用于免疫活性或防治癌癥的包含從釀酒酵母is2中得到的可溶性葡聚糖低聚物的組合物...的制作方法

專利名稱：用于免疫活性或防治癌癥的包含從釀酒酵母is2中得到的可溶性葡聚糖低聚物的組合物 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含從釀酒酵母IS2中分離得到的可溶性葡聚糖低聚物的組合物及其制備方法，該組合物可用于免疫活性或者防治癌癥。
背景技術：
β-葡聚糖可以從各種來源如酵母菌、微生物、蘑菇、谷物和藻類中分離得到。到目前為止，已對β-葡聚糖進行了研究并以各種形式的產品加以應用。特別是對從酵母菌細胞壁得到的β-葡聚糖進行了研究，具有很深的了解。
酵母菌是一種微生物，FDA將其分類為GRAS(食品安全規范)，該菌用于包括食品領域在內的各種領域，其內層細胞膜包括作為主要成份的1，3-和1，6-葡聚糖，還有少量的甲殼質和甘露蛋白質；然而其外層細胞膜包括連接甘露聚糖的甘露蛋白質。
β-葡聚糖是酵母菌細胞壁的主要成份。據報道，β-葡聚糖能夠通過激活和激增巨噬細胞來增加Ag-特異性免疫反應，能提高對病原體如真菌、細菌、病毒等的抵抗力，能抑制外傷中出現的免疫消弱和能增加宿主對癌癥和癌癥轉移的抵抗力。(Abel，G.and Czop，J.K.，INT.J.Immunophamacol.，14，pp1363-1373，1992；Babineau，et al.，220(5)，pp601-609，1994；Benach J.L.，et al.，Infection and Immunity，35(3)，pp947-951，1982；Di Renzo，L.，et al.，Eur.J.Immunol.，21，pp1755-1758，1991；Fukase，S.，et al.，Cancer Res.，47，pp4842-4847，1987；Janusz，M.J.，etal.，J.Immun.，142，pp959-965，1989；Olsen，E，J.，et al.，J.Immun.，64，pp3548-3554，1996，Sakurai，T.，et al.，Int.J.Immunopharmacol.，14，pp821-830，1992；Czop，J.K.，et al.，Prog.Clin.Biol.Res.，297，pp287-296，1989)。
因為酵母菌的β-葡聚糖是水不溶性多糖，所以到目前為止，已經發展出許多制備高溶解性β-葡聚糖的方法，如下所述。
美國專利No.5,576,015公開了細微粒形式的β-葡聚糖的制備方法以提高其吸收率；美國專利No.4,877,777公開了向葡聚糖上引入化學式以提高其溶解性的方法；美國專利No.5,037,972和美國專利No.6,143,883公開了制備可溶性葡聚糖顆粒的方法，該方法包括用有機溶劑提取葡聚糖，然后用β-葡聚糖酶或者纖維素酶處理該葡聚糖，這些酶能降解葡聚糖的基本結構β-1，3-D-葡萄糖鏈。
然而，上述引用文獻中并未報道或公開從酵母變異菌株IS2(KCTC0959BP)分離得到的特定可溶性葡聚糖低聚物及該葡聚糖低聚物對癌癥疾病的治療效果，這些公開在此并入作為參考。
本發明的發明人致力于研究從特定的酵母變異菌株中找到具有藥學活性的β-葡聚糖并最終完成本發明，確認通過提取酵母菌突變體IS2細胞壁所得到的M.W.小于50,000D的可溶性葡聚糖低聚物顯示了強大的對免疫系統刺激活性和對癌細胞增殖的抑制活性。
對本發明公開的以下詳細描述會使本發明的上述目的和其它目的顯而易見。

發明內容
根據本發明的一個方面，本發明提供了源自酵母菌變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物及其制備方法。
另外，本發明提供了用于提高免疫力和抗癌活性的包含利用本發明方法制備的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物。
相應地，本發明的目的是提供具有免疫提高活性和癌細胞增殖抑制活性的可溶性葡聚糖低聚物，該可溶性葡聚糖低聚物源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細胞壁，通過用酶處理不溶性β-葡聚糖得到。
本發明的另一個目的是提供制備可溶性葡聚糖低聚物的方法，該方法包括以下步驟(a)在培養基中培養酵母菌(釀酒酵母)變異IS2用于接種；(b)將上述酵母菌培養溶液接種到培養基中，培養并離心得到酵母菌；(c)向其中加入NaOH以從酵母菌細胞壁中提取β-葡聚糖；(d)將提取的β-葡聚糖與水解酶反應，然后經過濾得到可溶性葡聚糖低聚物；和(e)最后冷凍干燥以得到本發明的可溶性葡聚糖低聚物。
