專利名稱：重組的mva及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于產(chǎn)生重組的MVA病毒的MVA突變體，以及被該突變的MVA病毒感染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及DNA-載體構(gòu)建體，以及用該突變的MVA病毒和該DNA-載體構(gòu)建體構(gòu)建重組MVA的方法。
背景技術(shù)：
牛痘病毒(VV)屬于痘病毒科(poxviruses)正痘病毒屬(Orthopoxvirus)。牛痘病毒的某些毒株例如英國Lister研究所的Elstree株作為預(yù)防天花的活疫苗已經(jīng)應(yīng)用了許多年。由于接種疫苗可能引發(fā)并發(fā)癥(Schr，Zeitschr.FürPrventivmedizin 18，41-44 )，并且1980世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布天花已經(jīng)被消滅，所以如今只有高危人群才接種以預(yù)防天花。
牛痘病毒已經(jīng)被用作生產(chǎn)和傳輸外源抗原的載體(Smith等，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 2，383-407 )。在DNA重組技術(shù)的輔助下，這使得可以將編碼外源抗原的DNA序列(基因)引入到牛痘病毒基因組中。如果該基因在病毒DNA的整合位點(diǎn)對于牛痘病毒的生命周期不是必需的，那么產(chǎn)生的重組牛痘病毒就可能是有侵染性的。也就是說可以侵染外源細(xì)胞并且表達(dá)所整合的基因(歐洲專利申請No.83,286和No.110,385)。這樣產(chǎn)生的重組病毒一方面可以用作預(yù)防感染的活疫苗，另一方面也可以用來在真核細(xì)胞中生產(chǎn)外源蛋白。
牛痘病毒是被最廣泛評估的活的載體，并且它所具有的高度穩(wěn)定、操作廉價、便于管理、可以容納大量的外源DNA的獨(dú)特的性質(zhì)也支持它被用作重組疫苗。牛痘病毒載體具有既可以誘導(dǎo)抗體反應(yīng)又可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒素反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，可以以一種更為自然的方式向免疫系統(tǒng)提供抗原，并且在多種的動物模型中成功地作為載體疫苗用于傳染病的免疫保護(hù)。此外，牛痘病毒載體還是非常有價值的研究工具，它可以用來分析重組蛋白的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、鑒定體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的靶標(biāo)、鑒別抗特定疾病免疫防御的類型。
然而，牛痘病毒對人是有傳染性的，并且出于安全性的考慮和規(guī)章制度，牛痘病毒作為表達(dá)載體在實(shí)驗(yàn)室中的使用受到了很大地影響。此外，重組牛痘病毒將來可能的應(yīng)用，例如生產(chǎn)用于人類的新的治療或預(yù)防方法的重組蛋白或重組病毒粒子，很可能由于重組牛痘病毒載體多產(chǎn)的復(fù)制而受到阻礙。文獻(xiàn)中報道的大多數(shù)重組牛痘病毒都是基于牛痘病毒的西里瑟夫(Western Reserve，WR)毒株。另一方面，已知該毒株有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，因此不適合用于人和動物(Morita等，Vaccine 5，65-70 )。
出于對牛痘病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株安全性的考慮，已經(jīng)從高度減毒的病毒毒株中開發(fā)了牛痘載體。這些減毒的病毒毒株已被鑒定具有有限的體外復(fù)制能力，和體內(nèi)無毒性。這些毒株需專門培養(yǎng)以避免出現(xiàn)不希望的副作用，這是早已知道的。因而，通過將牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)在雞胚成纖維細(xì)胞中經(jīng)過長時間的連續(xù)傳代就可能培育出修飾的安卡拉牛痘病毒(modified vaccinia virus Ankara，MVA)(參見Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V和Stickl，H.(1975)Infection 3，6-14；瑞士專利No.568392)。該MVA病毒按照布達(dá)佩斯條約的要求在CNCM(法國國家微生物保藏中心，Institut Pasteur，Collectione Nationale de Cultures deMicroorganisms，25，rue de Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)于1987年12月15日進(jìn)行保藏，保藏號為I-721。
該MVA病毒已被分析，以鑒定其相對于野生型CVA病毒在基因組上的變化。已經(jīng)確定存在六個主要的缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)(Meyer，H.，Sutter，G.Mayr A.(1991)J.Gen.Virol.72，1031-1038)。這個修飾的安卡拉牛痘病毒只有很低的毒性，也就是說用于免疫接種時不具有副作用。因而特別適合無免疫應(yīng)答的受試者的初次免疫。MVA毒株的卓越品質(zhì)已被大量的臨床試驗(yàn)所證明(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390(1987)，Stick等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392， )。
作為用于表達(dá)重組基因的安全的病毒載體，修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)是一個有價值的工具，并且，還可以用于其它不同的目的，如在體外研究蛋白質(zhì)功能，或在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)或體液免疫反應(yīng)。MVA最主要的優(yōu)點(diǎn)是即使在人類和大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中有復(fù)制缺陷的，但仍能進(jìn)行基因的高水平表達(dá)。作為一種疫苗，MVA有很好的安全記錄，能在生物安全I(xiàn)級的條件下操作，并已證明，當(dāng)在動物體內(nèi)提供異源抗原時，可產(chǎn)生免疫性和保護(hù)性(1-8)，其作為人類首選的疫苗已經(jīng)進(jìn)入到臨床階段(9-11)。
而對于新構(gòu)建體進(jìn)行評估的需要不斷增加，當(dāng)與有復(fù)制能力的重組牛痘病毒相比較時，MVA載體的產(chǎn)生是不同的，這是由于該病毒的生長缺陷以及減少的細(xì)胞病變效應(yīng)。因而需要快速簡易的重組MVA的構(gòu)建方法，以允許對多個候選的構(gòu)建體進(jìn)行比較評估。
