-AMC、MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC購自Calbiochem公司。CFP-TFRSA-YFP熒光底物按已有方法開發出來(Mahaian NP等人，1999″Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal theactivation of specific caspases during apoptosis″Cheni Biol 6，401-9)。人血漿α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的cDNA由賓夕法尼亞大學Dr.Harvey Rubin教授惠贈。
定點誘變將ACT的cDNA亞克隆到pQE-9表達載體(Qiagen，德國，圖9)，并在rACTWT的氨基末端(N-terminal)導入HIS6標簽后，將兩個限制酶切位點Sac II和MluI分別接在RSL結構域的PI密碼子的上游18bp處和下游18bp處。根據Stratagene公司提供的快變(quickchange)突變實驗方案，用寡核苷酸5′-GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG-3′對Sac II進行同義突變；用5′-GCACAATGGTACGCGTC TCCACTAATG-3′對MluI進行同義突變。
底物噬菌體展示庫的構建用修飾的pH0508b噬菌粒制備底物噬菌體庫(Lowrnafi等人，1991，″Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display″Biocheinistry 12，10832-8)。構建包括在Gly-Gly-Gly-Ser-重復-富含區域(Gly-Gly-Gly-Ser-repeat-rich region)的任意一端存在的HIS6標簽，所述富含區域在噬菌體M13基因III的羧基末端結構域(密碼子249-406)之前。隨機五肽通過用5′端被生物素酰化的引物對模板寡核苷酸進行PCR延伸而制得。所述模板寡核苷酸在產生的簡并密碼子兩端都有合適的限制位點。所述簡并密碼子是5′TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGTCGGT CATAGCAGTCGCTGCA-3′(其中N可以是任意核苷酸，S可以是G或C)，所述引物相應的側翼區域為5′TGAGCTAGTCTAGATAGGTG-3′和5′-TGCAGCGACTGCTATGA-3′。PCR模板按已有方法進行消化和純化(Smitll G.P，Scott J.K.1993″Libraries of peptides and proteins displayed onfilamentous phage″Methods Enzymol.217，228-57)，并被插入到由XbaI/SalI消化好的pH0508b載體中，并電穿孔導入到XL1-Blue(F-)。庫容量可根據轉化效率進行估計。所述轉化效率可通過將少部分轉化細胞涂布到含氨芐青霉素(100微克/毫升)和四環素(15微克/毫升)的Luria-Bertani平板上進行檢測。其余的轉化細胞用于制備噬菌體庫，加入M13K07輔助噬菌體培養過夜。所述輔助噬菌體的濃度使感染復數達每毫升100個空斑形成單位(p.f.u.)。從上清液中收集噬菌體，并通過聚乙二醇沉淀進行純化。從中隨機選取200個克隆用于測序，以驗證該庫的隨機性。
噬菌體展示五肽庫的篩選所述新五肽庫用hK2篩選8輪。用10毫升含1毫克/毫升BSA的氯化鈉/磷酸緩沖液(NaCl/Pi)洗滌100微升Ni2+-氨三乙酸交聯瓊脂糖珠(Ni2+-氨三乙酸交聯瓊脂糖樹脂)。
將噬菌體微粒(1011)加入到平衡好的Ni2+-氨三乙酸交聯瓊脂糖樹脂中，4℃下緩慢攪拌3個小時使二者結合。隨后用NaCl/Pi(含1毫克/毫升的BSA，5毫摩爾/升的咪唑和0.1％的吐溫20)洗滌所述樹脂以去除沒有結合的噬菌體微粒，然后在NaCl/Pi中平衡所述樹脂。所述底物噬菌體在37℃下在27納摩爾/升(nM)(終濃度)的hK2中暴露45分鐘。還進行了不含蛋白酶的空白篩選。將裂解的噬菌體釋放到上清液中，用XL1-Blue大腸桿菌擴增，然后進行下一輪篩選。八輪篩選后，大約15個單克隆從第五輪、第六輪和第八輪篩選中被挑選出來，并且分離了質粒DNA，將質粒上編碼所述底物的區域進行了測序。