上述酵母變異IS2的特征是具有提高免疫力活性。
通過上述步驟制備的可溶性葡聚糖低聚物包括分子量小于50,000，優選范圍1,000-10,000的葡聚糖低聚物。
本發明的又一目的是提供可作為有效成份的、以有效劑量治療或預防免疫缺陷疾病或癌癥的藥物組合物及其藥學可接受載體，該藥物組合物包括通過上述步驟獲得的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細胞壁的可溶性葡聚糖低聚物。
可根據下述優選的實施方案制備該具有創造性的可溶性葡聚糖低聚物。
對于本發明，上述可溶性葡聚糖低聚物可通過以下步驟制備；(a)第一步，培養酵母菌IS2(KCTC0959BP)的步驟，包括在含有0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母菌提取物和0.1-10w/v％蛋白胨(pepton)的液態培養介質中培養酵母菌IS2(KCTC0959BP)；(b)第二步，從酵母菌培養介質中得到酵母菌的步驟，包括將第一步制備的數量范圍為0.1-10v/v％的酵母菌培養介質接種到PH范圍為5.0-6.0的含0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母菌提取物、0.01-2w/v％硫酸銨、0.001-1w/v％磷酸鉀和0.001-1w/v％的硫酸鎂的初級液態培養介質中，在速度范圍100-400rpm下培養12-48小時，通氣量范圍從0.3-3vvm，生長介質的溫度范圍為20-40℃，然后經離心以得到酵母菌；(c)第三步，從酵母菌細胞壁中提取濕的β-葡聚糖的步驟，包括向酵母菌中加入1-10％的氫氧化鈉溶液，分散，在70-100℃溫度范圍內反應30分鐘到5小時，然后經離心就得到干燥的酵母菌細胞群，該過程可重復數次并合并，用強酸如鹽酸或硫酸將細胞群的PH滴定到4.0-5.0范圍內，重新分散在氫氧化鈉溶液中，在75℃下進一步反應1小時，經離心分離氫氧化鈉溶液和固體成份；最后，洗滌并純化該固體成份以得到濕的β-葡聚糖；(d)第四步，得到葡聚糖低聚物液態相的步驟，包括向上述所得物中加入數量等于葡聚糖體積(v/v％)1-10倍的蒸餾水和等于葡聚糖(v/w％)1/20到1/5量的β-葡聚糖水解酶，在30-80℃溫度范圍內反應6-24小時，淬滅反應后經離心回收上清液，用超濾膜過濾上清液以得到分子量小于50,000的具有發明性質的可溶性葡聚糖低聚物
(e)第五步，得到最終可溶性葡聚糖低聚物干燥粉末形式的步驟，包括將第四步所制備的低聚物在低于-70℃下單獨放置12-48小時，然后經冷凍干燥以得到本發明的可溶性葡聚糖低聚物干燥粉末形式。
本發明的另一目的是提供制備上述可溶性葡聚糖低聚物的方法。
本發明的又一目的是提供采用上述方法制備的、源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，另外，本發明的目的還包括提供可作為有效成份的、以有效劑量治療或預防免疫缺陷疾病或癌癥的藥物組合物及其藥學可接受載體，該藥物組合物包括通過上述步驟獲得的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細胞壁的可溶性葡聚糖低聚物。
本發明的組合物可用于加強或激活免疫系統。
上面提到的免疫缺陷疾病包括由各種細菌或病毒引起的傳染疾病。
上面提到的癌癥疾病包括各種疾病如肺癌、砷細胞(arsenic cellular)肺癌、結腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、腦或頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌、肛周癌、結腸癌、乳腺癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌(vulvul carcinoma)、何杰金淋巴瘤、食道癌、腸癌、內分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、平滑組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞瘤、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細胞癌、腎骨盆癌、CNS腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、脊髓瘤、腦干神經膠質瘤和垂體腺瘤。
