高度可控制性電穿孔方法及其應用的制作方法

專利名稱：高度可控制性電穿孔方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及高度可控制性電穿孔方法及其應用。
背景技術：
細胞膜起將分子內容物與其外部環境分隔的重要功能。細胞膜大部分由兩親類脂質組成，其可白組裝成高度隔離的結構，因此對于膜間的離子傳輸表現為高能屏障。
然而，類脂基質可因強大的外部電場而被破壞，導致膜間傳導和擴散通透性增加，如熟知的電穿孔現象。這些現象是因細胞膜中形成水性膜孔的結果。尤其是，電穿孔過程涉及在施加短期電場脈沖通常是介于較大盤電極之間時細胞膜的通透作用(Neumann，et al.，Bioelectrochem Bioenerg 48，3-16(1999)；Ho，et al.，Crit Rev Biotechnol16，349-62(1996))。
例如，圖2A和2B顯示傳統電穿孔系統20，電場的作用(如封閉環路22所示)會在細胞膜24上產生無規的膜孔26。這些膜孔的分布，僅就大小與數量而言，取決于施加電場的強度與時間。施加的電場越強且時間越長，則膜孔越多且越大。然而，這些膜孔的確切位置無法被控制，所以膜孔的最終分布是隨機的。研究人員無法控制化合物被導入細胞內基質中的位置，而這常常是生化反應途徑的重要因素。因此研究人員常需要依賴細胞本身的自然機制，但這在運用上卻是緩慢且困難。
電穿孔法用于導引大分子如DNA、RNA、染料、蛋白質與各種化學藥劑進入細胞。大的外部電場能引發高的膜間電位從而形成膜孔(例如，具有直徑為20-120nm范圍)。在施加電脈沖時，帶電大分子，如DNA，可以通過電泳主動地經由所述膜孔穿入細胞膜(Neumann，etal.，Biophys J 712 868-77(1996))。不帶電的分子也可通過被動擴散經由所述孔進入。在脈沖終止時，膜孔于上百毫秒時間內再次關閉，該時間由恢復為常規膜的傳導值檢測出(Ho，1996，前述)此方法常用于實驗室設備中，以將化學和生物化合物注入細胞中，并避免依賴細胞本身的蛋白質受體和細胞膜間的膜間通道。這使得研究人員易于研究化合物的生物效應，判斷其是抗癌藥物還是致死毒物。然而，現有的電穿孔技術是有局限的。
因此，必須提供一種方法和系統以克服傳統電穿孔法的限制。

發明內容
上述及其它現有技術中的問題和不足可以由本發明的可控制性電穿孔法的多種方法與設備加以克服或改進。本發明的可控制性電穿孔系統和方法允許控制水性膜孔的大小、數量、位置與分布，因此增加了適用性。此處所述的可控制性電穿孔系統和方法一般運用至少兩個子系統和子過程。其中一個子系統和子過程運用較廣泛的效用以削弱細胞膜，稱為廣效性子系統。另一個子系統和子過程運用較局限的效用以定位膜上膜孔的位置，稱為局效性子系統。
本發明的上述與其它的特色及優點，可由以下詳細的敘述和附圖為本領域技術人員領會與了解。


圖1A和1B顯示本發明所述的可控制性電穿孔系統的操作；圖2A和2B顯示傳統的電穿孔系統的操作；圖3A-3D顯示一細胞注入系統的一般實施方式；圖4A-4B顯示一細胞注入系統的實施例；圖5A-5B顯示用于一列細胞的細胞注入系統的實施例；
圖6顯示一利用多重磷脂質膜層和電穿孔法的分離裝置；圖7顯示一利用多膜層、電穿孔法和一組微流的分離裝置；圖8顯示一利用在不同位置具有不同的孔的單膜層的分離裝置；圖9顯示一可用于本發明各種實施方式的電極板網柵(electrodegrid)的實施例。
