高通量蛋白質合成系統及使該系統自動運行的合成裝置的制作方法

專利名稱：高通量蛋白質合成系統及使該系統自動運行的合成裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及由模板物質開始的無細胞合成系統。更詳細而言，涉及以模板物質作原料合成物質時為達到合成反應最大效率的系統。同時，涉及為使該系統自動運行的合成裝置。
背景技術：
作為在生物體外合成蛋白質和RNA等生物體高分子的方法，將那些反應中所必需的基質、離子類、緩沖液、細胞提取液以及合成酶置于試管內調制而進行反應的所謂分批處理方式從古沿用至今。但是，這種分批處理反應法，由于它的反應原理而引發基質濃度隨著反應的進行而下降、具有抑制合成作用的副產物濃度上升等，從而使得合成反應在短時間內停止，其結果是目的生成物產量降低，具有很大的限制。前蘇聯的A.Spirin等人報告通過利用超過濾膜、透析膜或者在樹脂上固定翻譯模板的柱層析法等，可以連續供給氨基酸和ATP、GTP等的能量源以及基質，同時可以連續地從反應系統中去除目的生成物以及副產物的連續式無細胞蛋白質合成法(非專利文獻1)。但是，使用這些半透膜和超級過濾柱的連續法必須組裝復雜的裝置，而且處理煩雜，因而需要充分的經驗。還有，這種方式同時在反應系統自動化上存在很大難點。
遠藤等人發明了不采用半透膜可以連續供給基質和去除副產物的接觸界面擴散法(專利文獻1)作為解決這些問題的方法。按照該方法可以不使用特別的反應裝置合成大量的蛋白質。但是，該方法是以分子擴散原理為基礎，具有為了合成必要量的蛋白質需要較長時間的缺點，其有待解決。
進而，試管內的RNA合成法，特別是即使在無細胞蛋白質合成反應中所必需的翻譯模板mRNA的高通量(バイスル一プツト)合成法中也存在蛋白質的無細胞合成法中所見到的問題，作為課題有待解決。遠藤等人進行RNA合成法的研究，研制了利用透析膜的連續合成法，這一方式是大幅度提高分批法的性能從而合成產量極高的RNA的合成法(專利文獻2)。但是，采用這一半透膜等的RNA連續合成法需要組裝復雜的裝置，而且處理煩瑣需要充分的工作經驗。進而，該方式在反應系統自動化方面存在很大難點。
后基因組時代的今天，作為蛋白質和RNA等生物體高分子的高通量合成法中所要求的必要條件，可考慮以下幾點。1)可以在短時間內大量合成；2)在短時間內可以合成多種類的分子；以及3)以單純的原理為基礎，可以獲得使反應裝置自動化的技術要素等。特別是1)以及2)的必要條件，不僅從單純的合成價格低的角度，而且為了在保持具有相對不穩定物性的蛋白質的活性狀態下來制備是極為重要的。
(專利文獻1)WO02/24939(專利文獻2)WO01/27260(非專利文獻1)Spirin，A.et al.(1993)Meth.in Enzymol.，217，123-142發明內容本發明的課題，與利用半透膜等的復雜裝置的連續式合成法的原理完全不同，是提供蛋白質和RNA等生物體高分子的高通量試管內合成反應法的技術系統以及利用該系統的自動合成裝置。由此，可以使以解析基因產物的RNA和蛋白質等的結構·功能為目的、簡便且有效地進行全面制備和大量生產成為可能。
本發明為了解決上述課題，在以模板物質為原料的合成系統中進行以長時間維持它的高反應速度為目的的各種研究，結果通過包括以下的工序、其控制機構或者其組合的無細胞系統以及利用該系統的自動合成裝置的完成，實現了課題的解決。
即，本發明如下。
1.無細胞系合成系統，其是以模板物質為原料的合成體系，其特征為含有以下的工序、其控制工序或者其組合1)使模板物質、基質以及反應溶液接觸，導入合成反應中，2)在合成速度略為降低的前后、合成反應即要停止的前后或者在這些狀態的過程中，對反應溶液進行稀釋處理，3)在稀釋處理后進行濃縮處理，4)通過被濃縮的反應體系進行合成反應；或者1)使模板物質、基質以及反應溶液接觸，導入合成反應中，2)在合成速度略為降低的前后、合成反應即要停止的前后或者在這些狀態的過程中，對反應溶液進行濃縮處理，3)在濃縮處理后進行稀釋處理，4)通過被稀釋的反應體系進行合成反應。
2.前項1的系統，其中，通過濃縮處理將副產物去除至反應體系外。
3.前項1或者2的系統，其中，通過稀釋處理將基質、能量源和/或模板物質補充至反應體系內。
4.前項1的系統，其特征在于，多次重復1)～4)工序。
5.前述1～4項中任一項所述的系統，其中，模板物質是轉錄模板。
6.前述1～4項中任一項所述的系統，其中，模板物質是翻譯模板。
7.前項6的系統，其中，反應溶液是包括細胞提取液。
8.無細胞系合成系統，其中，將通過前項5的系統得到的轉錄產物生成系統和通過前項6或者7的系統得到的翻譯產物生成系統組合起來。
9.合成試劑盒，至少包括一種在利用前述1～8項中任一項所述的系統而由模板物質開始的無細胞系合成方法中所使用的試劑。
10.從模板物質開始的無細胞系合成方法，其中，利用前述1～8項中任一項所述的系統。
11.從模板物質開始的無細胞系合成裝置，其中，利用前述1～8項中任一項所述的系統。
12.無細胞系合成裝置，其是用于自動實施前述1～8項中的任一項所述的系統的裝置，其中，為了多次實施利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成系統，至少裝備有以下控制機構(1)開始合成的機構，(2)將反應液濃縮的機構，(3)將反應液稀釋的機構，(4)使合成反應再活化的機構，(5)使上述(2)～(4)機構重復運作的機構；或者(1)開始合成的機構，(2)將反應液稀釋的機構，(3)將反應液濃縮的機構，(4)使合成反應再活化的機構，(5)使上述(2)～(4)機構重復運作的機構。
13.前項12中所述的合成裝置，其中，將反應液濃縮的機構是采用超過濾膜的機構，使反應液通過超過濾膜去除至反應體系外時，反應液中不能通過超過濾膜的物質被濃縮在反應系統內。
14.前項13中所述的合成裝置，其中，在將反應液濃縮的機構中，反應液向反應體系外去除時，采用離心機和/或吸引泵。
15.前項12中所述的合成裝置，其中，將反應液稀釋的機構是向反應液中添加稀釋溶液或者基質溶液。
16.前項11～15中所述的合成裝置，其中，在無細胞蛋白質合成工序中，為了自動實施從轉錄模板直至生成在翻譯模板上編碼的蛋白質的工序，至少具備以下一種控制機構
(1)可變控制反應容器內溫度的機構；(2)向反應容器內分注樣品或者試劑的機構；(3)運送反應容器的機構；(4)沉淀以及濃縮過濾的機構。
17.用于實施前述1～8項中任一項中所述的系統的程序，其中，為了多次實施利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成系統，包括以下的信息處理機構(1)以反應容器的容積和反應液濃度的信息為基礎，設定單位時間的合成量變成減少傾向過程之前的合成反應初期相范圍內的合成時間的信息處理機構，(2)達到(1)的合成反應初期相范圍內的合成時間時，將稀釋溶液添加至反應容器內，將反應液設定在可以進行實質性合成反應的濃度范圍以外的信息處理機構，(3)在(2)之后，濃縮反應容器中的反應液，為使因添加稀釋液而增加的反應液的液量回到原來液量而設定的信息處理機構，(4)在(3)之后，為了再開始合成反應而設定反應最適溫度的信息處理機構，(5)為了多次重復(1)～(4)的信息處理機構；或者(1)以反應容器的容積和反應液濃度的信息為基礎，設定單位時間的合成量在變成減少傾向過程之前的合成反應初期相范圍內的合成時間的信息處理機構，(2)達到(1)的合成反應初期相范圍內的合成時間時，濃縮反應容器中的反應液，將反應液設定在可以進行實質性合成反應的濃度范圍以外的信息處理機構，(3)在(2)之后，添加稀釋溶液至反應容器中，為使因濃縮而減少的反應液的液量回到原來液量的信息處理機構，
(4)在(3)之后，為了再開始合成反應而設定反應最適溫度的信息處理機構，(5)為了多次重復(1)～(4)的信息處理機構。
18.編入了前項17中所述的程序的無細胞系統合成裝置，其特征在于，通過該程序的數據處理與該裝置進行協同工作，運行合成開始、反應液的稀釋·濃縮、合成反應的再活化的機構，可以多次反復實施利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成系統。
19.通過前項11～16、18中所述的合成裝置合成的蛋白質。


圖1顯示本發明的無細胞蛋白質合成方法與通過分批法的過去的無細胞蛋白質合成方法的實驗結果的差異圖。
圖2顯示除了改變小麥胚芽提取液的濃度以外、與實施例1同樣地進行無細胞蛋白質合成的實驗結果圖。
圖3A是除了小麥胚芽提取液的濃度為800D、GFPmRNA的濃度為640μg/ml、使實施稀釋以及濃縮的不連續反復操作的間隔變化以外，與實施例1同樣地進行無細胞蛋白質合成的實驗結果圖。
圖3B顯示由于實施稀釋以及濃縮的不連續反復操作的間隔不同而導致的合成的GFP數量差異的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果圖。
圖4顯示通過具有過濾膜的濃縮器和送液泵的組合而可以除去本發明的無細胞蛋白質合成方法中生成的副產物的結構的一個模式圖。
圖5使用圖4所示的利用過濾膜和送液泵去除副產物的結構，經本發明的無細胞蛋白質合成方法進行蛋白質合成的實驗結果圖。
圖6A顯示除了采用600D的小麥胚芽提取液、450g/ml的dihydrofolate reductase(DHFR)的mRNA作為翻譯模板以外、使用與實施例1同樣的翻譯反應液，除了以1小時的間隔實施稀釋和濃縮的不連續重復操作2次以外、與實施例1同樣地進行無細胞蛋白質合成時的實驗結果圖。
B是顯示采用本發明的方法合成在N末端融合了抗生蛋白鏈菌素的GFP融合蛋白、在體系以外單獨分離GFP融合蛋白的實驗結果的電泳圖。
圖7是顯示本發明的RNA合成方法和利用分批法的過去的體外合成RNA法之間的實驗結果的差異圖。
圖8是顯示采用以乙醇沉淀純化的mRNA和未經純化的mRNA分別作為翻譯模板，實施本發明的無細胞蛋白質合成方法的實驗結果圖。
圖9是顯示利用原樣采用實驗例7的轉錄反應后的轉錄反應液而制備的翻譯反應液來進行本發明的無細胞蛋白質合成方法的實驗結果圖。
圖10自動合成裝置的概略11顯示裝置實施例結果的SDS-PAGE圖(符號說明)1過濾濃縮器2送液泵3反應槽4裝有(RNA)基質溶液的容器5送液切換閥6容器T1管T1T2管T2T3管T3T4管T4T5管T5①模板用板②試劑槽1(轉錄反應用溶液)③試劑槽2(翻譯反應用溶液)④試劑槽3(稀釋溶液)⑤300μl接口管(チツプ)⑥20μl接口管
⑦機械臂⑧分注機1⑨分注機2⑩接收轉錄·濾液用板接口管廢棄口恒溫槽1MTP(multi titer plate)操作臺翻譯用板升降臺離心機 廢液口具體實施方式
本發明的合成法，其特征在于，將以模板物質為原料的一般的分批方式或者連續擴散分批方式的、反應速度高的合成反應初期相的特性最大限度地利用。還有，本發明的合成裝置的特征在于，使最大程度利用這一特性的合成法能夠自動化。
它的方法是在合成速度略為降低的前后或者合成反應即要停止的前后、或者在這些狀態的過程中，進行反應溶液的稀釋處理或濃縮處理。通過這些稀釋處理或濃縮處理，對以模板物質為原料的合成中所必需的基質、能量源、離子類、緩沖液以及模板物質等成分進行補充或濃縮。
這些稀釋或者濃縮的反應溶液，其后，在被稀釋的情況下進行濃縮處理、在被濃縮的情況下進行稀釋處理。通過這種處理，使反應溶液回到原來的反應最適濃度。通過該濃縮處理，可以去除或者分離反應溶液中的成分，可以使反應產物和/或反應副產物得到回收和/或去除。通過這種濃縮或稀釋，可以使合成反應的各種要素再次達到最適濃度。而且，這種稀釋及濃縮處理，通過不連續地反復進行，可以合成大量的蛋白質。
本發明的原理是，對利用模板物質的合成反應不連續地重復進行稀釋以及濃縮的合成方法。
另外，本發明的自動合成裝置的原理是，使不連續地重復進行的合成方法自動化。
在本發明中，以模板物質為原料的合成體系之一是以mRNA為模板的蛋白質的翻譯合成體系，特別是使用蛋白質合成用細胞提取液的無細胞蛋白質合成體系，該提取液是將細胞內的作為蛋白質翻譯裝置的核糖體等從細胞中取出而利用的。其另一種是指將RNA聚合酶作為酶、通過轉錄模板進行試管內轉錄反應的RNA合成體系。
(無細胞蛋白質合成體系)在無細胞蛋白質合成體系中，與利用大腸桿菌提取物的無細胞蛋白質合成體系相比，利用小麥胚芽提取物的合成體系的核酸分解酶活性較低，而且，具有翻譯活性穩定且較高的特性(Madin K.et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，559-564)，在以質粒為模板的轉錄·翻譯體系中可以高效率地合成蛋白質(PCT/JP99/04088)。以下，在本發明中，以在小麥胚芽無細胞蛋白質合成體系以及在該合成體系中可以發揮作用的轉錄模板的合成法為例予以說明，但是，本發明的基本原理也可應用于采用其它的源自微生物和動物細胞的細胞提取物的無細胞蛋白質合成體系以及用于該體系的轉錄模板的合成體系。