本發明的另一方面還提供了藥物結合物，該結合物可適當地加入或除去另一種免疫增強劑或癌癥藥物，也可在保持它們藥效的限度內增加或減少藥物的組合物比率。
本發明的目的之一為提供包括源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物在制備治療性藥物方面的用途，該治療性藥物主要用于治療或預防人體或哺乳動物的免疫缺陷和癌癥疾病。
本發明的目的之一為提供治療或預防哺乳動物免疫缺陷和癌癥疾病的方法，包括將包含源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的組合物及其藥學可接受載體以有效劑量給藥到所述哺乳動物這一步驟。
根據所使用的方法，該發明性組合物可另外包括常規的載體、輔料或稀釋劑。根據用途和應用方法，所述載體優選地用作合適物質，但這并不是限制性的。合適的稀釋劑列于《雷氏藥學大全》(MackPublishing co，Easton PA)的書面文本中。
以下所述的配制方法和賦形劑僅僅是示例性的，而決不是對本發明的限制。
本發明的組合物可以藥物組合物的形式給出，包括藥學可接受載體、輔料或稀釋劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇糖、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、金合歡橡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。配制中可另外包括填料、抗粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、調味劑、乳化劑和防腐劑等。通過采用本領域熟知的任何操作來配制本發明的組合物，使其在對病人給藥后，有效成份能夠快速、持續或延遲釋放。
例如，本發明的組合物可溶解在油類、丙二醇或其它通常用來生產注射劑的溶劑中。合適的載體例子包括生理鹽水、丙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸異丙酯等，但并不限于這些。對于局部給藥，本發明的提取物可配制成軟膏和乳膏的形式。
包括原料藥組合物的藥學配制劑可以制備成任何形式，如口服劑量形式(粉末、片劑、膠囊、軟膠囊、水性藥物、糖漿、酏丸劑、粉末、小藥囊、粒劑)或局部制劑(乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香膏、貼片、泥膏劑、噴霧溶液、氣霧劑等等)、栓劑或無菌可注射制劑(溶液、懸浮劑、乳劑)。
以藥學劑量形式存在的本發明組合物可以以它們藥學可接受的鹽的形式使用，也可單獨或適當結合，及與其它藥學活性成份組合使用。
該發明性組合物所需的劑量隨被治療者的身體狀況和體重、嚴重程度、劑型、給藥途徑和給藥期的變化而變化，可由本領域的技術人員選擇。然而，為了獲得所需效果，通常建議本發明的發明性組合物的給藥量范圍為0.01-10g/kg，優選0.1-1g/kg體重/天。這些劑量可以每天以一次或可多次給藥形式給藥。
本發明的組合物可以通過各種途徑給藥到接受治療的動物如哺乳動物(大鼠、小鼠、家畜或人)上。所有的給藥方式都考慮到了，例如，可以口服、直腸或者靜脈的、肌內的、皮下的、皮內的、鞘內的、硬膜外的或腦室內注射給藥。
本發明的另一個目的也是提供用于預防和改善免疫缺陷和癌癥疾病的保健食品，該保健食品包括如下的組合物和飲食學可接受的添加劑，其中所述組合物不可缺少地包含源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
以組合物的總重量記，用于預防和改善免疫缺陷和癌癥疾病的保健食品應包含大約0.01-80w/w％，優選1-50w/w％的本發明上述源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
本發明提供了用于預防和改善免疫缺陷和癌癥疾病的包括源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的保健食品飲料組合物。
上述發明性低聚物組合物可加到食品和飲料中，用于預防和改善免疫缺陷和癌癥疾病。
為了發展保健食品，包括上述低聚物組合物的可加入食品的例子如，各種食品、飲料、面包、餅干、果醬、糖果、口香糖、茶、乳酪、維生素絡合物、康復食品及類似物，可以以粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料等加以使用。
本發明的發明性組合物沒有毒性和副作用，因此可安全使用。
