制備低表達血型抗原紅細胞的方法及其在血型試劑質量控制中的應用的制作方法

專利名稱：制備低表達血型抗原紅細胞的方法及其在血型試劑質量控制中的應用的制作方法
技術領域：
該項發明涉及血型抗原表達水平改變的細胞。特別是，該項發明涉及到這些細胞的制備及其在血型試劑的質量控制和血液學、免疫血液學和免疫學分析的校正和確認。
背景技術：
血液中心的功能是檢測血液以準確判斷個人的血型。對于血型的準確和精確的判斷對于多項治療是必需的，包括輸血，器官移植和治療新生兒的遺傳性溶血。
例如，一名病人在接受輸血前必需知道其血型。獻血者和受血者的血型的錯配將會產生嚴重的后果，甚至會導致受血者的死亡。
在輸血血清學中，ABO血型分類是紅細胞血型分類中最重要的一種分類方法。人的血型主要被分成四種血型A，B，AB和O型。每種血型的紅細胞分別攜帶A抗原，B抗原，A抗原和B抗原，既無A抗原也無B抗原。
在每個人的血液中，存在抗ABO血型抗原或紅細胞中缺少的抗原的抗體。因此，A型血的人血中含有抗B抗原的抗體，B型血的人血中含有抗A抗原的抗體，O型血的人血中含有抗A抗原和B抗原的抗體，AB型血的人血中既無抗A抗原的抗體也無抗B抗原的抗體。
在從獻血者向受血者輸血前，必須進行交叉配血。交叉配血是通過直接檢測獻血者血液對受血者血清的排異性，或者是根軍獻血者和受血者血型的記錄進行配對。交叉配血需要保證一種血型的紅細胞不能供給對該血型的抗原可以產生抗體的個人。
從歷史上看，直接測試獻血者紅細胞對受血者血清排異性的交叉配血可以檢測出微弱亞型的錯誤測定和試圖給不相容的受體輸血之間的不相容性。然而，現在直接測試的交叉配血方法在大部分血液中心很少用到，取而代之的是依賴于血型的正確記錄。
在血型血清學中，紅細胞的測定是采用含有針對特異抗原的抗體的試劑(正向分組)，測定血清對表達已知抗原的紅細胞的排異性(反向分組)。
從20世紀80年代開始，單克隆抗體(Mabs)已經被用于血型測定試劑中。與傳統的多克隆抗血清相比，單克隆試劑提供了更高的特異性，更加一致的反應性，而且大部分情況下可以提高靈敏度。
血型試劑的質量控制對于血型測定的準確性和可信性是必須的。血型試劑會在運輸和儲存過程中出現特異性和/或靈敏性的降低，或者是在制備和使用過程中造成的污染。
在人類中，有各種表達低水平A抗原和/或B抗原的ABO亞型。各亞型中抗原的表達水平差異很大，通常如果沒有廣泛的分析不易查明。大多數A型血和稀有的A亞型的抗原水平通常在以下范圍內是可以被接受的(每個紅細胞的抗原分子數)A1，8×105到1.2×106；A2，1.5×105到4×105；A3，4×104到1.2×105；Ax，7×103到104；Aend，2×103到3×103；Am，102到2×103；Ael，102到1.5×103.
B亞型也有相應的抗原表達水平。血型試劑應該能夠檢測所有臨床上顯著的ABO亞型。
從質量控制的目標出發，血型試劑用來測定紅細胞。因此抗原水平表達低的紅細胞更適合用作“質量控制細胞”(或者“標準試劑”)。
抗原表達水平低的紅細胞適合用于血型測定分析，因為這種紅細胞可以提供更多多克隆抗體試劑可能行為的信息。
這些紅細胞可以用作質量控制細胞，用來測定試劑的變化，這種變化會導致不能檢測表達低水平抗原的血液亞型的紅細胞，例如A2型的紅細胞表達抗原的水平處于趨向于可接受范圍的低端，從而導致血型檢測的錯誤發生。
這些紅細胞還可以用來校正和確認檢測系統，以保證所有臨床意義的ABO血型和亞型可以被檢測。
實際上，用表達低水平A抗原和/或B抗原的天然的ABO亞型的紅細胞作為質量控制細胞是很困難的。人群中具有這樣表型的比例很低。例如據估計，Ax血型的個人是A型血個人數量的0.003％。其他亞型的在人群中的比例還要低。
在那些不表達低水平抗原的細胞中，血型測定試劑是這樣評價的測定對正常細胞的排異性。(這包括使用表達相對高水平抗原的紅細胞，但這一方法缺乏靈敏度)；或稀釋血型測定試劑。(這包括稀釋血型測定試劑和測定其對正常細胞的排異性)。
很多實驗室僅依賴于對測定試劑供應商的質量控制。
血型測定試劑的評價普遍是采用血型測定試劑稀釋的方法。然而，實驗室只能以每周或每月為周期分批檢測血型測定試劑。