發明詳述本發明所述的可控制性電穿孔系統和方法允許控制水性膜孔的大小、數量、位置與分布，因此增加了實用性。參照圖1A與1B，本發明所述的對于膜12可控制性電穿孔系統10與方法，一般而言運用至少兩個激活的子系統和子過程。圖1A顯示膜12的一部份，而圖1B顯示本發明所述的可控制性電穿孔系統10。
值得注意的是，僅存在其中一個激活的子系統將不足以在膜上開啟或產生膜孔14而必須運用兩個激活的子系統，以類似于邏輯“與”門方式運作。其中一個廣效性子系統16運用較廣泛的效用以削弱膜，而另一個局效性子系統18則運用較局限的效用以定位在膜12上的膜孔14的位置。同時運用廣效性子系統16與局效性子系統18可高度定位且控制電穿孔法，從而開啟膜孔14。
因此，舉例而言，相比于描述于背景技術部分及圖2A與2B的傳統的細胞膜電穿孔法，除了傳統電穿孔技術所使用的電場以外，本發明所公開的電穿孔系統和方法運用一個在細胞膜上特定位置的局效性子系統18，以控制膜孔14的位置。局效性子系統18會激發磷脂質分子，因而降低廣效性子系統16產生水性膜孔所需的能量。因此，舉例而言，可施加給系統一極弱的電場，其不發生電穿孔現象。然而，此弱電場可在激光束激發過細胞膜的位置開啟水性膜孔。
廣效性子系統或子過程16可選自任何適用的膜削弱系統和/或過程。此弱系統和/或過程可選自電場(在某些優選實施方式中為均勻電場)、微波能量、其它電磁輻射、低能激光束(即低于引發隨機電穿孔法所需的能量)、和包含至少一種前述弱能系統和/或過程的任意組合。廣效性子系統或過程16的能量大小一般低于傳統隨機開啟膜孔的電穿孔法的能量。另外，弱能系統和/或過程16的覆蓋區域(例如橫截面區域)一般包含大于所期望膜孔大小的區域。在某些實施方式中，該區域包含整個細胞膜或一組細胞膜。在其它實施方式中，該區域為細胞膜的一個部位。
局效性子系統或子過程18可選自任何適用的膜孔定位系統和/或過程。上述定位系統和/或過程可選自激光束、電極頭、和包含至少一種前述定位系統和/或過程的任意組合。定位系統和/或過程18的區域(例如橫截面區域)一般相對于所期望的膜孔大小較狹窄。因此，可以使受控制的膜孔具有亞微米級或納米級的尺寸(例如1-100nm)，現今及開發中的激光器和電極頭技術能達到上述亞微米級和納米級的尺寸。
應用細胞注入本發明所述的可控制性電穿孔系統和過程，在控制的條件下，可用于注入大分子，包括DNA、RNA、染料、蛋白質與各種化學藥劑。在不限制本發明的可控制性電穿孔系統的應用的情況下，圖3A-5B顯示了運用可控制性電穿孔系統的細胞膜孔開口系統的各種實施方式。
參照圖3A-3D，系統30可控制性地將大分子注入細胞。圖3A顯示系統30包括用以固定細胞24的機構32。機構32為合適的微機械裝置，其包括在生物工藝領域廣泛已知的相關微系統。此機構32優選可固定個別細胞或控制細胞組。另外，機構32也可用于從細胞24獲取生物的、電的、光的或其它的數據。
參照圖3B，系統30包括用以固定細胞24的機構32，且可控制性電穿孔系統包括廣效性子系統16與局效性子系統18，其中局效性子系統18針對于細胞24的某一位置以引發膜孔34開口。
參照圖3C，經由一納米噴嘴或其它合適的注射裝置36導入一大分子38。當移除局效性子系統18和/或廣效性子系統16時，膜孔會關閉，使細胞24’內具有大分子38。
圖4A與4B顯示用以在細胞24中引入例如以導入上述大分子的可控制性開孔34的可控制性電穿孔系統40。系統40包括以電場發生裝置42、44、46的形式的廣效性子系統，和來自適當源的激光束48(未示出)。電場發生裝置的形式為一電極板42偶合至一可切換(經由一開關44)的電壓源46。如圖所示，激光束可聚焦，而施加電場以激活膜孔開口機制，其類似于前述的邏輯“與”電路方式。