(細胞提取物)作為細胞提取物的市售品，有源自大腸桿菌的E.coli S30 extractsystem(Promega)、RTS 500 Rapid Translation System(Roche)、源自兔網狀紅細胞的Rabbit Reticulocyte Lysate System(Promega)、源自小麥胚芽的Proteios(TM)(TOYOBO)等。其中，特別優選采用源自植物種子的胚芽提取物，可以例舉出小麥、大麥、稻、玉米、菠菜的種子等，以采用小麥胚芽提取液的體系最為合適。
(翻譯產物生產體系)這里，所謂翻譯產物生產體系是從生物體提取含有細胞內的作為蛋白質翻譯裝置的核糖體等成分，將翻譯模板、成為基質的核酸、氨基酸、能量源、各種離子、緩沖液以及其它有效因子加入到該提取液內，使之在試管內反應的方法。
(無細胞蛋白質合成體系)這里，所謂無細胞蛋白質合成體系是從生物體提取含有作為細胞內的蛋白質翻譯裝置的核糖體等成分，將轉錄或者翻譯模板、成為基質的核酸、氨基酸、能量源、各種離子、緩沖液以及其它有效因子加入到該提取液內，使其在試管內反應的方法。
(小麥胚芽提取液)作為本發明的細胞提取物含有液優選使用其中有小麥胚芽提取液的溶液。
就小麥胚芽提取液的制備方法而言，作為分離小麥胚芽的方法，例如可采用Johnston，F.B.et al.，Nature，179，160-161(1957)中所述的方法等；而作為從分離出的胚芽中提取細胞提取物含有液的方法，例如可采用Erickson，A.H.et al.，(1996)Meth.In Enzymol.，96，38-50等中所述的方法。此外，可例舉特愿2002-23139、特愿2002-231340的方法。
在本發明可適宜利用的胚芽提取物幾乎完全去除了原料小麥自身含有或者保持的抑制蛋白質合成功能的物質(麥黃酮(トリチン)、硫堇、核糖核酸酶等的作用于mRNA、tRNA、翻譯蛋白質因子和核糖體等并抑制其功能的物質)。即，幾乎完全去除了局部存在這些抑制物質的胚乳而得以純化。去除胚乳的程度，可以通過檢查小麥胚芽提取物中夾雜的麥黃酮活性，即核糖體脫腺嘌呤化的活性加以評價。如果核糖體沒有被實質性腺嘌呤化，那么，胚芽提取物中沒有夾雜源自胚乳的成分，即判定為幾乎完全去除了胚乳而得到純化。所謂核糖體沒有被實質性脫腺嘌呤化的程度，是指核糖體的脫腺嘌呤化率小于7％，優選在1％或更少。
上述胚芽提取物含有源自細胞提取物含有液以及根據需要另外添加的蛋白質。其含有量無特別限制，但從凍結干燥狀態下的保存穩定性、容易使用等的方面來看，在凍結干燥前的組合物中，該組合物整體優選在1～10重量％、更優選在2.5～5重量％；另外，在凍結干燥后的凍結干燥組合物中，該組合物整體優選在10～90重量％、更優選為25～70重量％。并且，這里提及的蛋白質含有量是通過測定吸光度(260、280、320nm)而算出的。
(去除微生物)細胞提取物含有液中常混有微生物、特別是絲狀菌(霉菌)等的孢子，優選預先除去這些微生物。特別是由于長期(1日或更長)的無細胞蛋白質合成反應中可常見到微生物繁殖，因此抑制它的繁殖很重要。微生物的去除裝置無特定限制，但優選采用過濾滅菌濾器。濾器的孔徑只要可以除去可能混入的微生物即可，并無特別限制，但通常為0.1～1μm、優選0.2～0.5μm。
進而，在細胞提取物含有液制備工序的某一階段，通過增加去除低分子合成抑制物質的工序和/或降低還原劑濃度的工序，可以作為以進行具有特定效果的無細胞蛋白質合成為目的的細胞提取物含有液。
(從細胞提取物含有液中去除低分子合成抑制物質的方法)細胞提取物含有液含有具有蛋白質合成抑制活性的低分子的合成抑制物質(以下，常稱為“低分子合成抑制物質”)，通過去除這些物質可以取得蛋白質合成活性高的細胞提取物含有液。具體而言，從細胞提取物含有液的構成成分中，通過分子量的不同分別去除低分子合成抑制物質。低分子合成抑制物質是細胞提取物含有液中包含的蛋白質合成所必需的因子中最小的物質，可以作為具有以下分子量的分子而區分。具體而言，可以作為分子量為50,000～14,000或更低的、優選為14,000或更低的分子而區分，得到去除。
作為從細胞提取物含有液去除低分子合成抑制物質的方法，可以采用大家已知的常用方法，具體而言，可以例舉出通過透析膜透析的方法、凝膠過濾法、或者超級過濾法等。其中，在對透析內液的物質供給的容易程度等上考慮，優選用透析的方法。
作為經透析去除低分子合成抑制物質的操作中使用的透析膜，可例舉出具有去除分子量為50,000～12,000的透析膜，具體而言，優選使用去除分子量為12,000～14,000的再生纖維素膜(Viskase Sales，Chicago制造)和去除分子量為50,000的SPECTRA/孔徑6(SPECTRUM LABOTRATORIESINC.，CA，USA制造)等。在這種透析膜中加入適當量的細胞提取物含有液等，采用通常方法進行透析。進行透析的時間，優選為30分鐘～24小時左右。
(細胞提取物含有液的穩定化)進行去除低分子合成抑制物質時，在細胞提取物含有液中生成不溶性成分時，通過抑制它的生成(以下，常稱之為“細胞提取物含有液的穩定化”)，能夠提高最終獲得的細胞提取物含有液或者翻譯反應用溶液的蛋白質合成活性。作為細胞提取物含有液或者翻譯反應用溶液穩定化的具體方法可例舉出，在進行去除上述低分子合成抑制物質時，將細胞提取物含有液或者翻譯反應用溶液制成至少含有高能磷酸化合物、例如ATP或者GTP等(以下，常稱之為“穩定化成分”)的溶液而進行的方法。優選ATP作為高能磷酸化合物使用。而且，優選在含有ATP和GTP的溶液中，更優選在含有ATP、GTP以及20種氨基酸的溶液中進行。
這些成分可以預先添加穩定化成分、溫育后提供給低分子抑制物質的去除工序，在采用透析法去除低分子合成抑制物質的情況下，也可將穩定化成分添加到透析外液中進行透析來去除低分子合成抑制物質。如果預先將穩定化成分添加到透析外液內，透析中穩定化成分即使被分解，也可不斷供給新的穩定化成分，因而優選。這也適用于采用凝膠過濾法和超級過濾法的情況，用含有穩定化成分的過濾用緩沖液平衡各種載體以后，提供含有穩定化成分的細胞提取物含有液或者翻譯反應用溶液，進而通過一邊添加上述緩沖液一邊進行過濾可以獲得同樣的效果。
穩定化成分的添加量以及穩定化處理時間，可以根據細胞提取物含有液的種類和制備方法而適當選擇。作為這些選擇方法，可例舉出將按試驗性的量及種類分開的穩定化成分添加到細胞提取物含有液內，適當的時間之后進行低分子抑制物質的去除工序，用離心分離等方法將得到的處理后的細胞提取物含有液分離為可溶性成分和不溶性成分，選擇其中的不溶性成分較少的穩定化成分的方法。進而，優選用取得的處理后細胞提取物含有液進行無細胞蛋白質合成，選擇蛋白質合成活性較高的穩定化成分的方法。而且，在上述選擇方法中，在使用細胞提取物含有液和透析法的情況下，可舉出在透析外液中也添加適當的穩定化成分，用它們進行適當時間的透析以后，根據得到的細胞提取物含有液中的不溶性成分的量和得到的細胞提取物含有液的蛋白質合成活性等來選擇的方法。
這樣，作為選擇的細胞提取物含有液的穩定化條件的例子，具體而言，在通過透析法進行低分子合成抑制物質的去除工序的情況下，可舉出在它的小麥胚芽提取物含有液以及透析外液中添加ATP100μM～0.5mM、GTP25μM～1mM、20種氨基酸各25μM～5mM，進行30分鐘～1小時或更長的透析的方法等。進行透析時的溫度，只要不喪失細胞提取物含有液的蛋白質合成活性，而且是可以進行透析的溫度即可。具體而言，最低溫度為溶液不凍結的溫度，通常為-10℃、優選-5℃；最高溫度為以對透析中使用的溶液不帶來壞影響為限度的溫度40℃、優選38℃。
而且，如果在調制成細胞提取物含有液后進行低分子合成抑制物質的去除，就沒有必要在細胞提取物含有液內進一步添加上述穩定化成分。
(mRNA的制備)作為模板物質的mRNA，只要是編碼目的蛋白質的物質，它的制備方法不受限制，可以采用眾所周知的任何方法。當然，特別優選通過本發明的方法從模板物質的DNA來制備，進而在一系列的體系中連續地使用。
(翻譯反應用溶液的制備)從mRNA開始的蛋白質的合成是，在含有核糖體的蛋白質合成用細胞提取液中，以無細胞蛋白質合成方法中適宜的濃度，添加含有適宜翻譯反應的成分的溶液(翻譯反應溶液)，該溶液含有成為基質的氨基酸(采用20種必需氨基酸或者根據目的的相似體或變異的氨基酸)、能量源(ATP和/或GTP)、根據需要的各種離子(鈣離子、鎂離子、銨離子等)、緩沖液(HEPES-KOH、Tris-醋酸等)、ATP再生體系(磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶的組合、磷酸肌酸和肌酸激酶的組合等)、核酸分解酶抑制劑(核糖核酸酶抑制劑、核酸酶抑制劑等)、tRNA、還原劑(二硫蘇糖醇等)、聚乙二醇、3’，5’-cAMP、葉酸、抗菌劑(疊氮鈉、氨卞青霉素等)等，再向其中加入翻譯模板mRNA，制備翻譯反應用液。將此翻譯反應用溶液調制為適于翻譯反應的溫度，進行翻譯反應，合成目的蛋白質。
(轉錄反應)轉錄模板可以按本發明者已經報告的具有廣泛應用性的模板分子構筑法(WO01/27260、02/18586)為基準制備，適宜的例示為在例如質粒載體pEU中導入所希望的結構基因，用SP6RNA聚合酶處理來進行轉錄的方法等，當然mRNA的制備方法不限于此。將轉錄模板與含有適合于轉錄模板中的啟動子的RNA聚合酶和RNA合成用的基質(4種三磷酸核糖核苷)等轉錄反應中所必需的成分的溶液(也稱轉錄反應溶液)混合，將此混合物在約20～約60℃、優選約30～約42℃溫育約30分鐘～約16小時、更優選約2～5小時進行轉錄反應。
(合成反應)在本發明的無細胞系合成系統中可以完成包括以下的工序、工序的控制或者它們的組合的系統。
必要的工序之一是使模板物質、基質、以及反應溶液接觸并導入合成反應體系。將所述的模板物質、基質以及反應溶液(轉錄反應溶液或者翻譯反應用溶液)調制到最適濃度以及最適溫度，進行最適的合成反應。合成反應通常進行約10分鐘～2小時、更優選為20分鐘～1小時。該時間可根據各體系而改變，可以通過反復實驗來調整最適時間。在本發明的不連續重復合成法中，特別優選這種一個循環的處理時間為較短的時間。
(稀釋或者濃縮)必要的工序之二是，作為上述反應時間，在合成速度略為降低的前后或者合成反應即要停止的前后或這些狀態的過程中，對反應體系進行稀釋或濃縮處理。所謂合成速度略為降低的前后是指發現mRNA或者蛋白質的單位時間合成量隨時間變化而有從最大量開始減少的傾向的時機，一般可以理解為是線而不是點。另外，所謂合成反應的即要停止的前后是指合成量下降到實質上不能檢出的程度的水平，這種情況一般可以理解為是線而不是點。所謂這些狀態的過程中是指合成速度開始下降到合成反應停止的區間。再有，為了獲得更好的合成效率，應該在合成速度略為降低的前后對反應體系實施稀釋或者濃縮處理。這一時間最優選為10分鐘～1小時。
對反應體系的稀釋或者濃縮按以下方式進行。
稀釋是向反應體系添加約1～20倍、優選約2～10倍容量的水溶液來進行。按照需要使水溶液中含有模板物質、基質、反應溶液。特別優選的是采用含有模板物質、基質、能量源等的溶液。選擇各成分的添加濃度，使得在接下來的濃縮處理之后可以調制出最適宜合成的濃度。通過這一稀釋，反應體系處于合成能力明顯下降的狀態。本發明因此狀態，故稱為不連續。
濃縮是將反應液去除到反應體系外時，反應液中的不能通過的物質(例如合成蛋白質、核糖體等)可以被濃縮至反應體系內，可以利用眾所周知的任何濃縮方法。優選的方法可例示為，用超過濾膜進行濾過處理、通過離心機處理、凝膠過濾處理、吸引泵、使液相或者氣相中產生壓力差的方法等。在這種處理時，通過調節膜的通過孔徑，用離心分離操作、或者分子篩分離·去除反應產物、反應副產物。膜的分子量截留尺寸、離心速度、凝膠過濾條件，可以根據眾所周知的所要處理的產物的物性調至最適。在本發明中，優選利用10,000～100,000Da的分子量分離膜。
通過這一濃縮處理，反應溶液被濃縮至原來容量的1/5～2/3，其結果是，大大偏離了各合成因子的最適合成濃度。通過這種濃縮，反應體系處于合成能力明顯下降的狀態。本發明因此狀態，故稱為不連續。
(合成反應的再活化)必要的工序之三是合成反應的再活化。將在前階段被稀釋處理的反應液加以濃縮，對被濃縮處理的反應液實施稀釋處理。
