專利名稱：爪哇根結線蟲分子檢測引物及其用法的制作方法
本申請為申請日2003年7月28日，申請號03131763.4，名稱一種根結線蟲快速分子檢測引物及其用法的分案申請。
技術領域：
本發明爪哇根結線蟲分子檢測引物及其用法，專用于南方、爪哇和花生根結線蟲快速分子檢測和鑒定，屬于農作物病害防治和植物檢疫技術的領域。
二、技術背景根結線蟲(Meloidogyne spp.)屬植物根系專性內寄生物，是世界性分布的威脅農業生產的主要病原物和世界各國的植物檢疫對象。迄今已記載的根結線蟲有約70種，其中南方根結線蟲(M.incognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)和花生根結線蟲(M.arenaria)因其廣分布性和多寄主性是最重要的種類(Jepson S B.Identification ofroot-knot nematodes.CAB InternationalWallingford，1987，256 pp.；Sasser J N，Carter CC.Overview of the international Melodogyne project 1975-1984.InSasser J N，Carter CC，eds.An Advance Treatise on Meloidogyne.vol.1.Biology and Control.NorthCarolina State University GraphicsRaleigh，1985，19-24.)。在中國，這三種根結線蟲在大多數省(區)均有發生，侵染農作物達百種以上，致使寄主常年減產15-25％，有時達70％以上(徐建華等.江蘇省大棚蔬菜寄生線蟲的種類和發生.南京農業大學學報，1994，1747-51.)，嚴重地制約了大棚蔬菜、果樹、花卉等作物的生產和出口創匯。據估計，我國農作物的生產每年因根結線蟲的為害而遭受的經濟損失達數億元以上。
控制根結線蟲病發生的主要途徑有使用化學殺線蟲劑、選種抗病作物品種、實施輪作、建立無病種苗生產基地和對進出口農作物進行嚴格的檢疫。化學殺線蟲劑雖防效顯著，但因潛在的環境污染問題其使用范圍已受到嚴格的限制；作物抗性的利用在蔬菜作物根結線蟲病的治理上已得到廣泛和有效的應用(Roberts P A.Current status of the availability，development and use of host plant resistance tonematodes.J.Nematol.，1992，24213-227.)；無病種苗生產基地的建設對于無病區農作物，尤其是果樹等多年生木本作物根結線蟲病的防治至關重要；至于植物檢疫，不僅可及時堵截國外根結線蟲群體的傳入，而且也是確保國內經濟作物安全出口的必要手段。由于主要根結線蟲種類間存在顯著的致病性差異，上述非化學性防治方法的成功應用依賴于對目標區域和對象上發生的根結線蟲種類進行快速而準確的檢測和診斷。
根結線蟲的種類鑒定傳統上依據蟲體的形態特征或同工酶譜(Jepson S B.Identification of root-knot nematodes.CAB InternationalWallingford，1987，256 pp.；Esbenshade P R，Triantaphyllou A C.Isozyme phenotypes for the identification ofMeloidogyne species.J.Nematol.，1990，2210-15.)。但兩種鑒定法均需要適宜雌蟲的存在，因而不適用于生產上多數情況下出現的土壤樣本中幼蟲的檢測和診斷，而且形態鑒定法因雌蟲形態的種間近似性和種內變異性也常常不可靠。
為了克服形態和同工酶鑒定法的局限性，國際上自90年代興起了根結線蟲種類分子鑒定的研究。針對南方、爪哇、花生根結線蟲等主要種類，最初的研究集中于基于分子雜交的線蟲基因組限制性片段長度多態性(RFLP)分析(Piotte C et al.Molecular characterization of species and populations of Meloidogyne from variousgeographic origins with repeated-DNA homologous probes.Funda.Appl.Nematol.，1992，15271-276.)，但RFLP鑒定法不僅程序冗長繁瑣，而且需要相對多量的高質量線蟲DNA，顯然不適用于田間線蟲樣本的日常診斷和檢測。之后的研究均采用基于PCR的DNA分析法，包括對線蟲基因組進行隨機擴增的隨機擴增多態性DNA(RAPD)指紋法(Castagnone-Sereno P et al.Genetic polymorphism between and withinMeloidogyne species detected with RAPD markers.Genome，1994，37904-909.；Cenis JL.Identification of four major Meloidogyne spp.by random amplified polymorphic DNA(RAPD-PCR).Phytopathology，1993，8376-80.)，對線蟲基因組線粒體DNA(mtDNA)進行特異擴增的PCR-RFLP分析法(Powers T O，Harris T S.A polymerase chainreaction method for identification of five major Meloidogyne species.J.Nematol.，1993，251-6.；Stanton J et al.Nucleotide polymorphisms and an improved PCR-based mtDNAdiagnostic for parthenogenetic root-knot nematodes(Meloidogyne spp.).Funda.Appl.Nematol.