稀釋血型測定試劑和檢測對正常細胞的排異性的方法并不可靠。正常細胞表達高水平的抗原，例如，每個紅細胞的抗原分子數大于1.5×105。當檢測血型測定試劑時，這些試劑被稀釋至較低的稀釋度，仍可以與紅細胞作用，從而產生血清陽性的結果。用外推法處理這些結果以判斷正常稀釋度下的抗原表達水平。
這一方法除了耗費時間這一缺點之外，該方法還作了以下的假定血型測定試劑預測的靈敏度可以擴大至測定表達低水平抗原的紅細胞。除非血型測定試劑的真正的靈敏度剛好下降到測定一些ABO亞型所需的閾值，否則試劑的變質無法被檢測到。測定這種程度的試劑的變質只可能出現在更進一步耗時的稀釋實驗的完成。
應該指出的是，多克隆抗體試劑經常是雙克隆和具有特異性能的特點。眾所周知，在測定ABO亞型方面，某些克隆比其他的更好。因此，試劑經常以混合物的形式出現。當血型測定試劑被稀釋時，其內在的行為特點將不起作用。
當缺少可信的血型測定試劑時，實驗室常依賴于制造商的說明書和試劑的以往的表現。
當缺少可靠的血型測定試劑的質量控制時，血型測定是用變質的試劑，而且臨床上顯著區別的亞型可能會被錯誤的測定。這種試劑變質時，無法檢測抗原表達水平位于可接受范圍低端的亞型的紅細胞。
如果用于輸血，這種血液將導致或輕或重的輸血反應，包括受血者可能出現死亡。
顯而易見，需要一種可信的表達低水平抗原的紅細胞作為質量控制細胞。血型測定試劑的可靠的質量控制和測定系統的校正以保證準確和標準化的判斷血型，對于使受血者的危險性降低至最小程度是必須的。
缺乏大量輸血經驗的多技能的技術人員更加需要這種方法。可靠的測定可信度的增加比對于測定試劑過往表現的了解更重要。
這一發明的目的是提供用于血型測定試劑質量控制和測定系統的校正和確認的紅細胞，或者是至少為公眾提供一個有用的選擇。
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發明內容
這項發明包括以下方面首先，本項發明提供了表達低水平抗原的紅細胞，這種紅細胞抗原表達水平低，實質上等同于天然產生ABO血型和亞型的紅細胞。
這種表達低水平抗原的紅細胞是在體外制備的。
這種紅細胞的抗原水平的降低實質上更加等同于血清學上獲得的抗原表達少于5×105拷貝數的紅細胞，可以達到獲得的抗原表達少于1×105拷貝數的紅細胞，最好可以達到獲得的抗原表達少于2×104拷貝數的紅細胞。
表達低水平抗原的紅細胞實質上更加等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
表達低水平抗原的紅細胞，在血清學結果中，其每個紅細胞中的抗原數大于1×102拷貝數，最好每個紅細胞中的抗原數大于1×103拷貝數。
免疫優勢抗原紅細胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺或α連接的半乳糖連接到H抗原。
血型抗原最好是A抗原或B抗原。
當采用凝集實驗分析紅細胞時，抗原表達水平的降低相應于凝集分值降低2～3個單位。
酶學上抗原水平的降低是通過使用至少一種優勢免疫糖修飾酶來實現的。酶學上更好的抗原水平的降低是通過能夠在1-3位連接處使鍵斷裂的酶。酶學上更好的抗原水平的降低是通過使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時使用這兩種酶。
低水平的抗原表達更加等同于凝集分值的降低，實質上等同于測定天然紅細胞的弱表達ABO血型或亞型在凝集實驗中的凝集分值。
紅細胞最好是人類的紅細胞。
紅細胞最好處于懸浮狀態。
懸浮液中最好包含細胞防腐劑，比如CelpresolTM。
懸浮液中最好包含可以提供額外的控制指標，如臨床上顯著意義的抗體。
這項發明的優勢體現在，該項發明提供了一種酶學上低水平抗原表達的紅細胞的懸浮液，這種低水平的抗原表達實質上等同于自然存在的紅細胞的表型。而且抗原表達的水平實質上更加等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
紅細胞被用作質量控制細胞。
懸浮液作為質量控制試劑控制血型測定試劑的質量和/或對測試系統的校正和確證。
第二方面，這項發明提供了一種制備表達低水平抗原的紅細胞的方法，步驟包括將至少一種優勢免疫的糖修飾酶與初始抗原表達水平的紅細胞放入溶液中行成混合物；將混合物置于足以減少抗原表達水平的溫度下以降低抗原表達水平；處理該懸浮液，以阻止更進一步抗原表達水平的降低。
