方法

專利名稱：：方法
技術領域：
：本發明涉及一種個人化的癌癥治療方法和所述方法中使用的一種試劑盒，該方法采用一組標記基因組以預測患者是否對化學治療劑產生應答。具體地說，該方法預測患者對erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應答。更為具體的是，該方法利用在erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應答者和非應答者之間具有差異表達的一組標記基因的水平，關系到那些患有單獨或部分受erbB受體酪氨酸激酶調控的癌癥的患者，尤其是患有晚期非小細胞肺癌(NSCLC)例如腺癌的患者。
背景技術：
：肺癌是癌癥死亡的最主要原因，因此也是一個主要的全球性的健康問題。在治療這種疾病中，主要依靠化學療法，因為大多數在診斷時已經患有局部晚期3(44％)或是轉移性階段4(32％)的疾病[1]。然而，大規模的轉移分析的結果揭示了與最佳的輔助護理相比，基于鉑的化學療法只將晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者的生存期中位數延長了約6個星期[2]。在最近的十年，已經研發出許多新的細胞毒素劑，包括紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)和長春瑞濱(vinorelbine)，并且給肺癌晚期患者提供了多種選擇。然而，與基于順氯氨鉑的治療相比，每種療法只提供了適中的存活效果[3][4]。最近，研發出了致力于克服常規細胞毒性劑的局限的新的治療方法，該方法包括許多分子靶向劑[5][6]。最近幾年來，發現某些生長因子酪氨酸激酶在起始細胞復制的生物化學信號的傳遞中非常重要。它們是跨越細胞膜的大蛋白，并具有一個用于結合生長因子如表皮生長因子(EGF)的胞外結構域和一個細胞內部分，該細胞內部分起著激酶的作用，使蛋白質中的酪氨酸氨基酸磷酸化從而影響細胞增殖。已知的各種受體酪氨酸激酶分類基于結合不同受體酪氨酸激酶的生長因子家族(Wilks，AdvancesinCancerResearch，1993，60，43-73)。這些分類包括I類受體酪氨酸激酶，其包括受體酪氨酸激酶的EGF家族。這包括配體EGF的受體、TGFα(也稱為TGFA)、雙調蛋白(也稱為AREG)、β-動物纖維素、結合EGF的肝素、表調節蛋白(epiregulin)和神經調節蛋白(neuregulins)(包括NRG-1、NRG-2、NRG-3和NRG-4)的受體。更為具體的是，這些受體包括那些具有功能性激酶結構域的被稱為erbB1(EGFR)、erbB2(Neu、Her2)和erbB4(Her4)以及不具有功能性結構域的erbB3(her3)的受體、II類受體酪氨酸激酶和III類受體酪氨酸激酶，其中II類受體酪氨酸激酶包括受體酪氨酸激酶的胰島素家族例如胰島素和IGFI受體和胰島素相關受體，III類受體酪氨酸激酶包括受體酪氨酸激酶的源于血小板的生長因子(PDGF)家族如PDGFα、PDGFβ和集落刺激因子1(CSF1)受體。已知包括EGFR、erbB2、erbB3和erbB4在內的受體酪氨酸激酶的erbB家族常常參與驅動腫瘤細胞的增殖和存活(評述見于Olayioye等，EMBOJ.，2000，19，3159)。其可發生的一種機制是所述受體在蛋白水平上的過度表達，這通常是基因擴增的結果。在許多普通的人類癌癥，例如包括腺癌在內的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)(Cerny等.，Brit.J.Cancer，1986，54，265；Reubi等.，Int.J.Cancer，1990，45，269；Rusch等.，CancerResearch，1993，53，2379；Brabenderetal，Clin.CancerRes.，2001，7，1850)和其它的肺癌(Hendler等，CancerCells，1989，7，347)中都觀察到了這一點(評述見于Klapper等，Adv.CancerRes.，2000，77，25)。對一種或多種上述受體錯誤調節的結果是，普遍認為許多腫瘤在臨床上變得更為迅速地蔓延因而導致更難對病人進行預后診斷(Brabender等，Clin.CancerRes.，2001，7，1850；Ross等，CancerInvestigation，2001，19，554，Yu等.，Bioessays，2000，22.7，673)。除了這些臨床發現之外，很多臨床前信息表明受體酪氨酸激酶的erbB家族參與細胞的轉化。除此之外，許多臨床前研究已經證實了可以通過用小分子抑制劑、顯性負性或抑制性抗體敲除一個或多個erbB活性來誘導抗增殖作用(評述見于Mendelsohn等，Oncogene，2000，19，6550)。因此，現在已經認識到這些受體酪氨酸激酶的抑制劑應當可用作哺乳動物癌癥細胞的增殖的一種選擇性抑制劑(Yaish等.Science，1988，242，933，Kolibaba等，BiochimicaetBiophysicaActa，1997，133，F217-F248；Al-Obeidi等，2000，Oncogene，19，5690-5701；Mendelsohn等，2000，Oncogene.19.6550-6565)。除了這些預先的臨床數據，采用抗EGFR和erbB2的抑制性抗體(依次為c-225和曲妥珠單抗(trastuzumab))的研究結果證明其對于所選實體瘤的治療在臨床上有效(評述見Mendelsohn等，2000，Oncogene，19，6550-6565)。受體酪氨酸激酶的erbB家族的許多小分子抑制劑是已知的，尤其是EGFR和erbB2受體酪氨酸激酶的抑制劑。例如，歐洲專利申請號0566226和國際專利申請WO96/33980和WO97/30034公開了某些在4-位有一個苯胺基取代基的喹唑啉衍生物具有EGFR受體酪氨酸激酶活性，并且它們是包括前列腺癌在內的癌癥組織增殖的抑制劑。JRWoodburn等在Proc.Amer.Assoc.CancerResearch，1997，38，633和Pharmacol.Ther.，1999，82，241-250中已經公開了化合物N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺是一種有效的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。利用代碼號ZD1839和化學文摘登記號184475-35-2，該化合物還被稱作易瑞沙(注冊商標)、吉非替尼(美國采用的名字)。下文中，將該化合物稱為吉非替尼。近來吉非替尼在日本已經獲得批準用于治療無法用手術進行治療的或復發的非小細胞肺癌(NSCLC)，并且在美國被批準在鉑和多烯紫杉醇(docetaxel)化學治療失敗后作為用于治療患有局部晚期轉移性NSCLC患者的單治療。此外從國際專利申請WO96/30347中已知某些在4-位有一個苯胺基取代基的結構相關的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。WO99/55683公開了化合物N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺或者其藥學上可接受的鹽(與代碼號CP358774和OSI-774相聯系，下文用代碼號OSI-774表示)是一種EGFRTKI。從國際專利申請WO97/38983中進一步可知某些其它的在4-位有一個苯胺基取代基的結構相關的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。在J.Med.Chem.，1999，42，1803-1815和WO00/31048中公開了化合物6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(與代碼號PD183805和CI1033相聯系，下文用代碼號CI1033表示)是一種EGFRTKI。從國際專利申請WO97/02266中進一步可知某些在4-位有一個苯胺基取代基的結構相關的雜環衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。例如化合物4-[(1R)-1-苯乙基氨基]-6-(4-羥基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(與代碼號PKI-166、CGP75166和CGP59326相聯系，下文用代碼號PKI-166表示)是一種EGFRTKI。從歐洲專利申請號0787722和國際專利申請WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中進一步可知某些其它在4-位有一個苯胺基取代基的結構相關的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。