上面提到的組合物可加到食品、添加劑或飲料中，其中上述低聚物在食品或飲料中的量，對于保健食品來說，以食品的總重量計，可大體上從約0.01到80w/w％；對于100ml健康飲料組合物來說，為0.02-30g，優選是0.3-5g。
在本發明的健康飲料組合物以所示比率包含作為必要成份的上述低聚物的前提下，對其它液態成份沒有特別限制，其中，其它成份可以是各種芳香劑或天然糖類等，如常規飲料。前面提到的天然糖類的例子是單糖如葡萄糖、果糖等；二糖如麥芽糖、蔗糖等；常規糖類如糊精、環糊精；糖醇如木糖醇和赤蘚醇等。除了前面提到的那些芳香劑，天然芳香劑如taumatin，甜菊提取物如levaudiosideA、甘草甜素等和合成芳香劑如糖精、阿巴斯甜等可優先適用。上述天然糖類的量通常是100ml本發明飲料組合物用約1g到20g，優選5到12g。
上面提到的組合物的其它組份是各種營養素、維生素、礦物質或電介質、合成調味劑、著色劑和在乳酪巧克力等中使用的改善劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠態粘合劑、PH控制劑、穩定劑、防腐劑、甘油、醇、在碳酸酯飲料中使用的碳化劑等。除了前面提到的那些，其它組份還可以是制備天然果汁所用的果汁、果汁飲料和蔬菜飲料。
該發明性組合物可作為混合劑用于乳酸菌配制的飲料或醬等等中。
上述提到的組份可單獨使用，也可組合使用。
本發明提供的保健食品除了包括本發明組合物外，還包括約0.01到30w/w％的維生素、寡糖和可食用成份。
這些成份的比例不是嚴格的，但是通常范圍為每100w/w％本發明組合物包含0.01到30w/w％。包括上述提取物的可加入食品的例子是各種食品、飲料、口香糖、維生素復合物、康復食品等。
該發明性組合物可另外包括一種或多種有機酸如檸檬酸、反丁烯二酸、脂肪酸、蘋果酸、磷酸鹽如磷酸鹽，磷酸鈉，磷酸鉀、焦磷酸鹽、縮聚磷酸鹽；天然抗氧化劑如多元酚、兒茶酚、α-生育酚、迷迷香提取物、維生素C、干草根提取物、殼聚糖、鞣酸、植酸。
在不背離本發明思想和范圍的條件下可以對本發明組合物、用途和制備做各種修改和變動，這一點對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。


通過下面的詳細說明并結合附圖可更清楚地了解本發明的上述和其它目的、特征及優點。其中；圖1顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對小鼠淋巴細胞NO生成的影響；圖2顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對小鼠脾細胞IL-2生成的影響；
圖3顯示了可溶性葡聚糖低聚物對小鼠骨髓IL-3依賴的LyD9細胞系增殖的抑制效果；圖4顯示了可溶性葡聚糖低聚物對Raw264.7細胞系、小鼠巨噬細胞系增殖的抑制效果；圖5顯示了可溶性葡聚糖低聚物對EL4細胞系、小鼠T淋巴細胞系增殖的抑制效果；圖6顯示了可溶性葡聚糖低聚物對Jurkat細胞系、人T淋巴細胞系增殖的抑制效果；圖7顯示了可溶性葡聚糖低聚物對HeLa細胞系、人子宮頸癌細胞系增殖的抑制效果；圖8顯示了可溶性葡聚糖低聚物對KAT03細胞系、人胃癌細胞系增殖的抑制效果；下面，通過以下實施例對本發明進行更明確的解釋。然而，從任何意義上來說，不應理解為本發明限于這些實施例。
最佳方式下列實施例和實驗實施例用于解釋本發明，而沒有限制其范圍。
實施例1.酵母菌變異IS2的培養和采收將含有10g/L葡萄糖、6g/L酵母菌提取物、3g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、1.5g/L磷酸鉀(K2PO4)、0.5g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)的液態介質作為原介質。
液態YPD介質(葡萄糖20g/L、酵母菌提取物10g/L、蛋白胨20g/L)用于接種和生長培養基，該生長培養基包含400g/L葡萄糖、30g/L酵母菌提取物、40g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、15g/L磷酸鉀(K2PO4)和5.7g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)。
生長培養基用高壓滅菌后，將100ml培養的酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)播種到其上，并在旋轉速度300rpm、通氣量1vvm、溫度30℃、PH5.5條件下培養，最終通過分批次培養系統得到50-55g/L干燥細胞群(DCW)。