有關圖3A-3D和圖4A-4B的系統和方法的描述，研究人員僅需以組織結構中少量的細胞暴露于生物化合物，并觀察其傳導至鄰近細胞訊號的方式。或者，研究人員可研究是否非對稱的細胞如神經元和腸胃粘膜細胞對于在不同位置注入的化合物反應不同。
參照圖5A與5B，系統50為類似圖3A-3D或圖4A-4B并結合一列細胞24組52的操作。當廣效性子系統16與局效性子系統18操作時，細胞24上形成膜孔34。此膜孔可用于選擇性地將大分子導入細胞24中。
分離裝置參照圖6-10，其為利用本發明的可控制性電穿孔系統而獲得的過濾/分離裝置的各種實施方式。
圖6描述了系統60的一個實施方式，例如，分子篩。系統60包括多個膜層62，例如，磷脂質雙層膜。每一膜層62在運用廣效性子系統時可經受局效性子系統，另外膜孔64的位置可在組裝和/或制造時預先決定，例如，具有適當的微-或毫微-缺陷，或由各膜層的不同電壓水平決定孔大小時可以一致。每一膜層所施加的不同電壓(例如V1、V2與V3)可產生從大膜孔64至小膜孔64的過濾梯度，從而使得分子66通過合適的膜層。
使用生產成本極低的磷脂質雙層膜，相同的濾膜60可重復使用且采用電穿孔法可適用于所需的任何尺寸，小心控制施加的電場。除了多層濾膜，可以使用單個濾膜并并構造使之適合于任何情形。
參照圖7，系統70顯示具有類似于圖6中所述功能的分子篩，其與具有通道74的生物芯片組72相連。通道74可基于尺寸收集各級大分子和分子。另外，通道74可加入或與梯度系統，例如壓力、熱力、電力或其它梯度相連以引導大分子和分子至組72。組72可為任何適用的微流體或毫微流體裝置。舉例而言，制造此類裝置的方法如描述于2003年11月30日的Reveo Inc.PCT Application No.PCT/US03/37304，其標題為“Three Dimensional Device Assembly and Production MethodsThereof”，將其加入本文作為參考。
圖8顯示另一動態過濾裝置的實施例，其中一列激光器組提供膜孔開口的定位。圖8顯示過濾系統80，其包括連接于一廣效性子系統16與一局效性子系統18的膜層82。舉例而言，局效性子系統18可由激光器組88產生。或者，除了激光器組88，可加入一光束導向裝置，從而只使用一個激光源。當與膜層82上某位置相連的激光器組被激活時，膜孔84會開啟。膜孔的大小受控于預定的膜特性、局效性子系統區域或大小，或者廣效性子系統的大小。
細胞、蛋白質、酶、DNA分子、RNA分子與其它大分子或分子可受制于一列容器86組，例如位于合適的微流體裝置上。因此，分離裝置80在任何用途下需要極規整和高度靈活。
圖9顯示本發明的各實施方式中，適于提供廣效性子系統的電極的范例。經由以柵格形式提供電極，可供應適用的電場產生系統以符合各種用途，包括局效性子系統、大分子導引、過濾或任何其它目的。
除了基于大小的過濾，前述的分離裝置也可基于離子價而分離，因為施加的電壓僅能驅使一種類型的離子通過膜。
盡管已顯示和描述了優選實施方式，但在不背離本發明精神和范圍的情況下可以做各種改進和修改。因此，需要指出的是通過舉例而描述的本發明并不限于此。
權利要求
1.膜的可控制性電穿孔系統，其包含有廣效性子系統，用以給所述膜提供廣泛的能量，和局效性子系統，用以給所述膜提供局限的能量，其中在對應于所述局限的能量位置的位置處打開或產生孔。
2.如權利要求1所述的系統，其中所述廣效性子系統是選自電場、微波能、其它電磁輻射、和低能激光束的弱能系統，或者是包含至少一種前述弱能系統的任意組合。
3.如權利要求1所述的系統，其中所述廣效性子系統的能量大小低于不具有所述局效性子系統從而產生無規膜孔的電穿孔系統的能量大小。