通過周期性取樣和測定混合物判斷抗原表達水平的降低。
通過凝集實驗檢測混合物的抗原表達水平。
在凝集實驗中測定紅細胞時，當抗原表達水平的降低相應于凝集分值降低2～3個單位時，處理懸浮液以阻止抗原表達水平的降低。
紅細胞的起始抗原表達水平等于血清學檢查中，每個紅細胞抗原表達數量大于5×105拷貝數。
表達抗原的紅細胞所在溶液中含有至少一種優勢免疫的糖修飾酶的是A型紅細胞。
表達抗原的紅細胞所在溶液中含有至少一種優勢免疫的糖修飾酶的是B型紅細胞。
表達抗原的紅細胞所在溶液中含有至少一種優勢免疫的糖修飾酶的是AB型紅細胞。
通過清洗紅細胞去除免疫優勢的糖修飾酶以阻止抗原水平的過度降低。
抗原表達水平的降低實質上等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
表達低水平抗原的紅細胞，在血清學檢查中，其每個紅細胞中的抗原數少于5×105拷貝數，最好每個紅細胞中的抗原數少于1×105拷貝數，最好每個紅細胞中的抗原數少于2×104拷貝數。
表達低水平抗原的紅細胞，在血清學結果中，其每個紅細胞中的抗原數大于1×102拷貝數，最好每個紅細胞中的抗原數大于1×103拷貝數。
免疫優勢抗原紅細胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺或α連接的半乳糖連接到H抗原。
血型抗原最好是A抗原或B抗原。
所用的酶至少一種是優勢免疫糖修飾酶。該酶能夠在α1-3位連接處使鍵斷裂。最好使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時使用這兩種酶。
抗原表達水平的降低更加等同于凝集分值的降低，實質上等同于在同一凝集實驗中測定天然紅細胞的弱表達ABO亞型在凝集實驗中的凝集分值。
紅細胞最好是人類的紅細胞。
第三方面，該發明提供了由發明的第二方面所提供的酶學上表達低水平抗原的紅細胞的制備方法。
第四方面，該法面提供了血型測定試劑的質量控制的方法，包括將血型測定試劑與根據第一方面和第三方面制備的紅細胞懸浮液進行反應；測定凝集值。
凝集值的測定是通過觀察凝集的數量。
這個方法對于血型測定試劑的一系列的稀釋度都是可以重復的。
可以選擇的是，這個過程可以包括一步判斷紅細胞抗原表達水平的步驟，也就是通過參考已知的紅細胞的抗原表達水平。表達已知抗原水平的紅細胞可以通過國際專利應用PCT/NZ02/00219中所描述的方法進行制備。
第五方面，這項發明提供了一個由兩種或多種紅細胞懸浮液的試劑盒，這種紅細胞的制備參見發明的第一方面和第三方面。
這個試劑盒包含對表達A型和B型紅細胞靈敏度的控制，紅細胞的制備參見發明的第一方面和第三方面。懸浮液中包含細胞防腐劑，比如CelpresolTM。懸浮液中包含可以提供額外的控制指標，如臨床上顯著意義的抗體。
可供選擇的是，試劑盒中包含靈敏度控制的試劑，包括表達Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)抗原的紅細胞。
下面將詳細介紹這項發明。
發明詳述A抗原的優勢免疫的糖是一個α連接的N-乙酰半乳糖胺。B抗原的優勢免疫的糖是一個α連接的半乳糖。優勢免疫的糖連接到H抗原。
優勢免疫的糖的通過酶的去除和修飾會導致原始抗原性的丟失。因此，A，B或AB血型的紅細胞的A抗原和B抗原的表達水平可以被酶降低。
抗原的酶解消化是基于以下標準，酶(糖苷酶)能夠在紅細胞膜上特異降解糖類抗原，而不會破壞非目標結構，例如非靶位連接的蛋白質和糖類。
酶的變性以前被用來去除紅細胞中的ABO血型抗原，從而將A型細胞和B型細胞轉化成O型細胞。研究者用高濃度的酶可以去除大部分甚至全部的紅細胞抗原。
在輸血時，這些去除抗原的細胞能夠用作通用的鮮血單位(Davis1997；Goldstein 1989；Hobbs 1996；Hoskins 1995；Lenny 1991a；Zhu 1996)。“去除抗原的血”在臨床輸血中試驗成功，盡管現在并沒有常規應用(Goldstein 1982；Lenny 1991b；Lenny 1994)。
這些作者描述的方法沒有提供表達減少但又有限的抗原水平的紅細胞，這種抗原的表達水平處于或高于臨床上顯著性的閾值。實際上，這些方法試圖提供不表達抗原的紅細胞，或至少不超過臨床顯著性閾值數量抗原的紅細胞。
