具有不對稱脂質包被的脂質微粒和制備其的方法

專利名稱：具有不對稱脂質包被的脂質微粒和制備其的方法
技術領域：
本發明涉及一種具有不對稱脂質包被的脂質微粒組合物，用于向個人，更具體地是，向細胞遞送治療劑。
背景技術：
脂小泡，或脂質體，已經顯示出對于向靶組織和器官遞送治療劑和診斷劑的用途。脂小泡具有被一個或多個脂雙層所包圍的水性內部，其中所述治療劑包載于水性的內部空間中或在脂雙層內。因而，水溶性和水不溶性藥物都能夠分別通過水性空間內的脂小泡和脂雙層進行轉運。
許多藥物的作用涉及它們與細胞內位點的直接相互作用。為了發揮作用，藥物必須穿過細胞膜到達細胞質。由于多種原因，實現脂質體包載的試劑的細胞內遞送的成功受到限制。一種原因是脂質體在全身性施用于血流中后迅速被網狀內皮系統從循環中去除。另一個原因是遞送一種分子，特別是大的和/或帶電分子進入細胞質和/或核中的固有困難。
通過添加在脂質體上的親水性聚合物表面包被以掩飾小泡使其不被網狀內皮系統識別和吸收，已經在很大程度上克服了被網狀內皮系統迅速吸收造成的限制。延長的脂質體血液循環壽命為細胞吸收提供了更大的機會，所述脂質體具有聚乙二醇(PEG)聚合物鏈的包被(美國專利號5,013,556)。
帶電分子的細胞內遞送仍然是一種技術挑戰。特別是，由于分子的電荷和大小，核酸，包括DNA和RNA二者的遞送，都是具有挑戰性的。蛋白、肽和帶電的藥物組合物涉及相同的跨細胞膜轉運的技術障礙。一種帶負電的試劑，特別是進行基因治療的核酸片段的遞送方法是將DNA或RNA與陽離子脂質相混合。陽離子脂質與核酸的靜電相互作用允許形成脂質-核酸微粒，其大小范圍適于進行體內施用。在外部微粒表面上帶正電的陽離子脂質對于與帶負電的細胞膜的相互作用是有益的，從而促進脂質-核酸微粒融合或吸收入細胞中。
但是，在用陽離子脂質制備的脂質微粒的外表面上的正電荷的存在對于獲得長的血液循環壽命以進行廣泛生物分布(biodistribution)的目標是有害的。微粒上的電荷導致在施用位點或其附近立即與組織表面結合，基本上限制了微粒進行循環和分布到靶位點上的可用性。人們希望設計一種在施用后為中性的脂小泡組合物以便允許進行生物分布，此外其在一段時期后，即，在微粒的生物分布后帶上電荷，以便允許與細胞膜相互作用以進行結合和包載的試劑的細胞內遞送。
發明概述因此，本發明的一個目的是提供一種脂質微粒組合物，其包括一種帶電的脂質用于與帶電的治療劑相互作用，此外它在形成后具有最小的外表面電荷。
本發明的另一個目的是提供一種脂質微粒組合物，其包括一種帶電的脂質并且在微粒形成后具有最小的外表面電荷，但是它能夠隨著時間推移而產生電荷，如在生理溫度進行溫育期間。
在一方面，本發明包括一種制備具有外部脂質包被的脂質微粒的方法。該方法包括制備由(i)包含帶電脂質的脂質組合物和(ii)治療劑組成的脂質微粒。每個微粒都具有外部脂質包被，所述脂質包被具有外部脂質小葉和內部脂質結構。隨后把微粒在將所述帶電脂質從外部脂質小葉上有效去除的條件下進行溫育。
在一個實施方案中，所述脂質微粒由包含至少一種陽離子脂質的脂質組合物組成。
在另一個實施方案中，制備步驟包括(i)形成由脂質組合物組成的脂小泡和(ii)將脂小泡與治療劑復合。
在一個實施方案中，脂質微粒的溫育包括在含有不帶電脂小泡的介質中進行溫育。在另一個實施方案中，可以將一種脂質-聚合物-配體綴合物加入到溫育介質中。在其它的實施方案中，所述溫育介質可以進一步包括一種用親水性聚合物衍生的脂質。一種例示性的用親水性聚合物衍生的脂質是由聚乙二醇衍生的磷脂。
在其它的實施方案中，微粒的溫育在小于大約15℃的溫度和/或持續大于大約5小時的時間進行。
在一個實施方案中，所述脂質微粒是脂質體。
仍然在其它的實施方案中，將所述脂質微粒制備為具有一種被包載的治療劑，所述治療劑選自帶電藥物、蛋白、肽和核酸。
在另一方面，本發明包括一種包含具有脂質包被的脂質微粒的組合物，所述脂質包被由外部脂質小葉和內部脂質結構組成。所述脂質包被由(i)包含帶電脂質和(ii)具有凝膠-晶形相變溫度的脂質組合物形成，其中所述脂質微粒在低于脂質組合物相變溫度的溫度具有少許或沒有明顯的電荷，但在高于所述相變溫度溫育后具有可測量到的電荷。
在一個實施方案中，所述脂質組合物具有大約34-38℃的相變。
還在另一個方面，本發明包括一種制備脂質微粒的方法，所述脂質微粒于體內施用之前在其外部脂質包被中具有不對稱的帶電脂質組合物。該方法包括制備由(i)包含帶電脂質的脂質組合物和(ii)治療劑組成的脂質微粒，其中每個微粒都具有外部的脂質包被，所述脂質包被具有外部脂質小葉和內部脂質結構。把微粒在將帶電脂質從外部脂質小葉上有效去除的條件下進行溫育。
在一個實施方案中，溫育在小于大約15℃的溫度進行。在另一個實施方案中，溫育期為超過大約5小時的時間。在另一個實施方案中，溫育介質由中性脂小泡組成。
當結合附圖閱讀下列發明詳述時，將更充分地理解本發明的這些和其它目的以及特征。
附圖簡述

圖1A-1E是本文所述脂質微粒的圖示；圖2A是顯示形成脂質微粒步驟的流程圖；圖2B是每個形成步驟上的示例性脂質-DNA微粒的示意圖；圖3是以mV表示的ζ電勢的圖，其作為陽離子脂質體的陽離子脂質濃度(DOTPA，摩爾百分數)的函數；圖4A是由DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶24∶24∶2)組成的不對稱脂質微粒的以mV表示的ζ電勢的圖，其作為在緩沖液(菱形)和在含有中性脂小泡的緩沖液(三角形)中于37℃以小時表示的溫育時間的函數；圖4B是由DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶25.5∶22.5∶2)組成的不對稱脂質微粒的以mV表示的ζ電勢的圖，其作為在緩沖液(菱形)和在含有中性脂小泡的緩沖液(三角形)中于37℃以小時表示的溫育時間的函數；
圖5是由DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶25.5∶22.5∶2)組成的并于4℃保存兩個月的不對稱脂質微粒的以mV表示的ζ電勢的圖，其作為在緩沖液(菱形)和在含有中性脂小泡的緩沖液(三角形)中于37℃以小時表示的溫育時間的函數；而圖6是對于六種脂質微粒制劑顯示以pg/mg蛋白表示的細胞中螢光素酶表達的圖，所述脂質微粒制劑由DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶25.5∶22.5∶2)組成，其中制劑1-3是沒有不對稱雙分子層的對照微粒而制劑4-6是具有不對稱外部雙分子層的脂質微粒，其中在轉染之前所有制劑都在37℃溫育0小時(制劑1、3)，48小時(制劑2、5)和60小時(制劑3、6)的時間。
