專利名稱：冬蟲夏草大規模發酵生產及菌粉加工工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以藏藥(藥食同源)提取液等為復合培養基的冬蟲夏草大規模發酵生產及菌粉加工工藝，是冬蟲夏草(Cordyceps Sinensis(Berk.)Sacc.)無性階段的發酵工藝，特別是以中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu etZeng，異名為冬蟲夏草真菌頭孢子菌屬菌種)為發酵菌種的大規模發酵生產及菌粉加工工藝。
背景技術：
冬蟲夏草系我國中藥三大寶之一，在防病治病、保健強身方面具有不可替代的作用。天然冬蟲夏草是冬蟲夏草真菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲體上而形成的蟲菌復合體，僅分布于我國青藏高原海拔3500-5000米之間的高山草甸和灌木叢中。其藥理藥效的不可替代作用、生態環境惡劣的特點和采挖難度大的特殊性等使其珍貴而稀少。隨著生活水平的不斷提高，人們對冬蟲夏草的需求量越來越大，而資源量卻越來越少，供求矛盾越來越突出。為了解決這一問題，近幾年，我國生物醫學界的研究人員先后分離出多株蟲草真菌菌株，試圖利用人工發酵方式生產蟲草菌絲體，用以代替天然冬蟲夏草。經過不懈的努力，有幾家已生產出在藥理、毒理及功效成份等方面與天然蟲草相似的產品。但還未達到與天然冬蟲夏草等同的目標。我們經過幾十年的探索，終于生產出在基因方面與天然冬蟲夏草等同，在有效成分方面全面達到或超過天然冬蟲夏草的冬蟲夏草菌粉。并能實現現代化條件下的大規模生產。
本發明的目的是發明一種藥效好、成本低、工藝簡單、菌絲體生長速度快、收率高的大規模發酵生產及菌粉加工工藝。具體有以下特點(1)以藏藥(藥食同源)提取液等復合培養基為條件，可促進冬蟲夏草真菌的生長，提高冬蟲夏草菌粉的質量，縮短冬蟲夏草真菌的發酵周期，比目前同類產品的發酵周期約少12天。
(2)收率高，比同類產品發酵工藝的收率高20％。
(3)成本低。比同類產品的成本低20％。
(4)自動化程度高。發酵過程的PH值、壓力系數、攪拌速率、溶氧量、發酵液濃度等均能在自動控制下進行。
(5)污染幾率降低，產量高。接種器先進，發酵設備無死角，污染率降到2％以下，產量比常規發酵技術有很大提高。
(6)本發明產品具有補肺腎、益精氣、抗病毒、抗腫瘤，對肺腎兩虛引起的咳嗽、氣喘、咯血、腰背酸痛等疾病和腫瘤、病毒性疾病有治療作用。
發明內容
本發明采用一種以藏藥提取液等為復合培養基的冬蟲夏草大規模發酵生產及菌粉加工工藝1、冬蟲夏草菌種的分離將天然新鮮的冬蟲夏草菌核洗凈，用無菌水多次沖洗，消毒，在無菌條件下，切去外皮，避開腸道，切取白凈組織為薄片，接于分離培養基表面，在5～15℃溫度下，靜止培養10天，白色菌絲即可從薄片上長出，將白色菌絲進一步分離純化，可得到冬蟲夏草菌種，此菌種經中國科學院微生物研究所(郭英蘭教授)鑒定為中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng，異名為冬蟲夏草真菌頭孢子菌屬菌種)，為真正的冬蟲夏草真菌菌種。
2、斜面培養基馬鈴薯30克，蛋白胨10克，奶粉10粉，黃豆粉3克，維生素10克，硫酸鎂0.5克，磷酸二氫鉀1克，瓊脂20克，水1000毫升，在15～18℃的溫度下培養30～40天。
3、搖瓶培養基馬鈴薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。
將上述成份混合，定容到一定體積，用氫氧化鈉或鹽酸調PH到7.3。然后分裝到容積為500毫升的三角瓶中，每瓶100毫升培養液，壓力0.5～1公斤/平方厘米，滅菌30分鐘。
在15～20℃往復式搖床上振蕩培養3天，往復式搖床振蕩頻率110次/分，振幅5厘米。
4、發酵生產(1)種子罐培養馬鈴薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。PH為6.8～7.4。
培養基制作方法同搖瓶。種子罐裝液量為總容積的70％，壓力0.5～1公斤/平方厘米，滅菌30分鐘。
在無菌條件下，將搖瓶種子液轉接入種子罐中，接種量1/10～1/20，培養溫度15±3℃，攪拌轉速150～200轉/分，通氣量1∶0.2～1，培養時間5～6天。
(2)發酵罐培養基馬鈴薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。PH為6.8～7.4。