前者的情況是在稀釋處理后進行濃縮處理。這里的所謂濃縮是指將通過稀釋增加的反應體系的液量回復至原來的液量。濃縮方法沒有特別的限制，可以利用眾所周知的任何濃縮方法。優選的方法可例示為，使用超過濾膜的過濾處理、通過離心機處理、凝膠過濾處理、使液相或者氣相中產生壓力差的方法等。在這種處理時，通過調節膜的通過孔徑，用離心分離操作、或者分子篩分離·去除反應產物、反應副產物。膜的分子量截留尺寸、離心速度、凝膠過濾條件可以根據眾所周知的所要處理產物的物性調至最適。在本發明中，優選利用10,000～100,000Da的分子量分離膜。
后者的情況是在濃縮處理后進行稀釋處理。這里的所謂稀釋是指將通過濃縮被減少的反應體系的液量回復至原來的液量。使稀釋溶液中根據需要含有模板物質、基質、反應溶液。特別優選采用含有模板物質、基質、能量源等的溶液。各成分的添加濃度，應該按照稀釋后可以調制出最適合成濃度來選擇。
這樣，恢復至反應系統最適濃度的反應體系，溫度可以再次被調至最適反應溫度，反應系統可以再次活化。最適溫度為15～25℃。
再者，為了反應產物和/或反應副產物的分離·回收·去除等，可以優選實施根據與處理對象物親和性的處理。所謂根據親和性可以例示為，先將親和性物質固定，使它與目的物質接觸并結合，其后溶解·回收目的物質的方法。所謂親和性物質可以例示為，例如如果回收物質是蛋白質，就是蛋白質相應的抗體、受體相應的配體、轉錄因子相應的核酸等。另外，用適當的標記·標記物修飾目的產物(例如，抗生蛋白鏈菌素、組氨酸標記、GST、麥芽糖結合蛋白質等)，使用能與這些修飾物質特異性結合的物質(例如，生物素、二價金屬離子、谷胱甘肽、麥芽糖等)來純化。
在本發明中，可以不連續地多次重復稀釋以及濃縮的處理，通過這種重復達到使無細胞合成體系的多次再生。通過這一再生就可以實現蛋白質的大量合成。
在本發明中，可以將稀釋以及濃縮的處理作為一系列的工序與控制機構相結合來完成。為了實現這種控制，可以通過驅動源(馬達、氣壓·油壓機、其它的可以控制運作的調節器等)以及用計算機控制的控制電路、程控電路等調節運作的開·關、運作的程度、運作的速度、運作間隔。并且，根據需要可以適宜地裝備信號傳輸用驅動裝置、運作確認用感知器、運作控制用開關、定時器等。
本發明如上述說明那樣，通過不連續地多次重復稀釋以及濃縮來達到無細胞合成體系的再生，更具體的說明它的效果如下。
(稀釋濃縮分批方式無細胞蛋白質合成法)在本合成法，合成反應容器可以將過去使用至今的裝有超過濾膜和透析膜的、可以濃縮的容器作為分批反應容器來開始合成反應。采用無細胞蛋白質合成方法在最適條件下進行蛋白質合成反應后，例如合成反應停止的前后，為了使反應系統再活化，將含有基質和作為能量源的氨基酸、ATP及GTP的其它緩沖液和離子類等蛋白質合成中必要的成分(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，559-556中所述的透析外液，以下簡稱為基質溶液)以及模板物質的mRNA的溶液，按反應液的1至20倍容量一次性添加、稀釋(稀釋處理)。其后，通過將反應容器放在例如離心機上離心，通過過濾膜，排出容器內增加的溶液，回復到原來的反應液容量(濃縮處理)。這種濃縮處理可以不依據離心力而是通過使液相或者氣相中產生壓力差來實現。通過這種稀釋以及濃縮處理，在提供新鮮的基質溶液給反應體系的同時，可以排除合成反應生成的抑制翻譯反應的副產物。這樣，例如通過在合成反應的停止前后進行的用含有基質等溶液不連續地重復稀釋和濃縮反應液，從而完成反應系統的再活化，可以長時間地合成蛋白質。該方法與Spirin等人研制的使用半透膜來連續進行基質、能量源的補充和代謝產物的廢棄的、所謂連續法的原理不同，它的合成效果達到數十到數千倍(在本發明的方法中，可用2～3小時獲得通過使用半透膜的方法約用30小時獲得的產量)，本質上具有很大的差異。再有，在采用本原理的蛋白質合成方法方面，通過選擇使用過濾膜的切割分子量大小，可以在排除副產物的同時選擇性地從反應系統中分離出合成蛋白質。即，通過利用本原理，使蛋白質合成和合成產物純化可以同時進行。再有，在改變進行濃縮后進行稀釋的順序的情況下也可達到同樣效果。
(稀釋濃縮分批試管內RNA合成法轉錄產物生成系統)采用噬菌體RNA合成酶的一般的RNA合成反應液組成、反應方法以及合成RNA的分析方法是按照WO01/27260以及WO02/18586中所述的方法。在本發明合成法中，可以將過去的裝有超過濾膜和透析膜的、可以濃縮的容器作為分批反應容器開始合成反應。采用的超過濾膜的切割分子量選擇RNA不能通過的大小。在合成反應停止的前后，將含有成為基質的4種三磷酸核糖核苷酸、離子類和緩沖液等的RNA合成中所必要成分的溶液(按照WO01/27260以及WO02/18586中記載方法制備的透析外液，以下簡稱為RNA基質溶液)，按照反應液的1至20倍容量添加稀釋。將反應容器放在離心機上離心，通過過濾膜，排出容器內增加的溶液，濃縮至原來的反應液容量。這一過程的處理可以不依據離心力而是通過使液相或者氣相中產生壓力差來實現。經過這些處理，在將新鮮的基質溶液提供給反應體系的同時，通過從反應體系中排除在分批RNA合成反應中生成的單核苷酸和焦磷酸，使根據化學平衡原理事實上已經停止的RNA合成反應通過移動平衡而重新開始。通過將在這一反應停止前后進行的利用基質的反應液的稀釋和過濾濃縮的操作反復實施，使長時間的RNA合成變為可能。這一方法與以前遠藤等人發明的經透析法的RNA連續合成法(WO00/68412)的原理不同。在采用本原理的蛋白質合成方法中，通過將用水(或者希望的溶液)稀釋和用過濾膜等濃縮的操作反復實施，可以將不含核苷酸類、緩沖液成分和離子類的RNA作為水(或者含有目的成分的溶液)回收。即，用這一方法，可以通過選擇成為模板的DNA分子種，高速、高產量且低價格(高價的RNA合成酶的使用量僅為通常的分批法所必要的量)制備所希望的mRNA溶液。
再有，在進行濃縮后進行稀釋的改變順序的情況下，也可達到同樣效果。
(自動合成裝置)
本發明的自動合成裝置提供使通過不連續地反復實施稀釋和濃縮來至少進行依據翻譯模板的合成反應(蛋白質合成)的合成法的一系列反應操作自動地進行的方法。而且，提供使從轉錄產物生產體系合成的轉錄模板開始到生成該模板編碼的蛋白質為止的反應操作自動地進行的方法。這里所謂“使……操作自動地進行”意味著在一系列的工序中，實驗者不需對反應系統(反應容器)直接加以手動操作。因此，實施各工序時，實驗者通過手動使用本發明的自動合成裝置中設定的規定的操作按鈕和開關，并不有損本發明中“自動”的必要條件。
在本發明中，從轉錄產物生產體系合成的轉錄模板開始到生成該模板編碼的蛋白質為止的反應操作自動化的裝置，以至少具有以下的(1)～(5)的工序為特征。
以下，例舉有關各工序具體的實施方式來詳細說明，但本發明的方法只要具有翻譯模板的純化工序的特征，就不受其限制。
(1)轉錄模板的制作工序在本發明的自動合成裝置方面，本工序不一定必須自動進行，通過手動獲得的轉錄模板也可用于以下的自動化工序中，但包括本工序在內，優選使從轉錄模板的制作開始到生成該模板編碼的蛋白質為止的一系列工序自動進行。
在本說明書中所謂“轉錄模板”是指可以作為體外轉錄反應的模板分子而使用的DNA，在適當的啟動子序列下游至少具有編碼目的蛋白質的堿基序列。所謂適當的啟動子序列是指可以使在轉錄反應中使用的RNA聚合酶識別的啟動子序列，可例舉出SP6啟動子、T7啟動子等。編碼目的蛋白質的DNA可以為任何基因。
轉錄模板優選在啟動子序列和編碼目的蛋白質堿基序列之間具有控制翻譯效率活性的堿基序列，例如可以采用源自煙草花葉病毒的Ω序列等源自RNA病毒的5’非翻譯區域、和/或柯薩克序列(Kozak’s sequence)等。而且，轉錄模板優選包括在編碼目的蛋白質堿基序列的下游中含有轉錄終止區域的3’非翻譯區域。所謂3’非翻譯區域優選在終止密碼子下游約1.0～約3.0千堿基左右。這些3’非翻譯區域不必是編碼目的蛋白質的基因原來有的序列。
轉錄模板的制作可以通過眾所周知的手法實施。可以例舉培養含有插入DNA的質粒的大腸桿菌等的宿主細胞，該DNA含有與所希望的轉錄模板相同的堿基序列，采用公知的純化方法大量制備該質粒后，用適當的限制酶從該質粒中切出轉錄模板DNA，通過苯酚處理以及氯仿處理去除限制酶，進一步通過乙醇或異丙醇的醇沉淀(根據需要，添加適當量的醋酸銨、醋酸鈉、氯化鈉等的鹽)等純化轉錄模板的方法。獲得的DNA的沉淀溶解在超純凈水或下述的轉錄反應用溶液中，可供以下的轉錄反應使用。
為了這樣一系列操作自動或半自動(指部分工序中實驗者直接手動操作反應體系的狀態)實施的裝置是已知的，通過將這些裝置組裝到本發明的自動合成裝置中，就可以自動進行從轉錄模板的制作到蛋白質的生成。但是，如果考慮到以提供為了高通量分析而在本發明所涉及的高通量合成系統為目的，以及裝置的簡單化，縮短所要時間等，優選利用通過以下的多聚酶鏈反應(PCR)來制作轉錄模板的方法。
在本發明的合成裝置的優選實施方式方面，采用將編碼目的蛋白質的DNA克隆化的宿主(例如具有含有該DNA的質粒的大腸桿菌等)用直接PCR擴增轉錄模板的方法。例如通過眾所周知的手法采用DNA自動合成機器合成含有適當的啟動子序列、具有控制翻譯效率活性的5’非翻譯序列以及編碼目的蛋白質的DNA的5’端部分區域的寡核苷酸，將此作為有義引物，而將含有3’非翻譯序列的3’端區域序列的寡核苷酸作為反義引物，將編碼目的蛋白質的DNA以及它的下游中含有該3’非翻譯序列質粒的大腸菌等的宿主作為模板加入直接PCR反應液內，在通常的條件下使之進行擴增反應可以獲得所希望的轉錄模板。另外，為了防止產生通過非特異擴增生成的短鏈DNA(結果出現目的產物的回收量低以及低分子翻譯產物干擾)，也可使用國際公開第02/18586號小冊子中所述的啟動子分斷型引物。
擴增反應也可采用市售PCR用熱循環儀在市售PCR用96孔板中進行，也可將同樣的溫度可變控制裝置與本發明的合成裝置聯動，或者將用于進行本發明的合成裝置的轉錄·翻譯反應的各種方法直接適用于PCR中。
如上述獲得的轉錄模板DNA通過氯仿提取和醇沉淀純化后也可用于轉錄反應，但為了裝置的簡單化、縮短所要時間，優選將PCR反應液直接地作為轉錄模板溶液來使用。在轉錄模板的制作中，與一次大量制備質粒、用限制酶處理質粒獲得轉錄模板的方法相比較，通過采用上述從宿主的直接PCR可以格外地節省工序，可以用較少的工序數、在短時間大量合成轉錄模板。即，因為不需要培養含有重組目的基因質粒的大腸桿菌來大量制備質粒的工序，可以縮短為培養和純化質粒的超速離心所需要的時間。而且，由于可以省略從質粒中切出轉錄模板的限制酶處理、以及用于除去限制酶等的苯酚處理、氯仿處理、用于純化轉錄模板的醇沉淀、用于溶解轉錄模板DNA的沉淀的工序，因此，沒有由苯酚/氯仿的殘留引起的轉錄反應的抑制和由多工序純化操作引起的轉錄模板的丟失。此外，由于可以減少反應中需要的步驟次數，進一步具有使用少量的接口管等即可的優點。
(2)轉錄反應工序本發明的合成裝置，包括從采用眾所周知的方法制備的編碼目的蛋白質的轉錄模板DNA，通過體外轉錄反應產生翻譯模板mRNA的工序。將向反應體系(例如96孔滴定板等市售的反應容器)中提供的含有轉錄模板的溶液、優選上述PCR反應液與含有適合于轉錄模板中啟動子的RNA聚合酶(例如SP6RNA聚合酶等)和RNA合成用的基質(4種三磷酸核苷)等的轉錄反應中必需成分的溶液(也稱為『轉錄反應用溶液』)混合后，在約20℃～約60℃、優選為約30℃～約42℃，溫育30分鐘～16小時、優選溫育約2小時～約5小時，如此地進行該轉錄反應工序。轉錄模板溶液、轉錄反應用液向反應容器內的分注、混合等的操作可以使用下述的自動合成裝置的分注裝置(例如移液器(作為反應容器使用市售96孔滴定板時，優選使用具有適合于孔間距的8聯或12聯分注接口管的裝置)等)。而為了轉錄反應的溫育，可以通過下述的合成裝置的溫度控制機構一邊控制一定溫度一邊進行。
(3)翻譯模板的純化工序如上述那樣，生成的轉錄產物(即“翻譯模板”)是RNA分子，其包含按照所需而插入轉錄模板中的、具有控制翻譯效率活性的5’非翻譯序列和/或3’非翻譯序列，具有編碼目的蛋白質的堿基序列。轉錄反應后的反應液中混有除翻譯模板RNA外的未反應的三磷酸核苷和反應副產物焦磷酸、其它轉錄反應用溶液中含有的鹽等，因為已知這些物質抑制后來的翻譯反應，所以，通過交換反應溶液去除這些物質。作為這樣的溶液交換方法，可以例舉出將反應溶液加入到裝有濾器的容器中通過離心去除含有抑制翻譯反應的物質的溶液、添加新的適當的緩沖液等溶液、重復這一操作的方法，但不限于此。如果將新添加的溶液作為翻譯反應用溶液，可以不經過純化模板進行下一步的翻譯反應。而且，作為去除這些物質的方法可以舉出選擇性地沉淀翻譯模板分離去除未反應基質等的方法。作為這樣的沉淀方法，可例舉出鹽析等，優選例如醇沉淀法，但不局限于此。采用醇沉淀法的情況下，使用的醇只要是選擇性地使RNA沉淀的物質，就沒有特別的限制，例如優選乙醇、異丙醇等，更優選乙醇。乙醇的情況下，優選使用轉錄反應液的約2倍量～約3倍量；異丙醇的情況下，優選使用轉錄反應液的約0.6倍量～約1倍量。而且，通過與適當的鹽共存，可以增大沉淀產量。作為這種鹽可以舉出醋酸銨、醋酸鈉、氯化鈉、氯化鋰等。例如采用醋酸銨的情況下，優選使終濃度達到約0.5M～約3M來添加。此外，醇沉淀可在室溫下進行。