實施例2.從酵母菌變異IS2中提取β-葡聚糖將上面實施例1中制備的80g酵母菌DCW懸浮在1,000ml 4％的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，然后在95℃下培養1小時。該培養的懸浮液在2,000rpm速度下離心15分鐘以分離成氫氧化鈉溶液部分和固體部分。
將分離得到的固體部分重新懸浮在2,000ml 3％的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，在75℃下培養3小時，然后在2,000rpm速度下離心15分鐘再次分離成氫氧化鈉溶液部分和固體部分。
將收集的固體部分用HCl調節到pH4.5并分散到最終體積為2,000ml的程度，然后在75℃下培養1小時。該培養的懸浮液在2,000rpm速度下離心15分鐘以分離成氫氧化鈉溶液部分和固體部分。
所得固體用蒸餾水洗滌三次，得到160g來自酵母菌變異細胞壁的濕β-葡聚糖。
實施例3.源自酵母菌變異IS2β-葡聚糖的可溶性葡聚糖低聚物的制備將實施例2制備的160g濕β-葡聚糖、480ml蒸餾水和等于葡聚糖1/10量的ββ-葡聚糖(v/w)加到1,000ml燒瓶中，在40℃下培養15小時。
停止反應后，反應混合物在7,000rpm下離心15分鐘，收集上清液。用超濾膜(Filtron Co.，MWCO 10K)過濾收集的上清液以除去未反應的酶，就得到了含有分子量小于10,000道爾頓的葡聚糖低聚物的溶液。該溶液在-74℃下單獨放置過夜后，經冷凍干燥得到5.8g粉末形式的可溶性葡聚糖低聚物。
實驗實施例1.可溶性葡聚糖低聚物對NO(氧化氮)生成的影響實施例3制備的可溶性葡聚糖低聚物溶解在濃度為5mg/ml磷酸鹽緩沖的鹽水中(PBS，2.56g/L NaH2PO4·H2O，22.5g/L Na2HPO4·7H2O，87.9g/L NaCl，PH7.2)，將0.2ml所得可溶性葡聚糖低聚物溶液腹腔注射到5-6周大的雄性C57BL/6小鼠(Biolink CO.)體內。
作為本實驗的對照組，源自野生型酵母菌(KCTC7911)菌株的可溶性葡聚糖低聚物根據上面實施例1和實施例3所描述的方法制備，并以與上述所描述的方法相同的方式給藥。
給藥3天后，使用滅菌篩和漢克斯(Hank’s)平衡鹽溶液(0.185g/LCaCl2·2H2O，0.09767g/L無水MgSO4，0.4g/L KCl，0.06g/L無水磷酸鉀單堿，0.8g/L氯化鈉，0.04788g/L無水磷酸氫二鈉，1.0g/LD-葡萄糖，0.011g/L苯酚紅·鈉，0.35g/L碳酸鈉，PH7.0)將上述小鼠的淋巴細胞從其脾中輕柔地分離。剩余的RBC用NH4Cl處理除去，并將分離出來的淋巴細胞懸浮在完全培養基中。
根據文獻公開的方法制備腹膜巨噬細胞(Gallily，R.，and M.Feldman.，Immunology12，p197-，1967)。
腹腔注射可溶性葡聚糖低聚物后用漢克斯平衡鹽溶液收集巨噬細胞，然后將細胞懸浮在完全培養基中。
在培養皿中，以濃度2×105細胞/ml再懸浮2×105細胞/ml的巨噬細胞，并在培養基中、在測量NO(氧化氮)生成之前、在刀豆素A(ConA，5？g/ml)和LPS(1？g/ml)的刺激下培養20小時。
因為NO在空氣中很容易被氧化為穩定的亞硝酸鹽，所以亞硝酸鹽的量可通過油脂反應測得。
將0.1ml包含30％乙酸中的1％磺胺和60％乙酸中的0.1％N-(1-萘基)乙二胺-二-氯化氫的混合物加到0.1ml培養基中，在室溫下培養20分鐘。通過ELISA讀取儀檢測到550nm處的吸收。
作為NO生成的測得結果，與用作陰性對照的PBS-處理組相比，注射了源自野生型酵母菌KCTC7911和源自酵母菌變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物的實驗組表現了NO生成的更多增加。而且，確認了源自酵母菌變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物比源自KCTC7911菌株的可溶性葡聚糖低聚物具有更高的NO生成能力(見圖1)。
圖1顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對小鼠淋巴細胞NO生成的影響。
實驗實施例2.可溶性葡聚糖低聚物對IL-2生成的影響使用滅菌篩從用實施例3制備的可溶性葡聚糖低聚物處理的小鼠脾中分離淋巴細胞。同時，用NH4Cl處理除去紅細胞，并將分離的淋巴細胞懸浮在完全培養基中。