發酵生產條件將菌液接種到大規模(50T以上)工業生產發酵罐中，接種量5％～20％，接種溫度為23±1℃。培養溫度采取分階段變溫控制方式發酵第1～2天為15±1℃，發酵第3～5天為18±1℃，發酵第6～7天為21±1℃)。通氣量1∶0.2～1(V∶V)，轉速每分鐘150～200轉，攪拌均勻，罐壓0.5～1公斤/平方厘米，連續發酵5～7天，開始發酵24小時后，每隔16小時取發酵液樣，測定PH值、還原糖及氨態氮。當PH值降至5.5～5.0，還原糖1％以下，氨態氮0.1％以下，鏡檢菌絲體已產生大量分生孢子時，就可出罐。冬蟲夏草大規模生產工藝流程圖見附圖15、菌粉加工工藝當四級深度發酵罐內的發酵液符合放罐質量標準時可出罐。本發明菌粉加工方法有如下幾種(1)將發酵物(菌絲體、發酵液)減壓濃縮，噴霧干燥得發酵粉。
(2)用板框過濾或離心方法，將發酵物中固、液分離，獲得菌絲體及濾液。再將菌絲體切片，在60℃以下干燥、粉碎成粉(A)。同時，將濾液減壓濃縮成浸膏，60℃以下干燥、粉碎成粉(B)。上述切片、干燥、粉碎、過篩、包裝等加工過程均在潔凈度為10萬級的凈化區進行，最后貼簽得到冬蟲夏草菌粉產品。該產品具有補肺腎、益精氣、抗病毒、抗腫瘤，對肺腎兩虛引起的咳嗽、氣喘、咯血、腰背酸痛等疾病和腫瘤、病毒性疾病有治療作用。
附圖1 冬蟲夏草大規模生產工藝流程圖附圖2 菌粉加工工藝流程圖具體實施方式
一種以藏藥提取液等為復合培養基的冬蟲夏草菌大規模發酵生產及菌粉加工工藝，其特征在于取新鮮冬蟲夏草蟲體，切成薄片，接于分離培養基表面，在15℃溫度下，靜止培養10天，白色菌絲即可從薄片上長出，將白色菌絲進一步分離純化，得到冬蟲夏草中國被毛孢菌株，置于培養基上培養。
1、斜面培養基馬鈴薯30克，蛋白胨10克，奶粉10粉，黃豆粉3克，維生素10克，硫酸鎂0.5克，磷酸二氫鉀1克，瓊脂20克，水1000毫升，在15-18℃的溫度下培養30～40天。
2、搖瓶培養基馬鈴薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。
將上述成份混合，定容到一定體積，用氫氧化鈉或鹽酸調PH到7.3。然后分裝到容積為500毫升的三角瓶中，每瓶100毫升培養液，壓力0.5～1公斤/平方厘米，滅菌30分鐘。
在15～20℃往復式搖床上振蕩培養3天，往復式搖床振蕩頻率110次/分，振幅5厘米。
3、發酵生產(1)種子罐培養馬鈴薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。PH為6.8～7.4。
種子罐培養基及種子罐培養條件培養基成份同搖瓶培養基，制作方法也相同。種子罐裝液量為總容積的70％，壓力1公斤/平方厘米，滅菌30分鐘。
在無菌條件下，將搖瓶種子液轉接入種子罐中，接種量1/10，培養溫度15±2℃，攪拌轉速160轉/分，通氣量1∶0.2～1，培養時間6天。經鏡檢無雜菌污染，可轉入發酵罐生產。
(2)發酵罐培養基馬鈴薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。PH為6.8～7.4。
將菌液接種到大規模(50T以上)工業生產發酵罐中，接種量5％～20％。培養溫度為15～21℃(分階段變溫控制，發酵第1～2天為16±1℃，發酵第3～5天為18±1℃，發酵第6～7天為21±1℃)。通氣量1∶0.2～1(V∶V)，轉速每分鐘150～200轉，攪拌均勻，罐壓0.5～1公斤/平方厘米，連續發酵5～7天，開始發酵24小時后，每隔16小時取發酵液樣，測定PH值、還原糖及氨態氮。當PH值降至5.5～5.0，還原糖1％以下，氨態氮0.1％以下，鏡檢菌絲體已產生大量分生孢子時，就可出罐。
5、菌粉加工工藝當四級深度發酵罐內的發酵液符合放罐質量標準時可出罐。本發明菌粉加工方法有2種(1)將發酵物(菌絲體、發酵液)減壓濃縮，噴霧干燥得發酵粉。
(2)用板框過濾或離心方法，將發酵物固、液分離，獲得菌絲體及濾液。再將菌絲體切片，在60℃以下干燥、粉碎成粉(A)。同時，將濾液減壓濃縮成浸膏，60℃以下干燥、粉碎成粉(B)。上述切片、干燥、粉碎、過篩、包裝等加工過程均在潔凈度為10萬級的凈化區進行，最后貼簽得到冬蟲夏草菌粉產品。
6、本發明產品通過各項檢測，在蟲草素、腺苷、蟲草多糖、甾醇、生物堿、總氮、各種氨基酸、微量元素等幾十種有效成份均超過了天然蟲草。在藥理作用上，具有補肺腎、益精氣、抗病毒、抗腫瘤，對肺腎兩虛引起的咳嗽、氣喘、咯血、腰背酸痛等疾病和腫瘤、病毒性疾病有治療作用，優于天然冬蟲夏草。
(1)DNA分子檢測采用本發明實施例所得的冬蟲夏草菌粉，經國家唯一的菌類鑒定部門——中科院微生物研究所(2004)微檢字第165號鑒定報告表明，青海月王青藏藥業有限責任公司送檢的冬蟲夏草發酵液，經DNA提取、擴增、測序，與天然冬蟲夏草DNA分子序列完全相同。充分證明我們的產品冬蟲夏草發酵液為天然冬蟲夏草菌種產品。