(4)翻譯反應工序如上述那樣，通過將含有獲得的翻譯模板的翻譯反應用溶液以適當的溫度、適當的時間進行溫育，可以進行翻譯反應。翻譯反應通常進行約10分鐘～2小時，更優選20分鐘～1小時。這個時間可根據各反應體系而改變，通過反復實驗可以調至最適時間。在本發明的不連續重復合成法中，這一個循環的處理時間特別優選較短的時間。
如前所述在上述的反應中，在合成速度略為降低的前后或者合成反應即要停止的前后，或這些狀態的過程中時，進行對反應體系的稀釋或濃縮。所謂合成速度略為降低的前后意味著可見蛋白質的單位時間合成量隨時間變化而具有從最大量開始出現減少傾向的時機，一般可以理解為是線而不是點。并且，所謂合成反應的即要停止的前后是指合成量降至實質上不能檢出程度的水平，這種情況一般也可以理解為是線而不是點。所謂這些狀態的過程中是指合成速度開始下降到合成反應停止的期間。在此，為了獲得更好的合成效率，在合成速度略為降低的前后對反應體系進行稀釋或者濃縮處理。這一時間最適為10分鐘～1小時。
對反應體系稀釋或者濃縮按以下方式進行。
稀釋為向反應體系添加約1～20倍、優選添加約2～10倍容量的水溶液來進行。使水溶液內按照所希望地含有模板物質、基質、反應溶液。特別優選采用含有模板物質、基質、能量源等的溶液。各成分的添加濃度，應該按照使得在以下的處理得濃縮后可調制出合成最適濃度的標準來選擇。通過這一稀釋，反應體系處于合成能力顯著下降的狀態。因此狀態，本發明稱為不連續。
濃縮可以利用在將反應液去除到反應體系外時能將反應液中的不能通過的物質(例如合成蛋白質、核糖體等)濃縮在反應體系內的、眾所周知的所有濃縮方法。優選為，例示如使用超過濾膜的過濾處理、通過離心機的處理、凝膠過濾處理、吸引泵、使液相或者氣相內產生壓力差的方法等。在這種處理時，通過調節膜的通過孔徑、離心分離操作、或者經分子篩分離·除去反應產物、反應副產物。膜的分子量截留尺寸、離心速度、凝膠過濾條件，可以按照眾所周知的處理目的產物的物性調至最適。在本發明中，優選利用10,000～100,000Da的截留分子量的分離膜。
通過這一濃縮處理，反應溶液被濃縮至原來容量的1/5～2/3，其結果，各合成因子成為大大偏離最適合成濃度的狀態。通過這種濃縮，反應系統變為合成能力顯著下降的狀態。因此狀態，本發明稱為不連續。
接著進行合成反應的再活化。將在前階段被稀釋處理的反應液加以濃縮，被濃縮處理的反應液進行稀釋處理。
前者的情況是在稀釋處理后進行濃縮處理。這里的所謂濃縮意味著將通過稀釋被增加的反應體系的液量回復至原來的液量。濃縮方法沒有特別的限制，可以利用眾所周知的所有濃縮方法。優選為，例示如使用超過濾膜的過濾處理、通過離心機的處理、凝膠過濾處理、使液相或者氣相內產生壓力差的方法等。在這種處理時，通過調節膜的通過孔徑、離心分離操作、或者經分子篩分離·去除反應產物、反應副產物。膜的分子量截留尺寸、離心速度、凝膠過濾條件，可以根據眾所周知的處理目的產物的物性調至最適。在本發明中，優選利用10,000～100,000Da的截留分子量分離膜。
后者的情況是在濃縮處理后進行稀釋處理。這里的所謂稀釋意味著將通過濃縮被減少的反應體系的液量回復至原來的液量。使稀釋溶液內按照所希望的含有模板物質、基質、反應溶液。特別優選采用含有模板物質、基質、能量源等的溶液。各成分的添加濃度，應該按照稀釋后可調制達到合成最適濃度來選擇。
這樣，恢復至反應體系最適濃度的反應體系，可以再次將溫度調至最適反應溫度、反應體系可以再次活化。最適溫度為15～25℃。
在本發明中，可以不連續地多次重復稀釋以及濃縮的處理，通過這種重復達到使無細胞合成體系的多次再生。重復次數從2次到20次，優選從5次到10次。通過這種再生，就可以完成蛋白質的大量合成。
有關其它的工序，可以按照能夠適用于自動化的眾所周知的任意順序和條件來進行，沒有特別的限制。
在本發明中，為進行上述操作的裝置至少具有以下的(a)～(e)的機構為其特征。
(a)對反應容器內的溫度實施可變控制的機構(b)向反應容器內分注樣品或試劑的機構(c)運送反應容器的機構
(d)沉淀及濃縮過濾的裝置以及(e)控制上述(a)～(d)的機構使其按照上述本發明的方法運作的控制機構。
通過采用這種至少裝有(a)～(e)結構的裝置，可以使從上述本發明的轉錄產物生產系統合成的轉錄模板到生成該模板編碼的蛋白質為止的反應操作自動實施。以下具體詳述有關各結構。
(a)對反應容器內的溫度實施可變控制的機構所謂對反應容器內的溫度實施可變控制的機構是指在轉錄反應、翻譯反應的溫育以及翻譯反應的停止、翻譯模板的沉淀、或者采用本發明的自動合成裝置通過PCR法自動實施轉錄模板的制作工序時在PCR法的擴增反應等中，為調整反應容器內液體溫度到達適當溫度條件的機構。可控制改變的溫度范圍沒有特別的限制，只要是在包括轉錄模板制作的無細胞蛋白質合成的一系列反應操作中通常所必要的溫度范圍(例如約4℃～約100℃，優選約15℃～約60℃)內能夠控制改變反應容器內溫度的機構，就可作為實現這點的裝置而沒有特別的限制。可以例舉出眾所周知的タカラPCR熱循環儀MP(タカラ生物股份有限公司制造)、(Gene Amp PCR System 9700(AppliedBiosystems Inc.，制造)等。具體而言，與進行移液操作等的場所及置放反應容器的操作臺不同，是在裝置內設計多個置放反應容器的操作臺，通過控制改變操作臺上整個空間的溫度，從而實現控制改變反應容器內的溫度。
(b)向反應容器內分注樣品或試劑的裝置所謂向反應容器內分注樣品或試劑的機構是指為了在反應容器內進行轉錄反應、翻譯反應、PCR等的一系列的無細胞蛋白質合成反應，而向反應容器內分注樣品或試劑的機構。這里“樣品”是指轉錄模板、翻譯模板、PCR用模板質粒(或者含有該質粒的宿主(如大腸桿菌))等；“試劑”是指轉錄反應用溶液、翻譯反應用溶液、翻譯反應溶液、稀釋溶液、醇、鹽溶液、PCR反應用溶液等。作為這樣的分注機構，只要是根據工序能調整分注樣品、試劑的分量來進行分注的機構，就可以無特別限制地使用眾所周知的適當的可以自動分注的移液臂(分注機)等來實現。而且，移液臂可以具備將使用完的接口管丟棄在合成機的接口管廢棄口的功能以及將吸完的濾液吐出到廢液口中的功能。
另外，該分注機構更優選具備上述功能加上用于2種或更多種溶液均一化及溶解沉淀的混合功能(如移液、攪拌等)。
再有，經移液臂，通過向反應容器的各單元中添加基質溶液或者稀釋溶液可以實行反應液的稀釋處理。
(c)運送反應容器的機構所謂運送反應容器的機構是指使反應容器向各操作臺、離心機、升降臺、恒溫槽移動的機構。這樣的運送反應容器的機構只要能夠將反應容器運送至目的地，可以沒有特別限制地采用眾所周知的適宜機構來完成。例如可以采用過去的合成裝置中使用的機械臂來完成。
(d)沉淀以及濃縮過濾的機構所謂沉淀及濃縮過濾機構是指使轉錄反應中產生的白色懸濁物沉淀的操作或者重復濃縮過濾翻譯反應時的反應液的機構。這樣的機構是可以使反應中生成的白色懸濁物沉淀并分離固體的，而且，只要可以重復濃縮翻譯反應時的反應液，就沒有特別限制，可以用眾所周知的適宜機構來完成。例如可采用眾所周知的離心機、還有在過濾和凍結干燥中以往就使用的適宜裝置來完成該機構。
(e)控制機構控制機構中包括對為了使上述(a)～(d)的機構運作而在各機構中使用的驅動源(發動機、空氣壓縮·油壓縮機、其它的可以控制運作的傳動裝置等)的運作的開始與停止、運作的程度以及狀態等進行控制的控制裝置。它的控制結構是為了可以完成使上述(a)～(d)的機構的運作和從轉錄產物生產體系中合成的轉錄模板到生成該模板編碼的蛋白質為止的反應操作自動進行。
前述控制裝置，例如可以是組合含有具有控制程序的計算機的控制電路、程控電路等、控制上述各機構的運作時所必要的控制機器而構成，為使上述的各機構按照目的順序運作，做成可以向各機構提供信號、以及根據需要提供電力、空壓、油壓等的控制結構。另外，也可適當添加用于給上述各機構的驅動源輸送直接驅動信號的必要的驅動器、用于檢測出上述各機構的驅動源的運作狀態的必要的感知器、開關等。
另外，對可以適用于本發明的合成裝置的反應容器沒有特別的限制，可使用無細胞蛋白質合成反應中使用至今的眾所周知的各種反應容器，可例舉出96孔PCR用板、96孔滴定板、8聯試管及試管(1.5ml、15ml、50ml等)，但例如將翻譯反應系統采用分批法和重層法時，可以在96孔板等的小的反應系統中進行翻譯反應，而且，由于用本發明的合成裝置，轉錄反應也可以在小的反應系統中進行，包括轉錄反應·翻譯模板的純化、翻譯反應、根據希望用于制作進一步提供給轉錄反應的轉錄模板的PCR在內的一系列無細胞蛋白質合成法的反應操作，可以在多種反應體系中對多種蛋白質同時進行，可以在短時間內合成多種的蛋白質。
進而，提供用于將通過翻譯模板的合成反應利用不連續重復地進行稀釋以及濃縮的合成法實施的裝置。本發明的裝置以至少具有以下的(1)～(5)機構為其特征。
(1)開始合成的機構，(2)濃縮反應液的機構，(3)稀釋反應液的機構，(4)合成反應的再活化的機構，(5)使上述的(2)～(4)的機構重復運作的機構；或者(1)開始合成的機構，(2)稀釋反應液的機構，(3)濃縮反應液的機構，(4)合成反應的再活化的機構，
(5)使上述的(2)～(4)的機構重復運作的機構。
通過使用至少具有這樣的(1)～(5)結構的裝置可以使上述本發明的高通量合成系統自動進行。以下具體詳述各機構。
(1)開始合成的機構①將分注機移至加入翻譯反應液的試劑槽內，吸引翻譯反應液。
②將分注機移至翻譯用板(單元的底部為濾器)的上方，將翻譯反應液吐出至加入轉錄產物的翻譯用板的各單元內。
③接著②，分注機進行各個單元的移液操作。
④機械臂將蓋上翻譯用板的蓋子，并把該板運送至恒溫槽以及安裝在恒溫槽內。
⑤翻譯板保溫，開始合成。
⑥在設定的合成時間結束后，機械臂將翻譯用板運送至MTP操作臺。
(2)稀釋反應液的機構①將分注機移至加入稀釋溶液的試劑槽內，吸引稀釋溶液。
②將分注機移至翻譯用板上方，將稀釋溶液吐出至加入翻譯產物的翻譯用板的各個單元內。
(3)濃縮反應液的機構①機械臂將翻譯用板重疊在接受轉錄·濾液用板上。
②機械臂將重疊的翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板運送至升降臺內。
③將裝載重疊的翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板的升降臺下降至與離心機的高度相吻合。
④機械臂將重疊的翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板安裝在離心機內。此時，翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板為一組的情況下，在對角線上安裝隔板。另外，在二組的情況下，將相互的板安裝在對角線上。
⑤通過離心機開始離心。此時由于翻譯用板的底為濾器，因此可以將濾液去除至接受轉錄·濾液用板的單元中，翻譯用板中各個單元被濃縮。
⑥機械臂將重疊的翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板從離心機運送至升降臺內。
⑦使裝載重疊的翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板的升降臺上升。
⑧機械臂將重疊的翻譯用板以及接受轉錄·濾液用板運送至MTP操作臺，將翻譯用板和接受轉錄·濾液用板分開安裝。
(4)使合成反應再活化的機構前面階段先做稀釋處理的情況下繼續進行濃縮處理，先做濃縮處理的情況下繼續進行稀釋處理。
①機械臂將濃縮處理后的翻譯用板或者稀釋后的翻譯用板運送至恒溫槽內并安裝在恒溫槽內。
②翻譯板保溫，開始合成。
(5)使上述的(2)～(4)機構重復運作的機構①設定時間結束后，使恒溫槽的溫度降低，使實質性合成停止。
②機械臂將翻譯用板運送至MTP操作臺。
③多次重復(2)～(4)中所述的機構重復運作。
另外，上述合成裝置的機構是使高通量合成系統自動運行的一個例子，可以進一步包含通過濃縮處理進行廢液處理的機構、將分注機的接口管作廢棄處理的機構等。
此外，為多次實施利用用于實施高通量合成系統的蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成體系，包括以下的信息處理機構的程序也是本發明的對象。