根據這項發明，表達低水平A抗原或/和B抗原的紅細胞是在體外制備的。在A抗原或/和B抗原表達水平方面，制備的紅細胞在血清學檢查中等于天然存在的ABO亞型的紅細胞。
消化作用的條件，例如處理的時間、溫度、酶活性和紅細胞與酶的比例，在控制抗原表達水平的減少方面是可以調節的。細胞膜上抗原的酶解消化時間也依賴于酶溶液的相對濃度和細胞上抗原初始的表達水平。
酶濃度的改變可以用作控制抗原的表達水平。如果想得到弱表達A抗原或B抗原的細胞，可以使用高濃度的酶。如果需要強凝集的細胞，可以使用低濃度的酶。
醫用輸血中所用到的典型的質量控制細胞由A型或B型細胞制備，這種條件下酶將去除A抗原和/或B抗原，從而在抗原測定分析中得到特定的反應分數。這項分析將包括板，試管，凝膠卡，和微型板方法，和任何手工或自動化的使用凝集的平臺，或任何其他的檢測抗原的方法(例如酶聯免疫，流式細胞儀等)。
傳統方法獲得紅細胞在血清學檢測中，凝集分析的結果接近于2+。實際的血清學結果需要依賴于所用分析系統的靈敏度，例如板與自動化方法的靈敏度是不同的。
消化的過程可以通過定期取樣和分析凝集系統的表現進行監測。一旦消化的條件依賴于實驗比例的大量的表達低水平抗原的紅細胞，就可以制備可供作為質量控制的細胞。
凝集實驗是測定抗原的一種方法。細胞間抗體的交聯形成的紅細胞結塊稱為凝集。凝集可以通過觀察(用眼睛)或用血型分析儀自動化技術檢測。增強對凝集的觀察可以通過使用特定的酶或放射活性或熒光標記技術。
根據以下方案對手動的凝集反應進行計分

對凝集水平的評價可以通過直接觀察凝集或通過使用誘導凝集的方法產生非直接的凝集進行評價，例如增強效應或使用抗球蛋白分子。
表達低水平抗原的紅細胞，在血清學上實質上等同于天然產生ABO血型和亞型的紅細胞，作為質量控制細胞具有特別的優勢和優點。
如果需要，質量控制細胞的實際抗原表達水平(每個紅細胞上的抗原分子數)可以通過參考已知抗原表達水平的紅細胞。這些被參考的紅細胞可以是自然存在的弱表達抗原的ABO亞型或表達已知抗原水平的紅細胞，可以通過國際專利應用PCT/NZ02/00219中所描述的方法進行制備。
應該說明的是，并不需要知道質量控制細胞的實際抗原表達水平。質量控制細胞被用來評價和檢測血型測定試劑的發生的質量上的變化。質量控制細胞抗原表達水平低且有限才是重要之處。
可以制備具有不同抗原表達水平的質量控制細胞。一套質量控制細胞的抗原表達水平可以通過選擇臨床上顯著性閾值，在此閾值測定抗原的失敗將會導致臨床上明顯的輸血反應。另一套質量控制細胞的抗原表達水平可以通過選擇有足夠把握測定弱亞型的紅細胞。
上述提到的質量控制細胞可以通過控制靈敏度在一定范圍內，從而確證ABO血型測定的準確性。這些靈敏度控制細胞也可以用在校正高度靈敏的機器或在流式細胞儀測定抗原定量曲線時使用。這可以保證ABO血型供給的安全性。
這項發明使得質量控制的標準化和全球一致性。這項發明使得可以對不同實驗室和不同方法學的結果進行比較。將質量控制細胞包含在輸血血清學質量保證計劃，可以建立的ABO血型測定的質量控制標準。
這項發明中，包含在試劑盒中的的質量控制細胞可以用來確證血型測定中A型血(弱)和B型血(弱)的表型。這一試劑盒可以包括質量控制細胞，用來確證對Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)表型的血型測定結果。這一試劑盒能夠保證ABO和RhD血型測定試劑能夠進行質量控制。包含表達一定范圍抗原水平的質量控制細胞的其他試劑盒對于一些專業化的實驗室是很有益處的。
在制備質量控制細胞的懸浮液時，重懸的液體可能含有臨床上有顯著意義的抗體。因此，應該引入額外的質量控制特征，例如共存的抗體對照。
提供以下的定義和解釋輔助理解這項發明的權利要求的描述和要求范圍。
“臨床顯著閾值”是當紅細胞的抗原表達水平低于此標準時，如果進行輸血，抗原檢測的失敗在臨床上無顯著性。
“優勢免疫糖修飾酶”是指這些酶能夠修改A抗原或B抗原的抗原決定簇，從而導致抗原表達水平的降低。例如優勢免疫糖修飾酶包括α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶。
“酶學上抗原表達水平的降低”是指通過酶消化細胞表面的抗原，體外得到的抗原表達水平。
