專利名稱：新型重組腺病毒載體骨架質粒及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型重組腺病毒載體骨架質粒及其用途。
背景技術：
腺病毒載體是目前運用最廣的病毒載體之一，它被廣泛用于基因治療、基因功能性研究、反義治療、疫苗開發等領域。目前普遍使用的腺病毒包裝系統主要有兩種AdEasy系統和AdMax系統。其中，AdEasy系統由穿梭質粒、骨架質粒和原核細胞(BJ5183)組成，外源基因序列被構建入穿梭質粒后，通過與骨架質粒在原核細胞中完成病毒基因組重組來產生重組腺病毒。AdMax系統由含有loxP位點的穿梭質粒、骨架質粒和HEK-293細胞株組成，外源基因序列被構建入穿梭質粒后，通過與骨架質粒在HEK-293細胞中進行基因重組來產生重組腺病毒。
AdMax腺病毒系統是由腺病毒載體鼻祖Dr.Frank Graham在1999年創建的一套重組腺病毒構建系統，目前已被加拿大的Micobix公司開發成為一種腺病毒載體包裝系統。AdMax系統進行重組腺病毒包裝的基本原理是通過Cre-loxP或FLP-frt重組酶，使轉染進HEK-293細胞的穿梭質粒和骨架質粒發生定點重組，產生重組腺病毒，這樣得到的重組病毒是E1缺失的復制缺陷型腺病毒，病毒在不能夠提供E1區的細胞中只能實現外源基因的表達而本身不具備增殖能力。AdMax系統的特點是通過重組酶在真核細胞內完成重組出毒，高效且穩定，可以說，它是目前最方便快捷的腺病毒包裝系統之一。
與現在使用最普及的AdEasy系統相比，AdMax系統出毒更快，能夠高效率、簡便而快速地獲得重組腺病毒，并且病毒的產率(yielding)明顯提高。利用AdMax系統，只需要2～4周就能完成從質粒構建到重組出毒的全過程，成功率大于98％(其中95％的克隆含有目的基因)，因為重組出毒是在真核細胞內完成的，保持了對腺病毒的生存壓力，因此有助于保持重組腺病毒基因組的完整性；而AdEasy系統的出毒成功率只有18-34％(Stratagene公司新版的AdEasy XL系統成功率在94％左右)，而且在原核細胞(BJ5183)中完成病毒基因組重組，理論上，失去了生存壓力的腺病毒基因組更容易發生突變，病毒遺傳背景及活性可能會受到影響。
人類腺病毒家族有51個已知血清型，分為6個亞群A組、B組、C組、D組、E組和F組。現今最常用的腺病毒載體是Ad5，即血清型為5的腺病毒，屬于C亞群，AdEasy系統和AdMax系統包裝出的也都是Ad5。腺病毒的纖突結(fiber knob)介導病毒與細胞的吸附，除了B組腺病毒以外，其它各組腺病毒都用CAR(coxsackievirus-adenovirus receptors)作為其主要吸附受體(attachment receptor)，而B組腺病毒則用另外一種細胞受體CD46作為吸附受體(Gaggar，A.，et al.，Nature Medicine.2003)。依據組織親嗜性和與致病部位的相關性，B組腺病毒又進一步分為B1和B2亞組B1亞組感染呼吸道，B2亞組感染腎和尿道。Ad11p，Ad14，Ad35為B2亞組腺病毒；Ad3，Ad16，Ad21，Ad50為B1亞組腺病毒。CD46是一種廣泛表達的補體調節蛋白(complement regulatory protein)，這種蛋白幾乎存在于所有的人類體細胞表面。近年來，B組腺病毒的衍生體作為頗具吸引力的基因治療載體而受到關注，因為它們可以轉導造血干細胞、樹突狀細胞(DC細胞)和惡性腫瘤細胞等靶細胞，而這些細胞往往不易被常用的腺病毒載體(如Ad5)感染(Shayakhmetov，D.，et al.，Journal of Virology.2000)。