例如化合物N-[4-(3-溴代苯胺基)喹唑啉-4-基]丁-2-炔酰胺(與代碼號CL-387785和EKB-785相聯系，下文用代碼號CL-387785表示)是一種EGFRTKI。從NatureMedicine，2000，6，1024-1028和美國專利號6,002,008中進一步可知某些其它在4-位有一個苯胺基取代基的結構相關的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。例如化合物4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-6-(4-二甲基氨基丁-2(E)-烯酰胺基)-7-乙氧基喹啉(下文用代碼號EKB-569表示)是一種EGFRTKI。從WO99/35146和WO01/04111中還可得知的是，某些喹唑啉衍生物是一種或多種erbB受體酪氨酸激酶的抑制劑。例如，化合物N-f3-氯-4-[(3-氟代芐基)氧]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺(也表示為lapatinib或下文中以代碼號GW2016表示)就被認為是EGF和erbB2受體酪氨酸激酶的抑制劑。NovartisAE788是另一種合適的抑制劑化合物。還可以用適當的抗erbB受體的抗體抑制胞外配體結合到受體上從而抑制erbB受體酪氨酸激酶。例如利用抗erbB2的抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)[HerceptinTM]和抗erbbl抗體西妥昔單抗(cetuximab)[C225]。已經證明在臨床中使用這種抑制性抗體有利于治療所選擇的實體瘤(評述見于Mendelsohn等，2000，Oncogene，19，6550-6565)。如上所述，吉非替尼是一種表皮生長因子受體-酪氨酸激酶(EGFR-TK)的口服活性抑制劑，其阻斷了負責驅動增殖、侵襲和癌細胞生存的信號傳導通路[7]。在對基于鉑的化學治療不應答的患有晚期NSCLC的登記患者的臨床研究中觀察到了有效的抗腫瘤作用和NSCLC相關癥狀和生活質量的快速改善。在隨機的雙盲II期單藥治療試驗(IDEAL1試驗)中，將吉非替尼用作對晚期NSCLC的化學治療的第2或第3條線所獲得的腫瘤反應率為18.4％(95％CI11.0-25.9％)，在IDEAL2試驗中，將其用作對晚期NSCLC的化學治療的第3或第4線所獲得的腫瘤反應率為11.8％(95％CI6.2-19.7％)[8]、[27]、[28]。而且，在這些試驗中，該藥的治療獲得了高疾病控制率(IDEAL1中為54.4％，IDEAL2中為42.2％)及一般的總體癥狀改善率(IDEAL1中為40.3％，IDEAL2中為43.1％)。當與對于常規的細胞毒性劑的反應相比時，這些結果是有希望的，但是事實仍然是該研究中的登記患者中約有半數并未獲得有效治療，病癥沒有得到改善。而且，這種藥物治療易對無應答者產生副作用，包括威脅生命的副作用如間質性肺炎[11]。患者對不同化學療法的反應各不相同，因此就需要發現能夠預測哪一種治療方式最適合某個具體的患者的方法。越來越多的證據提示患者對多種藥物產生的應答可能與患者的遺傳圖譜有關，影響例如對某種藥物的應答的遺傳因子的確定可用于給患者提供個人化的治療方案。這種個人化的治療方案為患者提供了使治療效果最佳的可能性，同時減少了例如與可選擇的治療方法或效果更差的治療方法有關的副作用。因此需要一種能夠預測患者對藥物的反應的方法。發明概述實驗證明，某些癌癥對化學治療劑的敏感性可以通過基因表達預測到，因此可以通過測定患者組織中某些基因的相關水平來確定用這些化學治療劑治療癌癥患者的適合性。因此，本發明提供了一組分離的標記基因，包括至少一個鑒定為在患者間具有差異表達的基因，所述患者是對一種erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應答者和非應答者；所述分離的基因組包括一個或多個選自至少由包括衍生于所述基因的特異性寡核苷酸在內的表4中所列的51個基因構成的組中的基因。表4中，給出了這些基因在GeneBank數據庫中的登錄號。本領域技術人員應當理解的是，在所給登錄號中的序列代表的僅僅是該表格中所涉及的基因序列的例子；包括含有序列糾錯的序列在內的可選擇的序列、等位基因或其它變異，剪接突變等也包括在用這些名字所表示的基因的定義中。在最優選的實施方式中，所涉及的序列是登錄號中所列序列以及表4a中詳細列出和陳述的具體序列。另一方面，本發明還提供了一組分離的標記基因，包括至少一個鑒定為在患者間具有差異表達的基因，所述患者是對一種erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應答者和非應答者；所述分離的基因組包括一個或多個選自于至少由包括衍生于所述基因的特異性寡核苷酸在內的表4中所列的51個基因構成的組中的基因。本發明通過使治療與每個患者相適應從而發揮各種現有藥物更為有效的用途，使得改良預測以及由此產生的癌癥患者的生活質量的提高成為可能。優選的組是表4中所列前40個基因中的至少一個或多個。更為優選的組是表4中所列前20個基因中的至少一個或多個。更為優選的組是表4中所列前12個基因中的至少一個或多個。更為優選的組是表4中所列前5個基因中的至少一個或多個。特別優選的組是表4a中所列前12個基因，也就是FLJ22622(例如GenBankNM024829)、AREG(例如GenBankBC009799)、COR01C(例如GenBankNM-014325)、AVEN(例如GenBankBC010488)、DUSP3(例如GenBankNM004090、DJ473B4(例如GenBankAI026836)、PHLDA2(例如GenBankBU500509)、RBM7(例如GenBankNM0106090)、EST(GenBankBX0952512)、OSMR(例如GenBankAI436027)、GCLC(例如GenBankAI971137)、COL4A3BP(例如GenBankBQ024877)。優選的是，所述抑制劑選自吉非替尼、OSI-774、PKI-166、EKB-569、GW2016、CI-1033和一種抗erbB抗體如曲妥珠單抗(trastuzumab)和西妥昔單抗(cetuximab)。最優選的是，所述抑制劑是吉非替尼。本發明尤其適用于預測在那些患有單獨或部分受erbB受體酪氨酸激酶調控的癌癥的患者或患者群中對前述化學治療劑的應答。這些癌癥包括，例如非實體瘤如白血病、多發性骨髓瘤或淋巴瘤，和實體瘤如膽管、骨、膀胱、腦/CNS、乳腺、結腸直腸、子宮頸、子宮內膜、胃、頭和頸、肺、肝、肌肉、神經元、食道、卵巢、胰腺、胸膜/腹膜、前列腺、腎臟、皮膚、睪丸、甲狀腺、子宮和陰門腫瘤。本發明尤其適用于鑒定對例如如上定義的erbB受體酪氨酸激酶抑制劑這樣的化學治療劑產生應答的患有NSCLC，尤其是包括晚期腺癌在內的晚期NSCLC的患者。本發明通過鑒定NSCLC的“個體的癌癥圖譜”從而確定哪種腫瘤會對吉非替尼產生應答，在例如NSCLC尤其是晚期NSCLC這樣的癌癥治療方面提供了相當大的優勢。這包括無法用第一條治療線和例如化學療法這樣的其它任何治療方法治療的患者。本發明對于治療以前無法用化學療法如基于鉑的化學療法治療的NSCLC的患者特別有效。本發明對于治療以前接受過化學療法如基于鉑的化學療法治療的局部晚期(IIIB階段)或轉移性NSCLC(IV階段)的患者也特別有效。本發明還提供了一種預測患有癌癥例如肺癌患者或患者群中對使用化學治療劑尤其是erbB受體酪氨酸激酶抑制劑進行治療的應答性，包括比較選自如上定義的基因組中的一組標記基因的差異表達。優選通過基因表達圖譜進行表達的評價，所述基因表達圖譜采用的是基于寡核苷酸的陣列或任何形式的基于cDNA的陣列的RT-PCR(反向轉錄-聚合酶鏈式反應)；實時PCR、原位雜交、RNA印跡法、基因表達的連續分析(SAGE)例如Velculescu等在Science270(5235)484-487中描述的，或差別表達。這些和其它方法的細節都可以在例如Sambrook等，1989，MolecularCloningALaboratoryManual)中找到。這種評價優選使用微陣列分析。作為選擇，或另外，所述評價還使用免疫組化分析。另一方面，本發明還提供了一種用于預測患有癌癥患者或患者群對使用化學治療劑尤其是erbB受體酪氨酸激酶抑制劑治療的應答性的試劑盒，包括合適的支持介質上的如上定義的標記基因組。優選的是，標記基因連接在載體材料上或者像硝酸纖維素這樣的膜上，或尼龍或塑料膜或載玻片上。該試劑盒優選含有一種微陣列。包括優選實施方式的發明詳述通過下面的實施例將對本發明進行更為詳細的說明和闡述，所述實施例用于幫助本領域技術人員實現本發明，但無論如何都不是要限制本發明的范圍。下面對本發明的一些要素進行更詳細的描述。根據這里所述的實施方式的內容，“分離的標記基因組”在這里是指一組可用于對根據本發明的患者的應答分類或歸類的基因。“差異表達”基因是在應答者或非應答者組間以更高水平或更低水平表達的基因。