“抗原表達”是指細胞表面出現的抗原，“抗原表達水平”是指細胞表面出現的抗原數量。
“質量控制細胞”是指表達抗原的細胞，典型的是紅細胞，用來評價血型測定試劑的質量和對測定系統進行校正和確證。這項發明的質量控制細胞的例子是例1，2和3中描述的酶修飾的細胞。
在上述敘述中出現的抗原水平“實質上等同于”是指這一抗原表達的水平將在血清學分析中提供實質上同樣的結果。
抗原表達水平是通過每個紅細胞的抗原拷貝數定義的，抗原表達水平處于可接受的水平是指已知ABO亞型的抗原表達水平，或者該抗原表達水平能夠提供血清學上已知ABO亞型的相同的結果。
抗原表達水平的“高”和“低”是用來區別普通ABO亞型如A1和不常見的弱抗原表達的ABO亞型。
具體實施例方式
下面將通過具體實施例闡明本項發明。
實施例1α-半乳糖苷酶作用的B抗原表達水平的降低綠咖啡豆中提取到的10個單位的α-半乳糖苷酶從Glyko(Cat.No.X-5001)購買。
AB血型的100微升的紅細胞用磷酸緩沖液(PBS)清洗三次。
對照反應(ctrl)50微升包裹的紅細胞加入到40微升100mM的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液和22.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
酶促反應(enz)50微升包裹的細胞加入到含有40微升的4個單位的α-半乳糖苷酶的100mM pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液和22.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
混合物在37℃水浴中反應，并不時進行混合。該反應結束時間分別是6小時和9小時，中止的方法是去除相當于15微升包裹的紅細胞，用含有1％牛血清白蛋白的磷酸緩沖液清洗細胞三次。
15微升包裹的紅細胞重懸在1毫升的Celstab(細胞防腐溶液)，用來評價血型測定試劑(抗血清)的稀釋度。
對照反應或酶反應中清洗的細胞重懸在0.8％的Celstab(Diamed)。50微升0.8％的懸浮液轉移到Diamed卡，分別加入以1∶4，1∶32和1∶512稀釋的50微升抗B的血型測定試劑(抗血清)。
將混合物反應5分鐘，根據標準操作規程，將Diamed卡在Diamed免疫離心機中離心10分鐘。
根據制造商的說明書對凝集反應進行打分。
表1稀釋的抗B血型測定試劑(Alba clone，蘇格蘭)測定α-半乳糖苷酶修飾(酶促)和未修飾(對照)組對AB型紅細胞的凝集結果。

實施例2α-N-乙酰半乳糖胺酶作用的A抗原表達水平的降低α-N-乙酰半乳糖胺酶(Cat.No.X-5001)從Glyco公司購買。
AB血型的100微升的紅細胞用磷酸緩沖液(PBS)清洗三次。
對照反應(ctrl)6微升包裹的紅細胞加入到100微升100mM的pH4的檸檬酸鹽緩沖液和26.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
酶促反應(enz)6微升包裹的細胞加入到含有100微升的100個毫單位(mU)的α-N-乙酰半乳糖胺酶的100mM pH4的檸檬酸鹽緩沖液和26.5微升的500mM中的pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中。
混合物在37℃水浴中反應，并不時進行混合。該反應結束時間分別是6小時、12小時和24小時，中止的方法是取出相當于2微升包裹的紅細胞，加入到100微升CelStab試劑中，成為0.8％的懸浮液。(為避免細胞損失，無須用磷酸緩沖液清洗細胞。)懸浮液用來評價用來評價血型測定試劑(抗血清)的稀釋度。
50微升懸浮液轉移到Diamed卡，分別加入以1∶32和1∶256稀釋的50微升抗A的血型測定試劑(Alba clone，蘇格蘭)。
將混合物反應5分鐘，根據標準操作規程，將Diamed卡在Diamed血庫離心機中離心10分鐘。
根據制造商的說明書對凝集反應進行打分。
表1稀釋的抗A血型測定試劑(Alba clone，蘇格蘭)測定α-N-乙酰半乳糖胺酶修飾(酶促)和未修飾(對照)組對AB型紅細胞的凝集結果。