與親代毒株相比，MVA有大約有占其基因組15％的缺失(30,000個堿基對)，包括K1L基因的大部分。僅有263bp長度的片段依然存在于MVA基因組中。正如在1998年Antoine，G.，F(xiàn).Scheiflinger，F(xiàn).Dorner和F.G.Falkner所描述的，MVA的K1L基因序列對應(yīng)于其基因組上20685-20981位之間的022L開放閱讀框的前263個堿基對。該修飾的安卡拉牛痘病毒的全基因組以及它與其它正痘病毒基因組的比較可以在《病毒學(xué)》(Virology)244365-396中找到。
以前，已經(jīng)開發(fā)了一種簡易高效的構(gòu)建重組MVA的方法。該方法基于對牛痘病毒宿主范圍基因K1L的短暫表達(dá)的選擇。該方法基于通過短暫的宿主范圍基因表達(dá)選則重組MVA(12)，以牛痘病毒K1L基因功能作為MVA能夠在兔腎細(xì)胞系RK-13中存活的嚴(yán)格標(biāo)記物。描述了構(gòu)建體和新MVA載體質(zhì)粒的使用，在所述質(zhì)粒上攜帶有一個牛痘病毒宿主范圍基因K1L的表達(dá)框架，作為短暫的可選擇的標(biāo)記。這些質(zhì)粒既允許在MVA基因組上穩(wěn)定地插入增加的重組基因，也允許對MVA基因組序列進(jìn)行精確的靶向突變。重復(fù)DNA序列連接在K1L基因的兩側(cè)，被設(shè)計用來在非選擇培養(yǎng)條件下通過同源重組從病毒基因組上除去標(biāo)記基因。
當(dāng)上述選擇的方法直接用于構(gòu)建攜帶有包括來自水母Aequorea victoria的綠色熒光蛋白(gfp)的異源基因序列的多重重組MVA時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一部分分離的重組MVA可以在RK-13細(xì)胞系中存活，但是不能表達(dá)感興趣的目的基因?；趯Ψ蛛x的多重MVA分子水平的分析，發(fā)現(xiàn)了兩個不同的導(dǎo)致目的基因不表達(dá)的原因(i)在重組基因的插入位置只有標(biāo)記基因K1L，并沒有重組基因插入。(ii)MVA基因組的自然缺失II的區(qū)域被影響/截短(圖1A)。第一種情形是由于首先在MVA基因組的側(cè)翼I基因序列與現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的側(cè)翼I重復(fù)序列之間發(fā)生了一次單交叉(12)，接著又在殘留的側(cè)翼I序列間發(fā)生了一次同源重組，于是只有K1L標(biāo)記序列穩(wěn)定地插到了重組MVA基因組中。第二種情形是在MVA中與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的K1L基因之間發(fā)生了同源重組。后一種重組的發(fā)生Tscharke和Smith也已經(jīng)研究過(13)。
因此，本發(fā)明的一個目的是為克服上述問題而提供一種改進(jìn)的生產(chǎn)重組MVA的方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的時提供可以被用于該重組方法的MVA突變體以及DNA-載體構(gòu)建體。
這體現(xiàn)在獨(dú)立權(quán)利要求的主題中。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例體現(xiàn)在從屬權(quán)利要求中。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的MVA突變體，其特征為該MVA的K1L基因序列(正如下面所定義的只包括一個片斷)和優(yōu)選的它的啟動子序列或該啟動子序列的一個功能部分已經(jīng)通過在MVA基因組上引入突變或缺失，或同時引入突變和缺失而失活。
正如上面所說到的，在MVA基因組(編碼序列)中只提供K1L基因的264bp長度的片段。另外，相應(yīng)的包括另外100bp的調(diào)控序列也被提供。該MVA K1L基因序列是MVA基因組上20685-20981之間的開放閱讀框022L的一部分，正如Antoine，G.，F(xiàn).Dorner，和F.G.Falkner在1998年所闡述的。這樣就可以理解失活MVA K1L基因序列的一個功能部分和調(diào)控序列是完全可以達(dá)到本發(fā)明的目的。“失活”意味著在序列上的改變，以避免在MVA中的與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(DNA-載體構(gòu)建體)上的K1L基因序列之間的同源重組，這樣就避免了在MVA基因組的自然缺失II的區(qū)域引發(fā)的影響/截短(和導(dǎo)致目的基因不表達(dá))。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，MVA的K1L基因，優(yōu)選包括它的啟動子序列，或該啟動子序列的功能部分通過從病毒基因組缺失而失活。作為另一種備選方案，K1L基因功能缺陷的重組MVA可以通過序列突變來產(chǎn)生。例如插入突變，通過抑制K1L基因特異的同源重組使K1L基因失活。該重組的MVA可以成為方便的導(dǎo)入外源基因以及接下來篩選轉(zhuǎn)染的毒株的方法，即，用于獲得重組MVA的方法。
正如前面所提到的，在MVA基因組中的失活通常意味著一定程度的失活，該失活導(dǎo)致避免MVA中和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(載體構(gòu)建體)中的K1L基因的同源重組。在突變的情形下，本發(fā)明中失活的K1L序列與牛痘病毒(VV)中的K1L序列間的同源性低于50％，優(yōu)選在10-50％之間，更優(yōu)選在15-40％之間，最優(yōu)選在20-30％之間。同源性為0的情況也可能存在。
在缺失突變的情形中，所缺失的片斷，至少包括MVA K1L基因的100bp，更優(yōu)選包括150或200bp。如上面所說的，還可能缺失全部的264bp。此外，調(diào)控序列也應(yīng)該缺失更大的程度，以避免同源重組的發(fā)生。K1L基因的編碼區(qū)和調(diào)控序列完全缺失也是可能的(即，缺失約360bp)。
使用最近建立起來的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法用于被MVA感染的原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，隨后在霉酚酸(mycophenolic acid)存在的情況下，通過用β-半乳糖苷酶篩選產(chǎn)生病毒(Sutter，G.和B.Moss.1992，PNAS USA 8910847-10851)，從而產(chǎn)生具有從病毒基因組中刪除K1L編碼序列的突變MVA。
本發(fā)明的原理是只要在RK-13細(xì)胞系中的MVA中不導(dǎo)入適當(dāng)?shù)腄NA序列(K1L編碼序列和或者任意地進(jìn)一步的例如編碼外源蛋白的DNA序列)，復(fù)制就不發(fā)生。因此本方法/MVA突變體/DNA構(gòu)建體是適于重組MVA的篩選。同時，它們也是產(chǎn)生MVA的有效工具。