發明詳述I.定義如本文所用的“脂質微粒”意指具有至少一個脂雙層的任何形狀或大小的微粒。即，該術語包括單層、多層(plurilamellar)和多層(multilamellar)小泡。在一些微粒中，微粒的部分可以是單層的而其它部分則可以是多層的。微粒可以是球形的，或可以在外形上更似球狀。包括于術語“脂質微粒”中的為脂質體以及脂質與其它微粒成分的復合物。微粒可以具有確定的水性空間，即，脂質體，或者可以具有口袋或水性空間的區域，即，脂質復合物。
縮寫DMTAP1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨-丙烷；DOPE二油酰磷脂酰乙醇胺；PEG聚乙二醇；DS二硬脂酰基；mPEG-DS甲氧基(聚乙二醇)-二硬脂酰基。
II.脂質微粒和制備方法在一方面，本發明涉及一種制備脂質微粒的方法，其具有擁有外表面的外部脂質包被和內部脂質部分，以及跨越所述脂質包被的組合物梯度，所述脂質包被在外表面和內部脂質部分之間延伸。這種具有跨越全部或部分脂質包被的組合物梯度的微粒具有稱為不對稱脂質組合物的物質，其將在圖1A-1E中進行圖示，其中顯示了這些脂質微粒的理想化圖解。圖1A顯示了具有單一外部脂質包被12的單層脂質微粒10。一部分的脂質包被以分解圖進行顯示以更好地闡明所述脂質的排列。所述包被由外部包被表面14和內部包被表面16所組成。如此處所示，包被采取脂雙層的形式；不過此圖是理想化的并且所述脂質包被可以具有更加復雜的脂質排列。外部包被表面對應于包被的外部脂質小葉，其中對小葉中的脂質的極性首基進行定向，以便與懸浮了微粒的外部大量介質相接觸。內部包被表面對應于內部脂質結構，其可以是脂質小葉或可以是更加復雜的脂質排列，其中對內部小葉中的脂質的極性首基進行定向，以便在微粒的水性空間內進行接觸。由于主要由不帶正(陽離子的)或負(陰離子的)電荷的脂質所組成，例如中性小泡形成的脂質或其它中性脂質，外部脂質小葉具有低的或最小的電荷。在一個優選的實施方案中，外部脂質小葉由中性或陰離子脂質組成；即由于陽離子脂質的存在，外部脂質小葉包含少許或沒有顯著的陽離子電荷。內部脂質結構由帶電脂質組成。這一特征在圖1A中通過指示內部脂質結構中的18、20上的帶正電脂質而得以闡明，所述帶正電脂質在內部包被表面上提供正電荷。對于這種具有單層脂質包被的脂質微粒來說，在內部和外部脂質小葉之間脂質組成的差異形成了本文稱之為不對稱脂質包被的結構。更加具體地，跨過外部脂質包被厚度的帶電脂質組成的差異稱為不對稱外部脂質包被。
圖1B-1C是多層脂小泡的圖示，其也是通過描述來產生不對稱外部脂雙層或包被的方法進行制備的。首先，參考圖1B，小泡24具有多個巢式的、同中心的脂質包被層，標定為理想化的雙分子層26、28、30。在實踐上，脂雙層的數目可以比圖中所示的三個多得多并且在脂質排列上可以比所示的簡化雙分子層復雜得多。將由脂雙層26、28、30組成的脂質包被的部分以分解圖進行顯示以便易于觀察脂質的排列。脂質包被30是最外面的脂質層并與外部的懸浮了微粒的介質相接觸。外部脂質包被30具有外表面32和內表面34，其中外表面由外部脂質小葉36所限定而內表面由內部脂質結構38所限定。相對于內部脂質結構38的脂質組成，外部脂質小葉36的脂質組成是不同的，其不同在于外部脂質小葉具有較少的帶電脂質，并更加優選較少的陽離子脂質。相反，內部脂質結構包括導致沿著內表面38的正表面電荷的陽離子脂質，如在40、42上的加號所示。因而，在圖1B中所示的多層脂質微粒中，外部脂質包被關于其脂質組成是不對稱的。
圖1C顯示與圖1B的脂質微粒24相似的脂質微粒44，類似的元件通過類似的數字標識來確定。微粒44包括多個脂質層，如層26、28、30。外部脂質包被30具有外表面32和內表面34。在這個實施方案中，外部脂質包被30的的脂質組成在外表面32和內表面34之間是相對恒定的，其中外部脂質包被具有最少的帶電脂質。然而，在最外部脂質包被30內部的脂質層在其組成中包括帶電的脂質，如加號43、45、47所示。因而，在脂質微粒的這一實施方案中，不對稱脂質包被是關于外部脂質包被30和內部脂質結構或脂質層的。即，關于其脂質組成，脂質包被由于從外部微粒表面延伸到內部微粒區域，所以作為一個整體是不對稱的。
圖1D顯示與圖1B中所述相似的多層脂質微粒46的另一個實施方案。但是微粒46包括一種用親水聚合物衍生的脂質，如脂質48、50、52，其是圖中所示的每種脂雙層54、56、58中衍生脂質的代表。如下面將要討論的，具有橫穿微粒脂質包被分布的聚合物衍生的脂質的微粒是通過在微粒形成期間將聚合物衍生的脂質包括于脂質混合物中而形成的。微粒46中的外部脂質包被58具有不對稱的脂質組成，這是因為在外部脂質小葉60中不存在帶電脂質而在內部脂質結構66中存在帶電脂質，如脂質62、64。在內部脂質小葉中存在帶電脂質致成帶電的內部脂質包被表面，如沿著內部包被表面上的加號所示的。
圖1D的脂質微粒包括一種能夠被任選地包括的額外特征。脂質微粒還可以制備成包括靶向配體，如配體70、72，其作為尋靶(homing)裝置起作用以便將脂質微粒帶入進行治療作用的所需位點。附著于脂質微粒上的靶向配體在，例如，美國專利號5,891,468；6,056,973和6,180,134中有所介紹，在此將這些專利中關于適于用作靶向配體的部分、攜帶配體的脂質綴合物的制備和包含脂質-配體綴合物的脂質微粒的制備的公開內容并入作為參考。可以在形成后通過在脂質-配體或脂質-接頭-配體綴合物的微膠粒溶液中溫育預脂質微粒而將靶向配體摻入脂質微粒中。還可以通過將脂質-配體綴合物包括于脂質組合物中以形成微粒而將靶向配體摻入到脂質微粒中。
另一種例示性的脂質微粒示于圖1E中。如上所述，圖1A-1D中的圖示是高度理想化的，顯示了球狀的微粒，和明確的脂質層和明確的水性空間。在實踐中，微粒結構可能會復雜得多，如圖1E中所部分圖示的。圖1E顯示了一種由陽離子脂質(由實心首基表示，如脂質53、55)和中性脂質(由空心首基表示，如脂質57、59)組成的脂質-DNA微粒51。將DNA 61置于微粒的內部，并通過電荷相互作用以比中性脂質更多的陽離子脂質進行包被。微粒具有確定的外部脂質小葉63和由外部脂質小葉內部的脂質層組成的內部脂質結構。因而內部脂質結構包括與外部小葉63相對的內部小葉65和包圍DNA的內部雙分子層，如雙分子層67、69。微粒51具有水性空間的口袋，如口袋71，但是并不具有在常規脂質體中普遍的確定的的水性內部隔室。