“應答者/非應答者”按照國際抗癌聯盟/世界衛生組織(UICC/WHO)標準的目標腫瘤應答按如下方式分類完全性應答(CR)在所有可評價的損傷中沒有殘留腫瘤；部分應答(PR)在可測量的損傷的總量中有殘留的腫瘤，表現為由于化學療法的誘導，與基線相比減少了50％或更多并且沒有新的損傷；穩定的疾病(SD)有殘留的腫瘤，不符合CR的要求；和進行性疾病(PD)在可測量的損傷的總量中殘留的腫瘤表現為與基線相比增加了25％或更多或者出現新的損傷。本發明對于確定患者是CR還是PR尤為有效。“ErbB受體抑制劑包括但不僅限于erbB受體酪氨酸激酶抑制劑”該家族包括如本發明發明背景部分描述的EGF、erbB2(HER)、erbB3(注意erbB3沒有功能型激酶區域)和erbB4。“基因特異性寡核苷酸”意思是這些寡核苷酸對于各個基因而言是特有的，以便例如所述基因的片段唯一識別該基因。有利的是，一個基因特異性寡核苷酸長度在5至50個核苷酸之間，優選為約15至30個寡核苷酸，最優選為約23個寡核苷酸。“陣列或微陣列”在許多教科書和文獻中一般性地描述了陣列技術和各種與之相關的技術和應用。基因陣列技術尤其適于實施本發明。制備微陣列的方法是本領域中所公知的。這些方法包括Lemieux等，(1998)，MolecularBreeding4，277-289，Schena和Davis.ParallelAnalysiswithBiologicalChips.inPCRMethodsManual(eds.M.Innis，D.Gelfand，J.Sninsky)，Schena和Davis，(1999)，Genes，GenomesandChips。在DNA微陣列中APracticalApproach(ed.M.Schena)，OxfordUniversityPress，Oxford，UK，1999)，TheChippingForecast(NatureGeneticsspecialissue；January1999Supplement)，MarkSchena(Ed.)，MicroarrayBiochipTechnology，(EatonPublishingCompany)，Cortes，2000，TheScientist14[17]25，GwynneandPage，微陣列分析thenextrevolutioninmolecularbiology，Science，1999August6；和EakinsandChu，1999，TrendsinBiotechnology，17，217-218。所述技術在PCT/US01/10063和US2002090979及其參考文獻中有描述。供應商包括Affymetrix(California)和ClontechLaboratories(California)。陣列技術的主要應用包括序列的鑒定(核苷酸序列/核苷酸序列突變)和測定核苷酸序列的表達水平(豐度)。基因表達圖譜可利用陣列技術，也可結合利用蛋白組學技術(Celis等，2000，FEBSLett，480(1)2-16；Lockhart和Winzeler，2000，Nature405(6788)827-836；Khan等，1999，20(2)223-9)。陣列技術的其它應用也是本領域中已知的；例如，核苷酸序列的發現、癌癥研究(Marx，2000，Science2891670-1672；Scherf，等，2000，NatGenet；24(3)236-44；Ross等，2000，NatGenet.2000Mar；24(3)227-35)，SNP分析(Wang等，1998，Science，280(5366)1077-82)、藥物發現、藥理基因組學(pharmacogenomics)、疾病診斷(例如，利用微觀流體裝置Chemical&EngineeringNews，February22，1999，77(8)27-36)、毒理學(RockettandDix(2000)，Xenobiotica，30(2)155-77；Afshari等.，1999，CancerResl；59(19)4759-60)和毒理基因組學(toxicogenomics)(功能性基因組學與分子毒理學的雜合體)。毒理基因組學的目標是查明對有毒物的毒性反應與暴露于這種有毒物的對象的核苷酸序列圖譜的改變之間的相關性(Nuwaysir，等(1999)，MolecularCarcinonucleotidesequencesis，24153-159)。一般而言，通過在空間上隔開文庫中的成員，任何文庫都可以以整齊的方式排列成一種陣列。適于用作排成陣列的文庫的例子包括核酸文庫、肽、多肽和蛋白質文庫，以及其中包括任意分子的文庫例如配體文庫。因此，提到“文庫”之處，其包括陣列形式的文庫。文庫的成員通常被固定到或固定化在固相上，優選固定在一種固體基底上，以限制試樣的擴散和混合。尤其是，這些文庫可以被固定化在結實的平面固相上，其包括膜和無孔的基質例如塑料和玻璃。此外，以便于標定(也就是參考或通向某一特定標本)的方式排列試樣。典型的是，在格子形成中將這些試樣點樣成斑點。為了實現該目的，可以對一般的檢測系統進行修改。例如，可將陣列固定在微板的表面上，既可以是多份試樣在一個孔中，也可以是每個孔中一種試樣。此外，固體基底可以是膜，例如硝基纖維素或尼龍膜(例如，用于印跡實驗的膜)。可供選擇的基底包括玻璃或基于二氧化硅的基底。因此，通過任意合適的本領域公知方法，例如通過電荷相互作用或通過化學偶聯將試樣固定到孔壁或孔的底部或者固定到膜表面上。還可以使用其它排列和固定手段，例如移液操作、滴落-接觸、壓電方式、墨水噴射和泡沫噴射技術、靜電作用等。就基于硅的芯片來說，可利用光刻法將試樣排列和固定在芯片上。可以通過形成″斑點″排列在固體基底上；這可通過手動或利用機器人技術來固定試樣。一般而言，陣列可被稱為巨陣列或微陣列，區別在于試樣斑的尺寸。巨陣列通常含有尺寸約為300微米或更大的試樣斑，通過現有的凝膠和印跡掃描儀就可簡便地成像。微陣列中的試樣斑尺寸直徑通常小于200微米，這種陣列通常含有數千個斑點。因此，微陣列可能需要專業化的機器人技術和成像設備，這可能需要定做。由Cortese，2000，TlaeScientist14[11]26做的評述中概括地描述了使用儀器的方法。用于生產DNA分子的固定化文庫的技術在現有技術中已有描述。一般而言，最早的技術方法描述了如何制備單鏈核酸分子文庫，采用例如分色涂蓋技術在固體基底上的多個不連續的位點建立序列的各種排列。US5,837,832描述了一種用于生產固定在硅質基底上的DNA陣列的改良方法，其基于超大規模集成化技術。尤其是，US5,837,832描述了一種用于制備位于基底上的空間確定的位點上特異性的探針組合的被稱之為“貼瓷磚”的策略，其可用于生產本發明的固定化DNA文庫。US5,837,832也提供了可以使用的早期技術的參考文獻。為了幫助檢測，可以用像熒光、生物發光、磷光、放射性報道分子這樣的任意可簡單檢測的報道分子來標記目標和探針。在Shalon等，1996，GenomeRes6(7)639-45中公開了探針和目標的標記。本發明方法中所采用的材料理想地是適于制備試劑盒的材料。一般包括一套說明書。常規的重組DNA方法技術除非另有說明，本發明采用了常規的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫技術，這些技術在本領域普通技術人員的能力范圍內。這些技術在文獻中有說明。參見例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F.M.等(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，andA.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques，JohnWiley&Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，IrlPress；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology，AcademicPress。這些常規文件都并入本文作為參考。在本發明的一個具體實施方式中，采用一種表示27,648個基因的cDNA微陣列系統篩選能夠為晚期NSCLC預測對吉非替尼的應答性的一組基因。對表達圖譜的統計分析鑒定出了12個在對吉非替尼的應答者和非應答者之間差異表達的基因。一種基于這些基因表達的藥物應答評分系統成功地預測了對吉非替尼治療的應答。圖1圖解說明四種典型的肺腺癌的激光-微光束顯微解剖的圖。上行顯示的是解剖之前的樣品；下行表示的是經解剖的癌癥細胞(H.E.菌株X100)。TBB顯示的是轉支氣管活組織檢查；LN表示的是淋巴結。圖2建立一種用于預測吉非替尼治療效率的評分系統。A.當區分基因的數量改變時出現了不同的預測分。區分基因組的編號(從5到51)對應于從表4的按等級排序列表的頂部選擇出的基因的編號。分類評分(CS)的值越大表明兩組分離得越好。B.采用了用于吉非替尼-敏感性(左)的51個候選基因和12個最終為了GRS而選出的預測基因的17個“學習”病例的等級群聚。