這里所采用的術(shù)語“重組的MVA”指的是那些經(jīng)過例如DNA重組技術(shù)而被遺傳改造的MVA，以及指的是被提供以用于諸如疫苗或是表達(dá)載體的用途的MVA。
根據(jù)本發(fā)明，重組的MVA牛痘病毒可以通過下面的步驟制備。然而，應(yīng)理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能在本發(fā)明的范圍內(nèi)和運(yùn)用他所具有的本領(lǐng)域的知識進(jìn)行改變。此外，在此所引用的文獻(xiàn)作為參考而全部引入。
DNA構(gòu)建體被導(dǎo)入到細(xì)胞，尤其是真核細(xì)胞中。優(yōu)選鳥類、哺乳類和人類的細(xì)胞。該DNA構(gòu)建體包括編碼牛痘病毒(VV)K1L蛋白或K1L來源的多肽的DNA序列，以及編碼外源多肽的DNA序列。上述兩個DNA序列均被DNA序列側(cè)面連接在非必需位點(diǎn)的側(cè)面。所述的非必需位點(diǎn)，如MVA基因組中的缺失III等自然缺失區(qū)。優(yōu)選的真核細(xì)胞是被本發(fā)明中的突變的MVA多產(chǎn)地感染的BHK-21(ATCC CCL-10)、BSC-1(ATCC CCL-26)、CV-1(ECACC 87032605)或者M(jìn)A104(ECACC 85102918)細(xì)胞，并允許同源重組。進(jìn)一步優(yōu)選的宿主細(xì)胞是雞的成纖維細(xì)胞，鵪鶉的成纖維細(xì)胞，QT-9細(xì)胞系，Vero細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞，B-細(xì)胞或者是人的原發(fā)細(xì)胞(例如，原發(fā)成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)。
正如上面所提到的，DNA構(gòu)建體包括一個編碼VV的K1L基因的序列或者是功能等效的基因的序列。在本發(fā)明中所說的功能等效是指與VV的K1L基因的核苷酸相比較包含一個或多個替換、插入、缺失的核苷酸，但不改變它的功能。這些缺失優(yōu)選是1個核苷酸，但是也可以有2個、3個、4個或更多個核苷酸5’或3’或者在序列內(nèi)部，或者這些核苷酸被其他的核苷酸所替代。根據(jù)本發(fā)明的這些VV的K1L等效蛋白編碼的核酸可顯示出和原始的VV的K1L基因的核苷酸例如至少有80％，更典型的為至少90％或是95％的序列一致性(如上所述)。
在本文中，特別地，編碼等效的VV的K1L蛋白的各種變化的VV的K1L基因例如在序列中的缺失、插入和/或替換，被稱為“沉默的”變化，這也被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
例如，在核酸序列中的這種改變被認(rèn)為引起一個等同的氨基酸的替代。優(yōu)選的是，這樣的氨基酸的替代是那種結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸之間的替換，即，保守性氨基酸的替換。
氨基酸的替換可以依據(jù)殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性(兩性分子)的相似性來實(shí)現(xiàn)。例如，疏水性氨基酸有丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性和中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正(堿性的)電荷的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸。
“插入”或“缺失”的數(shù)目通常是1到5個氨基酸。允許的變化的程度可以通過重組DNA方法在一個多肽序列上引入插入、缺失或替換的試驗(yàn)來決定。所得的變異體可以檢測它們的生物活性。
凡是影響蛋白質(zhì)N端或C端部分的核苷酸的變化通常不會改變蛋白質(zhì)的活性，因?yàn)檫@些部分通常不涉及生物活性。每一種建議的修飾均在現(xiàn)階段現(xiàn)有技術(shù)的范圍內(nèi)，并且編碼產(chǎn)物保持生物活性。
如果DNA構(gòu)建體被導(dǎo)入到真核細(xì)胞中，并且K1L編碼DNA和外源DNA已經(jīng)與病毒DNA重組，就可能通過在細(xì)胞中傳代分離到期望的重組牛痘病毒MVA。這些細(xì)胞要求有K1L功能來支持病毒的生長，例如RK-13細(xì)胞。重組病毒的克隆可以通過已知的噬斑純化的方式(Nakano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1593-1596[1982)；Franke等，Mol.Cell.Biol.1918-1924 ；Chakrabarti等，Mol.Cell.Biol.3403-3409 ；Fathi等，Virology 97-105 )。
這些被插入的DNA構(gòu)建體可以是線性的和環(huán)狀的。環(huán)狀的DNA優(yōu)選被使用。特別優(yōu)選使用質(zhì)粒。
這些DNA構(gòu)建體可包含側(cè)面連接如下位點(diǎn)的左側(cè)和右側(cè)的序列在MVA基因組上非必需位點(diǎn)，例如缺失區(qū)III(Sutter，G.和Moss，B.(1992)Pr.C.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851)；MVA基因組上該設(shè)計的K1L缺失位點(diǎn)或任何根據(jù)本發(fā)明的突變MVA基因組內(nèi)的非必需位點(diǎn)。
外源DNA序列可以被插到非必需位點(diǎn)，例如自然缺失區(qū)的兩側(cè)的序列之間。
外源DNA序列可以是編碼治療性多肽的基因，治療性多肽如分泌的蛋白質(zhì)，例如抗體的多肽、趨化因子(chemokines)、細(xì)胞因子(cytokines)或干擾素，或者是來源于病原體的可優(yōu)選用作疫苗的多肽，或者用于生產(chǎn)有治療或科研價值的多肽。病原體可理解為是能引起疾病的病毒、細(xì)菌、寄生蟲，以及在生物體中無限增殖并可能導(dǎo)致病理生長的腫瘤。這些病原體的例子已被Davis，B.D.等人描述(《微生物》(Microbiology)，第三版，HarperInternational Edition)。優(yōu)選的病原基因來源于流感病毒、麻疹和呼吸合胞病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒例如HIV I和HIV II、人類肝炎病毒例如HCV和HBV、皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、惡性瘧原蟲(malaria parasitePlasmodium falciparum)和引起肺結(jié)合的分枝桿菌(Mycobacteria)。
優(yōu)選的編碼腫瘤相關(guān)抗原的基因來源于與黑色素瘤相關(guān)的鑒定抗原，例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白1和2；睪丸癌抗原，例如，MAGE-1、-2、-3和BAGE；在腫瘤中過表達(dá)的非突變型共用抗原(non-mutated sharedantigens)，例如，Her-2/neu，MUC-1和p53。