nc表示測試中不能看見細胞在例1和例2中，細胞提供了血清學上弱的凝集值。在這兩個例子中，酶修飾的細胞對于抗體滴度減小的檢測更加敏感，例如當用酶修飾的細胞檢測稀釋的血型測定試劑時得到了較低的凝集分值。
這些細胞適合于用作對血清學的血型分析和血型測定試劑的評價質量控制細胞。使用酶修飾的細胞對于檢測抗體滴度的減少更加具有鑒別力。
盡管酶修飾細胞的抗原表達的實際水平是未知的，如果需要可以通過抗體結合實驗進行分析。然而，技術人員對血型測定試劑的質量變異的更加靈敏檢測的能力，不需要知道酶修飾細胞上抗原表達的實際水平。
由于初始抗原來源不同(由不同個體提供)，因此實驗條件會有細小的差別，盡管反應時間、酶濃度和/或溫度的不同，也可以獲得提供類似結果的作為質量控制細胞的酶修飾細胞。可以通過監控反應過程，獲得需要反應分數的細胞，反應停止后就得到了所制備的質量控制細胞。
實施例3從咖啡豆中制備α-半乳糖苷酶的方法。
α-半乳糖苷酶是根據Courtois和Petek的方法從綠咖啡豆(中果咖啡)中提取到的。(Courtois，J.E.and Petek，J.，α-Galactosidase from CoffeeBeans，(1996)Methods of Enzymology，8565-571)。
提取到的酶濃縮到離心超濾裝置(Millipore)在檸檬酸鹽磷酸緩沖液(100mM，pH6.0)中透析。酶粗提物的活性無需測定。總蛋白質濃度是96mg/ml。
降低B抗原表達的酶學方法對照反應(ctrl)AB血型的經過清洗、包裹的紅細胞(300微升)加入到裝有檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(500微升，100mM，pH6.0和200微升，500mM，pH6.0)的Eppendorf離心管中。
酶促反應(enz)AB血型的經過清洗、包裹的紅細胞(300微升)加入到裝有α-半乳糖苷酶的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(500微升，100mM，pH6.0)和檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(200微升，500mM，pH6.0)的Eppendorf離心管中。
混合物在37℃水浴中反應24小時，并不時通過振搖進行混合。
酶處理的紅細胞用含有1％牛血清白蛋白的磷酸緩沖液清洗三次。然后將經過清洗、包裹的紅細胞以0.9％的比例懸浮在Celstab細胞防腐劑的溶液中，用來加入到Diamed凝膠卡和手工的試管血清學檢測。
細胞懸浮液(50微升，Cellstab中紅細胞濃度為0.9％)和血型測定試劑(抗體)的稀釋液(50微升)被用吸管加入到Diamed卡上，作用5分鐘，然后在Diamed離心機中離心10分鐘，記錄結果。
細胞懸浮液(25-40微升，Cellstab中紅細胞濃度為0.9％)和抗體試劑稀釋液(25微升)在玻璃血清試管中進行反應，然后在免疫離心機中離心15秒，記錄結果。
血型測定試劑的質量控制商品化的抗B(單克隆和一個多克隆人)試劑由過去儲存的抗體試劑提供。這些儲存的試劑通過單批次的酶修飾細胞進行測定，而這些細胞實際的抗原表達水平是未知的。
選擇血型測定試劑是因為這些試劑是過期的，因此可能已經發生了變質，而且測定效果受損。這些試劑的稀釋液也被選擇進行評估。用編碼代替了制造商的名稱。作為反應條件的一個功能的血型測定試劑的表現與評估的供應商相反。
血型測定試劑的變質可以被酶修飾細胞所檢測到。變質是顯著的，因為盡管血型測定試劑的稀釋液在用表達高水平抗原(對照反應)的細胞時可以獲得顯著的凝集分值，當用表達低水平抗原的質量控制細胞(酶促反應)進行測定時，這些同樣的試劑不能提供顯著性的凝集分值。
可以推斷的是，當用試劑檢測未處理的對照細胞(活性好)產生強陽性結果，而用酶修飾細胞(推斷這些質量控制細胞在檢測質量不好的試劑)產生弱的或陰性的反應結果。盡管在用未修飾的細胞無法檢測抗血清是否顯著丟失活性，后面的表格突出列出以下例子。
如前所述，無需判斷酶修飾細胞抗原表達的實際水平。實際上，可以根據使用者的要求選擇抗原表達的水平。那些不同的表達水平是通過控制酶促反應獲得的。







n.d.表示未做。