樹狀圖代表的是單個的病例之間表達模式的形似性；分枝越長表示差異越大。這兩組被12-基因組最為清楚地分開。C.非應答者和應答者的差異的示意圖，和基于GRS檢驗的“檢驗病例”。紅色菱形表示學習PR病例的預測分，藍色菱形表示學習PD病例。粉色三角形表示未用于建立GRS的檢驗PR病例，藍色三角形表示檢驗PD病例。黃色三角形表示在整個4個月的觀察期間保持SD狀態的檢驗SD病例，綠色三角形表示曾經在該研究中的某一時間點被鑒定為SD而在治療開始后三至四個月內顯示出進行性的檢驗病例。圖3用半定量RT-PCR和免疫組織化學分析對GRS的確認。A.對PR和PD組的RNA的半定量RT-PCR分析的代表性圖象。OSMR和GCLC基因在非應答者中過表達(PD)。通過ACTB的擴增來控制每一cDNA模板的完整性。B.用抗AREG抗體(X200)對從同一PD患者(No.LC21)獲得的纖維鏡經支氣管(肺)活組織檢查(TBB)和淋巴結(LN)活組織檢查的代表性樣品進行組織免疫化學染色。C.用抗其它四個預測標記(TGFA，ADAM9，CD9和OSMR)的抗體(X200)對來自PD患者(No.LC21)的代表性樣品進行組織免疫化學染色。圖4由ELISA測定的5個PR、10個SD和20個PD腺癌病例中的TGFA血清濃度。TGFA的平均血清水平由黑條紋表示在PD患者中為19.0±2.8pg/ml(平均值±標準誤差)，在SD患者中為13.9±1.9pg/ml，在PR患者中為12.8±1.4pg/ml。圖5.分泌的AREG對吉非替尼-敏感性PC-9細胞的抗細胞凋亡作用。A.通過半定量RT-PCR檢查的AREG轉錄物在細胞系PC-9、NCI-H358和-H522中的表達。B.在從NCI-H358或-H522細胞的培養物獲得的補充有10％FCS的培養基、無血清培養基或無血清條件培養基中培養的PC-9細胞。每一種培養基都曾經在48小時的時間點替換成同一種培養基；在加入濃度為0.5或1.0μM的吉非替尼后72小時，通過MTT檢測測量細胞生存能力。對該試驗做了三次。Y軸表示培養在不同培養基中的細胞的相對MTT值(存在0.5或1.0μM的吉非替尼的MTT/不存在吉非替尼的MTT)。C.以自分泌形式分泌的AREG對NSCLC細胞對吉非替尼的抗性的影響。在培養開始時，將PC-9細胞接種在含有1.0μM的吉非替尼和重組的AREG蛋白(終濃度為1-100ng/ml)的培養基中；72小時后，用通過三次重復的MTT測定來檢測細胞的生存能力(藍條)。Y軸表示細胞的相對MTT值(在各濃度的AREG下的MTT/沒有AREG的MTT)。還研究了在沒有1.0μM的吉非替尼存在條件下AREG對NSCLC細胞的生存能力的影響。將單個的PC-9細胞加入到含有重組AREG蛋白但沒有吉非替尼的培養基中；72小時后，用通過三次重復的MTT測定來檢測細胞的生存能力(紅條)。圖6對PD和PR患者的切片中的雙調節素表達進行的免疫組織化學分析。材料和方法患者和組織樣本進行包括多中心試驗的II期臨床研究，以探究產生臨床抗腫瘤效果的主要生物學因子以及研究在以前接受化學治療沒有成功的患有非小細胞肺癌患者中以每日250mg劑量的ZD1839的不利的藥物反應(ADR)和藥代動力學。主要的目的就是闡明能夠預先確定吉非替尼可能的抗腫瘤效果的基因表達圖譜。研究初始，采用至今為止作為基礎原理的研究測定了樣本尺寸12，13。由于在患有肺癌的患者中對吉非替尼的應答率已經低于20％8-10，為了獲得上述檢測的學習病例，檢測了約50位患者。那些局部晚期患者(IIIB階段)或轉移性NSCLCs對一種或多種常規的化療方案產生抵抗的患者都被收錄到該試驗中。收錄的標準是(1)年齡大于20歲(2)體力狀態(PS)0-2，(3)足夠的肝和腎機能試驗。所有患者都在日本的德島大學或KinkiUniversity醫院接受治療，每天口服一次250mg的吉非替尼。該治療一直持續到患者由于(1)疾病的進行，(2)無法忍受的毒力或(3)撤回允諾而脫離該研究。在開始治療后每隔4星期就按照國際抗癌聯盟/世界衛生組織(UICC/WHO)概述的標準對目標腫瘤應答進行評定。應答的分類如下完全應答(CR)，在所有可評價的損傷中沒有殘留腫瘤；部分應答(PR)在可測量的損傷的總量中有殘留的腫瘤，表現為由于化學療法的誘導，與基線相比減少了50％或更多并且沒有新的損傷；穩定的疾病(SD)有殘留的腫瘤，不符合CR的要求；和進行性疾病(PD)在可測量的損傷的總量中殘留的腫瘤表現為與基線相比增加了25％或更多或者出現新的損傷。所有可評價的損傷都是采用與基線相同的技術如普通X-射線、CT或MRI以二維方式測量的(可測量的損傷的最大直徑與其最長的垂線的乘積之和)。在4個月治療結束(或停止服藥)時，根據下列定義評定每位患者的最佳總應答CR，在兩個連續的檢測時間點之間的間隔為至少28天的符合CR要求的患者；PR，在兩個連續的檢測時間點之間的間隔為至少28天的被判定為PR或更好的患者；SD，在兩個連續的檢測時間點之間的間隔為至少28天的被判定為SD或更好但不符合CR或PR的患者。SD病例的第一次判斷應該在第一次腫瘤檢測時間點或這之后(隨機取樣28天后)；PD，在第一次腫瘤檢測時間點或這之前被確定為PD的患者(隨機取樣28天后)；未知，不符合對加重的疾病最佳應答的患者，在基線之后(隨機取樣之前)和在進行之前所有的目標狀態都是未知的。在吉非替尼治療前，經書面同意經支氣管(肺)(TBB)、皮膚或淋巴結活組織檢查取出腫瘤樣本。從各個研究所的倫理委員會已經獲得論理學的允許。立刻冰凍活組織檢查樣本，包埋在TissueTekOCT培養基中(Sakura，Tokyo，Japan)，在80℃下儲存。對所有的樣本都進行了顯微鏡檢驗，一開始就選擇了來自于28名患者(17個學習病例和11個檢驗病例)的樣本以進行進一步分析，這些樣本都含有足夠的癌癥細胞以用于表達圖譜分析。為了驗證該預測系統，來自于5個新登記的病例(4PD和1SD)的樣本的隨機組合(blindedset)也被加入到11個檢驗病例中。這些患者的臨床和組織學信息被總結在表1-3中。顯微解剖考慮到癌癥細胞和各種從一種腫瘤到遞呈到另一種上的實質細胞在比例上的差異，顯微解剖是一種在cDNA陣列上獲得精確的基因表達圖譜的必要手段。因此，我們用蘇木精和曙紅對8μm厚的冰凍切片染色，使用μCUT激光微光束顯微解剖系統(MolecularMachines&IndustriesAG，Glattbrugg，Switzerland)14選擇性地收集癌癥細胞。在該系統中，組織切片被安置在一種薄的支撐性聚乙烯膜上，該膜將會與該靶組織一起被切下；脈沖-紫外線(UV)狹窄光束聚焦激光沿著可在顯示屏觀察到的預先選擇的路線切下癌癥細胞。這種要提取的材料決不直接暴露于激光下而是僅僅被激光包圍；不像其它LMM系統，這使得切下的細胞在沒有輻射的條件下得以恢復從而繼續存活。采用這種系統，我們能夠快速分離組織的小片區域，并從組織切片中分離出單細胞(圖1)。RNA提取和基于T7的RNA擴增用RNeasy迷你試劑盒和不含RNA酶的DNA酶試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany)按照生產商提供的方案從癌癥細胞的各顯微解剖群中提取總RNA。如上所述，對總RNAs進行基于T7的RNA擴增15。從每份樣本中進行兩個循環的擴增獲得40-200μg的aRNA(經擴增的RNA)(＞100,000倍)。作為對照探針，以同樣方式擴增出正常人肺poly(A)+RNA(BDBiosciencesClontech，PaloAlto，CAandBIOCHAIN，Hayward，CA，USA)。在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP存在下分別將各樣本和對照組中的aRNA等分樣品(2-5μg)反轉錄。cDNA微陣列我們的“廣及基因組-范圍的”cDNA微陣列系統含有從國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的UniGene數據庫中選出的27,648個cDNAs15。所述微陣列的制作、雜交、清洗和信號強度的檢測以前都被描述過15。為了使腫瘤和對照組中的mRNA量標準化，將每種基因表達的Cy5/Cy3比率調整到使得52個管家基因的平均Cy5/Cy3比率等于1。我們利用方差分析將截止值分配給每一個微陣列玻片以如下方式計算基因的Cy5/Cy3比率(1)如果Cy5(癌癥樣本)低于截止水平，那么該基因的Cy5/Cy3比率就被替換為其Cy5和Cy3高于切斷水平的其它基因的Cy5/Cy3比率中的2.5％；(2)如果Cy3(對照樣本)低于截止水平，那么該基因的Cy5/Cy3比率就被替換為其Cy5和Cy3高于切斷水平的其它基因的Cy5/Cy3比率中的97.5％；(3)如果Cy5和Cy3都低于截止水平，那么該基因的Cy5/Cy3比率就空著。用于預測對吉非替尼應答的基因的提取為了發現可能與對吉非替尼的敏感性相關的基因，比較了兩組患者間約27,648個基因的各種測量結果，這兩組中其中一組被分類為對吉非替尼應答者(PR)，另一組分為非應答者(PD)。