為了使外源DNA序列或基因可以表達(dá)，必須在該DNA中提供調(diào)控序列，該調(diào)控序列是基因轉(zhuǎn)錄所必須的。該調(diào)控序列(被稱作啟動子)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，例如，牛痘病毒特異性啟動子，如在EP-A-198,328中所描述的牛痘11kD基因，和7.5kD基因(EP-A-110,385)或者允許啟動牛痘病毒特異轉(zhuǎn)錄的異源痘病毒啟動子，或者允許啟動牛痘病毒特異轉(zhuǎn)錄的合成的啟動子。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的DNA-載體構(gòu)建體包括以下功能性連接的部分
-在其真正的啟動子(K1L標(biāo)記基因)，牛痘病毒特異啟動子或者異源痘病毒啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的VV的K1L編碼序列-兩個在K1L標(biāo)記基因兩側(cè)的DNA序列用于隨后通過同源重組從重組MVA中除去標(biāo)記，優(yōu)選的是兩個相同的無活性的(例如，大腸桿菌lacZ基因來源的)DNA片段，-一個供外源基因可選自地連接的多克隆位點(diǎn)，-允許牛痘病毒特異轉(zhuǎn)錄的牛痘病毒特異性啟動子或異源的痘病毒啟動子，或允許牛痘病毒特異轉(zhuǎn)錄人造的啟動子，所述部分通過兩個MVA-DNA序列被連接到側(cè)面，所述的MVA-DNA序列是外源基因的主要插入目標(biāo)，插入到根據(jù)本發(fā)明上述的突變MVA基因組中的任何非必需位點(diǎn)中，MVA基因組的缺失區(qū)III內(nèi)的位點(diǎn)，或者是MVA基因組中設(shè)計的K1L缺失位點(diǎn)。
這些DNA構(gòu)建體可以通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入到細(xì)胞中，例如用磷酸鈣沉淀法(Graham等，Virol.52，456-467 ；Wigler等，Cell 777-785 )，電穿孔法(Neumann等，EMBO J.1，841-845 )，顯微注射法(Graessmann等，Meth.Enzymoloy 101，482-492(1983))，脂質(zhì)體法(Straubinger等，Methodsin Enzymology 101，512-527(1983))，原生質(zhì)體法(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，2163-2167(1980))或是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的其他方法。磷酸鈣沉淀法是優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法。
為制備疫苗，依據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的MVA牛痘病毒可以被轉(zhuǎn)化成生理上可以接受的形式?；诙嗄陙頌榉乐翁旎ń臃N制備疫苗的經(jīng)驗(yàn)(Kaplan，Br.Med.Bull.25，131-135 )，這是可以實(shí)現(xiàn)的。典型的，在安瓿中，最好是玻璃安瓿中，約106-108個重組MVA顆粒于100ml添加了2％的蛋白胨和1％人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中被凍干。凍干物可包括適合于腸胃外給藥的膨脹劑(比如甘露醇、葡聚糖、糖、苷氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或者其他助劑(比如抗氧化劑、穩(wěn)定劑)。然后將玻璃安瓿密封保存，最好在-20℃以下，可以保存幾個月。
為了接種，凍干物可以溶解于0.1-0.2ml的水溶液中，優(yōu)選的是生理鹽水，而且可以用于腸胃外給藥的，例如，皮下接種。根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選在皮內(nèi)注射。在注射的位置可能會有輕微的紅腫，有時還會發(fā)癢(Stickl等，supra)。給藥的方式、劑量和注射次數(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過已知的方法是可以選擇。在一定長度的時期內(nèi)恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行幾次免疫有利于獲得對異源抗原高水平的免疫反應(yīng)。
綜上所述，本發(fā)明的生產(chǎn)重組MVA的方法包括以下幾步如上所述用突變的MVA感染宿主細(xì)胞，利用本發(fā)明的DNA-載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，和通過在兔腎細(xì)胞RK-13上的生長來篩選修復(fù)的MVA，或者也可用其他細(xì)胞類型，這些類型主要要求具有K1L基因功能，使MVA或如權(quán)利要求1所述的突變MVA能多產(chǎn)的生長。
圖1可能存在的基于K1L的宿主細(xì)胞范圍篩選的缺陷(pit-falls)和其去除的示意圖。(A)是MVA基因組(HindIII的限制性酶切譜圖)和pIIIdHR載體質(zhì)粒的示意性譜圖。缺失區(qū)II的位點(diǎn)描述開放性閱讀框(ORFs)，包括K1L的基因片段(陰影區(qū))。缺失區(qū)III的位點(diǎn)側(cè)鏈-I和側(cè)鏈-II指的是MVA-DNA序列，該MVA-DNA序列對于外源基因靶向插入MVA基因組中缺失III的位點(diǎn)是必需的。側(cè)鏈-I-rep表示的是與側(cè)鏈-I的右端同源的一個283bp MVA-DNA片段的重復(fù)序列，它可以通過同源重組的方法刪除K1L的表達(dá)區(qū)。K1L-標(biāo)記，K1L基因序列包括真正的啟動子，Pvv，牛痘病毒的特異性啟動子，MCS，多克隆位點(diǎn)。1和2是指采用常規(guī)的K1L篩選(虛線顯示)潛在的不期望的同源重組事件。(B)從MVA基因組中去除K1L序列。最上面是MVA基因組的HindIII限制性酶切譜圖，下面是位于MVA基因組上的缺失II位點(diǎn)上的開放閱讀框(ORF)，包括成片段的K1L基因(陰影區(qū))。pIInewLZ-gpt-delK1L的缺失質(zhì)粒，攜帶在261bpK1L片段兩側(cè)的MVA序列(N2L和K2L的基因序列)；N2L-rep，N2L開發(fā)閱讀框5’區(qū)的315bp的重復(fù)區(qū)域；P11，牛痘病毒的晚期啟動子；P7.5，牛痘病毒的早期/晚期啟動子；LacZ，編碼β-半乳糖苷酶的大腸桿菌LacZ基因；gpt，編碼葉黃素-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌gpt基因。最下面是位于MVA-IInew中的缺失II位點(diǎn)。(C)新的MVA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIIIΔHR。側(cè)鏈-I和側(cè)鏈-II是指MVA-DNA序列，該序列對于外源基因靶向插入到MVA基因組中缺失III位點(diǎn)是必需的。K1L-標(biāo)記是K1L基因的序列，包括真正的啟動子、Pvv、牛痘病毒的特異性啟動子、MCS、多克隆位點(diǎn)。兩個相同的lacZ衍生的DNA片段(del)拷貝位于K1L標(biāo)記基因的兩側(cè)，用于隨后通過同源重組從重組的MVA上除去該可選擇的標(biāo)記。