4.如權利要求1所述的系統，其中所述廣效性子系統所覆蓋的區域包含大于所期望的膜孔的大小的區域。
5.如權利要求1所述的系統，其中所述廣效性子系統所覆蓋的區域包含一個細胞的膜。
6.如權利要求1所述的系統，其中所述廣效性子系統所覆蓋的區域包含一列細胞的膜。
7.如權利要求1所述的系統，其中所述廣效性子系統所覆蓋的區域包含膜的一個部位。
8.如權利要求1所述的系統，其中所述局效性子系統是選自激光束、和電極頭的定位系統，或者是包含至少一種前述定位系統的任意組合。
9.如權利要求1所述的系統，其中所述局效性子系統的區域對應于所述膜孔的大小。
10.如權利要求1所述的系統，其中所述膜孔具有亞微米級尺寸。
11.如權利要求1所述的系統，其中所述膜孔具有約100納米或更小的尺寸。
12.可控制性電穿孔系統，其包含有廣效性子系統，用以給膜提供廣泛的能量，和局效性子系統，用以給膜提供局限的能量，其中當所述廣效性子系統與所述局效性子系統均被激活時，孔被打開。
13.可控制性地在膜上開孔的方法，其包括導引廣泛的能量至所述膜，和導引局限的能量至所述膜，其中在對應于所述局限的能量位置的位置處打開或產生孔。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量是選自電場、微波能、其它電磁輻射、和低能激光束的能源系統，或者是包含至少一種前述能源系統的任意組合。
15.如權利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量的大小低于不具有所述局限的能量從而產生無規膜孔的電穿孔系統的能量大小。
16.如權利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區域包含大于所期望的膜孔大小的區域。
17.如權利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區域包含一個細胞的膜。
18.如權利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區域包含一列細胞的膜。
19.如權利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區域包含膜的一個部位。
20.如權利要求13所述的方法，其中所述局限的能量是選自激光束、和電極頭的定位系統，或者是包含至少一種前述定位系統的任意組合。
21.如權利要求13所述的方法，其中所述局限的能量的區域對應于所述膜孔的大小。
22.如權利要求13所述的方法，其中所述孔具有亞微米級的尺寸。
23.如權利要求13所述的方法，其中所述孔具有約100納米或更小的尺寸。
24.細胞開孔系統，其包含有微機械裝置，用以固定細胞，和如權利要求1所述的系統，用以可控制性地在所述細胞上開孔。
25.如權利要求24所述的細胞開孔系統，其中所述廣效性子系統包含電極板和可切換的電壓源。
26.如權利要求24所述的細胞開孔系統，其中所述局效性子系統包含激光器。
27.細胞孔大分子系統，其包含有微機械裝置，用以固定細胞，如權利要求1所述的系統，用以可控制性地在所述細胞上開孔，和大分子注入裝置，用以經由所述孔將大分子注入所述細胞。
28.細胞開孔的方法，其包括固定細胞，和應用如權利要求13所述的方法，可控制性地在所述細胞上開孔。
29.用以將大分子引入細胞內的方法，其包括固定細胞，應用如權利要求13所述的方法，可控制性地在所述細胞上開孔，和經由所述孔將所述大分子引入所述細胞內。