重組野生型ACT及其變體的構建和表達使用引物通過模板寡核苷酸的PCR延伸生成相應在反應活性部位環上P3和P3′之間(見下表4)的位置有變化的6個變體rACT8.20，5’-TACCGCGGTCAAAATCACCCTCCCGTTCTCGGAGCAGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT6.3，5’-TACCGCGGTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGATGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT8.3，5’-TACCGCGGTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT6.7，5’-TACCGCGGTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACCGCTGA-3’；rACT6.1，5’-TACCGCGGTCAAAATCATGACAAGATCTAACTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT5.18，5’-TACCGCGGTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTGA-3’(其中劃線序列編碼反應活性部位環的新斷裂位點)，所述引物相應的側翼區是5′-TACCGCGGTCAAAATC-3和5′-TCACGCGTGTCCAC-3′。將PCR產物用Sac II和Mlu I限制酶消化，然后亞克隆到消化好的rACTWT構建體中。重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白在大腸桿菌TG1菌株中制備。細胞在37℃下在含100微克/毫升氨芐青霉素的2xTY培養基(每升含16克胰蛋白胨、10克酵母提取物、5克氯化鈉)中生長至A600＝0.5。然后加入異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5毫摩爾/升，使重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白在16℃下表達16小時。通過沉淀收集100毫升培養物里的細胞，重懸于冷磷酸緩沖液(PBS)中，經過弗氏壓碎器，復性所有可溶的細胞質蛋白。細胞碎片通過離心去除，上清液加入Ni2+-氨三乙酸交聯瓊脂糖珠，4℃下90分鐘以結合重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白。隨后用50毫摩爾/升pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、500毫摩爾/升的NaCl和25毫摩爾/升的咪唑洗滌所述樹脂；結合在樹脂上的蛋白質用50毫摩爾/升pH值為8.0的Tris、500毫摩爾/升的NaCl和150毫摩爾/升的咪唑洗脫10分鐘。一旦完成純化，在4℃下將rACT在50毫摩爾/升pH值為8.0的Tris、500毫摩爾/升的NaCl和0.05％Triton X-100中透析16小時。每種純化物的蛋白濃度用Bradford蛋白質分析法(Bradford assay)測定，通過考馬斯亮藍染色SDS-PAGE凝膠光密度測定使蛋白濃度標準化(Laemmli UK.1970″Cleavageof structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4″Nature 227，680-5)。
表4重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)及其變體的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環(RSL)序列對比

底物多肽用噬菌體展示隨機五肽庫，經激肽釋放酶hK2篩選。
常規字體的殘基是野生型ACT(rACTwT)共有的，黑體和下劃線標注的殘基對應ACT變體在所述RSL上的重置底物多肽。hK2底物多肽中的易裂鍵用↓表示，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的斷裂位點用星號(*)標注在P1-P′1殘基之間。
抑制作用測定和抑制作用的化學計量(SI)用hK2和另外不同的酶測定rACTWT及其變體的抑制作用的化學計量(SI)值。初始測試時rACT與蛋白酶摩爾比過量100倍，所述蛋白酶為激肽釋放酶(hK2)、前列腺特異性抗原(PSA)、人激肽釋放酶(hK1)、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、人血漿激肽釋放酶(PK)、尿激酶(uPA)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)。反應在反應緩沖液(50毫摩爾/升pH值為7.5的Tris、150毫摩爾/升的NaCl、0.05％Triton X-100和0.01％的BSA)中，25℃下進行30分鐘(PSA在37℃下進行90分鐘)；殘余的蛋白酶活性通過加熒光底物檢測(hKl、hK2和PK加Z-Phe-Arg-AMC；Chtr加Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC；uPA加Z-Gly-Gly-Arg-AMC；HNE加MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC；PSA加CFP-TFRSA-YFP)。將加本發明的抑制劑的酶活性與未被抑制的反應進行對比。觀察加抑制劑的反應，通過培養不同濃度的重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白檢測SI。用線性回歸分析活性分數(受抑制的酶反應速率/未受抑制的酶反應速率)與抑制劑對蛋白酶摩爾比率的關系曲線，抑制作用的化學計量由橫坐標截距可得。