圖2包括用于HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3的基因序列的重組MVA的構(gòu)建以及基因組結(jié)構(gòu)。MVA基因組的HindIII限制性酶切的示意圖位于最上面。HCV編碼序列位于牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5的轉(zhuǎn)錄控制因子的下游，并且通過同源重組的方法插入到MVA基因組缺失III的位點(diǎn)。側(cè)鏈-I和側(cè)鏈-II指的是MVA-DNA序列，該序列接近缺失III位點(diǎn)，并用于將目標(biāo)重組到MVA基因組中。Rec2是指位于側(cè)鏈1的右側(cè)末端的283bp重復(fù)的MVA-DNA序列，并可以通過同源重組從最終的重組病毒基因組中去除K1L可選擇的標(biāo)記。重組MVA-HCV-NS3的基因組結(jié)構(gòu)示于最下方。
圖3MVA-P7.5-NS3的體外特性左圖病毒的DNA的PCR分析，用于檢測插入到缺失III位點(diǎn)的基因序列和NS3的特異性序列。野生型MVA的DNA基因組，MVA-HCV-NS3和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIII-dHR-P7.5-NS3，該質(zhì)粒作為模板DNA用于擴(kuò)增由瓊脂糖凝膠電泳分離的獨(dú)特的DNA片段。1-kB-梯(Gibco)作為標(biāo)記(第一道)。右圖使用10IU/細(xì)胞的MVA或者M(jìn)VA-P7.5-NS3感染CEF細(xì)胞，感染24小時后收集。細(xì)胞溶菌產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)通過SDS-10％PAGE分離，然后使用多克隆的HCV的特異性抗血清進(jìn)行Western印跡分析。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的位置和分子量(kDa)在MW道上顯示。
以下實(shí)施例用于更好地理解本發(fā)明，而不是用來給人以本發(fā)明僅限于該實(shí)施例的主題的印象具體實(shí)施方式
為了提高K1L瞬時的選擇性技術(shù)，發(fā)明人采取了兩種方法構(gòu)建沒有K1L的MVA(例如MVA(IInew)，圖1B)；設(shè)計一種新的DNA載體的構(gòu)建體(轉(zhuǎn)移質(zhì)粒)(例如pIIIΔHR，圖1C)。
1.病毒的生長和純化1.1MVA和MVA突變病毒的生長MVA病毒是毒性被大大地削弱了的牛痘病毒，通過在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中對原始的CVA毒株進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)而得到的。該產(chǎn)生歷史的通常的觀點(diǎn)、牛痘MVA毒株的特點(diǎn)和使用，參考Mayer等人在Infection3，6-14 的文章中進(jìn)行了總結(jié)。由于適應(yīng)了CEF，MVA病毒在其它細(xì)胞體系中的生長受到了極大的限制。除了一種具有良好特性、容易保持細(xì)胞系的倉鼠(hamster)幼仔的腎細(xì)胞(BHK-21)可以支持MVA病毒的生長，而且可以像CEF一樣高效的表達(dá)重組基因，而且在表達(dá)載體和活的重組疫苗的開發(fā)中已經(jīng)被推薦用于標(biāo)準(zhǔn)的MVA增殖。(Drexler等，1998，J.Gen.Virol.，79，347-352)。
MVA病毒在CEF細(xì)胞中能夠正常地生長，而且它已經(jīng)適應(yīng)了該宿主細(xì)胞。為了制備CEF細(xì)胞，我們需要將11天齡的胚胎從孵化的雞蛋中分離出來，去除末端，把雞胚切成小塊，慢慢地溶解在含有25％胰島素的溶液中，在室溫下放置2小時。最終的細(xì)胞懸浮液用1倍體積的培養(yǎng)基I(MEM Eagle，例如可購自Gibco，Basle，Switerland；Order No.072-1500中所提到的)稀釋，培養(yǎng)基I包含5％的胎牛血清(FCS)，青霉素(100units/ml)，鏈霉素(100mg/ml)和2mM的谷氨酰胺，然后使用細(xì)胞篩過濾(例如，可購自Technomara AG，Zurich，Switzerland，Order No.Bellco 1985，150目)，然后使用臺式離心機(jī)在2000rpm、室溫下離心5分鐘使細(xì)胞沉淀(Hermle KG，D-7209 Gosheim，F(xiàn)RG)。細(xì)胞沉淀物占初始培養(yǎng)基I體積的1/4，使用這種方法得到的CEF細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿上分散開。他們繼續(xù)在培養(yǎng)基I中生長，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)所需的細(xì)胞密度培養(yǎng)1-2天，然后用來直接感染或者是經(jīng)過1-2個進(jìn)一步細(xì)胞傳代以后感染。原始培養(yǎng)物的制備在R.I.Freshney所寫的《動物細(xì)胞培養(yǎng)》中有清楚的描述(Alan R.Liss Verlag，New York ，第11章，99頁以后)。
我們研究的MVA突變體常規(guī)是在CEF細(xì)胞或者在倉鼠幼體的腎細(xì)胞BHK-21(美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC CCL-10)中繁殖的，所述細(xì)胞生長在含有最低含量必需物的培養(yǎng)基中(MEM)，其中含有10％的胎牛血清(FCS)。BHK-21細(xì)胞保存在含有5％CO2的潮濕空氣中，溫度保持在37℃。
病毒感染使用以下的方法。細(xì)胞在175cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。在細(xì)胞有80-90％匯合的時候除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于MVA病毒的磷酸緩沖液(PBS/Dulbecco，例如Animed AG，Muttenz，Switzerland，Order No.23.100.10)懸浮液(每個細(xì)胞含0.01的感染粒子(＝pfu)，0.01ml/cm2)中孵育1個小時。然后加入培養(yǎng)基(0.2ml/cm2)，將培養(yǎng)瓶置于37℃條件下孵育2-3天，直到約80％的細(xì)胞已環(huán)繞。在進(jìn)行下一處理之前(純化等)，病毒的溶解產(chǎn)物與細(xì)胞和培養(yǎng)基一起在-30℃條件下儲存在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，而不經(jīng)處理。