將收集的細胞調整到2×105細胞/ml并等分到96孔培養板上。脾細胞用ConA，(5？g/ml)處理并在37℃下、在5％CO2培養箱中培養48小時。培養結束后，通過酶免試劑盒(ELISA kit)(Endogen Co.)測定由Con-A刺激產生的IL-2釋放量。
將抗-IL-2抗體(Becton Dikinson Co.)加到96孔培養板上吸附24小時，洗去未吸附的抗體。接著，將0.1ml的樣品加到其上并培養1小時。然后，每一個孔用含10％吐溫-20的PBS清洗并向其上加入檢測Ab。再次清洗之后，處理細菌蛋白-HRP并在室溫下培養1個小時。向其中加入TMB底物(Becton Dikinson Co.)并加入終止液以終止反應。測定450nm處的吸收。
在給藥源自KCTC7911的可溶性葡聚糖低聚物的地方，IL-2生成沒有變化，甚至當細胞受Con-A刺激時。
然而，在給藥源自酵母菌變異IS2的可溶性葡聚糖低聚物和細胞受Con-A刺激的地方，顯示了來自腹膜巨噬細胞IL-2的生成增加(見圖2)。
圖2顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對小鼠脾細胞IL-2生成的影響實驗實施例3.可溶性葡聚糖低聚物對癌細胞增殖的抑制效果對癌細胞系生長的抑制效果由MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物)細胞增殖分析測定。
作為本實驗的細胞系，本實驗用到6種類型的細胞系，即LyD9細胞系，該細胞系為小鼠骨髓IL-3依賴的造血干細胞系；Raw264.7細胞系，該細胞系為小鼠巨噬細胞系；EL4細胞系，該細胞系為小鼠T淋巴細胞系；Jurkat細胞系，該細胞系為人T淋巴細胞系；HeLa細胞系，該細胞系為人子宮頸癌細胞系和KAT03細胞系，該細胞系為人胃癌細胞系。
細胞用指定濃度的樣品處理并培養44小時，向其中加入MTT溶液以鑒定細胞活力。
將癌細胞的濃度調整到2×105細胞/ml并轉移到96孔板的每一個孔中。在早期的培養中，可溶性葡聚糖低聚物以濃度范圍0.5-5mg/ml內的各種濃度加到培養基中，進一步在5％CO2培養箱中、在37℃下培養48小時。
用MTT分析測得細胞活力。
將MTT(Sigma Co.，USA)試劑加到每一個孔中，并進一步培養4個小時。向其中加入100ml 0.04N的異丙醇鹽酸，該混合物在室溫下培養20分鐘，通過ELISA讀取儀檢測到550nm處的最終吸收。
如圖3到8所示的，本發明的可溶性葡聚糖低聚物顯示了強大的對癌細胞增殖抑制活性。特別地，源自酵母菌變異IS2的可溶性葡聚糖低聚物比源自KCTC7911的可溶性葡聚糖低聚物顯示了更強大的活性，具體來說，在相同濃度下，與源自KCTC7911的可溶性葡聚糖低聚物相比，源自酵母菌變異IS2的可溶性葡聚糖低聚物顯示的效力是前者的2-6.6倍。可以肯定的是，在大多數癌細胞系中，可溶性葡聚糖低聚物的有效濃度范圍為2.5-5.0mg。
實驗實施例4.毒性測試方法用實施例3的低聚物在ICR小鼠(平均體重25±5g)和斯普拉-道來氏大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)上進行急性毒性實驗。對包括10只小鼠或大鼠的4組分別口服給藥測試樣品4mg/kg、40mg/kg、400mg/kg、4,000mg/kg或溶劑(0.2ml，i.p.)，觀察兩周。
結果在任一組中或對任一種性別都沒有對死亡率、臨床表現、體重變化和總調查結果的治療相關影響。這些結果說明本發明的提取物是有效和安全的。
下面將描述配制方法和賦形劑，但本發明并不限于這些。具有代表性的實施例如下所述。
粉末的制備實施例3的干粉末...............................50mg乳糖..........................................100mg滑石..........................................10mg通過混合上述成份及填充密封包裝進行粉末制備。
片劑的制備實施例3的干粉末...............................50mg玉米淀粉......................................100mg乳糖..........................................100mg硬脂酸鎂......................................2mg通過混合上述成份及壓片進行片劑的制備。