30.用于過濾分子或大分子的系統，其包含有多個膜層，各膜層包括如權利要求1所述的可控制性地在細胞上開孔的系統，各膜層被開啟成具有不同的孔徑，從而產生孔大小梯度。
31.過濾分子或大分子的系統，其包含有多個膜層，和廣效性子系統，其與各膜層相結合，其中各膜層包括具有缺陷的位置，在不激活所述廣效性子系統的情況下，所述位置關閉，而在激活所述廣效性子系統的情況下，所述位置被打開。
32.如權利要求31所述的系統，其中位于各膜層的缺陷控制所述孔的大小。
33.如權利要求31所述的系統，其中所述廣效性子系統的能量大小控制所述孔的大小。
34.用以過濾分子或大分子的系統，其包含有膜層，其包括如權利要求1所述的用以可控制性地在細胞上開孔的系統，其中所述局效性能量子系統包含一組局效性能量次子系統。
35.用以過濾分子或大分子的系統，其包含有膜層，其包括如權利要求1所述的用以可控制性地在細胞上開孔的系統，其中所述局效性能量子系統包含一組激光器。
36.用以過濾分子或大分子的系統，其包含有膜層，其包括如權利要求1所述的用以可控制性地在細胞上開孔的系統，其中所述局效性能量子系統包含與電磁能量源相連結的光束導向裝置。
37.可控制性開孔裝置，其包含有雙層細胞膜，激光束源，和電場源，其中將由來自所述激光束源的激光束施加于所述雙層細胞膜的一個位置，從而界定出一開孔位置，并施加來自所述電場源的電場，從而開孔。
38.如權利要求37所述的可控制性開孔裝置，其中所述雙層細胞膜包含磷脂。
39.如權利要求37所述的可控制性開孔裝置，其中，由所述激光束激發所述位置的分子，從而減少開孔所需的電場能量，其中所述電場可以比不存在激光束時開啟所述孔所需的電場弱。
40.過濾裝置，其包含如權利要求37、38和39所述的可控制性開孔裝置。
41.分離裝置，其包含數個如權利要求40所述的過濾裝置，所述過濾裝置堆疊在一起，并對各個過濾裝置施加不同的電壓從而使孔大小不同。
42.如權利要求40所述的過濾裝置，其中所述激光束源能將激光束導引至膜上的多個部位，由此界定當施加電場時用以開孔的不同位置。
43.如權利要求42所述的過濾裝置，其中孔的大小因膜的特性或電場的級別而改變，所述過濾裝置還包括多個與膜上用以施加激光束的位置相連的容器。
44.用以分離顆粒的方法，其包括提供雙層膜，導引激光束至膜上的某位置，施加電場以在所述膜上的所述位置開孔，由此，小于所述孔大小的顆粒將被分離。
45.用以分離顆粒的方法，其包括提供多個雙層膜的堆疊，導引激光束至所述膜上的某位置，施加單獨的電場至各個膜，以在各個膜上開孔。
46.如權利要求45所述的方法，其中改變施加至至少一個所述多個膜中的電場以改變開口大小。
47.分離顆粒的方法，其包括提供雙層膜，導引激光束至所述膜上的第一位置，施加電場以在所述膜上的第一位置處開孔，則小于第一膜孔大小的顆粒將被分離，并被收集于一第一容器中，導引激光束至所述膜上的第二位置，施加電場以在所述膜上的第二位置處開孔，則小于第二膜孔大小的顆粒將被分離，并被收集于一第二容器中。
全文摘要
本發明涉及可控制性電穿孔系統和方法，由于所述系統和方法可以控制水性膜孔的大小、數量、位置與分布，因此增加了適用性。所述的可控制性電穿孔系統和方法一般運用至少兩個激活子系統和子過程。其中一個子系統和子過程運用相對廣泛的效用以削弱膜，稱為廣效性子系統。另一個子系統和子過程運用相對局限的效用以定位膜中的膜孔的位置，稱為局效性子系統。
文檔編號C12M3/00GK1759172SQ200480006432
公開日2006年4月12日 申請日期2004年1月12日 優先權日2003年1月10日
發明者薩迪克·M.·法里斯 申請人:瑞威歐公司