1.2病毒的純化純化步驟是為了獲得盡可能純的與MVA和WR病毒(Joklik，Virology18，9-18 ；Zwartouw等，J.gen.Microbiol.29，523-529 )一致的病毒制備物，其中不含任何宿主細(xì)胞所特有的成分。被感染并保存在-30℃的條件下的細(xì)胞培養(yǎng)物先解凍，將塑料基板上的殘余細(xì)胞搖晃下來或刮下來，把細(xì)胞和病毒通過離心的方法(Sorvall離心機(jī)，GSA轉(zhuǎn)子，10℃、5000rpm、1小時)與培養(yǎng)基分離。將含有病毒和細(xì)胞的沉淀部分一次懸浮在PBS中(沉淀體積的10-20倍)，然后將懸浮液按照上面的方法再次離心。新的沉淀物溶解在10倍體積的RSB緩沖液中(10mM Tris-HCl pH 8.0，10mMKCl，1mM MgCl2)，然后將懸浮液進(jìn)行短暫的超聲處理(Labsonic 1510帶有一個直徑4毫米的探頭，購自Bender and Hobein，Zürich，Switzerland；在60W、室溫下進(jìn)行2×10秒)以破碎剩余的完整細(xì)胞使得病毒粒子從細(xì)胞膜內(nèi)釋放出來。細(xì)胞核和較大的細(xì)胞碎片可以通過隨后短暫的離心除去(Sorvall GSA轉(zhuǎn)子，購自杜邦公司，D-6353Bad Nauheim，F(xiàn)RG；3000rpm、10℃離心3分鐘)。沉淀物再次懸浮在上述的RSB緩沖液中，按上述方法進(jìn)行超聲和離心。所收集到的含有游離的病毒粒子上清液被合并，然后使用10ml含有35％蔗糖的10mM Tris-HCl pH 8.0將其分層，隨后使用KontronTST 28.38/17轉(zhuǎn)子(Kontron Instrumente，Zurish，Switzerland；相當(dāng)于Beckman SW27轉(zhuǎn)子)在10℃14,000rpm下離心90分鐘。將上清液丟棄，含有病毒粒子的沉淀放入10ml，pH 8.0的10mM Tris-HCl緩沖液中，然后進(jìn)行短暫的超聲處理使微粒分布均勻(室溫下進(jìn)行2×10秒，使用上述的裝置)，使用分級梯度的方法進(jìn)行進(jìn)一步的純化過程。各級梯度分別包括含有蔗糖的5ml、pH 8.0的10mM Tris-HCl(蔗糖的濃度梯度為20％、25％、30％、35％和40％)。該梯度使用Kontron TST 28.38/17轉(zhuǎn)子在10℃下、14,000rpm下離心35分鐘。離心以后在30％和40％蔗糖區(qū)域之間可以看到幾條分散的含有病毒粒子的條帶。將這個區(qū)域從梯度中虹吸出來(10ml)，蔗糖溶液用PBS緩沖液(20ml)稀釋，然后離心將病毒沉淀出來(Kontron TST 28.38/17轉(zhuǎn)子在10℃、14,000rpm下離心35分鐘)。該沉淀這時主要含有純的病毒粒子，將它放入PBS中，使得病毒的平均濃度達(dá)到(1～5)×109pfu/ml。純化的病毒貯液可以直接使用或者按照隨后試驗(yàn)的要求用PBS稀釋。
2.MVA病毒突變體的構(gòu)建和鑒定2.1K1L缺失質(zhì)粒的構(gòu)建為了從MVA基因上去除掉剩余的263bp的K1L序列和MVA ORF022L的啟動子序列(全部去除的序列包括MVA基因組中從20719到21169的區(qū)域，Antoine，G.，F(xiàn).Scheiflinger，F(xiàn).Dorner and F.G.Falkner，1998，Virology 244365-396)，發(fā)明人構(gòu)建了缺失的質(zhì)粒pIInewLZ-gpt-delpUCII-LZ(14)的側(cè)鏈l，以前被用于MVA基因的缺失區(qū)II的位點(diǎn)的同源重組的質(zhì)粒由不含K1L基因序列并且已經(jīng)通過PCR方法從MVA基因組的DNA中分離出來的新的側(cè)鏈(K2L)代替，所用的引物是IIflnewA5’CAG CTG CAG CGG CCG CCTTAC ACC GTA CCC 3’(SEQ ID NO1)，和IIflnewB5’CAG GCA TGC GTAGAA CGT AGA TCC GG 3’(SEQ ID NO2)。另外，N2L開放閱讀框架(ORF)的5’區(qū)域有一個315bp的重復(fù)序列(也使用PCR的方法分離，使用引物delIIA5’CAG CTG CAG CCA TAA TGG TCA ATC GCC 3’(SEQ ID NO3)和delIIB5’CAG GCG GCC GCG GTA TTC GAT GAT TAT TTT TAA CAAAAT AAC 3’(SEQ ID NO4))，被插入到LacZ-gpt-序列組件的下游，形成了pIInewLZ-gpt-del，并且允許通過N2L基因序列的同源重組去除標(biāo)記序列組件。
2.2MVA突變體的形成MVA(IInew)通過pIInewLZ-gpt-del基因轉(zhuǎn)染到感染了MVA(F6的獨(dú)立克隆)的原雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)而獲得，接下來使用前面所述的在霉酚酸存在的條件下篩選有β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的病毒(7)。篩選到重組的MVA以后，選擇壓力被除去并且分離沒有標(biāo)記物的病毒(圖1B)。
3.重組MVA病毒的產(chǎn)生3.1質(zhì)粒載體的構(gòu)建另外，為了排除在MVA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中存在的MVA重復(fù)序列和MVA基因組序列之間的同源重組的可能性，我們設(shè)計了一個新的質(zhì)粒pIIIΔHR，該質(zhì)粒包含K1L標(biāo)記序列組件，其兩側(cè)與兩個從lacZ基因衍生而來的短的216bp重復(fù)序列連接。
K1L標(biāo)記序列組件，即在其真正的啟動子的控制轉(zhuǎn)錄下的K1L編碼全序列，可以用來自Western Reserve牛痘病毒(由B.Moss博士提供，LVDNIH，Bethesda MD，USA)的基因組DNA中的一段1100-bp的DNA片段，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，所使用的寡聚核苷酸K1L-5’-3CAG CAGCCC GGGTGCGAT AGC CAT GTA TCT ACT AAT CAG(SEQ ID NO5)和K1L-3’-1CAGCAGCCC GGGGGA AAT CTA TCT TAT ATA CAC(SEQ ID NO6)(限制性內(nèi)切酶SmaI的酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)。