膠囊的制備實施例3的干粉末...............................50mg玉米淀粉......................................100mg乳糖..........................................100mg硬脂酸鎂......................................2mg通過混合上述成份及采用常規明膠制備方法填充明膠膠囊來制備片劑。
注射劑的制備實施例3的干粉末...............................50mg注射用蒸餾水..................................最優量PH控制劑......................................最優量通過溶解活性成份，控制PH到7.5，然后將所有成份填充到2ml安瓿瓶(ample)中，并用常規制備注射劑的方法滅菌進行注射劑的制備。
液體的制備實施例3的干粉末...............................0.1-80g
糖........................................5-10g檸檬酸....................................0.05-0.3％焦糖......................................0.005-0.02％維生素C...................................0.1-1％蒸餾水....................................79-94％CO2氣.....................................0.5-0.82％通過溶解活性成份，填充所有成份及采用常規液體制備方法滅菌進行液體的制備。
保健品的制備實施例3的干粉末...........................1000mg維生素混合物..............................最優量？維生素A乙酸酯...........................70mg？維生素E.................................1.0mg？維生素B1................................0.13mg？維生素B2................................0.15mg？維生素B6................................0.5mg？維生素B12...............................0.2mg？維生素C.................................10mg？生物素..................................10mg？煙酰胺..................................1.7mg？葉酸....................................50mg？泛酸鈣..................................0.5mg礦物混合物................................最優量？硫酸亞鐵................................1.75mg？氧化鋅..................................0.82mg？碳酸鎂..................................25.3mg？磷酸單鉀................................15mg磷酸二鈣..................................55mg檸檬酸鉀..................................90mg碳酸鈣....................................100mg
氯化鎂................................24.8mg上面提到的維生素和礦物混合物可以在很多方面進行變化。但是不能認為這些變化背離了本發明的思想和范圍。
健康飲料的制備實施例3的干粉末.......................1000mg檸檬酸................................1000mg低聚糖................................100g杏濃縮物..............................2g牛磺酸................................1g蒸餾水................................900ml通過溶解活性成份，混合，在85℃攪拌1小時，過濾，將所有成份填充到1000ml安瓿瓶中及采用常規健康飲料的制備方法滅菌進行健康飲料的制備。