，1997，20261-268.)，和通過將RAPD標記轉化為序列確定擴增區域(SCAR)標記的SCAR標記鑒定法(Zijlstra C et al.Identification of Meloidogyneincognita，M.javanica and M.arenaria using sequence characterized amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology，2000，2847-853.)。但目前這些已研制的南方、爪哇和花生根結線蟲的分子鑒定法都存在著一定的缺陷。RAPD指紋法因使用短PCR引物而試驗結果不穩定可靠；mtDNA-PCR-RFLP分析法雖結果可靠且靈敏度較高，但該方法需對PCR擴增產物用多種限制性內切酶進行酶切而使得診斷時間過長和費用昂貴；而已有的SCAR標記鑒定法則檢測靈敏度只達1-10ng純化的DNA，不能對生產上常見的土壤樣本中的幼蟲直接進行鑒定。
發明內容
技術問題本發明的目的是克服已有根結線蟲分子鑒定法存在的缺陷，提供結果可靠、易于操作、靈敏度高的南方、爪哇和花生根結線蟲的檢測和診斷方法。該方法可以試劑盒的形式直接應用于生產實踐，對于應用作物抗性、植物檢疫、無病種苗生產基地的建設等手段治理我國農作物根結線蟲病的發生，以及確保我國蔬菜、果樹、花卉等經濟作物的安全出口無疑具有切實重要的意義。
技術方案一種根結線蟲快速分子檢測引物，包括南方、爪哇和花生根結線蟲高效特異擴增PCR引物三對，即MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R，其引物及其序列為MI-F5’-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3’；MI-R5’-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3’；MJ-F5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’；MJ-R5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’；MT-R5’-CAAGACCCAATGGCCATAGG-3’其中MI-F/R引物對在南方根結線蟲群體上特異性地擴增出955bp的產物；MJ-F/R引物對在爪哇根結線蟲群體上特異性地擴增出517bp的產物；MI-F/MT-R引物對在南方、爪哇和花生根結線蟲群體上特異性地擴增出799bp的產物。
上述根結線蟲快速分子檢測引物的用法，包括在大量根結線蟲存在時，采用Miniprep DNA提取法提取線蟲的DNA，按如下的PCR反應體系和條件分別用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物對對線蟲樣本進行PCR擴增，PCR反應體系12.5μl，包括5ng模板DNA，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR緩沖液(含2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶；PCR條件為預變性94℃4min；35循環的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及終延伸72℃10min；然后將5μl PCR產物用1.5％(重量/體積，下文同)瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果；或者在單條根結線蟲的條件下，用于土樣和根樣中南方、爪哇和花生根結線蟲的快速檢測和鑒定對于根樣，在解剖鏡下用解剖針自根結部位解剖出雌蟲或雄蟲；對于土樣，用50％蔗糖液離心快速分離土壤中線蟲，在解剖鏡下用挑針挑取疑似的根結線蟲二齡幼蟲或雄蟲。將單條的幼蟲、雌蟲或雄蟲置于載玻片上6μl的含有10mMTris-HCl，pH 8.0，100μg/ml蛋白酶K的裂解液中，用細鋼針壓碎，然后將線蟲裂解液吸入200μl的PCR薄壁管中在-80℃放置30min，冷凍后的線蟲裂解液經60℃1h，95℃15min處理后作為線蟲DNA模板直接用于PCR擴增；用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物對分別對2μl的線蟲裂解液進行PCR擴增，PCR反應體系12.5μl，包括2μl的線蟲裂解液，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR緩沖液(含2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶；PCR條件為預變性94℃4min；40循環的94℃30s，62℃30s和72℃45s；以及終延伸72℃10min。
然后將5μl PCR產物用1.5％瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果。