動力學在準一級條件下，使用進程曲線方法測量，hK2、胰凝乳蛋白酶、人血漿激肽釋放酶(PK)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)與不同的rACT的相互作用的締合速率常數(Morrison JF，Walsh CT.1988″The behavior andsignificance of slow-binding enzyme inllibitors″Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol 61，201-301)。在此條件下，將固定量的蛋白酶(2納摩爾/升)與不同濃度的抑制劑(0-800納摩爾/升)和過量的底物(10微摩爾/升)混合。所有反應都在反應緩沖液(50毫摩爾/升pH值為7.5的Tris、150毫摩爾/升的NaCl、0.05％Triton X-100和0.01％的BSA)中，25℃下進行45分鐘。產物生成速率通過FLx800熒光96孔微板測讀儀(Biotek，美國)測量。在此模型中，抑制作用在整個反應過程中視為不可逆的，酶活性的進程用產物生成(P)表示，酶的起始速率(Vz)，被抑制一段時間(t)酶的一級反應速率為(kobs)，速率常數只取決于抑制劑濃度。
P＝(Vz/kobs)×[1-e(-kobs)]方程1對每種抑制劑的kobs都在4個不同抑制劑濃度下用方程1計算非線性回歸的數據得到。通過繪制kobs對抑制劑濃度[I]測定二級反應速率常數k′，k′等于上述曲線的斜率(k′＝Δkobs/Δ[I])。由于抑制劑和底物競爭，以下方程2用于校正二級反應常數k′，考慮底物濃度[S]和所述蛋白酶對其底物的米氏常數Km，得出ka。
ka＝(1+[S]/Km)×k’方程2hK2對Z-FR-AMC的Km為67微摩爾/升，胰凝乳蛋白酶對Suc-AAPF-AMC的Km為145微摩爾/升，PK對Z-FR-AMC的Km為170微摩爾/升，HNE對MeOSuc-AAPV-AMC的Km為130微摩爾/升。
絡合物生成和抑制劑降解的蛋白質印跡法分析激肽釋放酶hK2與不同的重組ACT，以[I]o∶[E]o比為100∶1，在50毫摩爾/升的Tris、200毫摩爾/升的NaCl和0.05％Triton X-100中，37℃下培養3小時。將蛋白樣品在95℃加熱5分鐘，用SDS-PAGE(12％的丙烯酰胺，T∶C比19∶1)分離，然后電印跡轉移至Hybond-ECL(Amersham Pharmacia)硝化纖維膜上。游離的hK2和hK2-ACT絡合物用鼠抗hK2單克隆抗體和堿性磷酸酯酶共軛的羊抗鼠二抗檢測。蛋白質印跡用ECL檢測試劑盒(Amersham Phannacia Biotech)顯影。hK2還和ACT8.3或ACT6.7在25℃(動力學條件)下，以[I]o∶[E]o比為100∶1，在50毫摩爾/升的Tris、200毫摩爾/升的NaCl和0.05％Triton X-100中，培養30分鐘。蛋白質用抗His6單克隆抗體進行蛋白質印跡法檢測，然后按上述方法檢測二抗。
可溶性重組野生型及變體ACT的制備野生型絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白α-1抗胰凝乳蛋白酶用于開發激肽釋放酶hK2特異性抑制劑。rACTWTRSL結構中P3-P′3之間的殘基被底物五肽取代。所述底物五肽由上述噬菌體展示技術選出。6種rACT變體(見表1)得以設計并構建。根據絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的RSL中的Leu-358-Ser-359，排列底物多肽的易裂鍵。rACTWT及其變體作為氨基末端位置含His標簽的融合蛋白，由大腸桿菌TG1表達。所有的融合蛋白都在低溫下制備，使得蛋白主要以活性可溶形式積聚。在自然條件下純化，蛋白生成的水平在1.0-2.5毫克/升之間變化。純化的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的純度，例如變體6.1(泳道1)和野生型ACT(泳道2)，經SDS-PAGE分析評價超過98％(圖1)。