上述就是對本發明的描述，顯而易見地，可以在很多方面對它們進行變化，但是不能認為這些變化背離了本發明的思想和范圍。而且，是要將那些對于本領域技術人員來說顯而易見的變化包括在下述權利要求的范圍之內的。
工業實用性如本發明詳細說明中描述的，本發明涉及M.W.范圍為1,000到10,000的可溶性葡聚糖低聚物，該低聚物通過用商業可得的β-葡聚糖水解酶處理由分離酵母變異IS2細胞壁得到的不溶性β-葡聚糖來制備。該可溶性葡聚糖低聚物在促進免疫活性和抑制癌細胞生長方面顯示強大效力，可用作治療或保健食品來治療和預防免疫缺陷和癌癥疾病。
權利要求
1.源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細胞壁的通過用水解酶處理不溶性β-葡聚糖得到的可溶性葡聚糖低聚物，其具有免疫促進活性和癌細胞增殖抑制活性。
2.制備可溶性葡聚糖低聚物的方法，該方法包括以下步驟(a)在培養基中培養酵母菌(釀酒酵母)變異IS2(KCTC 0959BP)以用于接種；(b)將上述酵母菌培養溶液接種到培養基中，分批進料培養并離心得到酵母菌；(c)向其中加入NaOH以從酵母菌細胞壁中提取β-葡聚糖；(d)將提取的β-葡聚糖與水解酶反應，然后經過濾得到可溶性葡聚糖低聚物；和(e)最后冷凍干燥以得到分子量小于50,000的可溶性葡聚糖低聚物。
3.一種藥物組合物，該藥物組合物包括根據權利要求2所述的制備方法得到的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細胞壁的可溶性葡聚糖低聚物，該組合物作為活性成份用來治療或預防免疫缺陷疾病。
4.一種藥物組合物，該藥物組合物包括根據權利要求2制備方法得到的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細胞壁的可溶性葡聚糖低聚物，該組合物作為活性成份用來治療或預防癌癥疾病。
5.根據權利要求4的藥物組合物，其中，所述癌癥選自肺癌、砷細胞肺癌、結腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、腦或頸癌、皮膚或內眼黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌、肛周癌、結腸癌、乳腺癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金淋巴瘤、食道癌、腸癌、內分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、平滑組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞瘤、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細胞癌、腎骨盆癌、CNS腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、脊髓瘤、腦干神經膠質瘤或垂體腺瘤。
6.包括源于酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物在制備用于治療或預防人體或哺乳動物的免疫缺陷和癌癥疾病的治療性藥物方面的用途。
7.包含如權利要求1所述的源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物和飲食學可接受的添加劑的保健食品，所述保健食品用于治療或預防免疫缺陷和癌癥疾病。
8.根據權利要求7的保健食品，其中，所述保健食品可以以粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料形式提供。
全文摘要
本發明涉及M.W.范圍為1,000到10,000的可溶性葡聚糖低聚物，該低聚物通過用商業可得的β－葡聚糖水解酶處理由分離出的酵母變異IS2細胞壁得到的不溶性β－葡聚糖來制備。該可溶性葡聚糖低聚物在促進免疫活性和抑制癌細胞生長方面顯示強大效力，因此可用作治療或保健食品來治療和預防免疫缺陷和癌癥疾病。
文檔編號A23L1/30GK1767837SQ200480007032
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月17日 優先權日2003年3月18日
發明者鄭鳳鉉, 樸正勛, 姜晚植, 李廣鎬, 文元國 申請人:碧歐普羅吉有限公司, 天然F&P公司