(1)以反應容器的容積和反應液濃度的信息為基礎，設定單位時間的合成量在出現減少傾向途中之前的合成反應初期相范圍內的合成時間的信息處理機構；(2)達到(1)的合成反應初期相范圍內的合成時間時，向反應容器內添加稀釋溶液，將反應液設定在能夠進行實質性合成反應可能的濃度范圍以外的信息處理機構；(3)在(2)之后，濃縮反應容器內的反應液，進行設定而使得因添加稀釋溶液而增加的反應液的液量回復到原來的液量的信息處理機構；(4)在(3)之后，為使合成反應再次開始而設定反應最適溫度的信息處理機構；(5)用于多次重復(1)～(4)的信息處理機構。
或者(1)以反應容器的容積和反應液濃度的信息為基礎，設定單位時間的合成量在出現減少傾向途中之前的合成反應初期相范圍內的合成時間的信息處理機構；(2)達到(1)的合成反應初期相范圍內的合成時間時，濃縮反應容器內的反應液，將反應液設定在能夠進行實質性合成反應的濃度范圍以外的信息處理機構；(3)在(2)之后，向反應容器內添加稀釋溶液，進行設定而使得因濃縮而減少的反應液液量回復到原來液量的信息處理機構；(4)在(3)之后，為使合成反應再次開始而設定反應最適溫度的信息處理機構；(5)用于多次重復(1)～(4)的信息處理機構。
進而，在編入上述程序的眾所周知的合成用裝置方面，通過該程序的信息處理與該合成裝置共同作用，進行開始合成、反應液的稀釋·濃縮、合成反應的再活化工序，可以多次重復進行利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成體系，以此為特征的合成裝置也是本發明的對象。
另外，使其進行轉錄反應、翻譯反應之際，優選反應容器在密閉中進行，由此觀點優選采用帶有蓋子的反應容器，進而裝置優選具有進行該反應容器蓋子的開閉的機構。上述蓋子，如作為反應容器使用96孔板時，可例示為將一個一個的孔分別能夠密封的橡膠制的蓋子。關閉狀態下優選蓋子可以蓋緊反應容器，由此可以考慮采用具有一定程度的重量(例如500G左右)的蓋子，或者用夾子樣的東西將蓋子和反應容器夾住閉上蓋子。并且，使反應容器的蓋子進行開閉的機構，例如可以采用眾所周知的卡盤結構·吸引結構與機械臂組合的結構等來實現。
本發明的合成裝置除上述各機構以外，按照需要可以具有儲備反應試劑的機構。
如同上述，本發明的高通量系統以及自動進行該系統的裝置，可以同時簡便自動地合成多種蛋白質。例如備齊多個編碼各種變異體的蛋白質的轉錄模板、翻譯模板，同時多量地合成多種的變異體蛋白質，不需要對變異體進行詳細設計即可提供用于分析等，很有用。
并且本發明的高通量系統以及自動運行該系統的裝置可以很好地用于各種蛋白質的高通量功能分析的用途。例如，同源性檢索的結果，以編碼包含保存下來的共同功能區(例如蛋白激酶功能區等)的蛋白質的基因群為模板，采用本發明的裝置通過本發明的方法同時合成該蛋白質，另外同樣合成可能成為磷酸化的靶蛋白質群(例如轉錄因子等)，將兩者以各種組合方式混合，例如，以攝取32P標記的ATP為指標，可以同時鑒定何種蛋白質激酶使何種蛋白質磷酸化。
或者，以編碼轉錄因子中含有特有的模體(Zn指狀結構、亮氨酸拉鏈等)的蛋白質的基因群為模板，采用本發明的裝置通過本發明的方法同時合成該蛋白質，通過檢測與已知的順式成分序列的結合、與其它轉錄控制因子形成雜合二聚體的能力、進而與特定基因啟動子的轉錄控制區域的結合能力等，可以獲得用于闡明轉錄因子交織的相互影響的信息。
實施例以下例舉實施例具體說明本發明，但本發明并不受下面記載的實施例的限制。
(無細胞蛋白質合成法)1)從DNA到mRNA的反應(轉錄反應)制備轉錄反應溶液[最終濃度為80mM HEPES-KOH pH 7.8、16mM醋酸鎂、10mM二硫蘇糖醇、2mM精脒、2.5mM 4NTPs(4種三磷酸核苷酸)、0.8U/μlRNase抑制劑、0.1μg/μl DNA[質粒GFP(GreenFluorescent Protein)]、1.6U/μl SP6 RNA聚合酶]，37℃下反應3小時。反應后在4℃以12000rmp離心1小時、離心后收集上清，添加乙醇至終濃度約70％、醋酸銨至終濃度約0.27M，在4℃的冰上靜置10分鐘后以3000rmp離心30分鐘(乙醇沉淀)。該乙醇沉淀進行3次后，用適量的透析緩沖液(最終濃度為35mM HEPES-KOH pH7.8、3.1mM醋酸鎂、103mM醋酸鉀、16mM肌酸、1.2mM ATP、0.26mM GTP、2.5mM DTT、0.43mM精脒、0.3mM的各種氨基酸)將RNA濃度調至約5～10mg/ml。
另外根據本發明，通過稀釋以及濃縮的不連續的重復操作來合成mRNA是遵照實驗例7來進行。
2)翻譯反應用溶液的制備使用翻譯反應溶液[最終濃度為35mM HEPES-KOH pH7.8、103mM醋酸鉀(KOAc)、3.1mM醋酸鎂(Mg(OAc)2)、16mM磷酸肌酸、1.2mM ATP、0.26mMGTP、2.5mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.43mM精脒、0.3mM AAs(20種的L型氨基酸的混合物)、1.03mg/ml肌酸激酶]，調制胚芽提取液，使翻譯反應時的胚芽提取液的濃度(O.D.260nm)為40至120來使用。
3)翻譯反應在含有上述的胚芽提取液的翻譯反應溶液內根據胚芽提取液的翻譯反應時的濃度，加入上述制備的mRNA溶液進行反應。即，將胚芽提取液的翻譯反應時的O.D.260nm為100時添加的mRNA量作為0.8mg/ml，制備根據比例計算加入的mRNA的量。
將上述制備的反應溶液在20℃下反應。從反應開始經過一定時間后(10分鐘～3小時)用2～3倍容量的上述翻譯反應液稀釋反應溶液，隨后用切割分子量為30,000Da的超過濾膜濃縮，回復反應溶液至與稀釋前等量狀態。多次重復這一操作。或者，事先濃縮至約1/2～1/3容量，其后用上述翻譯反應液稀釋至原來的容量。
在用分批法操作將mRNA追加添入翻譯反應溶液的情況下，根據上述小麥胚芽液的濃度加入在1)中制備的轉錄反應液(乙醇沉淀前的溶液)，或者經過乙醇沉淀操作而制備的mRNA溶液進行。
4)蛋白質合成效果的確定合成蛋白質質量的測定根據Madin K et al.等的報告(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-556)中所述的方法進行。
5)小麥胚芽提取液的形態另外，本研究采用的小麥胚芽提取液、無細胞蛋白質合成反應液組成、mRNA的制備法、分批無細胞蛋白質合成法是按照Madin K et al.等的報告(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-556)、專利第3255784號、特開平2000-236896號、WO00/68412號、Sawasaki T.etal.等的報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)，99，14652-14657)中所述的方法制備。
(裝置例)圖4顯示出本發明的稀釋以及濃縮操作可以多次進行不連續地進行合成反應的體系的模式圖。在通過具有過濾膜和送液泵樣的結構完成稀釋以及濃縮操作的情況下，可例示利用如圖4中所模式地顯示的結構。通過利用具有過濾膜的過濾濃縮器1和送液泵2組合的結構，在反應槽3內翻譯反應的終止前后用(RNA)基質溶液稀釋(轉錄或者)翻譯反應液后，通過過濾濃縮器1過濾副產物，排出至容器6內。另一方面，使被濃縮的(轉錄或者)翻譯反應液再次回到反應槽3中，可以使反應再次開始。
在圖4所示體系中，接受(RNA)基質溶液的容器4和反應槽3通過管T1、送液切換閥5以及管T2連接，這一送液切換閥5通過管T3、送液泵2、管T4、過濾濃縮器1、管T5與反應槽3連接。這樣，送液切換閥5是可以適當切換下述各種狀態的結構(a)未向反應槽3內送液的狀態(閥關閉狀態)；(b)通過送液泵2的運作從裝有(RNA)基質溶液的容器4吸取(RNA)基質溶液，可以直接向反應槽3內送液的狀態；(c)通過送液泵2的運作，吸取反應槽3內的(轉錄或者)翻譯反應液，使之通過過濾濃縮器1后回到反應容器3，如此可使(轉錄或者)翻譯反應液循環的狀態；(d)通過送液泵2的運作從裝有基質溶液的容器4吸取(RNA)基質溶液，使之通過過濾濃縮器1、可以向反應槽3內送液的狀態。
采用這樣的結構按以下的順序進行操作。
1.在反應槽3內，用分批反應進行(轉錄或者)翻譯反應。這期間，關閉送液切換閥5[上述(a)的狀態]，送液泵3也停止，使向反應槽3內送液處于停止狀態。
2.在(轉錄或者)翻譯反應停止前后的任何時刻，切換送液切換閥5[上述(b)的狀態]，使送液泵2運作，將(RNA)基質溶液供給反應槽3內混合。
3.變換送液切換閥5[上述(c)的狀態]，使送液泵2運作，吸取反應槽3內的(轉錄或者)翻譯反應液，使之通過過濾濃縮器1，將副產物排至容器6，并且使濃縮的反應液循環回到反應槽3內。
4.切換送液切換閥5[上述(d)的狀態]，使送液泵2運作吸取容器4內的(RNA)基質溶液，使之通過過濾濃縮器1送液至反應槽3內，將過濾濃縮器1內殘留的部分(轉錄或者)翻譯反應液洗出流至反應槽3內。
5.切換送液切換閥5[上述(b)的狀態]，使送液泵2運作，吸取容器4內的(RNA)基質溶液，送液至反應槽3內，將反應槽3內的(轉錄或者)翻譯反應液量調至原來的容量后，切換送液切換閥5[上述(a)的狀態]停止送液。
6.回到1，重復上述的操作。
實現利用這樣體系的裝置時，作為使用的送液泵可以使用眾所周知的適宜的送液泵，沒有特別的限制，可例示如蠕動泵[例如LKB-Pump-P1(Phamacia公司制)等]等。而且，作為過濾濃縮器也可使用眾所周知的，而沒有特別的限制。具體而言，可以例示為交叉流動過濾裝置、VF05C2型(切割分子量為3萬、Sartorius公司制)等。
通過具有過濾膜和送液泵的結構實現上述的稀釋以及濃縮機構的系統，與利用離心機的情況相比，蛋白質的合成產量提高(參照實驗例4)，而且，可以構建能大規模容量進行無細胞蛋白質合成的裝置。進而，通過將小型的反應容器與過濾濃縮器組合，可以構建小容量型的裝置，作為去除上述的副產物的機構，與具有過濾膜和離心機樣的結構不同，不必裝置成為大規模的。而且，在具有這樣的過濾膜和送液泵樣的結構上，稀釋·濃縮過程的精密控制是容易的，可以期待對適合各種目的的一般的無細胞蛋白質合成技術的自動化而言成為極為重要的骨干技術。
實驗例1作為不連續地重復本發明的稀釋以及濃縮處理的分批式無細胞蛋白質合成法的一個例子(實驗例1)，圖1顯示了使用小麥胚芽提取液的實驗結果。比較例是通過分批法的過去的無細胞蛋白質合成法得到的結果。縱軸是合成蛋白質的量(mg/ml)，橫軸顯示反應時間(小時)。在圖1中，連結黑圓的線(●-●)為本發明的方法，連結白圓的線(○-○)為過去分批法的結果。在合成反應中，40A260nm/ml(小麥胚芽提取液在260nm波長的吸光度)的濃度的小麥胚芽提取液與320μg/ml的編碼Green FluorescentProtein(GFP)的mRNA(翻譯模板)混合，在20℃進行無細胞蛋白質合成。
比較實驗的合成反應是采用帶有切割分子量為3萬的超過濾膜的濃縮容器(分離分子量30,000KDa)來進行。以熒光活性為指針的蛋白質生成量的時間變化在過去的分批法反應方式中顯示為典型的雙曲線型。即，經過反應開始初期的最大速度相反應速度降低，在反應接近停止3小時以后，即使經過長時間保溫合成蛋白質的量未見增加(○-○)。該結果與迄今為止的報告頗為一致(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-556)。這一反應停止的原因并沒有完全闡明，主要考慮為作為能量源的ATP和GTP濃度下降(能量枯竭)和不能再生的副產物AMP和GMP的蓄積通過某種機制抑制蛋白質合成所致。
本發明的合成反應在裝有超過濾膜的容器內進行，在反應速度較高、反應停止前相當于反應開始2小時后，添加反應液量3倍容量的蛋白質合成基質溶液(含基質以及能量源)并攪拌(稀釋處理)。接著通過離心機離心，濃縮用這種基質溶液所稀釋的溶液至稀釋前的反應溶液容量(箭頭所示的時刻)(濃縮處理)。通過不連續地多次重復這種稀釋以及濃縮的一系列處理，含有副產物的低分子物質經超過濾膜被排除、其濃度降低，另一方面使合成反應所消耗的ATP、GTP、氨基酸分別回復至接近反應開始時的各自濃度。通過這種濃縮處理，同時使源自小麥胚芽的核糖體、tRNA和其它所有的翻譯因子被濃縮至反應開始時的原來濃度。可以確認通過這種處理，一旦低下的蛋白質合成反應再次開始，維持至原來較高的初期速度后，其后反應再次降低(●-●)。通過這種不連續地重復稀釋以及濃縮處理，可以利用初期反應速度較高的時間區域的特性，完成高效率的無細胞蛋白質合成。如圖1所示，通過4次的重復稀釋濃縮處理，可以使在GFP分批方式中1ml反應容量合成的0.072mg的合成量，上升至0.41mg。在此，合成蛋白質的量是按照GFP的熒光強度測定技術(熒光最大波長508nm)，1μg/ml的GFP以熒光強度為2.0來計算。