rACT變體的特異性主要針對激肽釋放酶hK2包括人嗜中性彈性蛋白酶、凝乳蛋白酶樣(Chtr、PSA或hK3)和胰島素樣(hK2、hK1、PK、uPA)蛋白酶在內的一系列酶已被篩選出來，以檢測rACT變體的抑制特異性(表5)。
表5rACTWT及其變體的抑制性概況

a在對應于由hK2選出的底物多肽的重組ACT的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環(RSL)上斷裂的氨基酸序列b蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白，以[I]o∶[E]o比為100∶1，25℃下培養30分鐘(PSA在37℃下90分鐘)。
抑制百分率符合100×(1-(抑制劑存在的反應速率/未受抑制的空白反應速率))
與過量抑制劑([I]o∶[E]o比為100∶1)培養30分鐘，hK2被rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7和rACT6.1完全抑制，但是rACT8.20和rACT5.18對酶活性的抑制分別為95％和73％。在此條件下，野生型rACT未表現對hK2的活性有抑制。在所述變體中，兩種變體(rACT8.3和rACT5.18)特異性抑制hK2，對其它測試的酶沒有抑制作用。另外兩種變體，rACT6.7和rACT6.2對PK也分別有36％和100％的抑制作用。野生型ACT和變體rACT8.20抑制兩種胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Chtr和PSA，而且還抑制PK和HNE。所述重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白都沒有表現出對激肽釋放酶hK1和uPA的抑制活性。
與野生型ACT相比，變體ACT對hK2的抑制作用化學計量明顯改善抑制作用化學計量的檢測是在所有酶的生理條件的pH和離子強度下完成的，以保證最有價值的比較。重組野生型ACT給出的對胰凝乳蛋白酶的SI值為2(表6)，與商購ACT在相似條件下得到的值相同(數據未給出)。
表6rACTWT及其變體與hK2及其它蛋白酶的抑制作用化學計量值和反應二級速率常數(ka)的比較

a用線性回歸分析外推I/E比而檢測的報告SI值(見圖1)b如《實驗規程(Experimental Procedure)》中所述，絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白-蛋白酶反應的二級反應常數通過在準一級或二級條件下測定。
c在對應于hK2選出的底物多肽的重組ACT的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環(RSL)上P3-P3’殘基的氨基酸序列-，沒有可檢測到的抑制活性。
為了檢測所有重組變體的SI值，申請人將hK2(5納摩爾/升)與濃度不同(6.25-500納摩爾/升)的rACT8.20(×)、rACT6.2(□)、rACT8.3(△)、rACT6.7(◇)、rACT6.1

rACT5.18(○)、rACTWT(+)，在反應緩沖液中25℃下培養30分鐘。hK2殘余的活性(速率)通過加入熒光底物(10微摩爾/升)Z-FR-AMC檢測。速率分數對應受抑制的酶反應速率(Vi)/未受抑制的空白酶反應速率(vo)之比。所述SI的檢測通過線性回歸分析外推I/E比(即x軸截距)。
如圖2所示，所有新構建的ACT變體都表現出比野生型ACT低的對hK2的SI值。所有這些變體中，rACT6.7、rACT6.1和rACT6.2的對hK2的SI值最低(分別是9、19和25)。然而rACT6.2和rACT6.1還有對PK的最低SI值(18和16)，rACT6.7對PK的SI值(277)高很多。兩種對hK2特異的重組ACT，rACT8.3和rACT5.18具有較高的SI比，分別為34和139。rACT8.20抑制劑對包括hK2的所有測試酶的SI值都高達100。
變體ACT與hK2形成穩定絡合物沒有降解抑制劑hK2與rACT8.20、rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7、rACT6.1、rACT5.18和野生型ACT，以I∶E比為100∶1，在37℃下培養30分鐘。與酶相互作用后，在還原的條件下，用鼠抗-hK2抗體檢測抑制劑的衰減，然后用蛋白質印跡法分析rACT與hK2(rACT8.20(泳道1)、rACT6.2(泳道2)、rACT8.3(泳道3)、rACT6.7(泳道4)、rACT6.1(泳道5)、rACT5.18(泳道6)和野生型ACT(泳道7))的反應產物。圖3A顯示了當將hK2與ACT變體培養時，游離hK2(E)完全消失，形成共價絡合物(EI)。該共價絡合物表現出高穩定性，因為它在經過16小時的培養期后沒有裂解(數據未給出)。野生型的ACT對hK2的抑制要慢得多，3小時培養之后多數還未絡合。檢測到的對hK2的SI值升高不能歸因于非絡合物促進ACT變體抑制劑降解。