為了減小可能在兩類間存在差異的有效基因的數目的維數，我們僅提取了滿足以下兩個標準的基因1)在各組的至少60％中的信號強度高于截止水平，和2)|MEDPR-MEDPD|□1，其中MED指示在每組中從對函數變換的相對表達比率計算而獲得的中位數。然后應用隨機置換測試來測定各個基因區分兩類(PR和PD)的能力；從經對數轉換的兩組中每種基因的相對表達比率計算出平均值(μ)和標準偏差(σ)。每種基因的辨別分值定義如下DS＝(μPR-μPD)/(σPR+σPD)。對于各組中的每一對都將樣本隨機置換1000次。由于每種基因的DS數據組都顯示出正常的分布，因此我們計算出一種用于使用者定義分組的p值。藥物反應分值的計算我們按照前述方法計算出反映候選預測基因表達水平的吉非替尼應答評分(GRS)16-18。每一種基因(gi)是投票贊成應答者(PR)還是非應答者(PD)依賴于樣本中表達水平(xi)是否接近于標準樣本中的一組或另一組的平均表達水平。票數的數量(vi)反映了樣本中的表達水平與兩個分類的平均值的偏差Vi＝|xi-(μPR+μPD)/2|。我們統計了票數而獲得了支持應答者(VPR)和非應答者(VPD)的總票數，并且以如下方式計算出GRS值GRS＝((VPR-VPD)/(VPR+VPD))×100，其中GRS值反映了在應答者或非應答者的方向中的勝利的界限。GRS值的范圍在-100至100；GRS的絕對值越高，預測的可靠性越強。評分的交互證實以及對預測系統的評價通過末位淘汰方法獲得所有樣本的預測得分，在該方法中，每一次從樣本組中移除一種樣本；使用剩下的樣本計算每種基因的兩個分類的置換p值和平均值。通過計算預測得分來預測留下的樣本的藥物反應。對于每份樣本都要重復一遍上述步驟16-17。為了評價預測系統的可靠性，我們采用每個基因組合中的應答者和非應答者的GRS值以如下方式計算出“分類得分”(CS)CS＝(μGRSpr-μGRSpd)/(σGRSpr+σGRSpd)17。CS值越大說明由預測系統將兩組分開得越好。分級群聚我們利用可從網上獲得的M.Eisen(http//genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/restech.html)編寫的軟件(″Cluster″and″TreeView″)制作出微陣列序列數據的圖示并制作出分級群聚的樹狀圖。在應用聚類算法之前，將每個斑點的熒光比率首先進行對數轉換，然后對于每種樣本的數據，以中位數為中心排除掉實驗誤差。半定量RT-PCR分析使用寡(dT)12-18引物和SuperScriptII逆轉錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)逆轉錄雜交到微陣列玻片上的來自于各個樣本和正常對照肺的相同aRNA的等分樣品(5.0μg)。使用下組特異于用于建立GRS的前12個基因的合成引物或者使用β-肌動蛋白(ACTB)特異性引物作為一種內部對照來進行半定量RT-PCR實驗FLJ22662，5’-GCCATAAGTGGTCCCACAGT-3’和5’-GTCTTCTAGTCCGTCATCTCCCT-3’；雙調蛋白(AREG)5’-CCATAGCTGCCTTTATGTCTGC-3’和5’-CTTTTTACCTTCGTGCACCTTT-3’；冠蛋白、肌動蛋白結合蛋白質、1C(CORO1C)、5’-TAATCTGCTGAGGACCTTTTGTC-3’和5’-TAATTCACTGTCCTCTTCTGGGA-3’；細胞凋亡、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性抑制因子(AVEN)、5’-GCTCACAGCAGTAAATGCCTA-3’和5’-TGCTATGCTGTAAACACTGGCTA-3’；雙特異性磷酸酶3(DUSP)、5’-GGATCCTTTATTGGTGGTAGAGC-3’和5’-CCAGAGTGACCCTGAAGATAAAT-3’；DJ473B4、5’-ACCTGATTCTCTAGGTGCAGTTT-3’和5’-GTCGTTTCAACCAGGTAGTTTTG-3’；血小板白細胞C激酶底物同源性樣區域、家族A、成員2(PHLDA2)，5’-GGGCGCCTTAAGTTATTGGA-3’和5’-GGATGGTAGAAAAGCAAACTGG-3’；RNA結合基序蛋白7(RBM7)，5’-TGTAAATGGAGATTGTACAGGTTG-3’和5’-AGGAACAGTACAAATGCTGTGGT-3’；BX092512(EST)、5’-GCACTCCTTGAAGGTACACTAAC-3’和5’-ATTTGTATTCACTCAGCCATGC-3’；制瘤素M受體(OSMR)、5′-ACCCAACTTCAAAACTAGGACTC-3′和S′-ACAGCTTGATGTCCTTTCTATGC-3′；谷氨酸-半胱氨酸連接酶、催化亞基(GCLC)、5′-TCATGAAAGGCACTGAGTTTTG-3′和5′-GTTAGCTGAAGCAGCTITATTGC-3′；膠原、IV型、α3結合蛋白(COL4A3BP)，5′-ATATGCACAATCCTGGAAGTGA-3′和5′-TGCCTTACTAGCATTACCACCAT-3′；ACTB、5′-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3′和5′-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGG3′。已針對循環數對PCR反應進行了優化以確保產物濃度在擴增的對數生長期內。我們進行了磷光成像定量分析(MolecularImagerFXBio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)，并且將RT-PCR的譜帶強度與微陣列數據中的標準化的基因表達的Cy5/Cy3比率進行了定量比較。進行RT-PCR以篩選出最近報道的作為一種突變熱點的EGFR的第709-870位密碼子的完整區域(從p-環至活化環)中的突變，其中采用了三組引物片段1，5’-TCTTACACCCAGTGGAGAAGC-3′和5′-GTCTTTGTGTTCCCGGACAT-3’；片段2，5′-ACTATGTCCGGGAACACAAA-3′和5′-TTCCGTCATATGGCTTGG-3′；片段3，5′-CGTCGCTATCAAGGAATTAAGAG-3′和5′-GTAGCTCCAGACATCACTCTGGT-3′。通過直接測序分析了經吉非替尼治療的19名患者的RT-PCR產物。免疫組織化學分析為了證實編碼EGFR和其它ERBB成員的配體的AREG和轉化生長因子-α(TGFA)蛋白和其它3個公知的與EGFR信號傳遞相關的用于預測對于吉非替尼的應答者和對非應答者的候選標記(一種解聯蛋白和金屬蛋白酶區域9(ADAM9)、CD9抗原(p24)和OSMR)的差異表達，我們用ENVISION+試劑盒/HRP(DakoCytomation，GlostrupDenmark)對由纖維鏡經支氣管(肺)活組織檢查(TBB)和淋巴結活組織檢驗獲得的臨床組織切片進行染色。在內源性過氧化物酶和蛋白質封閉反應后，迅速加入抗人AREG多克隆抗體(NeoMarkers，Fremont，CA，USA)、抗人TGFA單克隆抗體(Calbiochem，Darmstadt，Germany)、抗人ADAM9單克隆抗體(R&DSystemsInc.Minneapolis，MN，USA)、抗人CD9單克隆抗體(NovocastraLaboratoriesLtd，NewcastleuponTyne，UK)或抗人OSMR單克隆抗體(SantaCruzBiotechnology，Inc.，SantaCruz，CA，USA)，然后以經HRP標記的抗兔或抗小鼠IgG作為第二抗體。然后加入基質-色原體，使用蘇木精將樣本復染色。選出來自于11名患者的病毒組織樣本用于免疫組織化學分析。由沒有臨床重復數據的預先知識的三名獨立的研究人員通過評分強度將免疫染色的陽性半定量地評估為缺乏或陽性的。只有當評論者獨立地定義為陽性時才認為這些案例是陽性的。ELISA從由35名接受了根據與日本的廣島大學醫院的該項臨床研究同樣的方案以吉非替尼治療的肺-ADC患者(5名PR、10名SD和20名PD)組成的獨立的組中獲得血清。所有患者血清都是在診斷時征得患者同意下于開始治療后每隔4周獲得的，并且儲存于-80℃。通過采用一種可商購的酶檢測試劑盒(TGF-alphaELISA試劑盒OncogeneRsearchProducts，SanDiego，CA，USA)的ELISA檢測血清的TGFA水平。體外吉非替尼治療和AREG-自分泌測定人NSCLC(腺癌)細胞系PC-9、NCI-H358和NCI-H522是從美國典型培養物保藏中心(ATCC；Rockville，MD，USA)購買的。為了檢測AREG在這些NSCLC(腺癌)細胞中的表達，用寡(dT)12-18引物和SuperscriptII(Invitrogen)將各個細胞系的總RNA反轉錄成單鏈cDNA。