A.脂質微粒制備如上面所討論的，特別是關于圖1B-1C，本文所述的微粒關于微粒中的單一脂質層(例如，圖1B，其中所述外部脂質層的脂質成分是不對稱的)或關于脂質包被(由于它從外部微粒表面延伸到內部微粒區域)(圖1C)具有不對稱的脂質包被。現在將對這種不對稱脂質微粒的制備進行描述。
根據在圖2A中以一般性術語闡釋的方法制備具有不對稱外部脂質包被的脂質微粒，其中提供了涉及脂質微粒形成的基本步驟的流程圖。圖2B提供了在形成中的每一步驟上例示性脂質微粒性質的示意圖。在較寬的意義上，第一步是由一種包括帶電脂質，如陽離子脂質的脂質組合物制備脂小泡。接下來，將脂小泡與治療劑混合，以便使試劑與帶電脂質相復合，由此形成脂質微粒。相應于此步驟的一種例示性微粒在圖2B中顯示為微粒80。微粒80由陽離子脂質(由實心首基表示，如脂質82、84)和中性脂質(由空心首基表示，如脂質86、88)組成。將DNA 90置于微粒的內部并用比中性脂質更多的陽離子脂質通過電荷相互作用進行包被。
接著參考圖2A，隨后將脂質微粒在介質中并在實現從外部脂質包被或從脂質微粒的最外層脂質包被的外部小葉中提取帶電脂質的條件下進行溫育。在與包含中性脂質體懸浮液的溫育介質進行溫育之后，脂質-DNA微粒的性質在圖2B中顯示為微粒100。如由相對于溫育前的微粒80的少數具有實心首基的脂質在示意圖中所表示的，微粒的溫育導致陽離子脂質從外部脂質小葉102中的去除。在外部脂質小葉和內部脂質結構之間組成的差異為微粒添加了不對稱的脂質組成。不對稱微粒100相對于溫育前的微粒80具有減小的表面電荷。在本發明的一個實施方案中，溫育足以將帶電脂質從外部脂質小葉和從鄰接外部脂質小葉的內部脂質結構中去除。在另一個實施方案中，以這樣一種方式進行溫育，例如，通過變化溫育時間、溫度和/或介質，以便主要從外部脂質小葉中去除帶電脂質。這種在后的實施方案在圖2B中的微粒110中進行了圖示，并且會在下面進行更加充分的討論。簡言之，在這種在后的實施方案中，帶電脂質存在于內部脂質結構中，如微粒100的脂質小葉104，并且可用于轉位或“翻轉”至外部脂質小葉中去。所述轉位是通過將微粒在足以使得脂質運動的溫度進行溫育，一般是在高于脂質組合物的相變溫度的溫度。在內部脂質層中帶電脂質的較高濃度允許帶電脂質轉位到外部脂質小葉中的較低濃度區。如相對于微粒100在微粒110中由增加的陽離子脂質(由實心極性首基表示)所顯示的，所述轉位導致在脂質-DNA微粒上重新形成表面電荷。
還有可能通過首先制備具有不對稱外部脂質包被的脂小泡并且隨后將不對稱小泡與帶電藥物復合來生成不對稱脂質微粒。在這一實施方案中，把由帶電脂質組成的脂質微粒在適于從外部脂質包被或小葉去除大部分帶電脂質的條件下進行溫育，由此制成不對稱小泡。在不對稱脂質包被形成之后，將不對稱脂小泡與藥物復合以形成不對稱的脂質-藥物微粒。
1.脂小泡的制備由脂質組合物制備一般為單層或多層脂質體的脂質微粒，所述脂質組合物包括一種帶電脂質，優選是陽離子脂質。所述陽離子脂質可以是組合物中唯一的小泡形成性脂質，或者可以是組合物中的小泡形成性或非小泡形成性的兩種或幾種脂質的其中之一。根據本發明制備的例示性單層小泡是由脂質組合物制備的，所述脂質組合物由陽離子小泡形成性脂質、中性脂質和用親水性聚合物衍生的小泡形成性脂質組成。
陽離子小泡形成性脂質在有效的pH，例如，pH 4-9具有帶凈正電荷的極性首基。例示性的陽離子脂質包括1，2-二油酰氧-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2，3，-雙十四烷氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)；N-[1-(2，3，-二油酰氧)丙基]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DORIE)；N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)；1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨-丙烷(DMTAP)；二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)；3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)；二甲基雙十八烷基銨(DDAB)，陽離子表面活性劑，固醇胺等。還有可能通過用陽離子部分的衍生來給出中性的或帶負電的脂質陽離子。例如，可以將一種磷脂，如磷脂酰乙醇胺，在其極性首基上用正電部分，例如賴氨酸進行衍生化，例如對于用L-賴氨酸衍生化的脂質DOPE(LYS-DOPE)所闡明的(Guo，L.等，Journal of LiposomeResearch 3(1)51-70(1993))。這類陽離子脂質還包括糖脂，如具有陽離子極性首基的腦苷脂和神經節苷脂。另一種可以采用的陽離子小泡形成性脂質是膽固醇胺和相關的陽離子固醇。
應當理解包括于脂小泡形成中的帶電脂質可以是陰離子脂質，如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)；二油酰磷脂酰甘油(DOPG)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)；等。
除了帶電的脂質物質以外，制備脂小泡的脂質組合物還可以包括其它的脂質。一般，該組合物將包括一種小泡形成性脂質，其意指一種能夠在水性介質中自發形成雙分子層小泡的脂質，例如磷脂。所述脂質組合物還可以包括穩定摻入脂雙層的脂質，其疏水性部分與雙分子層膜的內部疏水區域相接觸，并且其首基部分定向于雙分子層脂質膜的外部極性表面。小泡形成性脂質優選具有兩條烴鏈，一般為脂酰基鏈，以及一個極性或非極性的首基。有多種合成的小泡形成性脂質和天然存在的小泡形成性脂質，包括磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中兩條烴鏈長度一般為大約14-22個碳原子，并且具有變化程度的不飽和性。具有變化程度的不飽和性的帶有脂酰基鏈的磷脂可以商購獲得或根據公開的方法制備。