進一步在非動力學條件(25℃下30分鐘)下，將ACT8.3(泳道1)或ACT6.7(泳道3)與hK2(在蛋白質印跡上分別為泳道2和泳道4)以I∶E比為10∶1培養。絡合物的生成在還原條件下，用鼠抗-His標簽單克隆抗體(圖3B)通過蛋白質印跡分析。所有的抑制劑蛋白不是和hK2絡合，就是表現出非斷裂的狀態，表明可能的底物途徑對絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白-蛋白酶相互作用不重要。
變體ACT表現出與hK2極高的締合常數每種蛋白酶表現出的與抑制劑的反應性決定了其與變體ACT抑制反應的速率。最終hK2和重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的相互作用在準一級條件下，用進程曲線測定。將hK2(2納摩爾/升)和底物Z-FR-AMC(10微摩爾/升)加入到具有變化量(20-800納摩爾/升)的抑制劑rACT8.20(◇)、rACT5.18(+)(圖4A)和抑制劑rACT6.2(○)、rACT8.3(□)、rACT6.7(△)、rACT6.1(×)(圖4B)中。描述進程的曲線用方程1非線性回歸分析，以所述絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白濃度對速率(kobs)作圖。
測定kobs之后，締合常數(ka)用蛋白酶對其相應底物(表4)的Km計算出來。野生型ACT與胰凝乳蛋白酶的ka值與文獻(Cooley等人，2001″Theserpin MNEI inhibits elastase-like and chymotrypsin-like serine proteasesthrough efficient reactions at two active sites″Biochemistry 40，15762-70)公開的數據相同。重組rACT6.7表現出與hK2結合最高的ka(8991M-1s-1)，而它與PK的ka是與hK2的ka的四十五分之一。相反，重組rACT6.2與hK2的ka和與PK的ka相等，該重組rACT表現出缺乏對這兩種酶的辨別能力。hK2特異重組抑制劑rACT8.3和rACT5.18的ka值很低，分別為2439M-1s-1和595M-1s-1，但是非hK2特異性的rACT8.20表現出與hK2締合的ka為1779M-1s-1，相比之下高于其與Chtr、PK和HNE締合的活性。其中一種重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白rACT6.1，與PK的反應速率高于與hK2的反應速率。
實施例2特異性抑制人hK2和hK3蛋白酶的重組ACT抑制劑的開發如實施例1所述，用編碼蛋白C抑制劑(PCI)的RSL的底物五肽序列(表7)取代野生型重組體ACT(rACTWT)的RSL結構上的殘基P3-P’3。
表7重組絲氨酸蛋白酶抑制劑ACT、PCI和ACTPCI的反應絲氨酸蛋白酶抑制劑環(RSL)的排列

常規字體的殘基是和野生型重組rACT(ACTwT)共有的，黑體和下劃線標注的殘基對應ACT變體在所述RSL上的重置底物多肽。底物多肽中的易裂鍵用↓表示，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的斷裂位點用星號(*)標注在P1-P′1殘基之間。
簡要地講，為制備重組蛋白ACTPCI(MDCI)，TG1細胞在合適的培養基中生長之后，用相應的構建體進行轉化。然后促使細胞達到最佳密度，在16℃下表達重組抑制劑16小時。
重組抑制劑ACTPCI從細菌細胞質中提取出來，如前面的實例所述，用Ni-NTA柱親合層析分離所述重組抑制劑ACTPCI。
通過SDS-PAGE對重組ACT表達的分析在還原條件下，用SDS-PAGE分析實施例1和2中開發的不同的抑制劑純度，結果見圖5。
抑制劑的評價對所述抑制劑進行了進一步的分析，以評價它們的特異性以及它們抑制蛋白酶的親合性。所述蛋白酶為人激肽釋放酶hK2和hK3(圖6)，以及血漿激肽釋放酶、胰島素、尿激酶、彈性蛋白酶、凝血酶、hK14和人激肽釋放酶8(表8)。所述兩種酶具有不同的酶特異性(hK2胰島素樣；hK3胰凝乳蛋白酶樣)，但都被ACT天然抑制。雖然ACT被認為是血液循環中的天然hK3抑制劑，但是它對hK2的抑制作用較差。
用蛋白質印跡法分析rACT和人激肽釋放酶間的抑制反應，結果見圖6。對于每一種ACT變體，將1微克抑制劑與100納克hK2或hK3在37℃生理條件下培養1小時。
用抗hK2 9D5的單克隆抗體進行檢測的結果見圖6A。
泳道1只有hK2，2商購ACT+hK2，3野生型ACT+hK2，4MD820+hK2，5MDCI+hK2，6MD62+hK2，7MD61+hK2。
圖6B顯示了用抗-His抗體(重組ACT蛋白上帶有的His標簽)檢測hK3-ACT絡合物的結果。