(2)本工藝所得冬蟲夏草菌絲體與天然蟲草中功效成份對比
(3)本工藝所得冬蟲夏草菌絲體與天然蟲草中微量元素對比
(4)本工藝冬蟲夏草菌絲體與天然蟲草在游離氨基酸和總氨基酸的比較
權利要求
1.一種以藏藥提取液等為復合培養基的冬蟲夏草大規模發酵生產工藝及其菌粉加工工藝，其特征在于從新鮮冬蟲夏草中分離出中國被毛孢菌株，將其置于斜面培養基上培養。1.1斜面培養基馬鈴薯30克，蛋白胨10克，奶粉10粉，黃豆粉3克，維生素10克，硫酸鎂0.5克，磷酸二氫鉀1克，瓊脂20克，水1000毫升，在15～18℃的溫度下培養30～40天。1.2搖瓶培養基馬鈴薯3～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。1.3種子罐培養基馬鈴薯3～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。PH為6.8～7.4。在無菌條件下，將搖瓶種子液轉接入種子罐中，接種量1/10～1/20，培養溫度15±3℃，攪拌轉速150～200轉/分，通氣量1∶0.2～1，培養時間5～7天。1.4發酵罐培養基馬鈴薯3～5％，黃豆粉0.5～2％，大黃提取液0.1～1％，紅景天提取液0.2～2％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。PH為6.8～7.4。發酵生產條件將菌液接種到大規模(50T以上)工業生產發酵罐中，接種量5％～20％，接種溫度為23±1℃。培養溫度采取分階段變溫控制方式發酵第1～2天為15±1℃，發酵第3～5天為18±1℃，發酵第6～7天為21±1℃)。通氣量1∶0.2-1(V∶V)，轉速每分鐘150～200轉，攪拌均勻，罐壓0.5～1公斤/平方厘米，連續發酵5～7天，開始發酵24小時后，每隔16小時取發酵液樣，測定PH值、還原糖及氨態氮。當PH值降至5.5～5.0，還原糖1％以下，氨態氮0.1％以下，鏡檢菌絲體已產生大量分生孢子時，就可出罐。1.5當深度發酵罐內的發酵液符合放罐質量標準時可出罐。本發明將發酵液加工成菌粉的方法有2種1.5.1將發酵物(菌絲體、發酵液)減壓濃縮，噴霧干燥得發酵粉。1.5.2用板框過濾或離心方法，將發酵物固、液分離，獲得菌絲體及濾液。再將菌絲切片，在60℃以下粉碎成粉(A)。同時，將濾液減壓濃縮成浸膏，60℃以下干燥、粉碎成粉(B)。上述切片、干燥、粉碎、過篩、包裝等加工過程均在潔凈度為10萬級的凈化區進行，最后貼簽得到冬蟲夏草菌粉產品。
2.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于搖瓶、種子罐、發酵罐培養基麩皮2～4％，馬鈴薯1～4％，蛋白胨0.5～2％，紅景天提取液0.4～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。
3.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于搖瓶、種子罐、發酵罐培養基馬鈴薯2～4％，茱芽蓼水解液0.4～2％，蛋白胨0.5～2％，人參果提取液0.2～1％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水。
全文摘要
本發明提供了一種冬蟲夏草大規模發酵生產及菌粉加工工藝。其特征在于以中國被毛孢菌株為發酵菌種，經斜面和搖瓶培養，采用馬鈴薯3～5％，黃豆粉0.5～2％，卓老沙僧(人參果)0.01～0.02％，山藥0.01～0.02％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氫二鉀、硫酸鎂少許，其余為水的培養基。相繼進入各級發酵罐全自動控制的發酵和菌粉加工工藝。發酵物收率比同類方法提高20％，發酵周期縮短12天，成本降低20％。污染率低于2％。經中科院微生物所DNA分子測序，發酵物與天然蟲草完全一致，蟲草素、腺苷、蟲草多糖、甾醇、生物堿、多種氨基酸和微量元素等有效成份均超過天然蟲草。藥理作用優于天然蟲草。
文檔編號C12N1/14GK1796539SQ200410101728
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月24日 優先權日2004年12月24日
發明者郝基榮, 李俊杰, 戴如琴, 湯風娣, 李廣群, 馬玉蓮, 王玉花 申請人:青海月王青藏藥業有限責任公司