在兩側(cè)帶有正向重復(fù)序列的K1L標(biāo)記序列組件從pΔK1L中切下來，如前面描述過的(12)，并插入到pIIIdHR中，取代K1L標(biāo)記和側(cè)鏈I的重復(fù)序列以產(chǎn)生pIIIΔHR(圖1C)。MVA重組病毒的最終基因組現(xiàn)在將包含目標(biāo)基因序列和LacZ的基因片段。插入額外的外源DNA可能會導(dǎo)致載體病毒的不太“干凈”，然而該惰性序列可能會充當(dāng)一個普通的基因標(biāo)記，便于對重組MVA的識別。
3.2重組MVA的形成和分離最后，這些變化變化在感染/轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中對重組效率的影響被檢測。CEF細(xì)胞被MVA(F6)或者M(jìn)VA(IInew)感染，然后被pIIIdHR-gfp或者pIIIΔHR-gfp轉(zhuǎn)染。48小時以后收集樣品，然后用等分試樣來感染單層RK13細(xì)胞。三天以后收集全部感染的單層細(xì)胞，將材料在RK13細(xì)胞進(jìn)行二次傳代。感染三天以后可見的/gfp熒光細(xì)胞聚集體的數(shù)目可以通過紫外/可見光顯微鏡來確定。然后發(fā)明人通過這個數(shù)據(jù)計算出正確重組結(jié)果的百分?jǐn)?shù)，即，插入到MVA中的K1L標(biāo)記序列組件和gfp基因(Table 1)。使用發(fā)明人所提出的常規(guī)的選擇系統(tǒng)(MVA(F6)和pIIIdHR-gfp)，他們發(fā)現(xiàn)在第二次RK13傳代后全部轉(zhuǎn)化灶重組的30.5％為K1L和gfp。從MVA基因組中去除殘余的K1L序列可以略微提高正確的重組(45％，MVA(IInew)和pIIIdHR-gfp)。然而，從MVA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上去除側(cè)鏈I重復(fù)序列會引起預(yù)期的重組結(jié)果明顯的增加(71％)甚至使用含有殘余的K1L序列的MVA。發(fā)明人使用新的MVA和gfp-轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(MVA(IInew)和pIIIΔHR-gfp)實(shí)際上獲得了達(dá)100％的效率。在平板稀釋和確定轉(zhuǎn)化灶的數(shù)目以前，首先進(jìn)行RK13的第一次“盲”傳代，因?yàn)槲覀冇^察到當(dāng)計算在RK13第一代中GFP陽性細(xì)胞時，所得結(jié)果顯示過高正確重組的結(jié)果，然而當(dāng)進(jìn)入下一次傳代時，大約一半這些分離的病毒不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化灶的GFP-陽性病毒。觀察到的這個現(xiàn)象可能是因?yàn)椴环€(wěn)定的單一重組的情況和/或來自攜帶質(zhì)粒DNA的短暫gfp表達(dá)。
總結(jié)起來發(fā)明人可以通過以下手段可以大大的提高基于K1L的選擇技術(shù)(i)去除MVA基因組中殘留的K1L序列(ii)設(shè)計新的MVA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其攜帶同源的非MVA序列以使短暫的標(biāo)記基因缺失。雖然程度不同，但是每種方法獨(dú)立使用都可以提高預(yù)期的重組病毒的產(chǎn)生。不含有K1L序列的MVA主干病毒和改造過的MVA載體質(zhì)粒結(jié)合使用可以實(shí)現(xiàn)非常高效的選擇，并且可以使基因準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)移到目標(biāo)基因組的位點(diǎn)上，而且可以幾乎將MVA重組病毒單獨(dú)分離。
4.產(chǎn)生/選擇rMVA的方法通過這種方法成功構(gòu)建了表達(dá)HCV-J細(xì)胞(基因型1b)中的非結(jié)構(gòu)3(nonstructural 3，NS3)上的開放閱讀框架(ORF)的重組MVA(rMVA)，這可以作為我們當(dāng)前以缺失內(nèi)在的K1L序列(MVA-IInew)的MVA親代病毒為基礎(chǔ)并且使用了同源的非MVA重復(fù)序列(LacZ)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒而產(chǎn)生rMVA這個新技術(shù)應(yīng)用的一個例子。最初，我們曾試圖使用Staib C.等在2000，Biotechniques 281137-1148所描述的方法，使用傳統(tǒng)的宿主細(xì)胞范圍選擇的方法制備可以表達(dá)HCV-J毒株(基因型1b)中HCV NS3基因(MVA-HCV/NS3)的rMVA。
包含HCV cDNA的質(zhì)粒來自一篇關(guān)于慢性肝炎的日本專利，并由日本京都大學(xué)的Kunitada Shimotohno博士(Kato等，1990，PNAS 879524-9528)提供，該質(zhì)粒用PCR擴(kuò)增被用來制備NS3基因(編碼HCV多肽的第1028-1658個氨基酸)，并且用于將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)品克隆到MVA的轉(zhuǎn)移載體pIII-dHR-P7.5中(圖2)。使用MVA(克隆分離的F6)感染單層的CEF細(xì)胞，然后使用pIII-dHR-P7.5-NS3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接下來使用K1L作為選擇標(biāo)記，用RK13細(xì)胞進(jìn)行幾步噬斑純化(plaque purification)步驟，我們沒有獲得真正的重組病毒。我們分離了穩(wěn)定結(jié)合在MVA基因組缺失區(qū)3(del3)位點(diǎn)的只帶有K1L序列的rMVA，或者是根本不能獲得穩(wěn)定生長病毒后代的rMVA。作為一種補(bǔ)救措施，我們決定使用我們改造的新的K1L篩選技術(shù)，把NS3基因序列重新克隆到新的MVA載體質(zhì)粒pIII-ΔHR-P7.5中，然后通過同源重組，使用改進(jìn)的不含有K1L的分離MVA IInew作為用于整合該表達(dá)序列組件的受體病毒。事實(shí)上，通過這種策略上的改變，我們可以只經(jīng)過幾步噬斑純化的過程，就產(chǎn)生并且分離出我們所要的重組病毒MVA-HCV/NS3。圖3描述了通過PCR分析(左圖)所得的rMVA病毒在體外的特性，檢測到NS3的ORF已經(jīng)準(zhǔn)確的插入到了MVA基因組的del3位點(diǎn)，并且已經(jīng)完全去除了K1L選擇標(biāo)記序列組件。而且，從Western印跡分析能夠證明這種新形成的MVA-HCV/NS3可以在感染的CEF細(xì)胞中正確地產(chǎn)生NS3多肽(圖3，右圖)。MVA-HCV/NS3目前已經(jīng)被評價為一種很有前途的可供選用的病毒載體，用于預(yù)防和/或治療人類感染HCV的疫苗的研發(fā)。因此，在本專利申請中描述的我們改進(jìn)的方法，已經(jīng)使我們獲得了一種您的重要的rMVA載體構(gòu)建體，如果使用標(biāo)準(zhǔn)的方法，這將會很繁瑣甚至是不可能的。