泳道1PSA，2PSA+ACT，3野生型ACT+PSA，4MD820+PSA，5MDCI+PSA，6MD62+PSA，7MD61+PSA。
氨基酸在反應環內變化，用篩選出的hK2特異性底物序列將ACT改造為對hK2高度特異性而不抑制hK3的抑制劑(MD820、MD61、MD62)。所述結果驗證了前面表4的內容。
只有基于蛋白C抑制劑(PCI)反應環的MDCI能抑制所測試的兩種激肽釋放酶(hK2和hK3)。
MD61和MD62是對hK2具有極高親合性的抑制劑，3分鐘內抑制所有的hK2蛋白(在同樣條件下)，相比之下，野生型或者商購的α-1抗胰凝乳蛋白酶需要培養12個小時以上才能抑制同樣量的hK2(數據未給出)。
表8MDCI的抑制概況

實施例3MD抑制劑對腫瘤生長的抑制作用3.1MD62和MD67抑制劑對腫瘤生長的抑制作用雄激素依賴的人前列腺癌細胞系DU-145得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。應用逆轉錄病毒技術得到轉染有hK2基因的DU-145細胞(DU145/hK2)。
收集指數生長的DU145/hK2細胞，以7.5×107個細胞/毫升的濃度重懸于含1或10微克抑制劑的DMEM(Invitrogen)培養基中。所述細胞懸液以1∶2的比例與matrigel基質(BD BioSciences)混合，皮下注射(3×106個細胞/40微升)到8周齡無胸腺Swiss裸鼠(兩只鼠/組)的左右脅腹。每只鼠接種兩個位置。
接種腫瘤后的第6天、第12天和第18天，皮下注射50微克或10微克MD62、MD67或者100微克或10微克ACT-WT。接種腫瘤后的第24天、第30天、第33天、第36天、第39天和第41天，皮下注射25微克或5微克抑制劑(MD62和MD67)或者50微克或5微克ACT-WT。
圖10A顯示出MD62對腫瘤生長的抑制作用。轉染了人激肽釋放酶2的前列腺癌細胞DU-145(3×106個細胞)移植到裸鼠體內，然后用MD62治療(5或25微克/注射劑)。
圖10B顯示出MD67對腫瘤生長的抑制作用。轉染了人激肽釋放酶2的前列腺癌細胞DU-145(3×106個細胞)移植到裸鼠體內，然后用MD67治療(5或25微克/注射劑)。
3.2MDCI抑制劑對腫瘤生長的抑制作用雄激素依賴的人前列腺癌細胞系DU-145得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。應用逆轉錄病毒技術得到轉染有hK2基因的DU-145細胞(DU145/hK2)。
收集指數生長的DU145/hK2細胞，以7.5×107個細胞/毫升的濃度重懸于含1或10微克抑制劑的DMEM(Invitrogen)培養基中。所述細胞懸液以1∶2的比例與基質matrigel(BD Biosciences)混合，皮下注射(3×106個細胞/40微升)到8周齡無胸腺Swiss裸鼠(兩只鼠/組)的左右脅腹。每只鼠接種兩個位置。
接種腫瘤后的第6天、第12天和第18天，皮下注射100微克或10微克MDCI或ACT-WT。接種腫瘤后的第24天、第30天、第33天、第36天、第39天和第41天，皮下注射50微克或5微克MDCI或ACT-WT。
圖11顯示出MDCI對腫瘤生長的抑制作用。轉染了人激肽釋放酶2的前列腺癌細胞DU-145(3×106個細胞)移植到裸鼠體內，然后用MDCI治療(5或50微克/注射劑)。
權利要求
1.一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該嵌合抑制劑蛋白包括a)起抑制作用的多肽序列和b)至少一段對所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點的多肽序列。
2.根據權利要求1所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述底物-酶相互作用位點的多肽序列為底物活性位點序列、該序列的片段、該序列的分子嵌合體、該序列的組合和/或該序列的變體。
3.根據權利要求2所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述底物活性位點序列為絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環序列、該序列的片段、該序列的分子嵌合體、該序列的組合和/或該序列的變體。
4.根據權利要求3所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應環序列選自包括SEQ ID No 16、17、18、19、20、21、22序列、所述序列的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體的組中。