在一個實施方案中，選擇小泡形成性脂質以獲得特定的流動性或剛度，以控制有效插入靶向脂質-配體綴合物的條件和/或允許帶電脂質在將要介紹的體內脂質微粒施用之后從內部脂質結構移位到外部脂質小葉中。通過摻入相對剛性的脂質，例如，具有相對高的相變溫度，例如，最高達60℃的脂質來獲得具有更加剛性的脂質包被的脂質微粒。剛性的，即，飽和的脂質有利于脂質包被中更大的膜剛性。還已知其它的脂質組分，如膽固醇，也有利于脂質結構中的膜剛性。例示性的剛性脂質包括具有62℃相變溫度的二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，和具有58℃相變溫度的氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)。
通過摻入相對流動性的脂質，一般地為具有相對較低的液體到液體-晶形相變溫度的脂質，例如等于或低于大約37-38℃的體溫的脂質來獲得更加流動性的雙分子層。具有低于38℃相變溫度的脂質的例子為卵磷脂酰膽堿(-15到-7℃)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(23℃)、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿(27℃)、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(35℃)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(23℃)、腦鞘磷脂(32℃)(Szoka，F.等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9467(1980))。許多脂質的相變溫度在多種來源中進行了列表，如Szoka & Papahadjopoulos，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9467-508(1980)，Avanti極性脂質目錄，和LipidThermotropic Phase Transition Database(LIPIDAT，NIST StandardReference Database 34)。
如上關于圖1D所述及的，脂質微粒可以任選地包括親水性聚合物鏈和/或脂質錨定的靶向綴合物的表面包被。通過在所述方法的起始步驟將聚合物衍生的脂質和/或配體衍生的脂質包括在用于形成脂小泡的脂質組合物中，可以將這些特征的任一個都并入到脂質微粒中。還可能在方法的第三步，當將脂質微粒在介質中溫育時，將這些特征并入到脂質微粒中。在這種情況下，聚合物衍生的脂質和/或配體衍生的脂質被包括于溫育介質中，并在溫育期間插入到脂質微粒的外部脂質包被中。這種所謂的“插入”方法已經在美國專利號5,891,468、6,056,973和6,210,707中進行過描述。
已經描述過用親水聚合物衍生的脂質和包含聚合物衍生的脂質的脂質體(美國專利號5,013,556；美國專利號5,395,619)。摻入到脂質包被中的聚合物衍生的脂質在脂小泡周圍形成一個親水性聚合物鏈的表面包被。當與缺少這種包被的脂質微粒相比時，所述親水性聚合物鏈的表面包被有效增加了脂質微粒的體內血液循環壽命。適于用親水性聚合物衍生化的小泡形成性脂質包括任何以上所列的脂質，特別是磷脂，如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
適于用小泡形成性脂質衍生化的親水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥丙酯、聚丙烯酸羥乙酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和親水性肽序列。上述聚合物可用作均聚物或嵌段或無規共聚物。
一種優選的親水性聚合物鏈是聚乙二醇(PEG)，優選分子量為500-10,000道爾頓的PEG鏈、更優選1,000-5,000道爾頓。可市售購得的具有多種聚合物大小的以甲氧基或乙氧基封端的PEG類似物也是優選的親水性聚合物，例如120-20,000道爾頓。
用親水性聚合物衍生化小泡形成性脂質的制備已經在例如美國專利號5395619中進行過描述。制備包括此種衍生化脂質的脂質體的方法也已有描述，其中脂質體制劑中一般地包括1-20摩爾百分數的所述衍生化脂質。
用靶向配體衍生化的脂質也已進行過描述(美國專利號5,891,468、6,056,973和6,210,707)。靶向配體一般是作為受體-配體結合配對的一部分的部分，其中所述配對的配體附著于脂質微粒上以便能夠使微粒能夠特異性結合到具有其受體配對的特定靶上。例示性的配體在美國專利號5,891,468中給出，在此將其并入作為參考。特別優選的配體是那些在結合到細胞受體后由細胞內化的配體。這種配體允許脂質微粒內容物的細胞內遞送。
2.通過脂小泡與治療劑的復合形成脂質微粒接著參考圖2，在形成帶電脂小泡后，將小泡與治療劑混合以形成脂質微粒。如本文所用的，“脂小泡”指脂質結構，它可以是小或大的單層或多層脂質體，或者可以是具有較少確定脂質層的脂質結構。“脂質微粒”指與治療劑，更具體地是與帶電治療劑復合的脂小泡。
如上所述，脂小泡包括一種帶電脂質，以賦予小泡總的電荷。所述總的電荷通過包括陰離子脂質可以是負的，或者通過包括陽離子脂質可以是正的。與帶電脂小泡混合的治療劑也是帶電的，更加具體地，攜帶與脂小泡相反的電荷。陽離子脂小泡與帶負電的治療劑復合物混合以形成脂質微粒。類似地，陰離子脂小泡與帶正電的治療復合物混合以形成脂質微粒。
帶正電和帶負電的治療劑是本領域已知的。優選的帶負電的治療劑是核酸，可以是DNA或RNA，單鏈或雙鏈的。在一個實施方案中，所述核酸是一種由與其靶互補的序列組成的反義DNA寡核苷酸，所述靶通常為信使RNA(mRNA)或mRNA前體。所述mRNA包含功能或有義、定向中的遺傳信息，且反義寡核苷酸的結合滅活預期的mRNA并阻止其翻譯成蛋白。基于生化實驗對這些反義分子進行測定，顯示蛋白由特定RNAs翻譯而來，并且一旦已知RNA的序列，就可以設計通過互補的沃森-克里克堿基對結合到其上的反義分子。這種反義分子一般包含10-30個堿基對，更加優選地是10-25個，最優選15-20個。可以將反義寡核苷酸修飾為硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸二酯和對乙氧基寡核苷酸以提高對于核酸酶水解的抗性(WO97/07784)。