在前面的描述中，已經有參考文獻提及那些已知等價物的整體物或化合物，然后，在這里把這些等價物混合在一起，就如同分別對其進行闡明。
特別指出的是，發明者的意圖是除酶以外的生物催化劑可以同樣發展成為和前文所述的優勢免疫糖修飾酶具有同樣活性盡管這項發明通過實施例和其有關的可能的具體操作了描述，值得注意的是，在不脫離本發明的精神和范圍前提下可以改進和/或修改本發明。
權利要求
1.作為質量控制細胞的表達低水平抗原的紅細胞。
2.權利要求1中的表達低水平抗原的紅細胞實質上等同于天然產生ABO血型和亞型的紅細胞。
3.權利要求1或權利要求2中表達低水平抗原的紅細胞，其每個紅細胞中的抗原數少于5×105拷貝數。
4.權利要求3中的表達低水平抗原的紅細胞，其每個紅細胞中的抗原數少于1×105拷貝數。
5.權利要求4中的表達低水平抗原的紅細胞，其每個紅細胞中的抗原數少于2×104拷貝數。
6.權利要求1中的表達低水平抗原的紅細胞實質上等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
7.權利要求1到權利要求6中的表達低水平抗原的紅細胞，其每個紅細胞中的抗原數大于1×102拷貝數。
8.權利要求7中的表達低水平抗原的紅細胞，其每個紅細胞中的抗原數大于1×103拷貝數。
9.權利要求1到權利要求8中的任何免疫優勢抗原紅細胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺連接到H抗原。
10.權利要求1到權利要求8中的任何免疫優勢抗原紅細胞的糖鏈連接方式，是α連接的半乳糖連接到H抗原。
11.權利要求9或權利要求10中紅細胞的抗原是血型抗原。
12.權利要求9中紅細胞的抗原是A抗原。
13.權利要求10中紅細胞的抗原是B抗原。
14.當采用凝集實驗分析紅細胞時，權利要求1到權利要求13中的紅細胞的抗原表達水平的降低相應于凝集分值降低2～3個單位。
15.權利要求1至權利要求14任何一項中所提到的紅細胞酶促抗原表達水平的降低是通過使用至少一種優勢免疫糖修飾化酶。
16.權利要求15中所提到的紅細胞抗原水平降低的酶促反應是通過酶促作用斷裂α1-3鏈完成的。
17.權利要求15中所提到的紅細胞抗原水平降低的酶促反應是通過使用α-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時使用這兩種酶完成的。
18.權利要求1至權利要求17任何一項中所提到的紅細胞抗原水平的符合凝集分值的減少，實質上等同于在同一凝集分析實驗中測定的天然存在的表達低水平抗原的ABO血型或亞型的紅細胞。
19.權利要求1至權利要求18任何一項中所提到的紅細胞是人類的紅細胞。
20.權利要求1至權利要求19任何一項中所提到的紅細胞是懸浮液的形式。
21.權利要求20中提到的懸浮液包含有細胞防腐劑，例如Celpressol。
22.權利要求20或權利要求21中所提到的懸浮液所含有的成分可以提供額外的質量控制特性。
23.權利要求22中所提到的懸浮液中的成分是臨床上顯著意義的抗體。
24.權利要求20至權利要求23任何一項中所提到的懸浮液用途為血型測定試劑質量控制和/或測定系統的校正和確證。
25.制備表達低水平抗原的紅細胞的方法的步驟包括將至少一種優勢免疫的糖修飾酶與初始抗原表達水平的紅細胞放入溶液中行成混合物；將混合物置于足以減少抗原表達水平的溫度下以降低抗原表達水平；處理該懸浮液，以阻止更進一步抗原表達水平的降低。
26.權利要求25中抗原表達水平的降低是由定期采樣和測定混合物判斷的。
27.權利要求26中的測定方法是凝集實驗。
28.權利要求27中的懸浮液在抗原表達水平的降低相應于凝集分值降低2～3個單位時，進行處理以阻止抗原表達水平的進一步降低。
29.權利要求25至權利要求28任何一項所提到的方法中，紅細胞的起始抗原表達水平為血清學檢查中，每個紅細胞抗原表達數量大于5×105拷貝數。
30.權利要求25至權利要求29任何一項所提到的方法中，表達抗原的紅細胞所在溶液中含有至少一種優勢免疫的糖修飾酶的是A型紅細胞。
31.權利要求25至權利要求29任何一項所提到的方法中，表達抗原的紅細胞所在溶液中含有至少一種優勢免疫的糖修飾酶的是B型紅細胞。