按以前描述的方式進行半定量反轉錄酶-PCR(RT-PCR)14。吉非替尼(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉ZD1839，易瑞沙)是由AstraZenecaPharmaceuticals(Macclesfield，UK)提供的，它是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶的抑制劑。以10mM的濃度將該藥溶解于DMSO，并保存在-20℃。我們進行了流式細胞術以確定肺腺癌細胞系對吉非替尼治療的敏感性。以5×105細胞/100-mm培養皿的濃度將細胞平鋪，并且在合適的無血清培養基中用1.0μM的吉非替尼進行處理。在處理后將細胞胰蛋白酶消化72小時，收集于PBS中，在70％冷乙醇中固定30分鐘。用100μg/ml核糖核酸酶(Sigma-AldrichCo.，St.Louis，MO，USA)處理后，用50μg/ml的PBS中的碘化丙錠(Sigma-AldrichCo.)對細胞染色。在BectonDickinsonFACScan上進行流式細胞術，用ModFit軟件(VeritySoftwareHouse，Inc.，Topsham，ME，USA)分析。從至少20,000個無門控的細胞中確定了細胞周期的G0/G1、S和G2/M期的細胞核的百分數以及G1亞期的總數。為了研究AREG的作用是否是在吉非替尼處理的肺腺癌細胞中發揮自分泌抗細胞凋亡因子的作用，我們進行了以下測定。首先在吉非替尼處理前，在無血清培養基中培養不表達AREG的吉非替尼敏感性PC-9細胞至少8小時。然后將這些細胞與0.5或1.0μM吉非替尼一起在無血清培養基或補充有10％FCS的培養基或者是從表達AREG的細胞(NCI-H358或NCI-H522)的72小時培養物中收集的無血清條件培養基中培養72小時。在48小時時間點用含有吉非替尼的相同培養基將每種培養基都更換一次。為了檢測每個細胞系對吉非替尼的反應，通過采用細胞計數試劑盒(CellCountingKits)(WAKO，Osaka，Japan)的MTT檢測評價生存能力。為了證實AREG對吉非替尼抗性NSCLC細胞的自分泌的影響，我們在含有1.0μM吉非替尼和終濃度為1-100ng/ml的重組AREG蛋白(Genzyme-Techne，Minneapolis，MN，USA)的無血清培養基中培養PC-9細胞72小時。用MTT檢測評價細胞的生存能力。還通過在無血清無吉非替尼僅含重組AREG蛋白的培養基中培養PC-9細胞而評價了AREG自身對NSCLC細胞的的生存能力的影響。以上述方式進行MTT檢測。結果對吉非替尼治療的應答在53名參加本試驗的患者中，46名的腫瘤被診斷為腺癌(86.8％)；5名為扁平細胞癌(9.4％)；兩名為大細胞癌(3.8％)。15名患者實現了PR并且沒有人顯示出CR；17名患者被分類為SD，19名被分類為PD。有2名患者的臨床應答數據無法獲得。該治療的腫瘤應答率(CR+PR/CR+PR+SD+PD)為29.4％，疾病控制率為(CR+PR+SD/CR+PR+SD+PD)62.8％(表1)。腫瘤樣本是從43名患者中收集的。來自于這43名患者的樣本含有足夠的腫瘤細胞數量以用于分析我們的cDNA微陣列上的表達圖譜。所認定的適于進行進一步微陣列分析的樣本的數量為8個PR、7個SD、13個PD(表2)。以28個樣本中的17個作為學習病例(7個PR、10個PD)進行分析，以11個樣本作為檢驗病例(1個PR、3個PD、7個SD)以建立一種預測吉非替尼治療效果的預測評分系統。為了進一步確認該預測系統的有效性，獲得了另外一組來自于5名新加入的檢測病例(4個PD和1個SD)的樣本的隨機組合(blindedset)，最后將其加入到上述起初的11個檢驗病例中。與對吉非替尼的敏感性相關的基因的鑒定我們通過比較27,648個基因的表達水平試圖提取在PR組(定義為應答者)中的7名患者的腫瘤和PD組(定義為非應答者)的10名患者的腫瘤之間差異表達的基因。(表2，3)我們進行隨機置換檢驗以區分由腫瘤應答定義的兩種亞類，鑒定出置換p值低于0.001的51個基因(表4)。在非應答者中，40個基因的表達水平更高一些，其它11個基因的表達水平更低一些。一種預測吉非替尼治療效果的預測評分系統的建立基于上述51個選出的基因的表達圖譜，我們試圖建立一種預測吉非替尼治療效果的預測評分系統。預測得分，稱之為吉非替尼應答得分(GRS)，是按照前述方法計算的(參見方法部分)。為了確定用于提供兩組的最佳區分的候選基因的數量，我們基于它們的置換p值的顯著性對這51個基因進行了按序排列并且通過末位淘汰檢驗法(leave-one-outtest)從按序排列的列表的底部開始遞減1個(51、50、49、48等等)計算了預測得分。我們計算出一種分類得分(CS)，這是我們以前定義的用于評價每組基因區分兩種類別的能力的一種標準17。如圖2A中所示，在差別基因的數量改變時我們獲得了不同的預測得分。當我們采用我們的候選基因列表中的頭12個基因計算得分時，我們獲得了最佳CS，這意味著應答者與非應答者得以最佳區分。采用所有51個基因或僅僅頭12個基因的分級群聚分析，根據對吉非替尼的應答將所有17個病例分至兩組中的其中一組(圖2，B)。當我們使用這頭12個基因進行簇分析時，這兩組能夠最清楚地被區分。最后，我們建立了一種數值的藥物-應答-評分算法，其基于所選出的這12個基因的表達水平可臨床上用于預測個體的NSCLC對吉非替尼的敏感性。為了證實該預測系統的有效性，我們研究了與這17個用于建立所述系統的“學習病例”完全無關的另外8個(″檢驗″)NSCLC病例(1個PR，7個PD)。我們對這些樣本中的每一個樣本中的基因表達圖譜進行了檢驗，然后根據這12個差別基因的表達水平計算出GRS。如圖2C中所示，在所有8個″檢驗″病例中由GRS系統獲得的得分與對吉非替尼的臨床應答相一致。患有SD的患者在腫瘤應答中的GRS值根據上面建立的預測評分系統，計算出8名檢測-SD患者的GRS值。雖然這些值廣泛地分布在-83.0(預測為非應答者)至61.6(應答者)，整個觀察期間維持在SD狀態的患者的得分可能高于在該研究中的某個時間點被認定為SD但在治療開始后3或4個月內顯示出疾病進行性的患者的得分(圖2，C)。盡管GRS系統是基于區分于腫瘤應答中患有PR的患者和患有PD(沒有SD)的患者之間的基因表達圖譜建立的，這些結果顯示GRS適于按患者對吉非替尼的應答將SD患者分成各個小組。用半定量RT-PCR對GRS有效性進行的驗證為了證實前12個預測基因在PR和PD病例間的差異表達，把從微陣列獲得的表達值與從相同患者中獲得的RNA的半定量RT-PCR所得的值聯系起來(5個PR和7個PD)(圖3A、表5A)。所有這12個基因的Spearman等級相關性是正相關，并且這12基因中有7個是顯著正相關的。GRS有效性的免疫組織化學驗證為了驗證預測蛋白標記在PR和PD病例間的差異表達，我們用五種不同的抗AREG、TGFA、ADAM9、CD9和OSMR抗體進行了免疫組織化學染色，已知的是AREG、TGFA、ADAM9、CD9和OSMR與配體-EGFR信號傳遞有關，它們的置換p-值都小于0.01。首先我們用這5種抗體對由經支氣管(肺)活組織檢查和淋巴結活組織檢查從相同患者中獲得的配對的腫瘤組織切片進行染色。在3名不同患者中沒有觀察到這5個標記的蛋白表達存在患者間的差異(圖3，B)。我們還在11個NSCLC樣本中(5個PR和6個PD)用5種標記對微陣列數據進行了驗證。其結果與微陣列數據相一致(圖3C、表5B)。TGFA的血清水平為了進一步評價該預測系統在常規臨床情況中的可行性，我們用ELISA在單獨采集用于血清學檢驗并未加入到微陣列分析的由5名PR、10名SD和20名PD患者中獲得的血清樣本中對TGFA蛋白進行了檢測。在PD患者中，TGFA的血清水平為19.0±2.8pg/ml(平均值±標準差)，在SD患者中為13.9±1.9pg/m，在PR患者中為12.8±1.4pg/ml(圖4)。當以16.0pg/ml作為截止值時，從PD患者獲得的20份血清樣本中有12份呈現為TGFA陽性，所有從PD患者獲得的血清樣本為陰性。體外吉非替尼處理和AREG自分泌檢測在非應答者中，EGFR和其它ERBB成員的一種配體AREG在非應答者中得到了顯著的過表達而在應答者中卻無法(幾乎沒有)檢測到。為了研究AREG蛋白在以自分泌形式分泌時是否導致了NSCLC對吉非替尼治療的抗性，我們進行了以下生物學分析。我們一開始通過RT-PCR實驗鑒定出了AREGmRNA在肺-腺癌細胞系NCI-H358和-H522中的表達，而在PC-9中沒有表達(圖5，A)。接著，我們在以1.0μM的吉非替尼處理PC-9細胞72小時后進行了流式細胞術分析，并發現與未經處理的細胞(6％)相比吉非替尼提高了G1期細胞核的百分率(24％)(數據未顯示)。該結果表明吉非替尼在PC-9細胞中可能誘導了細胞凋亡。然后在無血清培養基或從在存在或缺少0.5或1.0μM吉非替尼條件下生長的NCI-H358或-H522細胞獲得的無血清條件培養基中培養之后，我們分析了PC-9細胞的生存能力，其中PC-9細胞對吉非替尼敏感并且不表達AREG。