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表1使用傳統(tǒng)的與使用新的MVA和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒方法的重組效率計算gfp-表達(dá)的轉(zhuǎn)化灶*占光學(xué)顯微鏡下可見所有轉(zhuǎn)化灶**的百分比。括號中的數(shù)字表示的是每個樣品的兩個不同的10倍稀釋液中轉(zhuǎn)化灶的實(shí)際數(shù)值，并且每個樣品作了三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.一種MVA突變體，其中在MVA基因組中的K1L基因序列和它的啟動子序列或所述序列的功能部分優(yōu)選已經(jīng)通過缺失或突變的方法而失活。
2.一種由權(quán)利要求1中所述的MVA感染的宿主細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的真核細(xì)胞是雞成纖維細(xì)胞、鵪鶉成纖維細(xì)胞、QT-9細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、BS-C-1細(xì)胞、MA104細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、B-細(xì)胞或人的原代細(xì)胞(例如，原代成纖維細(xì)胞、樹突細(xì)胞)。
5.一種DNA-載體構(gòu)建體，包括編碼牛痘病毒(VV)K1L基因或功能等價基因的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中該構(gòu)建體進(jìn)一步包括編碼外源蛋白質(zhì)或其功能部分的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中外源蛋白質(zhì)是一種來源于包括治療性多肽和病原體的多肽以及它們中的功能部分所組成的組中的異源蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中治療性多肽來源于包括分泌蛋白質(zhì)，例如抗體多肽、趨化因子、細(xì)胞因子或是干擾素所組成的組中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中所述的病原體來源于病毒、細(xì)菌、原生動物和寄生蟲，以及腫瘤細(xì)胞或與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原和它們的功能部分所組成的組中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中病毒選自流感病毒、麻疹和呼吸道合胞體病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒、人類肝炎病毒、皰疹病毒或乳頭狀瘤病毒所組成的組中。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中原生動物是惡性瘧原蟲。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中細(xì)菌是引起肺結(jié)核的分枝桿菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原選自與黑色素瘤相關(guān)的分化抗原，例如絡(luò)氨酸酶、絡(luò)氨酸酶相關(guān)的蛋白質(zhì)1和2；癌癥檢測抗原，例如MAGE-1，-2，-3和BAGE；和在腫瘤上過度表達(dá)的未突變的共享抗體，例如Her-2/neu、MUC-1和p53。
14.根據(jù)權(quán)利要求6～13任意一項(xiàng)所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中牛痘病毒K1L和外源蛋白質(zhì)的編碼區(qū)均在兩側(cè)連接有DNA序列，該DNA序列側(cè)面連接在MVA基因組中非必需位點(diǎn)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中非必需位點(diǎn)是MVA基因組中的缺失III的位點(diǎn)，MVA基因組中設(shè)計的K1L缺失的位點(diǎn)或根據(jù)權(quán)利要求1突變的MVA基因組上的任何非必需位點(diǎn)。
16.前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA-載體構(gòu)建體，其中該載體包括以下功能連接的組件-K1L標(biāo)記基因，包括牛痘病毒的K1L編碼序列和轉(zhuǎn)錄單元，優(yōu)選包括其真正的啟動子的轉(zhuǎn)錄控制序列，-兩個DNA序列，連接在K1L標(biāo)記基因的兩側(cè)，以通過同源重組隨后從重組的MVA上除去該標(biāo)記，優(yōu)選兩個相同的無活性的(例如，來自大腸桿菌的lacZ)DNA片斷，-克隆位點(diǎn)，優(yōu)選為多克隆位點(diǎn)，異源基因可以任意地插入該位點(diǎn)；-用于牛痘病毒的特異性轉(zhuǎn)錄的啟動子，優(yōu)選來自牛痘病毒的啟動子，或可以使牛痘病毒特異性轉(zhuǎn)錄的異源痘病毒的啟動子，或可以使牛痘病毒特異性轉(zhuǎn)錄的合成的啟動子；所述組件側(cè)面連接有兩個MVA-DNA序列，這些序列對于外源基因靶向插入到以下位點(diǎn)是必需的，所述位點(diǎn)包括根據(jù)權(quán)利要求1突變的MVA基因組中的任何非必需位點(diǎn)、MVA基因組中的缺失III的位點(diǎn)、或MVA基因組中設(shè)計的K1L缺失的位點(diǎn)。
17.根據(jù)權(quán)利要求5～16中任意一項(xiàng)所述的DNA-載體構(gòu)建體是質(zhì)粒。
18.產(chǎn)生重組MVA的方法，包括以下步驟-用根據(jù)權(quán)利要求1的MVA突變體或野生型MVA感染MVA的宿主細(xì)胞；-用根據(jù)權(quán)利要求5～17中任意一項(xiàng)的DNA-載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染該宿主細(xì)胞；和-通過在兔腎PK-13細(xì)胞中，或在任何其它本質(zhì)上要求K1L基因功能，以使MVA或是權(quán)利要求1的MVA突變體能生產(chǎn)性生長的細(xì)胞類型中進(jìn)行生長，來篩選恢復(fù)的MVA。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于產(chǎn)生重組的MVA病毒的MVA突變體，以及被這些突變的MVA病毒感染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及DNA－載體構(gòu)建體，以及利用這些突變的MVA病毒和DNA－載體構(gòu)建體產(chǎn)生重組MVA的方法。
文檔編號C12N15/86GK1723285SQ200480001849
公開日2006年1月18日 申請日期2004年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月18日
發(fā)明者卡羅琳·斯泰伯, 瑪麗亞納·洛維爾, 沃克·愛爾福勒, 歌德·薩特爾 申請人:蓋斯福研究中心健康和環(huán)境有限公司