5.根據權利要求1-4所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述蛋白酶選自包括激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)的組中。
6.根據權利要求5所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述激肽釋放酶為hK2激肽釋放酶蛋白。
7.根據權利要求1-6所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述起抑制作用的多肽序列為對絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶起抑制作用的多肽序列。
8.根據權利要求7所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述起抑制作用的多肽序列為絲氨酸蛋白酶抑制劑序列、該序列的片段、該序列的分子嵌合體、該序列的組合和/或該序列的變體。
9.根據權利要求9所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述絲氨酸蛋白酶抑制劑序列選自包括α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制劑(PCI)、α-1抗蛋白酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相關蛋白前體(ATR)、α-2-血纖蛋白溶酶抑制劑(AAP)、人抗凝血酶-III前體(ATIII)、蛋白酶抑制劑10(PI10)、人膠原蛋白結合蛋白2前體(CBP2)、蛋白酶抑制劑7(PI7)、亮氨酸絲氨酸蛋白酶抑制劑2(HLS2)、人血漿蛋白酶Cl抑制劑(C1 INH)、單核細胞/中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑(M/NEI)、纖溶酶原激活物抑制劑-3(PAI3)、蛋白酶抑制劑4(PI4)、蛋白酶抑制劑5(PI5)、蛋白酶抑制劑12(PI12)、人內皮纖溶酶原激活物抑制劑-1前體(PAI-1)、人胎盤纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI2)、人色素上皮衍生因子前體(PEDF)、蛋白酶抑制劑6(PI6)、蛋白酶抑制劑8(PI8)、蛋白酶抑制劑9(PI9)、人鱗狀細胞癌抗原1(SCCA-1)、人鱗狀細胞癌抗原2(SCCA-2)、T4-結合球蛋白(TBG)、Megsin蛋白、蛋白酶抑制劑14(PI14)、以及它們的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體的組中。
10.根據前述任意一項權利要求所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白選自包括MD820、MD 62、MD 61、MD 67和MD CI的組中。
11.根據權利要求10所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白為MD 62或MD 67。
12.一種對蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白進行編碼的分離純化的DNA序列，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白為前述任意一項權利要求所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
13.根據權利要求12所述分離純化的DNA序列，其特征在于，所述序列選自包括SEQ ID N°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ IDN°9、SEQ ID N°11和SEQ ID N°13的組中。
14.一種表達載體，其特征在于，該載體包括權利要求12-13所述分離純化的DNA序列。
15.根據權利要求14所述的表達載體，其特征在于，該載體還包括能夠連接所述分離純化的DNA序列的啟動子。
16.一種真核或原核宿主細胞，其特征在于，該細胞轉染有權利要求14或15所述的表達載體。
17.一種藥物組合物，其特征在于，該組合物含有權利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白作為活性成分，以及選擇性結合的一種或多種適合的藥物載體。
18.一種對哺乳動物體內與蛋白水解相關的紊亂進行治療或預防的方法，該方法包括給所述哺乳動物服用權利要求17所述的藥物組合物。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，所述紊亂是這樣一種紊亂，在該紊亂中hK2激肽釋放酶的活性是有害的。