如圖5B所示，培養于無血清的含有吉非替尼的條件培養基中的PC-9細胞的生存能力比生長在具有相同吉非替尼濃度的無血清培養基中的PC-9細胞要強。由于以前已經報道過吉非替尼的提供者，吉非替尼的抗腫瘤效果在10％FCS存在下降低，這表明該檢測應該適于吉非替尼劑量和活性的定量測量。為了研究以自分泌形式分泌的AREG是否抑制了經吉非替尼治療的NSCLC細胞的細胞凋亡，我們在含有終濃度為1-100ng/ml的重組AREG蛋白并且含有或不含1.0μM吉非替尼的無血清培養基中培養PC-9細胞。與僅和1.0μM吉非替尼一起培養的PC-9細胞相比，與AREG蛋白和1.0μM吉非替尼一起培養的PC-9細胞的生存能力以AREG-劑量-依賴性的方式得以提高(圖5，C)。另一方面，重組AREG單獨對PC-9細胞的生存能力不產生影響(圖5，C)。該觀察結果顯然表明了AREG抑制由吉非替尼誘導的細胞凋亡，但是其自身并不影響細胞的生存能力。對AREG的免疫染色顯示在圖6中。討論大量的證據支持了以下觀點，即EGFR的自分泌途徑中的分子與一些對于癌癥的形成和進行至關重要的過程有關，這些過程包括細胞增殖、血管發生和轉移擴散5。因此，對特定的信號傳遞的治療性阻斷可能是一種有前途的癌癥治療策略。吉非替尼，一種合成的苯胺基喹唑啉，其通過與三磷酸腺苷競爭酪氨酸激酶受體的胞內區域的結合位點而抑制了酪氨酸激酶活性。在第II期試驗中，將吉非替尼用作晚期NSCLC的第2、第3或第4條線單藥治療，腫瘤應答率達到了近20％8-10，優于常規的細胞毒性劑所獲的應答率。在IDEAL1中對患者的多變量分析提示女性中的應答率可能要高于男性，腺癌患者中的應答率高于扁平細胞癌患者(差異比分別為2.7和3.5)9。最近的研究提示吉非替尼有效的個體更可能患細支氣管肺泡亞型的腺癌，且決不會是吸煙者(差異比分別為13.5和4.2)19。這里所報道的臨床試驗中記載的更高的應答率(29.4％)可能反映了腺癌患者的比例(46名腺癌、5名扁平細胞癌和2名大細胞癌)比其它研究中的病例的比例更高。包括細支氣管肺泡癌(BAC)特征在內的吉非替尼敏感性的臨床病理學決定因素在一定程度上有預測性9，10，19，20。然而，以往的報道和我們的觀察顯然顯示出沒有因子能夠完美地預測NSCLC對吉非替尼治療的應答。因此用于預先從非應答者中區分出應答者的方法可以使吉非替尼在臨床背景中的應用得到更多關注。通過從微陣列數據上獲得的晚期NSCLC的基因表達圖譜的統計學分析，我們鑒定出12個與對吉非替尼的敏感性相關的基因。我們介紹了一種基于在應答組和非應答組中顯示出最顯著的表達水平差異的12個基因的表達的預測評分系統。這組基因是從肺腺癌的表達圖譜中選出來的；然而，GRS系統成功地將我們的8個″檢驗″PR和PD病例根據它們對吉非替尼的臨床應答進行了分類，其中的一個是扁平細胞癌。此外，該系統可能將中間的腫瘤應答(SD)分成兩組，一組代表在很長時間成功維持在腫瘤-靜態效果的患者，另一組代表未能達到這種效果的患者。實際上，我們需要使用各醫院通用的最低限度入侵性技術來預測各個腫瘤的化學敏感性，因為很少有晚期NSCLC患者適于作為手術切除腫瘤的候選者。因此我們嘗試建立一種預測系統，其只是需要一定數量的能夠通過例如柔性(光導)纖維支氣管鏡檢查獲得的癌癥組織。通過驗證該方法的各個步驟，我們能將小至1mm的活檢標本中的基因表達精確地繪制。通過12個顯示出最顯著差異的基因的半定量RT-PCR證實了相應的微陣列結果，從而建立了GRS系統。而且，我們在TBB和淋巴結活組織檢查樣本中驗證了針對5種不同的用于將可能的應答者與非應答者區分開的生物標記(AREG、TGFA、ADAM9、CD9和OSMR)的抗體的有效性，這五種生物標記都與配體-EGFR信號傳遞有關。此外，我們通過ELISA能夠在肺-ADC患者中檢測血清TGFA蛋白。對這些用于臨床的標記的進一步評估是必要的，預測所需的基因的有限數目應當最終使得實驗室能夠通過利用像血液的血清學檢驗、PCR實驗或活檢標本的免疫組織化學分析這樣的常規方法預先診斷出吉非替尼治療對于一名NSCLC患者的有效性。根據我們的了解，這是首次關于無法切除的“晚期”肺癌的基因表達圖譜的報道，盡管已經報道了“早期”肺癌的手術切除樣本的圖譜。然而，經診斷患有NSCLC的患者中約有70％的腫瘤已經是局部晚期或遷移性的，這使得它們對常規的治療方式產生抗性。因此本文所列基因應當有助于揭示肺癌進展的分子機理，并且可能是藥物發展潛在的目標。吉非替尼是作為EGFR-TK的一種“選擇性”抑制劑而被研制出來的；然而無論是在體內還是在體外都沒有發現EGFR活化水平與對吉非替尼的應答之間有清楚的聯系7，23。在臨床試驗中，吉非替尼對腺癌比對扁平細胞癌更有效9，10，盡管EGFR的過表達在腺癌中的頻率更低24。因此，鑒定出哪種腫瘤是該治療的合適的目標非常重要。在我們的使用臨床樣本的分析中，在應答者與非應答者間的EGFR蛋白表達的差異在統計學上是不顯著的。另一方面，兩種都編碼EGFR以及其它ERBB成員的配體的雙向調節因子(AREG)和轉化生長因子α(TGFA)在非應答者中得到了顯著過表達而在應答中卻無法(幾乎沒有)檢測到(分別為p＝0.0000000000093和0.0095；表4)。這些配體和EGFR自分泌環對于肺癌細胞的生長和生存的重要性是無可爭辯的24-26，但是對AREG在癌癥的形成和進行中的作用卻還了解得很少。然而，一些證據線提示AREG的過表達與NSCLC患者的壽命縮短有關24。而且，最近報道了AREG在人肺癌細胞中的抗細胞凋亡活性25。為了研究AREG的抗細胞凋亡活性是否誘導了NSCLC細胞對吉非替尼治療的抗性，我們采用對吉非替尼敏感性的但是不表達AREG的NSCLC細胞系PC-9進行了生物檢測。我們發現吉非替尼對PC-9的抗腫瘤活性顯著地被AREG的自分泌降低了。該證據強烈地表露出盡管由于配體、二聚配偶體、效應物和下游路徑的復雜性由EGFR介導的生長因子信號傳遞在每一步都被顯著地復雜化了26，但是AREG可能是導致癌癥進展和對吉非替尼的抗性的配體-受體自分泌生長路徑的一種重要活化劑。幾種與EGFR-TK路徑相關的要素存在于我們的差異表達基因的列表中。例如，編碼雙特異性磷酸酶3(DUSP3)、ADAM9、CD9和OSMR的基因在非應答者中被顯著表達了(分別為p＝0.0000000000094、0.01、0.000022和0.0000011)。DUSP3基因通過對促細胞分裂劑激活的蛋白激酶(MAPK)的脫去磷酸作用而調節EGFR信號傳遞，脫去磷酸的促細胞分裂劑激活性蛋白激酶是一種重要的信號傳導的調節因子，ADAM9通過脫落proHB-EGF(pro肝素結合性表皮生長因子樣生長因子)的胞外區(ectodomain)而參與了EGFR信號傳遞的激活28。CD9與跨膜的TGFA發生物理性的相互作用。CD9的表達強烈地減少了由生長因子和PMA誘導的跨膜向可溶性TGFA的蛋白水解轉化，并極大地增強了TGFA誘導的EGFR激活29。據報道在乳腺癌細胞中OSMR與ERBB2在結構上相關。盡管已經提出過吉非替尼的其它靶分子，我們的研究結果提示EGFR信號傳遞至少是與對該藥的應答相關的重要過程中之一。由于吉非替尼能夠在體內誘導一些腫瘤細胞的凋亡，其它像AREG這樣的具有抗細胞凋亡活性的分子可能有助于腫瘤對該藥的抗性。已知的是AVEN(細胞凋亡、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑)增強了Bcl-xL的抗細胞凋亡活性，抑制Apaf-1調節的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性31，其在我們的非應答者中特異性地表達(p＝0.00000000042)。另一方面，調節藥物轉運的機制也應該影響藥物的抗性。GCLC(谷氨酸-半胱氨酸連接酶，催化性的亞基)在像順氯氨鉑、依托泊苷和阿霉素這樣的抗癌藥的細胞解毒中具有重要作用32，其在我們的非應答者組中過表達(p＝0.00000012)。由于這些基因在我們的腫瘤實驗組(panel)中與對化學治療的應答負相關(也就是這些基因的表達越高，對吉非替尼的抗性就越強)，它們可能與導致抗性產生的機制有關。還應該注意的是我們的候選預測基因中有幾乎一半的功能是未知的。因此需要進一步研究以更清楚地揭示作為NSCLC對吉非替尼的應答的基礎的生物學事件。總之，我們在人肺癌中鑒定出了51個在對吉非替尼的應答者和非應答者間顯著地差異表達的基因，并基于其中12個基因的表達模式建立了一種評分系統，用于預測各種腫瘤對該藥的應答。盡管采用更大組的臨床病例進行進一步驗證是必要的，但是本發明所呈現的數據可以產生對于作為信號抑制策略基礎的分子事件的有價值的了解，并且通過檢測一組具有高預測價值的基因而提供了關于對各個NSCLC患者的吉非替尼治療的重要信息。參考文獻1.Fossella，F.V.