通過本處理達到充分的合成效率，但伴隨稀釋以及濃縮處理的重復，可見體系的蛋白質合成速度漸漸降低的現象。其原因推測為源自胚芽的翻譯因子(群)漏出至濾液中或者吸附在超過濾膜上等引起反應體系內部的損失、mRNA的分解、或吸附在超過濾膜上所致的濃度降低等。
實驗例2圖2為顯示除了改變小麥胚芽提取液的濃度以外，與實施例1同樣地進行無細胞蛋白質合成的實驗結果圖。縱軸是合成的蛋白質的量(mg/ml)，橫軸顯示反應時間(小時)。在圖2中，連結小黑圓的線(·-·)顯示小麥胚芽提取液濃度為60A260nm/ml、GFPmRNA濃度為480μg/ml時(實施例2)的實驗結果。大黑圓的線(●-●)顯示小麥胚芽提取液濃度為80A260nm/ml、GFPmRNA濃度為640μg/ml時(實施例3)的實驗結果。并且在圖2中，箭頭顯示進行上述的操作的時刻。
如圖2所示，在實施例2中通過4次的稀釋以及濃縮的不連續重復操作，無細胞系合成的蛋白質為每1ml反應液合成0.62mg，在實施例3中通過4次的稀釋以及濃縮的不連續重復操作無細胞系統合成的蛋白質為每1ml反應液合成1.13mg。這樣，反應系統的翻譯因子濃度越高則用本發明的無細胞蛋白質合成方法得到的蛋白質合成量越多，與圖1顯示的過去分批法的實驗結果相比，顯著增高。
實驗例3通常的分批法中合成速度降低的時間依賴于反應溶液中基質濃度的減少以及副產物的蓄積濃度，由此得出與體系的翻譯因子濃度成反比例關系。即，體系的翻譯因子濃度(小麥胚芽提取液濃度)越高到達反應停止的時間越短(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，556-559)。因此，認為在使用高濃度翻譯因子的情況下，通過縮短進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作時間的間隔可以維持較高的合成速度，并由此可以期待使蛋白質單位時間內的生成效率上升。
圖3A為顯示小麥胚芽提取液的濃度為80A260nm/ml、GFPmRNA濃度為640μg/ml時，除改變進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作的間隔以外，與實施例1同樣地進行無細胞蛋白質合成的實驗結果圖；圖3B為顯示由于進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作的間隔的不同所致合成的GFP量的差異的聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果。
在圖3A的圖上，縱軸是合成蛋白質的量(mg/ml)，橫軸為反應時間(小時)。箭頭顯示進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作的時刻。而且在圖3A中，連結黑圓的線(●-●)顯示從反應開始以0.5小時間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作時(實施例4)的實驗結果，連結白圓的線(○-○)顯示從反應開始以1小時間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作時(實施例5)的實驗結果。在圖3A中，箭頭顯示進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的時刻。
圖3B顯示將以0.5小時的間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的實施例4，與除了以2小時的間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作以外與實施例4同樣進行時(實施例6)進行比較。這里，圖3B的箭頭顯示GFP的染色帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳在各反應時間(在實施例4中，從反應開始經過0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5小時的時刻；在實施例6中，從反應開始經過0、2、4、6、8、10、12、14小時的時刻)的反應液1μl用聚丙烯酰胺未改性凝膠電泳分離后，用考馬斯亮藍將蛋白質染色。
如圖3A、B所示，以0.5小時的間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的實施例4，與以1小時的間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的實施例5、以2小時的間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的實施例6相比單位時間的產量高。在實施例4中，2.5小時的反應每1ml可獲得1.12mg的合成量，但這比同一濃度的反應液以2小時的間隔進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作、使之反應10小時所獲得的產量要高。該結果直接顯示了當反應系統的翻譯因子濃度(小麥胚芽提取液濃度)越高在短時間內伴隨能量源等的消耗濃度變低，同時副產物的蓄積濃度變高、反應速度的降低和到達反應停止的時間縮短。因而，在設定稀釋以及濃縮的不連續重復操作的時間上，通過選擇依賴于反應系統中所含的小麥胚芽提取液濃度的最適時機，可以獲得最大的合成產量。
蛋白質作為它的一般物性可舉出不穩定性(高反應性)。因此，為了獲得高品質的蛋白質，構建在短時間提高合成產量的技術成為必要條件之一，可以說圖3證明的本發明的原理是極為有效的。
實驗例4圖5為采用圖4顯示的使用過濾膜和送液泵來去除副產物的結構，從而用本發明的無細胞蛋白質合成方法來進行蛋白質合成(實施例7)的實驗結果的圖。縱軸是合成的蛋白質的量(mg/ml)，橫軸顯示反應時間(小時)。在圖5中，連結黑圓的線(●-●)顯示實施例7的實驗結果，連結白圓的線(○-○)為通過過去分批法方法的實驗結果。在圖5中，箭頭顯示進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的時刻。
在實施例7中，作為過濾濃縮器，采用交叉流動過濾裝置(VF05C2型、Sartorius公司制、切割分子量為3萬)；作為送液泵采用LKB-Pump-P1(Pharmacia公司)。除了含有80A260nm/ml濃度的小麥胚芽提取液、640μg/ml濃度的GFPmRNA以外，使用與實施例1相同的翻譯反應液，以0.5小時的間隔進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作。作為反應容器采用帶有刻度的塑料管(Falcon管)，反應容量為15ml，在稀釋以及濃縮的不連續重復操作過程中的稀釋采用45ml容量的翻譯反應用溶液來進行。
如圖5所示，作為去除副產物的機構采用具有過濾膜和送液泵結構時，確認與利用實驗例1～3的超過濾膜和離心機的裝置同樣地，可以在本發明的無細胞蛋白質合成方法中很好地利用。在實施例7中，通過4小時的反應每1ml的反應容量可合成2.1mg，可以比上述的采用利用離心機和超過濾膜的裝置時合成高2倍左右產量的蛋白質。
實驗例5圖6A為顯示除了采用60A260nm/ml的小麥胚芽提取液、450μg/ml的dihydrofolate reductase(DHFR)的mRNA作為翻譯模板以外，使用與實施例1同樣的翻譯反應液；除以1小時間隔進行2次稀釋以及濃縮的不連續重復操作以外、進行與實施例1同樣的無細胞蛋白質合成時(實施例8)的實驗結果示意圖。作為比較實驗，除了是過去的分批法(未進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作)以外在同樣的條件下進行無細胞蛋白質合成。實施例8中，在分子量約20,000KDa的DHFR的無細胞體系的合成時，采用了裝有切割分子量30,000Da(ミリポア公司制)的超過濾膜的反應容器。
在圖6A中，泳道1、2、3分別為實施例8的由0、1、2次稀釋以及濃縮的不連續重復操作反應后的排出溶液(濾液)，在與上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作相同時刻采用過去分批法的反應液各1μl進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，示出考馬斯亮藍染色的結果(圖中的箭頭顯示合成產物的DHFR)。從圖6A中的箭頭顯示的DHFR條帶的染色強度來判斷，在過去分批法的實驗結果(各泳道左側的“反應液”)中，僅可確認反應1小時后微量的DHFR的合成，而實施例8的實驗結果(在各泳道右側的“濾液”)中，通過1次、2次稀釋以及濃縮的不連續重復操作，可以確認反應系統生成的DHFR在濾液中高效地表現出來。
實施例6圖6B為顯示采用本發明的無細胞蛋白質合成方法合成N端融合抗生蛋白鏈菌素的GFP融合蛋白(實施例9)、將GFP融合蛋白分離至體系外的實驗結果的電泳圖。
本實驗的無細胞蛋白質合成自身，以編碼GFP融合蛋白質的mRNA作為翻譯模板使用，除以1小時的間隔進行4次稀釋以及濃縮的不連續重復操作以外，與實施例1同樣地進行。將GFP融合蛋白分離到系統外的操作為，按照1將固定了生物素的磁珠添加到反應溶液中，利用生物素與抗生蛋白鏈菌素間的親和性將生成的融合體產物選擇性地捕集至磁珠上；2通過磁石將結合了融合蛋白質的磁珠選擇性地取出至反應容器外的順序進行。此外，電泳及染色與實驗例5同樣地進行。
如圖6B所示，分離操作前的反應液中能夠檢出的產物經過本操作從反應液中消失(分離后的反應液的泳道的箭頭)，可知通過磁珠可以有效地分離到體系外(分離產物泳道中顯示合成產物)。
實驗例7圖7為顯示本發明的RNA合成方法(實施例10)與分批法的過去在體外合成RNA方法的實驗結果的差異圖。在圖7中，圖7左為顯示分批法的過去方法的結果，圖7右為顯示本發明的RNA合成方法的結果，箭頭顯示編碼GFP的mRNA產物。
分別將海蜇的GFP基因各自插入小麥胚芽無細胞體系專用質粒載體pEU中作為轉錄模板，制備轉錄反應液[最終濃度為80mM HEPES-KOH pH7.8、16mM醋酸鎂、10mM二硫蘇糖醇、2mM精脒、2.5mM 4NTPs(4種三磷酸核苷酸)、0.8U/μl RNase抑制劑、0.1μg/μlDNA[質粒GFP(GreenFluorescent Protein)]、1.6U/μl SP6RNA聚合酶]，在37℃反應3小時。
實施例10的RNA合成反應在反應開始3小時后，將3倍量的上述的轉錄反應用溶液添加至轉錄反應液內稀釋后，通過采用離心機經濾膜將低分子排除到反應液系統外，濃縮轉錄反應液至原來的濃度。其后，以3小時的間隔進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作，使合成反應進行下去。在各稀釋以及濃縮的不連續重復操作時，分別吸取轉錄反應液，經溴乙啶染色使通過瓊脂糖凝膠電泳分離的轉錄產物(mRNA)可視化。
如圖7所示，在過去的分批法的體外合成RNA方法中，RNA合成反應在3小時左右停止，但在合成速度較高的3小時反應以后進行上述的稀釋以及濃縮的不連續重復操作的實施例10中，可合成過去方法的2.4倍的產量的mRNA。
實驗例8圖8為顯示分別采用乙醇沉淀純化的mRNA、未純化的mRNA作為翻譯模板進行本發明的無細胞蛋白質合成方法的實驗結果圖，縱軸是合成的蛋白質的量(mg/ml)，橫軸顯示反應時間(小時)。純化的mRNA，按照實施例(無細胞蛋白質合成方法)1)從DNA至mRNA的反應(轉錄反應)中所述的方法制備。未純化的mRNA用實施例10中所述的方法制備后用12,000rpm離心1小時后，回收上清制備。在圖8中，連結黑圓的線(●-●)為顯示含有在實施例10中合成的mRNA的轉錄反應液以1∶2的比例加入到翻譯反應液內，混合后，加入與混合液同量的透析緩沖液[35mM HEPES-KOH pH7.8、103mM醋酸鉀(KOAc)、3.1mM醋酸鎂(Mg(0Ac)2)、16mM磷酸肌酸、1.2mMATP、0.26mM GTP、2.5mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.43mM精脒、0.3mM AAs(20種的L型氨基酸的混合物)]稀釋，然后濃縮至原來的混合液的容量，再次加入同量的透析緩沖液，再次重復同樣的操作，在濃縮后加入肌酸激酶使之終濃度為約1mg/ml來進行蛋白質合成時(實施例11)的實驗結果。連結白圓的線(○-○)為顯示采用由在實驗例7中合成的mRNA經乙醇沉淀、純化而得到的物質制備的翻譯反應液來進行蛋白質合成反應時(實施例12)的實驗結果。在實施例11、12中，除了上述的mRNA分別采用480μg/ml的濃度、及使用60A260nm/ml濃度的小麥胚芽提取液以外，與實施例4同樣地進行。