核酸可以用作多種療法的治療劑，包括但不限于，病毒性、惡性和炎性疾病和狀況的治療，如，囊性纖維化、腺苷脫氨酶缺陷和AIDS。意欲通過施用腫瘤抑制基因，如APC、DPC4、NF-1、NF-2、MTS1、RB、p53、WT1、BRCA1、BRCA2、VHL或施用癌基因，如PDGF、erb-B、erb-B2、RET、ras(包括Ki-ras、N-ras)、c-myc、N-myc、L-myc、Bcl-1、Bcl-2和MDM2進行癌癥治療。還意欲通過施用下列核酸對顯示的狀況進行治療HLA-B7，腫瘤，結腸直腸癌、黑色素瘤；IL-2，癌癥，特別是乳腺癌、肺癌和腫瘤；IL-4、癌癥；TNF，癌癥；反義IGF-1，腦瘤；IFN，成神經細胞瘤；GM-CSF，腎細胞癌；MDR-1，癌癥，特別是晚期癌癥、乳腺和卵巢癌癥；因子VIII，血友病，和HSV胸苷激酶，腦瘤、頭頸腫瘤、間皮瘤和卵巢癌。
除了核酸以外，帶電的有機藥物分子也適于與脂小泡復合。多種帶電藥物是本領域已知的，并且易于被本領域技術人員所識別。
3.溫育脂質微粒以產生不對稱外部脂質包被接著參考圖2，在將脂小泡與治療劑復合后，將脂質微粒在從外部脂質包被層或從外部脂質包被層的外部脂質小葉中有效提取至少一部分帶電脂質的條件下進行溫育。如上面在圖1中所討論的，所述脂質微粒包括由內部脂質結構和外部脂質表面組成的外部脂質包被。外部脂質表面或小葉與外部的溫育介質相接觸。對脂質微粒進行溫育以實現從外部小時或從最外面的脂質包被中去除基本上全部的帶電脂質，由此得到不對稱的外部脂質包被。如將要進一步描述的，測定帶電脂質的去除程度，并通過諸如溫育時間、溫度和介質的因素進行控制。
通過將脂質微粒置于帶電脂質所分配進的介質中來實現將帶電脂質從外部脂質包被或小葉中去除。影響脂質從微粒到介質中的分配的條件是變化的，且包括溫育介質的選擇、溫育介質的溫度和溫育時間。在支持本發明而進行的研究中，由中性脂小泡的水性懸浮液組成的溫育介質可有效引發陽離子脂質從外部脂質包被或微粒脂質包被的小葉分配。包含中性脂小泡的溫育介質作為陽離子脂質的庫(sink)而起作用，引發陽離子脂質從脂質微粒外部包被的高濃度運動到溫育介質中的低濃度。優選的溫育介質包含與存在于脂質微粒中相同的中性脂質，從而沒有發生中性脂質從微粒到溫育介質的大量轉移。其它例示性的溫育介質是包括帶負電脂質、表面活性劑、聚合物微粒或其它能夠從脂質微粒中拉出帶電脂質的材料的介質。
在另一個實施方案中，在溫育脂質微粒以減少陽離子表面電荷之后，隨后將微粒溫育于第二種介質中，其包括一種帶負電的脂質物質以便將負電荷導入脂質微粒的外部脂質小葉中。
如上所述，脂質微粒可以任選地包括親水性聚合物鏈的表面包被和/或脂質錨定的靶向綴合物。通過將這些綴合物的其中之一或兩者都包括于溫育介質中可以將聚合物衍生的脂質或配體衍生的脂質摻入脂質微粒中。在溫育期間，綴合物插入到脂質微粒的外部脂質包被中。在脂質微粒的溫育期間脂質-聚合物綴合物和/或脂質-靶向配體綴合物的插入可以根據脂雙層的組成、靶向配體和其它因素進行調整。例如，快速的插入速率可以由較高的溫育溫度而獲得，但必須相對于溫度進行平衡，所述配體可以安全地加熱到該溫度而不會影響其活性。脂質組合物中脂質的相變溫度也會確定適于插入的溫度。還可以理解插入可以隨溶劑的存在而變化，如兩親溶劑，包括聚乙二醇和乙醇，或去污劑。
B.脂質微粒的表征如實施例1中所述的制備脂質微粒。簡言之，由DMTAP、DOPE、膽固醇和mPEG-DSPE制備陽離子小單層小泡(SUVs)。將陽離子脂小泡與攜帶螢光素酶報告基因的DNA質粒相復合以形成脂質微粒。在大約0℃的溫度進行陽離子SUVs和核酸的復合。將脂質微粒從未復合的陽離子SUVs和/或核酸中分離出來。隨后，將脂質微粒在由中性SUVs(POPC、膽固醇和mPEG-DSPE)組成的溫育介質中于4℃的溫度溫育24小時。溫育后，通過蔗糖密度梯度超離心將現在具有不對稱外部脂雙層的脂質微粒從溫育介質中的其它脂質組分中分離出來，以進行ζ電勢的電荷分析。
ζ電勢值提供了微粒外表面上表觀電荷的量度。更加具體地，ζ電勢是跨界面發生的電勢的量度，所述界面介于與固體相接觸的液體邊界層和液體中的可移動擴散層，例如，滑動面之間。利用可商購的儀器，如下面方法部分所示對ζ電勢值進行測量。圖3顯示了對于由DOTAP(xmol％)、POPC(55-xmol％)、膽固醇(40mol％)和聚乙二醇衍生的二硬脂酰基(PEG-DS，5mol％)所組成的陽離子脂小泡而言，以mV表示的ζ電勢之間的關系，其中DOTAP的量沿著圖的x軸以mol％顯示。按指示的組成制備脂小泡并擠壓成大約100nm的大小。在5mM NaCl中于25℃測量ζ電勢。ζ電勢作為陽離子脂質DOTAP的函數而提高，其中當濃度從0提高到10摩爾百分數時觀察到ζ電勢迅速的提高，而對于具有大于10摩爾百分數DOTAP的組合物則觀察到較慢的提高。
在另一個研究中，根據實施例1制備脂質微粒。所述脂質組合物由DMTAP(50mol％)、DOPE(24mol％)、膽固醇(24mol％)和PEG-DS(2mol％)組成。在將脂質微粒與DNA復合后，但在進行溫育以生成不對稱脂質包被之前，保留一份脂質微粒樣品進行ζ電勢分析作為比較性對照。將剩余的微粒在包含中性脂質微粒(實施例1)的介質中溫育多次以生成不對稱脂質包被。通過蔗糖密度梯度超離心將不對稱脂質微粒從溫育介質中的其它脂小泡中分離出來，并測量ζ電勢。結果與通過動態光散射測定的微粒大小一起顯示于表1A中。
表1A在各種條件下處理的脂質微粒和不對稱脂質微粒的ζ電勢
沒有不對稱脂質包被的脂質微粒的ζ電勢為17.27mV，顯示微粒外表面上的正電荷。將微粒在包含中性脂小泡的溫育介質中于25℃溫育24小時和于37℃溫育3.5小時分別有效地將ζ電勢減小到8.30mV和8.63mV，顯示表面電荷已經被顯著減弱。
利用由DMTAP(50mol％)、POPC(24mol％)、膽固醇(24mol％)和PEG-DS(2mol％)組成的脂質微粒進行了類似的研究。在將脂質微粒與DNA復合后，但在進行溫育以生成不對稱脂質包被之前在脂質微粒的樣品上測量ζ電勢作為對照。將微粒于不同的時間和溫度在溫育介質中進行溫育以生成不對稱脂質包被。ζ電勢測量和通過動態光散射測定的微粒大小顯示于表1B中。
表1B在各種條件下處理的脂質微粒和不對稱脂質微粒的ζ電勢
如相對于對照微粒在不對稱脂質微粒中降低的ζ電勢所證明的，在包含中性脂小泡的介質中溫育脂質微粒有效地將陽離子脂質從外部脂質小葉中提取出來。