32.權利要求25至權利要求29任何一項所提到的方法中，表達抗原的紅細胞所在溶液中含有至少一種優勢免疫的糖修飾酶的是AB型紅細胞。
33.權利要求25至權利要求32任何一項所提到的方法中，通過清洗紅細胞去除免疫優勢的糖修飾化酶。
34.權利要求25至權利要求32任何一項所提到的方法中，通過加入優勢免疫糖修飾化酶中止反應。
35.權利要求25至權利要求32任何一項所提到的方法中，通過加入優勢免疫糖修飾化酶的競爭性的底物中止反應。
36.權利要求25至權利要求35任何一項所提到的方法中，抗原表達水平的降低實質上等同于臨床上抗原顯著性的閾值。
37.權利要求25至權利要求35任何一項所提到的方法中，抗原表達水平的減少應小于5×105拷貝數。
38.權利要求37中所提到的方法中，每個紅細胞抗原表達水平的減少應小于105拷貝數。
39.權利要求38中所提到的方法中，每個紅細胞抗原表達水平的減少最好小于2×104拷貝數。
40.權利要求25至權利要求39任何一項所提到的方法中，每個紅細胞抗原表達水平的減少應大于102拷貝數。
41.權利要求40中所提到的方法中，每個紅細胞抗原表達水平的減少應大于103拷貝數。
42.權利要求25至權利要求30以及權利要求32至權利要求41任何一項所提到的方法中中，免疫優勢抗原紅細胞的糖鏈連接方式，是α連接的N-乙酰半乳糖胺連接到H抗原。
43.權利要求25至權利要求29以及權利要求31至權利要求41任何一項所提到的方法中，免疫優勢抗原紅細胞的糖鏈連接方式，是α連接的半乳糖連接到H抗原。
44.權利要求42或權利要求43所提到的方法中，抗原是血型抗原。
45.權利要求42所提到的方法中，抗原是A抗原。
46.權利要求43所提到的方法中，抗原是B抗原。
47.權利要求25至權利要求46任何一項所提到的方法中，酶在α1-3位斷鏈。
48.權利要求25至權利要求46任何一項所提到的方法中，使用的酶是α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同時使用這兩種酶。
49.權利要求25至權利要求48任何一項所提到的方法中，抗原表達水平的降低等同于凝集分值的降低，實質上等同于在同一凝集實驗中表達低水平抗原的天然存在的紅細胞的ABO亞型在凝集實驗中的凝集分值。
50.權利要求25至權利要求49任何一項所提到的方法中，用的是人的紅細胞。
51.表達低水平抗原的紅細胞是根據權利要求25至權利要求50制備的。
52.紅細胞懸浮液是根據權利要求51制備的。
53.根據權利要求52制備的懸浮液包含有細胞防腐劑，例如Celpressol。
54.根據權利要求51或權利要求52制備的懸浮液包含有可以提供額外控制特性的物質。
55.權利要求54所提到的懸浮液中的組成還包括臨床上顯著意義的抗體。
56.血型測定試劑的質量控制方法包括a.將根據權利要求20至權利要求24或權利要求52至權利要求55任何一項所制備的懸浮液與血型測定試劑進行反應；b.評價凝集的程度。
57.權利要求56所提到的方法中，凝集值的測定是通過觀察凝集的數量。
58.權利要求56或權利要求57所提到的方法，對于血型測定試劑的一定范圍內的的稀釋度都是可以重復的。
59.根據權利要求20至權利要求24或權利要求52至權利要求55所制備的試劑盒中含有兩種或更多的懸浮液。
60.根據權利要求59制備的試劑盒包含表達A抗原和/或B抗原紅細胞的懸浮液。
61.根據權利要求59或權利要求60制備的試劑盒中，紅細胞的抗原表達水平實質上等同于臨床上顯著的閾值。
62.根據權利要求59至權利要求61制備的試劑盒中，包含表達RhDCce(Rlr)和Rhce(rr)抗原的紅細胞。
全文摘要
采用至少一個優勢免疫糖修飾化酶制備低表達血型抗原的紅細胞的方法，如N－乙酰半乳糖胺酶或α－半乳糖苷酶。應用本方法制備的紅細胞所表達的抗原實質上只達到臨床上所能檢測到的抗原水平的閾值。應用本方法所制備的紅細胞可以應用于血型試劑的質量控制和測試系統的校正，從而精確和標準化地判斷血型。
文檔編號C12N5/06GK1751130SQ200480004362
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月17日 優先權日2003年2月17日
發明者斯蒂芬·邁克爾·亨利, 麗莎·格威妮絲·吉利佛 申請人:科威精密有限公司