20.根據權利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述紊亂為癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂或傳染性紊亂。
21.根據權利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌癥為前列腺癌、乳腺癌或轉移瘤。
22.根據權利要求20所述的方法，其特征在于，所述炎癥紊亂為良性前列腺肥大。
23.權利要求17所述藥用組合物的用途，其特征在于，該組合物用于制備對哺乳動物體內與蛋白水解相關的紊亂進行治療或預防的藥劑。
24.根據權利要求23所述的用途，其特征在于，所述紊亂是這樣一種紊亂，在該紊亂中hK2激肽釋放酶的活性是有害的。
25.根據權利要求23或24所述的用途，其特征在于，所述紊亂為癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂或傳染性紊亂。
26.根據權利要求25所述的用途，其特征在于，所述癌癥為前列腺癌、乳腺癌或轉移瘤。
27.根據權利要求25所述的用途，其特征在于，所述炎癥紊亂為良性前列腺肥大。
28.一種制備權利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇對對蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點進行編碼的多核苷酸序列，b)將多核苷酸序列引入編碼絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制劑蛋白的序列，由此得到嵌合序列，c)使所述嵌合序列在適合的條件下在細胞表達系統中表達，以及d)復性蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
29.根據權利要求28所述的方法，其特征在于，所述步驟a)通過噬菌體展示庫篩選完成。
30.根據權利要求28和29所述的方法，其特征在于，所述適合的條件包括將細胞表達系統在10-40℃的溫度下培養10-30個小時。
31.根據權利要求30所述的方法，其特征在于，所述適合的條件包括將細胞表達系統在16℃下培養16個小時。
32.根據權利要求28-31所述的方法，其特征在于，所述步驟b)通過從所述細胞表達系統中提取并分離所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白完成。
33.根據權利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的分離通過親合層析方法完成。
34.根據權利要求28-33所述的方法，其特征在于，進一步檢驗所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的抑制所述蛋白酶活性的能力。
35.根據權利要求28-34所述的方法，其特征在于，所述細胞表達系統為真核或原核細胞。
36.根據權利要求35所述的方法，其特征在于，所述原核細胞為細菌細胞。
37.一種檢測樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，其特征在于，該診斷試劑盒包括任意合適的分離純化的DNA序列，所述DNA序列選自包括SEQ IDN°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQID N°11和SEQ ID N°13、它們的互補序列、它們的片段和/或它們的變體的組中。
38.一種檢測樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，其特征在于，該診斷試劑盒含有權利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
全文摘要
本發明是關于一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該抑制劑蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對所述蛋白酶具有特異性的底物－酶相互作用位點的多肽序列。本發明還提供了一種已分離純化的DNA序列，該DNA序列編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白；一種特征在于其中含有所述已分離純化的DNA序列的表達載體；一種轉化了所述表達載體的原核或真核宿主細胞；以及提供了一種制備嵌合抑制劑蛋白的方法。
文檔編號C12P21/02GK1798838SQ200480015268
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月5日 優先權日2003年4月4日
發明者D·德佩爾特, S·克盧捷 申請人:洛桑大學