總之，如不對稱脂質微粒的ζ電勢測量所證明的，使在脂質包被組合物中具有帶電脂質的脂質微粒在介質中溫育，以將帶電脂質從外部包被中提取出來。在微粒形成期間帶電脂質的存在有利的，因為脂質和帶電的治療劑之間的電荷-電荷相互作用允許微粒的有效形成。從外部脂質包被中去除帶電脂質有利的，因為體內遞送后減少的或缺失的表面電荷允許較長的血液循環時間以進行更加廣泛的生物分布。
為了測定關與表1A、1B和實施例1中的上述脂質微粒是否在體內施用后保持不帶電荷，將不對稱脂質微粒置于37℃溫度中15小時，以模擬體內施用后的條件。在15小時時間段后測量微粒的ζ電勢，將結果顯示于表2A、2B中。同樣，為了測定脂質包被包圍和保護包載的DNA的程度，將一種染料(PicoGreendsDNA定量試劑)加入到每份制劑的等分試樣中，所述染料當接觸DNA時發射熒光。通過將脂質微粒的熒光發射與用染料處理的裸DNA相比來測定DNA保護的百分比。DNA保護的百分比也顯示于表2A、2B中。
表2A在各種條件下處理的不對稱脂質微粒的微粒大小、DNA保護的百分比和ζ電勢
1由脂質組成DMTAP/DOPC/膽固醇/mPEG-DS(50/24/24/2)制備的脂質微粒。
表2B在各種條件下處理的不對稱脂質微粒的微粒大小、DNA保護的百分比和ζ電勢
1由脂質組成DMTAP/POPC/膽固醇/mPEG-DS(50/24/24/2)制備的脂質微粒。
在體內模擬條件期間在外部脂質小葉中具有陽離子脂質的脂質微粒(對照微粒)的ζ電勢提高，顯示在外部微粒表面上電荷存在增多。不對稱脂質微粒的ζ電勢在暴露于37℃15小時的體內模擬條件后沒有顯著變化。例如，由DMTAP、DOPE、膽固醇和mPEG-DS(表2A)組成的不對稱脂質微粒在形成后具有8.30mV的ζ電勢。在37℃溫育后微粒的ζ電勢變化極小，提示于25℃初始溫育24小時或于37℃初始溫育3.5小時足以將陽離子脂質從外部脂質包被中去除。
對不對稱脂質微粒體外轉染細胞的能力進行了評估。根據實施例2中所述的方法將上述脂質微粒組合物與細胞在體外相接觸。將細胞的螢光素酶表達測定為轉染的指示。表3A和3B顯示用如實施例1中所述制備的不對稱微粒轉染的細胞的螢光素酶表達。
表3A在編碼螢光素酶的質粒體外轉染后螢光素酶的表達，所述質粒包載于在各種條件下處理的不對稱脂質微粒中
1由脂質組成DMTAP/DOPC/膽固醇/mPEG-DSPE(50/24/24/2)制備的脂質微粒。
表3B在編碼螢光素酶的質粒體外轉染后螢光素酶的表達，所述質粒包載于在各種條件下處理的不對稱脂質微粒中
1由脂質組成DMTAP/DOPC/膽固醇/mPEG-DSPE(50/24/24/2)制備的脂質微粒。
表3A和3B顯示相對于具有正表面電荷的對照微粒，不對稱脂質微粒的轉染能力減弱。低的轉染率提供了不對稱脂質微粒上減小的表面電荷的進一步證據。
總之，表1A-1B、2A-2B和3A-3B中的數據顯示了本發明的第一個方面，其中由帶電脂質制備脂質組合物，并且相對于溫育之前的表面電荷，將微粒進行溫育以減少表面電荷。在將帶電脂質的相當大部分從外部脂質包被中去除的條件下形成微粒。所述微粒相對于相同脂質組成但未進行處理以便從外部脂質包被中去除全部或部分帶電脂質的微粒而言，具有減弱的電荷。
在另一方面，本發明提供了不對稱脂質微粒，其在形成后具有低的或極小的表面電荷，但是能夠在暴露于體內條件后恢復或生成外部表面電荷。上文關于圖2B中的微粒110對這一方面進行了簡要討論。在脂質微粒的體內分布后，表面電荷的存在可以是有益的。例如，分布和進入腫瘤中后，需要有表面電荷存在以引發脂質微粒與細胞膜的結合。如上所述制備的具有不對稱脂質包被的脂質微粒能夠在微粒形成后進行陽離子脂質移位，其中在不對稱脂質微粒形成后包被的外部脂質小葉不帶電而內部脂質結構帶電。由于在脂質微粒中的帶電脂質的濃度梯度，其中在微粒內部比微粒的外表面上存在更高濃度的帶電脂質，所以在體溫發生帶電脂質的逐漸轉移。帶電脂質從內部脂質結構逐漸轉移，或移位至外部脂質小葉中在現在將要介紹的多個研究中得到了證實。
在本發明的這一方面，提供了一種脂質微粒組合物，其中由帶電脂質制備脂質微粒，但所述微粒在第一溫度不具有顯著的表面電荷，所述第一溫度一般是低于脂質包被相變溫度的溫度。然而，在暴露在高于脂質包被相變溫度的溫度時，微粒具有可測量到的表面電荷。上文關于圖2B對帶電脂質從內部脂質結構移位到外部脂質小葉中進行了討論，并通過圖2B中的微粒100、110進行圖示。關于為表2A、2B中的研究而制備的微粒，脂質組合物由50摩爾百分數DMTAP組成，其具有大約20-24℃的凝膠-液體晶形相變(Tc)(Zelphati等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9311493(1996))。因而DMTAP被表征為流體脂質，且加入膽固醇使得脂質組合物更加剛性。DOPE在高于大約11℃的溫度為六角相。預期在37℃下溫育微粒帶來在其相變之上的DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS組合物，其中脂質為流體。當脂質處于這種高于其相變的流體狀態時，易于發生從一個脂質小葉到另一個的脂質移位。因而，如例如通過ζ電勢測量所證明的，當使脂質包被中的脂質處于其相變之上的溫度時，不具有顯著電荷的不對稱微粒在形成后變得帶電了。
陽離子脂質從內部脂質小葉到外部脂質小葉中的移位顯示于圖4A-4B中。如實施例3中所述的，將脂質微粒制備成具有DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶24∶24∶2)的脂質包被，并通過在介質中于0-4℃溫育24小時而形成不對稱性，所述介質由具有脂質組成DOPE/膽固醇/mPEG-DS的中性脂小泡組成。隨后將不對稱脂質微粒保持于37℃至最多90個小時，并在選定的時間，取樣品進行ζ電勢測量。在37℃溫育不對稱脂質微粒的介質是單獨的水或是由POPC/膽固醇/mPEG-DS(58∶40∶2)形成的中性脂小泡的懸浮液。作為以小時表示的溫育時間函數的ζ電勢測量顯示于圖4A中。在包含中性脂小泡的介質中溫育的不對稱脂質微粒(三角形)具有大約11mV的起始ζ電勢。于37℃溫育20小時后，ζ電勢提高到大約16mV。通過42小時的溫育，ζ電勢提高到18mV，沒有觀察到進一步的提高。在單獨的緩沖液中溫育的不對稱脂質微粒(菱形)也隨著溫育時間推移而顯示ζ電勢的提高，表明陽離子脂質從內部脂質小葉移位或“翻轉”到外部脂質小葉中。