如圖8所示，在比較實施例11、12的蛋白質合成速度時，未見有意義的差異。從該結果可知，通過本發明的無細胞蛋白質合成方法，使用未純化mRNA的轉錄后的轉錄反應液來制備翻譯反應液進行反應，可實現簡便的無細胞蛋白質合成方法。
實驗例9圖9為顯示使用實驗例7的轉錄反應后的轉錄反應液來制備翻譯反應液來進行本發明的無細胞蛋白質合成方法的實驗結果的示意圖，縱軸是合成的蛋白質的量(mg/ml)，橫軸顯示反應時間(小時)。在圖9中，向上的箭頭顯示進行稀釋以及濃縮的不連續重復操作的時刻。向下的箭頭顯示添加轉錄反應后的轉錄反應液(含mRNA)的時刻。
翻譯反應液是將80A260nm/ml的小麥胚芽提取液、轉錄反應后的轉錄反應液(含GFPmRNA9.6mg)添加至與實施例1同樣的翻譯反應用溶液15ml內(GFPmRNA的最終濃度640μg/ml)，將該溶液濃縮至8ml液量后，通過上述的翻譯反應用溶液稀釋和隨之進行的濃縮操作來制備翻譯反應液，開始翻譯反應。作為去除副產物的機構，與圖4所示相同地使用具有過濾膜和送液泵的構造，從反應開始每經過4小時添加GFPmRNA(翻譯模板)，然后按30分鐘間隔通過含基質以及能量源的溶液進行不連續的稀釋·濃縮重復操作。
如實驗結果所示，通過追加mRNA，可以確認幾乎處于停止狀態的翻譯反應再次開始。進而可知，通過將這一稀釋·濃縮法和mRNA的追加組合，能使蛋白質合成持續很長時間。
裝置的實施例以下說明有關本發明的自動合成裝置的實施例。但是，有關本發明的自動合成裝置只要能使高通量合成系統自動實施，就不受下述實施例裝置的限制。
為了實施本發明的自動合成裝置，分別將以下的東西組裝在自動合成裝置內，采用該自動合成裝置進行GFP蛋白質合成。
轉錄模板采用組入GFP的pEU質粒載體、有義引物和反義引物，在30μl體系進行PCR，獲得的DNA作為轉錄模板。該DNA裝在96孔PCR板(模板用板①)內。
轉錄反應用溶液制作含有終濃度80mM HEPES-KOH、16mM醋酸鎂、2mM精脒、10mMDTT、3mMNTPs、1U/μlSP6RNA聚合酶、1U/μlRNasin的溶液4.95ml，裝入裝置內的試劑槽1(②)內。
翻譯反應用溶液分別制作含有終濃度30mM HEPES-KOH(pH7.8)、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM磷酸肌酸、2mM二硫蘇糖醇、0.3mM精脒、0.3mM 20種氨基酸、2.7mM醋酸鎂、100mM醋酸鉀、0.005％疊氮化鈉、40ng/μl肌酸激酶、在260nm光密度(OD)為80或者40單位(unit)的小麥胚芽提取液的溶液5.5ml，裝入裝置內的試劑槽2(③)內。此外，分別采用含有80單位或者40單位的小麥胚芽提取液的翻譯反應用溶液進行蛋白質合成。
稀釋溶液分別制作含有終濃度為30mM HEPES-KOH(pH7.8)、1.2mM ATP、0.25mMGTP、16mM磷酸肌酸、2mM二硫蘇糖醇、0.3mM精脒、0.3mM 20種氨基酸、2.7mM醋酸鎂、100mM醋酸鉀、0.005％疊氮化鈉的溶液100ml，裝入裝置內的試劑槽3(④)內。
合成容器模板用板(帶蓋PCR96孔(縱8×橫12)板(裝入模板DNA的板)①)、接受轉錄·濾液用板(帶蓋96孔(縱8×橫12)滴定板⑩)、翻譯用板(帶蓋PCR96孔(縱8×橫12)板(孔的底是濾器)、隔板(離心時平衡用)接口管300μl接口管(轉錄反應用溶液用、翻譯反應用溶液用、稀釋溶液用⑤)(280支)、20μl接口管(模板產物用⑥)(96支)分注機1吸液管8支(接裝300μl接口管用⑧)分注機2吸液管8支(接裝20μl接口管用⑨)GFP蛋白質合成，在以下的工序采用本發明有關的合成裝置來進行。
<工序1轉錄>
(1)機械臂(⑦)打開接受轉錄·濾液用板(⑩)的蓋子。
(2)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)、移動至裝有轉錄反應液的試劑槽1(②)。
(3)分注機1(⑧)從試劑槽1(②)吸取轉錄反應液95μl(45μl×2次+5μl)。
(4)分注機1(⑧)移動至接受轉錄·濾液用板的位置(⑩)，向該板的縱向各孔(8個)內吐出2次、每次45μl轉錄反應液。
(5)將(2)-(4)的工序進一步在尚未加入轉錄反應液的縱向7列的各孔中進行。
(6)分注機1(⑧)移動至接口管廢棄口()的位置，廢棄接口管。
(7)機械臂(⑦)打開模板用板(①)的蓋子。
(8)分注機2(⑨)裝上20μl接口管(⑥)。
(9)分注機2(⑨)的各接口管吸引5μl空氣(為提高吸引效率而實施的)。
(10)將分注機2(⑨)移動至模板用板(①)的位置，從模板用板(①)的縱向各孔(8個)中吸出5μl模板樣品。
(11)將分注機2(⑨)移至接受轉錄·濾液用板的位置(⑩)，向該板的縱向各孔(8個)內全量吐出模板樣品。
(12)通過分注機2(⑨)的各個接口管、用移液器混合接受轉錄·濾液用板(⑩)的縱向各孔(8個)。
(13)將分注機2(⑨)移動至接口管廢棄口()的位置，廢棄接口管。
(14)將(8)-(13)的工序進一步在尚未加入模板樣品的縱向7列的各孔中進行。
(15)機械臂(⑦)蓋上模板用板(①)以及接受轉錄·濾液用板(⑩)的蓋子。
(16)機械臂(⑦)將接受轉錄·濾液用板(⑩)運送至預先設定為37℃的恒溫槽1()中安裝。
(17)在恒溫槽1()中，進行37℃4小時的轉錄反應。
<工序2轉錄后去除沉淀>
(1)機械臂(⑦)將接受轉錄·濾液用板(⑩)從恒溫槽1()運送至MTP操作臺()。
(2)機械臂(⑦)打開接受轉錄·濾液用板(⑩)的蓋子。
(3)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)。
(4)分注機1(⑧)的各接口管吸引5μl空氣。
(5)將分注機1(⑧)移動至加入稀釋溶液的試劑槽3(④)，吸引稀釋溶液(濃縮離心后的液量因板上的列而發生變化，因此，吸引量每列在80μl～120μl之間作微調整。)。
(6)將分注機1(⑧)移動至接受轉錄·濾液用板(⑩)的位置，向該板的縱向各孔(8個)內吐出全量稀釋溶液。
(7)進一步將(4)-(6)的工序在尚未加入稀釋溶液的縱向7列的各孔中進行。
(8)分注機1(⑧)移動至接口管廢棄口()位置，廢棄接口管。
(9)機械臂(⑦)蓋上翻譯用板()的蓋子，重疊在運送接受轉錄·濾液用板(⑩)上(離心時為與隔板取得平衡)。
(10)機械臂(⑦)將重疊的翻譯用板()以及接受轉錄·濾液用板(⑩)運送至升降臺()上。
(11)將載置有重疊的翻譯用板()以及接受轉錄·濾液用板(⑩)的升降臺下降至與離心機()的高度吻合。
(12)機械臂(⑦)打開離心機()的門。
(13)離心機()，為使板可以安裝，調整離心機的板設置部位的位置。
(14)機械臂(⑦)將重疊的翻譯用板()以及接受轉錄·濾液用板(⑩)運送至離心機上安放。
(15)與(13)同樣地進行位置調整，為取得平衡，將隔板安裝在離心機上。
(16)在離心機()上，進行3100g、15分鐘的離心。
<工序3第1次交換轉錄液的緩沖液>
(1)離心機()停止后，機械臂打開離心機)的門，接著離心機進行對位(機械臂與離心機的板設置部位的位置相吻合)。
(2)機械臂(⑦)將重疊的翻譯用板()以及接受轉錄·濾液用板(⑩)從離心機()運送至升降臺上。
(3)與(1)同樣進行對位，機械臂(⑦)將隔板運送至升降臺上。
(4)機械臂(⑦)將重疊的翻譯用板()以及接受轉錄·濾液用板(⑩)運送至MTP操作臺()，分開安裝翻譯用板()和接受轉錄·濾液用板(⑩)。
(5)機械臂(⑦)打開翻譯用板()的蓋子。
(6)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)。
(7)分注機1(⑧)的各接口管吸引5μl空氣。
(8)分注機1(⑧)移動至接受轉錄·濾液用板(⑩)的位置，從接受轉錄·濾液用板(⑩)的縱向各孔(8個)內吸出全部溶液。
(9)將分注機1(⑧)移動至翻譯板()的位置，向翻譯板()的縱向各孔(8個)內吐出全部溶液。
(10)將(6)-(9)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行。
(11)分注機1(⑧)蓋上翻譯用板()的蓋子。
(12)分注機1(⑧)將翻譯用板()重疊在運送接受轉錄·濾液用板(⑩)上(上翻譯用板；下接受轉錄·濾液用板)。
(13)與工序(10)～(16)同樣地進行離心。
<工序4第2次交換轉錄液緩沖液>
與工序3(1)～(5)相同，從離心機取出接受轉錄·濾液用板、翻譯用板，安裝在MTP操作臺上，打開翻譯用板的蓋子。
(2)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)。
(3)分注機1(⑧)的各接口管吸引5μl空氣。
(4)將分注機1(⑧)移動至裝有稀釋溶液的試劑槽3(④)。
(5)分注機1(⑧)的各個孔吸引稀釋溶液(吸引量每列在80μl～120μl之間作微調整。)。
(6)分注機1(⑧)移動至翻譯板()的位置，向翻譯板()的縱向各孔(8個)內吐出全部溶液。
(7)將(3)-(6)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行。
(8)分注機1(⑧)移動至接口管廢棄口()的位置，廢棄接口管。
(9)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)。
(10)分注機1(⑧)的各接口管吸引5μl空氣。
(11)分注機1(⑧)移動至翻譯用板()的位置。
(12)通過分注機1(⑧)的各個接口管、用移液器混合翻譯板()的縱向各孔(8個)。
(13)將(8)-(12)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行(有時在各孔交換接口管)。
(14)分注機1(⑧)移動至接口管廢棄口()的位置，廢棄接口管。
(15)機械臂(⑦)蓋上翻譯用板()的蓋子。
(16)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)。
(17)分注機1(⑧)的各接口管吸引5μl空氣。
(18)分注機1(⑧)移動至接受轉錄·濾液用板的位置(⑩)。
(19)分注機1(⑧)從接受轉錄·濾液用板(⑩)的縱向各孔(8個)內吸出全部溶液。
(20)分注機1(⑧)移動至廢液口( )位置。
(21)分注機1(⑧)向廢液口( )吐出全量。
(22)將(17)-(21)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行。
(23)分注機1(⑨)移動至接口管廢棄口()位置，廢棄接口管。
(24)與工序2(9)～(16)同樣進行翻譯用板()的離心。
<工序5分注翻譯反應用溶液>
(1)與工序3(1)～(5)相同，從離心機取出接受轉錄·濾液用板、翻譯用板，安裝在MTP操作臺上，打開翻譯用板()的蓋子。
(2)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)，各接口管吸引5μl空氣。
(3)分注機1(⑧)移動至裝有翻譯反應用溶液的試劑槽2(③)。
(4)分注機1(⑧)從試劑槽2(③)中吸引50μl翻譯反應液。
(5)分注機1(⑧)移動至翻譯用板()的位置，向翻譯用板()的縱向各孔(8個)中吐出全部溶液。
(6)通過分注機1(⑧)的各個接口管用移液器混合翻譯用板()的縱向各孔(8個)。
(7)將(2)-(6)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行。
(8)分注機1(⑨)移動至接口管廢棄口()位置，廢棄接口管。
(9)機械臂(⑦)蓋上翻譯用板()的蓋子。
(10)機械臂(⑦)將翻譯用板()運送至恒溫槽1()。
(11)將翻譯用板()在26℃保溫1小時。
(12)在(11)的保溫工序期間(以后為廢棄濾液工序)，分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)，各接口管吸引5μl空氣。
(13)分注機1(⑧)移動至接受轉錄·濾液用板的位置(⑩)。
(14)分注機1(⑧)從接受轉錄·濾液用板(⑩)的縱向各孔(8個)內吸出全部溶液。
(15)分注機1(⑧)移動至廢液口( )的位置，吐出全量。
(16)將(12)～(15)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行。
(17)分注機1(⑨)移動至接口管廢棄口()位置，廢棄接口管。
<工序6重復翻譯>
重復以下工序6次.