本發明的關鍵技術是南方、爪哇和花生根結線蟲高效特異擴增的序列確定擴增區域(sequence characterized amplified region，SCAR)PCR引物。為了設計這些SCAR引物，應用隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術對源于國內外的南方、爪哇、花生、北方(M.hapla)和象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)群體的基因組差異進行了分析。篩選得到南方根結線蟲特異性的RAPD片段4個，分別為OPF-01600、OPF-01800、OPG-11740和OP26-011200；以及爪哇根結線蟲特異性的RAPD片段3個，分別為OPF-12600、OPG-18850和OP26-12690。對這些RAPD標記分別進行回收、克隆后測定了它們的DNA序列。在RAPD片段序列的基礎上設計了多對SCAR PCR引物，經對國內外的21個南方根結線蟲群體、9個爪哇根結線蟲群體、8個花生根結線蟲群體、4個北方根結線蟲群體和1個象耳豆根結線蟲群體進行特異性測試后確定了3對高效擴增的SCAR引物，即MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R，它們組合使用可正確地鑒定南方、爪哇和花生根結線蟲其中MI-F/MI-R引物對在南方根結線蟲群體上特異性地擴增出955bp的產物；MJ-F/R引物對在爪哇根結線蟲群體上特異性地擴增出517bp的產物；MI-F/MT-R引物對在南方、爪哇和花生根結線蟲群體上特異性地擴增出799bp的產物。三對PCR引物的擴增靈敏度達到1/3條的二齡幼蟲、雄蟲或雌蟲。這表明這些引物可被用于生產實踐中土樣和根樣中三種主要根結線蟲的快速可靠的檢測和鑒定。
有益效果本發明方法適用于土樣和根樣中南方、爪哇和花生根結線蟲的快速可靠的檢測和鑒定，檢測靈敏度達1/3條二齡幼蟲、雄蟲或雌蟲，對于集約化農業生產領域和植物檢疫領域中根結線蟲病害的防治和檢疫措施的有效實施具有重要的實用價值。與國外現有其他方法相比，本發明具有以下的技術優勢1.結果可靠本發明方法已經對源于中國、泰國、伊朗、澳大利亞、荷蘭、比利時、意大利、波蘭和美國的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根結線蟲的43個群體進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證。
2.操作簡便快速應用本發明方法，對線蟲樣本進行簡單處理、PCR擴增和常規的瓊脂糖電泳后即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切。一般整個檢測過程可在6小時內完成。
3.檢測靈敏度高本發明的SCAR引物的擴增靈敏度達到1/3條的南方、爪哇和花生根結線蟲的二齡幼蟲、雄蟲或雌蟲。因此本方法的實用性強，可滿足農作物種植前和植物檢疫過程中對三種根結線蟲快速可靠的檢測和鑒定的需要。
四
圖1引物MI-F/R對五種根結線蟲的不同群體的基因組DNA的PCR擴增。MDNA標記DL2000(Takara Biotech，大連，中國)；1-4南方根結線蟲群體；5-8爪哇根結線蟲群體；9-12花生根結線蟲群體；13-15北方根結線蟲群體；16象耳豆根結線蟲群體圖2引物MJ-F/R對五種根結線蟲的不同群體的基因組DNA的PCR擴增。MDNA標記DL2000(Takara Biotech，大連，中國)；1-4南方根結線蟲群體；5-8爪哇根結線蟲群體；9-12花生根結線蟲群體；13-15北方根結線蟲群體；16象耳豆根結線蟲群體圖3引物MI-F/MT-R對五種根結線蟲的不同群體的基因組DNA的PCR擴增。MDNA標記DL2000(Takara Biotech，大連，中國)；1-4南方根結線蟲群體；5-8爪哇根結線蟲群體；9-12花生根結線蟲群體；13-15北方根結線蟲群體；16象耳豆根結線蟲群體圖4引物MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R對單條二齡幼蟲的PCR擴增。MDNA標記DL2000(Takara Biotech，大連，中國)；1-3引物MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R分別對南方根結線蟲單條二齡幼蟲1/3裂解液的擴增；4-6引物MI-F/R、MJ-F/R和M1-F/MT-R分別對爪哇根結線蟲單條二齡幼蟲1/3裂解液的擴增；7-9引物MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R分別對花生根結線蟲單條二齡幼蟲1/3裂解液的擴增五具體實施方式
本發明的技術內容包括南方、爪哇和花生根結線蟲高效特異擴增SCAR PCR引物三對，即MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R，以及大量和單條根結線蟲的鑒定方法。
1.SCAR引物及其序列為MI-F 5’-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3’；MI-R 5’-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3’；MJ-F 5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’；MJ-R 5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’；MT-R 5’-CAAGACCCAATGGCCATAGG-3’三對引物組合使用可準確地鑒定南方、爪哇和花生根結線蟲其中MI-F/R引物對在南方根結線蟲群體上特異性地擴增出955bp的產物；MJ-F/R引物對在爪哇根結線蟲群體上特異性地擴增出517bp的產物；MI-F/MT-R引物對在南方、爪哇和花生根結線蟲群體上特異性地擴增出799bp的產物。
2.大量根結線蟲條件下的鑒定方法大量線蟲存在時可采用適當的方法(如Miniprep DNA提取法；Xu，J et al.Amolecular marker correlated with selected virulence against the tomato resistance gene Miin Meloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria.Phytopathology，2001，91377-382.)提取線蟲的DNA，按如下的PCR反應體系和條件分別用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物對對線蟲DNA樣本進行PCR擴增，然后將5μl PCR產物用1.5％瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果。PCR反應體系12.5μl，包括5ng模板DNA，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR緩沖液(包括2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶.PCR條件為預變性94℃4min；35循環的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及終延伸72℃10min。