圖4B是稍微不同脂質組成的不對稱脂質微粒的類似曲線圖；DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶25.5∶22.5∶2)。這里，在存在中性脂小泡時溫育的不對稱脂質微粒(正方形)在75小時的溫育時期中ζ電勢提高。對于在單獨的緩沖液中溫育的不對稱微粒(菱形)觀察到類似的結果。
在另一種研究中分析了不對稱脂質微粒的穩定性。制備如實施例1中所述的脂質微粒并保存于4℃中兩個月。在保存兩個月后，將微粒保持于37℃的具有和不具有中性脂小泡的介質中，持續大約100小時。在100小時的溫育時間上對不對稱脂質微粒的ζ電勢進行評估以監控陽離子脂質從內部脂質小葉到外部脂質小葉的移位。結果顯示于圖5中。
當在單獨的緩沖液(菱形)或在含有中性脂小泡的緩沖液(正方形)中溫育時，不對稱脂質微粒的ζ電勢隨著溫育時間推移而提高。ζ電勢的提高是陽離子脂質從內部脂質小葉運動到外部脂質小葉中的指示，顯示在2個月的保存期中不對稱脂質包被是穩定的。
對一種已經在4℃保存兩個月的不對稱脂質微粒進行體外轉染研究。如實施例1中所述制備一種由DMTAP/DOPE/膽固醇/mPEG-DS(50∶24∶24∶2)組成的不對稱脂質微粒組合物。隨后將不對稱脂質微粒于4℃保持兩個月。制備由相同脂質組成的對照組合物，但它不進行溫育設置以生成不對稱脂雙層。將對照組合物也在4℃保存兩個月。保存后，將兩種制劑于37℃溫育。在37℃溫育0小時、48小時和60小時后將制劑的樣本與細胞在體外接觸，并測量螢光素酶表達。結果顯示于圖6中。
在圖6中，制劑號1、2和3對應于缺少不對稱脂質包被的對照脂質微粒。制劑號4、5和6對應于不對稱脂質微粒。制劑1和4在37℃溫育之前顯示螢光素酶表達(于37℃溫育0小時)。由于外部微粒表面上正電荷的缺失，不對稱脂質微粒具有較低的螢光素酶表達，因而具有較低的轉染能力。制劑2和5對應于于37℃溫育48小時后的對照制劑和不對稱脂質微粒制劑。由于在48小時的溫育期間陽離子脂質從內部小葉移位到外部小葉中，所以相對于制劑4，制劑5的螢光素酶表達提高了，所述溫育模擬體內條件。制劑3和6對應于于37℃溫育60小時后的對照制劑和不對稱脂質微粒制劑。由于在60小時的溫育期間陽離子脂質進一步從內部小葉移位到外部小葉中，所以相對于制劑4和5，制劑6的螢光素酶表達提高了。作為于37℃溫育的結果，對照制劑2和3的螢光素酶表達降低了。
由于微粒表面上電荷的缺失，在圖6中給出的數據顯示不對稱脂質微粒組合物開始具有低的轉染率。微粒暴露于接近、等于或高于脂質組合物相變溫度的溫度允許帶電脂質從內部脂質小葉移位，或“翻轉”到外部脂質小葉中，從而在不對稱脂質微粒上生成表面電荷。電荷的存在增進了轉染，因為電荷增強微粒和細胞之間的結合。
III.實施例下列實施例進一步闡釋本文所述的發明，并且決不會限制本發明的范圍。
方法ζ電勢的測量通過Zetasizer 2000(Malvern Ins.)測量陽離子脂質體和脂質-DNA微粒的ζ電勢值。具體而言，根據儀器供應商所給出的操作程序將50μL的脂質體加入到5mL包含5mM NaCl的水溶液中(由USP鹽水的Milli-Q水30倍稀釋液制得)，并注射入樣品室中。于25℃對每份樣品進行3次測量。
動態光散射根據生產商的說明書操作，利用Coulter N4MD儀器通過動態光散射(DLS)獲得對脂質微粒大小的測定。將結果表示為以nm表示的平均直徑和由相對體積表示的微粒高斯分布的標準偏差。
實施例1不對稱脂質微粒的制備由脂質組成DMTAP/DOPE/CHOL/PEG-DS(50/24/24/2mol/mol)制備陽離子脂質體(小的單層小泡)。在氯仿/甲醇(90∶10 v/v)中制備各種脂質母液，DMTAP為10mg/mL(Avanti Polar Lipids，890860，DOPE為20mg/mL(Avanti Polar Lipids，850725)，膽固醇為20mg/mL，以及mPEG-DS為10mg/mL(甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基，mPEG分子量為2000道爾頓，Shearwater Polymers Inc)。利用正位移吸管取等分試樣的包含適量脂質的溶劑溶液，得到2mL 20mM脂質濃度的最終脂質懸浮液，并混合于10mL的圓底燒瓶中。通過于大約45℃的旋轉蒸發緩慢去除溶劑以便在燒瓶周圍形成一層薄膜。通過真空過夜去除殘留的溶劑。隨后通過于50℃加入2mL的去離子水將脂質攪拌水合0.5-1小時。隨后通過具有雙聚碳酸酯濾器(0.8μm在0.1μm之上)Lipex擠壓機(10mL體積，Northern Lipids，Inc.)將脂質懸浮液于50℃擠壓通過10次。如通過Coulter submicron particlesizer(model N4MD)所測量的，最終的脂質體直徑為117±30nm。擠壓后，將2mL去離子水加入到擠壓機中并穿過濾器推出以洗下剩余的脂質體。將這種清洗液與脂質體混合至4mL的終體積。最終的脂質濃度為大約10mM。
A.制備中性脂質體用于進行溫育通過類似于上面1.中給出的方法制備具有POPC/DOPE/CHOL/PEG-DS(58/40/2mol/mol)組成的脂質體。于40mg/mL POPC(Avanti Polar Lipids，850457)制備溶劑母液。最終脂質濃度為47.1mM而微粒平均直徑為108±40nm。
B.制備脂質-質粒DNA復合物將1mg/mL濃度的溶于水中的DNA質粒(pCC-螢光素酶)緩慢注射入置于冰水容器中的陽離子脂質體懸浮液中(如實施例1中所制備的10mM中性脂質/DOPE/膽固醇/mPEG-DS，50/24/24/2mol/mol，其中所述中性脂質為DOPE或POPC)。利用設定于10μL/分鐘速率的灌注泵伴隨著持續攪拌進行DNA注射。復合物的最終體積為1.6mL，DNA濃度為0.5mg/mL，而脂質濃度為5mM，即1μg/20nmoles脂質的DNA/脂質比率。
C.制備不對稱脂質-DNA微粒通過將脂質-DNA復合物微粒與如上面2.中所述制備的10倍過量中性脂質體(“庫脂質體”)相混合來制備不對稱的脂質-DNA復合物。具體地，將包含6.4μmoles脂質的如上面3.中所述制備的1.28mL脂質-DNA復合物與包含64μmoles脂質的2mL中性溫育脂質體(POPC/CHOL/mPEG-DS，58/40/2mol/mol)緩慢混合。在如圖4-6中所示于各種條件下溫育之前將混合物置于冰水浴中。