，等，RandomizedphaseIIItrialofdocetaxelversusvinorelbineorifosfamideinpatientswithadvancednon-small-celllungcancerpreviouslytreatedwithplatinum-containingchemotherapyregimens.TheTAX320Non-SmallCellLungCancerStudyGroup.JClinOncol，2000.18(12)p.2354-62.2.Non-smallCellLungCancerCollaborativeGroup.Chemotherapyinnon-smallcelllungcancerameta-analysisusingupdateddataonindividualpatientsfrom52randomisedclinicaltrials.Bmj，1995.311(7010)p.899-909.3.Schiller，J.H.，等，Comparisonoffourchemotherapyregimensforadvancednon-small-celllungcancer.NEnglJMed，2002.346(2)p.92-8.4.Kelly，K.，等，RartdomizedphaseIIItrialofpaclitaxelpluscarboplatinversusvinorelbinepluscisplatininthetreatmentofpatientswithadvancednon--small-celllungcanceraSouthwestOncologyGrouptrialJClinOncol，2001.19(13)p.3210-8.5.Baselga，J.，Whytheepidermalgromthfactorreceptor？Sherationaleforcancertherapy.Oncologist，2002.7Suppl4p.2-8.6.Traxler，P.，Tyrosinekinasesastargetsincancertherapy-successesandfailures.ExpertOpinTherTargets，2003.7(2)p.215-34.7.Wakeling，A.E.，等，ZD1839(易瑞沙)anorallyactiveinhibitorofepidermalgrowthfactorsignali7lgwithpotentialforcancertherapy.CancerRes，2002.62(20)p.5749-54.8.Herbst，R.S.，Dose-comparativemonotherapytrialsofZD1839inpreviouslytreatednon-smallcelllungcancerpatients.SeminOncol，2003.30(1Suppl1)p.30-8.9.Fukuoka，M.，等，Finalresultsfromaphase#trialofZD1839(′易瑞沙′)forpatientswithadvancednon-smallcelllungcancer(IDEAL1J.ProAmSocClin.Oncol2002.21；298a(A1188).10.Kris，MG.，等，AphaseIItrialofZD1839(′易瑞沙′Jinadvancednon-smallcell11.Inoue，A.，等，Severeacuteintersitialpneumoniaand吉非替尼.Lancet，2003.361(9352)p.137-9.12.Bohm，M.，等，MicrobeamMOMeNT.hon-contactlasermicrodissectionofmembrane-mountednativetissue.AmJPathol，1997.151(1)p.63-7.13.Okabe，H.，等，Genome-wideanalysisofgeneexpressioninhumanhepatocellularcarcinomasusingcDNAmicroarray.identificationofgenesinvolvedinviralcarcinogenesisandtumorprogression.CancerRes，2001.61(5)p.2129-37.14.Kitahara，O.，etal.，AlterationsofgeiieexpressionduringcolorectatcarcinogenesisrevealedbycDNAmicroarraysafterlaser-capturemicrodissectionoftumortissuesandnormalepithelia.CancerRes，2001.61(9)p.3544-9.15.Golub，T.R.，等，Molecularclassificationofcancerclassdiscoveryandclasspredictionbygeneexpressionmonitoring.Science，1999.286(5439)p.531-7.16.MacDonald，T.J.，等，Expressionprofilingofmedulloblastoma.PDGFRAandtheRAS/MAPKpathwayastherapeutictargetsformetastaticdisease.NatGenet，2001.29(2)p.143-52.17.Kaneta.Y.，等，PredictionofsensitivitytoSTI571amongchronicmyeloidleukemiapatientsbygenome-widecDNAmicroarrayanalysis.JpnJCancerRes2002.93，p.849-856.18.Pavelic，K.，等，EvidenceforaroleofEGFreceptorintheprogressionofhumanlungcarcinoma.AnticancerRes，1993.13(4)p.1133-7.19.Kikuchi，T.，等，Expressionprofilesofnon-smallcelllungcancersoncDNAmicroarraysIdentifi8cationofgenesforpredictionoflymph-nodemetastasisandsensitivitytoanti-cancerdrugs.Oncogene，2003.22(14)p.2192-205.20.Heighway，J.，等，Expressionproflingofprimarynon-smallcelllungcancerfortargetidentification.Oncogene，2002.21(50)p.7749-63.21.Beer，D.G.，等，Gene-expressionprofilespredictsurvivalofpatientswithlungadenocarcinoma.NatMed，2002.8(8)p.816-24.22.Miura，K.，等，Lasercapturemicrodissectionandmicroarrayexpressionanalysisoflungadenocarcinomarevealstobaccosmoking-andprognosis-relatedmolecularprofiles.CancerRes，2002.62(11)p.3244-50.23.Moasser，M.M.，等，ThetyrosinekinaseinhibitorZD1839(″易瑞沙)inhibitsHER2-drivensignalingandsuppressesthegrowthofHER2-overexpressingtumorcells.CancerRes，2001.61(19)p.7184-8.24.Rusch，V.，等，Overexpressionoftheepidermalgrowthfactorreceptoranditsligandtransforminggrowthfactoralphaisfrequentinresectablenon-smallcelllungcancerbutdoesnotpredicttumorprogression.ClinCancerRes，1997.3(4)p.515-22.25.Fontanini，G.，等，Evaluationofepidermalgrowthfactor-relatedgrowthfactorsandreceptorsandofneoangiogenesisincompletelyresectedstageI-IIIAnoiz-small-celllungcanceramphiregulinandmicrovesselcountareindependentprognosticindicatorsofsurvival.ClinCancerRes，1998.4(1)p.241-9.26.Brundage，M.D.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