(1)機械臂(⑦)將翻譯用板()從恒溫槽1()運送至MTP操作臺()。
(2)機械臂(⑦)打開翻譯用板()的蓋子。
(3)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)。
(4)分注機1(⑧)的各接口管吸引5μl空氣。
(5)將分注機1(⑧)移動至加入稀釋溶液的試劑槽3(④)，吸引稀釋溶液(離心后的液量因板上的列發生變化，因此，吸引量每列在80μl～120μl之間作微調整。)。
(6)分注機1(⑧)移動至翻譯用板()的位置，向該板的縱向各孔(8個)中吐出全部稀釋溶液。
(7)將(4)-(6)的工序進一步在尚未加入稀釋溶液的縱向7列的各孔中進行。
(8)與工序2(9)～(16)同樣地進行離心(離心時間為18分鐘)。
(9)與工序3(1)～(5)相同，從離心機取出接受轉錄·濾液用板、翻譯用板，安裝在MTP操作臺上，打開翻譯用板的蓋子。
(10)分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)，各接口管吸引5μl空氣。
(11)分注機1(⑧)移動至翻譯用板()的位置。
(12)通過分注機1(⑧)的各個接口管、用移液器混合翻譯用板()的縱向各孔(8個)。
(13)分注機1(⑨)移動至接口管廢棄口()的位置，廢棄接口管(也有替換接口管的情況)。
(14)(10)-(13)的工序進一步在其它的縱向7列的各孔中進行。
(15)機械臂(⑦)蓋上翻譯用板()的蓋子。
(16)機械臂(⑦)將翻譯用板()運送至恒溫槽1()。
(17)翻譯用板()在26℃保溫1小時。
(18)在(17)的保溫工序期間(以后為廢棄濾液工序)，分注機1(⑧)裝上300μl接口管(⑤)，吸引5μl空氣。
(19)分注機1(⑧)移動至接受轉錄·濾液用板(⑩)的位置。
(20)分注機1(⑧)吸出接受轉錄·濾液用板(⑩)的縱向各孔(8個)內的全部溶液。
(21)分注機1(⑧)移動至廢液口( )的位置。
(22)分注機1(⑧)吐出全部溶液。
(23)將(18)～(22)的工序，進一步在其它縱向7列的各孔中進行。
<工序7結束(重復工序6六次后)>
(1)工序6(18)的保溫結束后，將恒溫槽的溫度設定為4℃。
(2)將翻譯用板從合成機取出。
對于通過以上的工序合成的GFP，按照Madin K.et al.等人的報告(Madin K.et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，559-564)中所述的方法進行合成蛋白質的量的測定，用SDS-PAGE分析(圖11)。
在圖11中，在40單位的1-8泳道以及80單位的1-4泳道中，在GFP的條帶的位置上都合成有蛋白質。而且，BSA(125、250、500ng)的條帶濃度和在各泳道的GFP條帶的濃度比較時，可以推測所有的泳道至少合成了250ng的GFP。
通過以上的說明可以明確，選擇反應速度較高的反應初期時間，由重復稀釋以及濃縮的不連續操作而成的本發明的高通量合成系統以及使該系統自動進行的裝置，可以在短時間內高效地合成高品質的蛋白質，而且，可以極為有效地分離目的蛋白質。另外，可以明確該原理對在體外進行的RNA的有效合成也有用。
進而，應用該原理的蛋白質和RNA合成法，顯示可以解決Spirin等人的連續法中可見的種種缺點，即，裝置的復雜性、膜的低強度性、運轉時膜的堵塞、操作的煩雜性等引起的反應裝置出現的問題。加上連續法需要特別長的合成反應時間的缺點，不僅浪費時間，而且從確保生產的蛋白質的品質方面也留下了必須解決的重大問題，而該缺點在重疊法中也未得到解決。
工業上利用的可能性這里發明的技術，可以為面向后基因組時代的蛋白質研究提供基本的骨干技術。特別是為分析RNA和蛋白質等的結構·功能，作為可以簡便且高效地全面制備和大量生產的骨干技術，可以說是不可或缺的。
權利要求
1.無細胞系合成系統，其是以模板物質為原料的合成系統，其特征為，包括以下的工序、其控制工序或者其組合1)使模板物質、基質以及反應溶液接觸，導入合成反應中，2)在合成速度略降低的前后、合成反應即要停止的前后或這些狀態的過程中，稀釋處理反應溶液，3)稀釋處理以后進行濃縮處理，4)通過被濃縮的反應系統進行合成反應；或者1)使模板物質、基質以及反應溶液接觸，導入合成反應中，2)在合成速度略降低的前后、合成反應即要停止的前后或這些狀態的過程中，濃縮處理反應溶液，3)濃縮處理以后進行稀釋處理，4)通過被稀釋的反應體系進行合成反應。
2.根據權利要求1的系統，其特征為，通過濃縮處理，將副產物去除至反應體系外。
3.根據權利要求1或2的系統，其特征為，通過稀釋處理，將基質、能量源和/或模板物質補充至反應體系內。
4.根據權利要求1的系統，其特征為，多次重復1)～4)的工序。
5.根據權利要求1～4中任一項所述的系統，其特征為，模板物質為轉錄模板。
6.根據權利要求1～4中任一項所述的系統，其特征為，模板物質為翻譯模板。
7.根據權利要求6的系統，其特征為，反應溶液包括細胞提取物。
8.無細胞系合成系統，其特征為，將權利要求5的系統所獲得的轉錄產物生產體系與權利要求6或者7的系統所獲得的翻譯產物生產體系組合。
9.合成試劑盒，其特征為，含有至少一種用于利用權利要求1～8中任一項所述系統的、從模板物質開始的無細胞系合成方法中的試劑。
10.從模板物質開始的無細胞系合成方法，其特征為，利用權利要求1～8中任一項所述的系統。
11.從模板物質開始的無細胞系合成裝置，其特征為，利用權利要求1～8中任一項所述的系統。
12.無細胞系合成裝置，其是使權利要求1～8任一項所述的系統自動實施的裝置，其特征為，為了使利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成體系多次實施，至少裝備以下的控制機構(1)開始合成的機構，(2)濃縮反應液的機構，(3)稀釋反應液的機構，(4)使合成反應再活化的機構，(5)使上述(2)～(4)機構重復運作的機構；或者(1)開始合成的機構，(2)稀釋反應液的機構，(3)濃縮反應液的機構，(4)使合成反應再活化的機構，(5)使上述(2)～(4)機構重復運作的機構。
13.根據權利要求12所述的合成裝置，其特征為，濃縮反應液的機構是采用超過濾膜的機構，使反應液通過超過濾膜去除至反應體系外時，反應液中不能通過超過濾膜的物質被濃縮在反應體系內。
14.根據權利要求13所述的合成裝置，其特征為，在濃縮反應液的機構中，將反應液去除至反應體系外時，使用離心機和/或吸引泵。
15.根據權利要求12所述的合成裝置，其特征為，稀釋反應液的機構是向反應液內添加稀釋溶液或者基質溶液。
16.根據權利要求11～15中任一項所述的合成裝置，其特征為，在無細胞蛋白質合成工序中，為了使從轉錄模板到生成翻譯模板編碼的蛋白質的工序自動實施，至少具備一種以下控制機構(1)對反應容器內溫度進行可變控制的機構；(2)向反應容器內分注樣品或者試劑的機構；(3)運送反應容器的機構；(4)沉淀以及濃縮過濾的機構。
17.用于實施權利要求1～8中任一項所述的系統的程序，其特征為，為多次實施利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成體系，包括以下的信息處理機構(1)以反應容器的體積和反應液濃度的信息為基礎，設定在單位時間的合成量變為減少傾向的過程之前的合成反應初期相范圍內的合成時間的信息處理機構，(2)達到(1)的合成反應初期相的合成時間時，將稀釋溶液添加至反應容器內，設定在可以進行實質性合成反應的反應液濃度范圍以外的信息處理機構，(3)在(2)之后，濃縮反應容器中的反應液，通過設定使得通過添加稀釋液而增加的反應液的液量回到原來液量的信息處理機構，(4)在(3)之后，為再次開始合成反應而設定反應最適溫度的信息處理機構，(5)用于多次重復(1)～(4)的信息處理機構；或者(1)以反應容器的體積和反應液濃度的信息為基礎，設定在單位時間合成量變為減少傾向的過程之前的合成反應初期相范圍內的合成時間的信息處理機構，(2)達到(1)的合成反應初期相的合成時間時，濃縮反應容器內的反應液，將反應液設定在可以進行實質性合成反應的濃度范圍以外的信息處理機構，(3)在(2)之后，添加稀釋溶液至反應容器中，通過設定使得濃縮減少的反應液的液量回到原來液量的信息處理機構，(4)在(3)之后，為再次開始合成反應而設定反應最適溫度的信息處理機構，(5)用于多次重復(1)～(4)的信息處理機構。
18.無細胞系合成裝置，其特征為，編入權利要求17所述的程序的無細胞合成裝置，通過該程序的信息處理與該裝置進行協同工作，使合成開始、反應液的稀釋·濃縮、使合成反應再活化的機構運作，可以使利用蛋白質合成反應速度高的合成反應初期相的合成體系多次反復實施。
19.通過權利要求11～16、18中任一項所述合成裝置來合成的蛋白質。
全文摘要
開發蛋白質和RNA等的生命高分子的高通量的試管內合成反應法的系統技術。詳細而言，是無細胞系合成系統以及采用該系統的自動合成機，該系統是以模板物質為原料的合成系統，其特征在于包括以下的工序、其控制工序或者其組合1)使模板物質、基質以及反應溶液接觸，導入合成反應體系中。2)在合成速度略降低的前后或合成反應即要停止的前后或者這些狀態的過程中，將反應體系置于合成反應體系外，進行溶液的稀釋處理。3)稀釋處理以后進行濃縮處理。4)將反應體系回復至合成反應體系中。或者1)使模板物質、基質以及反應溶液接觸，導入合成反應體系中。2)在合成速度略降低的前后或合成反應即要停止的前后或者這些狀態的過程中，將反應體系置于合成反應體系外，進行溶液的濃縮處理。3)濃縮處理以后進行稀釋處理。4)將稀釋的反應體系回復至合成反應體系中。
文檔編號C12M1/00GK1777674SQ20048001099
公開日2006年5月24日 申請日期2004年4月23日 優先權日2003年4月25日
發明者遠藤彌重太, 澤崎達也, 小笠原富夫, 森下了, 佐伯美帆呂, 佐藤智久, 北本綾 申請人:株式會社無細胞科學