在溫育結束后，隨后通過蔗糖密度梯度離心方法分離庫脂質體。具體地，將蔗糖的逐級梯度加樣于干凈的超離心管中(4.0mL 11×60mm，Beckman cat 344062，用于SW 60 Ti轉子)。所述梯度為25、20、15、10和5wt％蔗糖(由底到上)。加載的樣品量一般為0.8-1mL。離心一般于20℃在40,000rpm進行3小時。一般將脂質-DNA復合物加載于10-15％界面上的弱帶中。庫脂質體通常保持于10％蔗糖區之上。隨后利用吸管小心移取DNA復合物帶。為了制備大體積的不對稱脂質-DNA微粒，與轉子SW28(Beckman)一起使用40mL的離心管。加到試管中的樣品體積為4mL。離心一般在20℃于40,000rpm進行15-20小時。
利用PicoGreendsDNA定量試劑(Molecular Probes，P-7581)通過熒光測定來確定不對稱脂質-DNA微粒中的最終DNA濃度。由一系列質粒DNA溶液生成標準曲線，所述質粒DNA溶液最高為2000ng/mL DNA(pCC-Luc)，其溶于10mM Tris HCl和1mM EDTA，pH 7.0中。發現線性范圍最高達1000ng/mL。
實施例2
體外轉染在體外對如實施例1中所述制備的不對稱脂質-DNA微粒和多種對照進行比較。以1.13×104細胞/孔將BHK細胞接種于6孔板中，并與完全MEM培養基于37℃，5％CO2溫育48小時。在轉染前，用1.0mL無血清的MEM培養基將細胞清洗兩次。將一等分試樣的轉染樣品與無血清的MEM培養基混合以獲得所需濃度的質粒DNA(一般60-200μg/mL pCC-Luc)。為了進行轉染，隨后將1mL覆蓋于清洗后的細胞上，接著在37℃溫育5小時。溫育后，吸出包含樣品的培養基并用1.0mL完全MEM培養基替換，且在相同條件下繼續進行溫育16.5小時。
利用Promega Luciferase Assay System(cat#E1500)測定螢光素酶活性。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)將細胞清洗兩次并且隨后加入250μL的Cell Culture Lysis 1X Reagentlysis。在兩次于室溫溫育8分鐘后(同時漩渦培養板)，將裂解的細胞轉移到微量離心管中。隨后以14K將管旋轉10分鐘。利用20μL的樣品通過發光計(100μL螢光素和包含ATP的測定緩沖液，10秒測量)立即對螢光素酶活性進行測定。通過提取物中的蛋白量將相對光單位進行規格化。
利用BioRad蛋白試劑測定蛋白含量。將10微升裂解的細胞轉移到96孔平底培養板上并加入200μL試劑。利用Molecular Devices培養板讀取器測量于595nm上的吸光度。
實施例3制備不對稱脂質微粒如實施例1中所述形成脂質微粒，只除了用冰浴將由中性SUVs組成的溫育溶液(見實施例1中的步驟4)的溫度維持于0-4℃之間。
盡管已經關于特定實施方案對本發明進行了描述，但對于本領域技術人員來說，在不背離本發明的前提下進行多種變化和改進是顯而易見的。
權利要求
1.一種制備具有外部脂質包被的脂質微粒的方法，包括制備由(i)包含帶電脂質的脂質組合物和(ii)治療劑組成的脂質微粒，所述微粒的每個都具有外部脂質包被，所述脂質包被具有外部脂質小葉和內部脂質結構；和在將所述帶電脂質從外部脂質小葉上有效去除的條件下溫育所述微粒。
2.根據權利要求1的方法，其中所述制備由制備脂質微粒組成，所述脂質微粒由包含至少一種陽離子脂質的脂質組合物組成。
3.根據權利要求1的方法，其中所述制備包括(i)形成由所述脂質組合物組成的脂小泡和(ii)將所述脂小泡與所述治療劑復合。
4.根據權利要求1-3任一項的方法，其中所述溫育包括在包含不帶電脂小泡的介質中溫育所述脂質微粒。
5.根據權利要求4的方法，其中所述溫育進一步包括向介質中加入脂質-聚合物-配體綴合物。
6.根據權利要求4的方法，其中所述溫育進一步包括向介質中加入用親水性聚合物衍生的脂質。
7.權利要求6的方法，其中所述加入由加入用聚乙二醇衍生的磷脂組成。
8.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述脂質微粒為脂質體。
9.根據權利要求1-7任一項的方法，其中所述溫育在小于大約15℃的溫度進行。
10.根據權利要求1-7任一項的方法，其中所述溫育持續時間超過大約5小時。
11.根據權利要求1-7任一項的方法，其中所述制備由制備具有包載的治療劑的脂質微粒組成，所述治療劑選自帶電藥物、蛋白、肽和核酸。
12.一種組合物，其包含具有脂質包被的脂質微粒，所述脂質包被由外部脂質小葉和內部脂質結構組成，所述脂質包被由(i)包含帶電脂質和(ii)具有凝膠-晶形相變溫度的脂質組合物形成，所述脂質微粒在低于所述相變溫度的溫度沒有顯著的電荷，但在高于所述相變溫度的溫度溫育后具有可測量到的電荷。
13.根據權利要求12的組合物，其中所述脂質組合物包含一種陽離子脂質。
14.根據權利要求12的組合物，其中所述脂質微粒進一步包括具有電荷的治療劑。
15.根據權利要求14的組合物，其中所述治療劑為核酸。
16.根據權利要求12-15任一項的組合物，其中所述脂質組合物具有大約34-38℃的相變。
17.根據權利要求12-16任一項的組合物，其中所述脂質微粒為脂質體。
18.一種制備脂質微粒的方法，所述脂質微粒于體內施用之前在其外部脂質包被中具有不對稱的帶電脂質組合物，該方法包括制備由(i)包含帶電脂質的脂質組合物和(ii)治療劑組成的脂質微粒，所述微粒的每個都具有外部脂質包被，所述脂質包被具有外部脂質小葉和內部脂質結構；和在將所述帶電脂質從外部脂質小葉上有效去除的條件下溫育所述微粒。
19.根據權利要求18的方法，其中所述溫育包括在小于大約15℃的溫度進行溫育。
20.根據權利要求18或權利要求19的方法，其中所述溫育包括時間超過大約5小時的溫育。
21.根據權利要求18-20任一項的方法，其中所述溫育包括在由中性脂小泡組成的介質中進行溫育。
全文摘要
描述了一種制備具有不對稱脂質包被的脂質微粒的方法。所述微粒的外部脂質包被的脂質組成從內部到外部表面有所變化。通過制備包含帶電脂質和治療劑的脂質組合物來形成不對稱脂質微粒，其中所述微粒的每個都具有外部脂質包被，所述脂質包被具有外部脂質小葉和內部脂質結構。隨后在有效從外部脂質小葉中去除帶電脂質的條件下對微粒進行溫育，由此形成脂質包被的不對稱性。所述微粒具有通過脂質移位恢復其表面電荷的能力。
文檔編號C12N15/88GK1829498SQ200480015016
公開日2006年9月6日 申請日期2004年3月30日 優先權日2003年3月31日
發明者張遠鵬 申請人:阿爾扎公司