3.單條根結線蟲條件下的鑒定方法該方法適用于土樣和根樣中南方、爪哇和花生根結線蟲的快速檢測和鑒定。對于根樣，在解剖鏡下用解剖針自根結部位解剖出雌蟲或雄蟲；對于土樣，用50％蔗糖液離心快速分離土壤中線蟲，在解剖鏡下用挑針挑取疑似的根結線蟲二齡幼蟲或雄蟲。將單條的幼蟲、雌蟲或雄蟲置于載玻片上6μl的裂解液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，100μg/ml蛋白酶K)中，用細鋼針壓碎，然后將線蟲裂解液吸入200μl的PCR薄壁管中在-80℃放置30min。冷凍后的線蟲裂解液經60℃1h，95℃15min處理后作為線蟲DNA模板直接用于PCR擴增。用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物對分別對2μl的線蟲裂解液(1/3單條線蟲量)進行PCR擴增，然后將5μl PCR產物用1.5％瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果。PCR反應體系12.5μl，包括2μl的線蟲裂解液，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR緩沖液(包括2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶。PCR條件為預變性94℃4min；40循環的94℃30s，62℃30s和72℃45s；以及終延伸72℃10min。
以上方法無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切，一般整個檢測過程可在6小時內完成。以下實施例用本發明方法已經對源于中國、泰國、伊朗、澳大利亞、荷蘭、比利時、意大利、波蘭和美國的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根結線蟲的43個群體進行了測試驗證，因此結果的可靠性具有充分的保證。
實施例1引物MI-F/R對南方根結線蟲的特異性擴增利用引物MI-F和MI-R對源于中國、泰國、伊朗、澳大利亞、荷蘭、比利時、意大利、波蘭和美國的南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)、北方(M.hapla)和象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)的43個群體的基因組DNA進行PCR擴增，結果只在南方根結線蟲群體上擴增出955bp的產物(表1；圖1)。PCR反應體系12.5μl，包括5ng線蟲DNA，0.4μM引物MI-F和MI-R，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR緩沖液(包括2mM MgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大連，中國)。PCR條件為預變性94℃4min；35循環的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及終延伸72℃10min。所用PCR儀為Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德國)。
實施例2引物MJ-F/R對爪哇根結線蟲的特異性擴增利用引物MJ-F和MJ-R對源于中國、泰國、伊朗、澳大利亞、荷蘭、比利時、意大利、波蘭和美國的南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)、北方(M.hapla)和象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)的43個群體的基因組DNA進行PCR擴增，結果只在爪哇根結線蟲群體上擴增出517bp的產物(表1；圖2)。PCR反應體系12.5μl，包括5ng線蟲DNA，0.4μM引物MJ-F和MJ-R，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR緩沖液(包括2mM MgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大連，中國)。PCR條件為預變性94℃4min；35循環的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及終延伸72℃10min。所用PCR儀為Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德國)。
實施例3引物MI-F/MT-R對南方、爪哇和花生根結線蟲的特異性擴增利用引物MI-F和MT-R對源于中國、泰國、伊朗、澳大利亞、荷蘭、比利時、意大利、波蘭和美國的南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)、北方(M.hapla)和象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)的43個群體的基因組DNA進行PCR擴增，結果在南方、爪哇和花生根結線蟲群體上擴增出779bp的產物，在北方和象耳豆根結線蟲群體上無擴增產物(表1；圖3)。PCR反應體系12.5μl，包括5ng線蟲DNA，0.4μM引物MI-F和MT-R，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR緩沖液(包括2mM MgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大連，中國)。PCR條件為預變性94℃4min；35循環的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及終延伸72℃10min。所用PCR儀為Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德國)。
實施例4利用引物MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R對南方、爪哇和花生根結線蟲的單條二齡幼蟲進行鑒定利用引物對MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R分別對南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)和花生根結線蟲(M.arenaria)的單條二齡幼蟲的1/3裂解液進行PCR擴增，結果引物MI-F/R只在南方根結線蟲上擴增出955bp的產物，引物MJ-F/R只在爪哇根結線蟲上擴增出517bp的產物，而引物MI-F/MT-R在南方、爪哇和花生根結線蟲上擴增出779bp產物(圖4)。PCR反應體系12.5μl，包括2μl二齡幼蟲(1/3單條幼蟲)裂解液，0.4μM各引物，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR緩沖液(包括2mMMgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大連，中國)。PCR條件為預變性94℃4min；40循環的94℃30s，62℃30s和72℃45s；以及終延伸72℃10min。所用PCR儀為Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德國)。
表1.SCAR引物對MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R對國內外南方、爪哇和花生根結線蟲群體的特異性擴增
權利要求
1.爪哇根結線蟲分子檢測引物，包括爪哇根結線蟲高效特異擴增PCR引物對MJ-F和MJ-R，其引物序列為MJ-F 5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’；MJ-R 5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’上述MJ-F和MJ-R引物對在爪哇根結線蟲群體上特異性地擴增出517bp的產物。
2.權利要求1所述爪哇根結線蟲分子檢測引物的用法，包括用于大量線蟲存在時的爪哇根結線蟲的檢測采用Miniprep DNA提取法提取線蟲的DNA，按如下的PCR反應體系和條件用MJ-F和MJ-R引物對線蟲樣本進行PCR擴增，PCR反應體系12.5μl，包括5ng模板DNA，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR緩沖液和1U Taq DNA聚合酶；PCR條件為預變性94℃ 4min；35循環的94℃ 30s，62℃ 30s和72℃ 30s；以及終延伸72℃ 10min；然后將5μl PCR產物用1.5％瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的有無和大小判定結果；或者用于在單條根結線蟲條件下的土樣和根樣中爪哇根結線蟲的檢測對于根樣，在解剖鏡下用解剖針自根結部位解剖出雌蟲或雄蟲；對于土樣，用50％蔗糖液離心快速分離土壤中線蟲，在解剖鏡下用挑針挑取疑似的根結線蟲二齡幼蟲或雄蟲；將單條的幼蟲、雌蟲或雄蟲置于載玻片上6μl的含有10mM Tris-HCl，pH8.0，100μg/ml蛋白酶K的裂解液中，用細鋼針壓碎，然后將線蟲裂解液吸入200μl的PCR薄壁管中在-80℃放置30min，冷凍后的線蟲裂解液經60℃ 1h，95℃ 15min處理后作為線蟲DNA模板直接用于PCR擴增；用MJ-F和MJ-R引物對2μl的線蟲裂解液進行PCR擴增，PCR反應體系12.5μl，包括2μl的線蟲裂解液，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR緩沖液和1U Taq DNA聚合酶；PCR條件為預變性94℃ 4min；40循環的94℃ 30s，62℃ 30s和72℃ 45s；以及終延伸72℃ 10min；然后將5μl PCR產物用1.5％瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的有無和大小判定結果。
全文摘要
本發明爪哇根結線蟲分子檢測引物及其用法，專用于南方、爪哇和花生根結線蟲快速分子檢測和鑒定，屬于農作物病害防治和植物檢疫技術的領域。設計了三對PCR引物，即MI－F/R、MJ－F/R和MI－F/MT－R，其分別在南方根結線蟲、爪哇根結線蟲以及南方、爪哇和花生根結線蟲群體上特異性地擴增出955bp、517bp和799bp的產物。三對引物的擴增靈敏度達到了1/3條二齡幼蟲、雄蟲或雌蟲。這表明這些引物可被用于生產實踐中土樣和根樣中三種主要根結線蟲的快速可靠的檢測和鑒定。附圖為引物MI－F/R、MJ－F/R和MI－F/MT－R分別對南方、爪哇和花生根結線蟲1/3條二齡幼蟲裂解液的PCR擴增產物電泳圖。
文檔編號C12Q1/68GK1661108SQ20041010422
公開日2005年8月31日 申請日期2003年7月28日 優先權日2003年7月28日
發明者徐建華, 孟慶鵬 申請人:南京農業大學