近年來，由于基因治療的需要，包括骨髓干細胞在內的的一系列人造血干細胞(Humanhematopoietic stemcells，HSCs)的轉染越來越受到重視。而此類細胞表面通常都缺乏CAR，是一類很難用傳統病毒載體，包括Ad5感染的細胞(Crooks，G.M.，and D.B.Kohn.，Blood.1993)。各個血清型的腺病毒間纖突結的核苷酸和氨基酸序列差別很大，通常認為正是這些差別導致了不同血清型的腺病毒所能識別受體的差異(Bailey，A.，et al.，Virology.1994)。因此，很多研究人員都在致力于帶有其他血清型腺病毒纖突結的Ad5嵌合體的構建，并已取得了一定的突破。Ad5F35腺病毒載體是一種“改外殼”的腺病毒雜合載體，即在5型腺病毒外殼的基礎上用35型腺病毒(Ad35)的纖突替代5型腺病毒的纖突。此重組病毒除了擁有35型腺病毒(Ad35)的纖突結外，其它外殼組成完全是5型腺病毒的外殼蛋白。有實驗表明，帶有綠色熒光蛋白(GFP)的Ad5F35感染CD34+細胞后，54％的細胞中表達了GFP；而用Ad5-GFP以同樣條件進行的平行實驗結果中，只有25％的CD34+細胞能夠表達GFP(Shayakhmetov，D.，et al.，Journal ofVirology.2000)。瑞典Lund大學的研究人員已經利用AdEasy系統的骨架質粒為基礎，對AdEasy系統進行改造，在骨架質粒中加入編碼Ad35的纖突柄、Ad35纖突結的DNA序列，就能夠實現利用AdEasy包裝嵌合型腺病毒載體的目的(Fan，X.，et al.，Gene Therapy.2000；Nilsson，M.，etal.，2003.Unpublished manuscript)。在穿梭質粒中插入編碼外源基因GFP的序列，就能夠利用改造過的AdEasy系統包裝出重組腺病毒Ad5F35-GFP，以Ad5-GFP為對照，轉染CD34+造血細胞。同樣條件下Ad5F35-GFP感染細胞數是Ad5-GFP的2～3倍；而被感染細胞中GFP的表達量則相差3～4倍(Nilsson M.，et al.，Molecular Therapy.2003)。
參考文獻文獻1.Gaggar，A.，Shayakhmetov，D.M.，and Lieber，A.CD46 is a cellular for group B adenoviruses.
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Molecular Therapy.2003；12；4C發明內容本發明提供了一種重組腺病毒載體骨架質粒pBHG-fiber5/35，利用這種骨架質粒，可以和AdMax系統含有loxP位點的穿梭質粒以及能夠提供腺病毒E1區的細胞(HEK-293細胞、911細胞或者PERC6細胞)共同組成一種新型重組腺病毒載體包裝系統。將外源基因克隆入含有loxP位點的穿梭質粒后，與本發明所述的腺病毒載體骨架質粒一起轉染細胞，就能夠包裝出帶有外源基因的Ad5F35，此重組Ad5F35是E1區缺失的復制缺陷型腺病毒，在不能夠提供E1區的細胞中只能實現外源基因的表達而本身不具備增殖能力。在本發明所述之骨架質粒的PacI單一酶切位點處也可以插入外源基因，帶有外源基因序列的pBHG-fiber5/35與含有loxP位點的穿梭質粒共轉染能夠提供腺病毒E1區的細胞，也可以包裝出能夠表達外源基因編碼蛋白質的重組Ad5F35型腺病毒。與現有的AdEasy系統、AdMax系統等腺病毒包裝系統中的骨架質粒相比，本發明所述的骨架質粒的優點在于第一，本發明中所述的骨架質粒可以和AdMax系統中含有loxP位點的穿梭質粒及細胞組合使用，進行重組腺病毒的包裝，從而使得已經將外源基因構建入原有AdMax系統穿梭質粒的用戶不必重新進行復雜的質粒構建，就可以應用由本發明所述的骨架質粒所構成的重組腺病毒載體包裝系統包裝出新型的Ad5F35重組腺病毒；第二，本發明中所述的重組腺病毒載體骨架質粒所構成的包裝系統具備AdMax系統出毒快、穩定性好、產率高的優點；第三，利用本發明中所述的骨架質粒，能夠包裝出帶有外源基因的Ad5F35型重組腺病毒，此類重組腺病毒能夠通過CD46來感染細胞，而CD46是一種廣泛表達的補體調節蛋白，這種蛋白幾乎存在于所有的人類體細胞表面，因此，利用本發明中所述骨架質粒所裝出的Ad5F35型重組腺病毒與AdMax系統包裝出的Ad5型重組腺病毒相比，所能夠感染的細胞種類明顯增加；第四，一些因為表面缺乏Ad5型腺病毒受體CAR而難以被現有AdEasy及AdMax系統包裝出的重組腺病毒所感染的細胞，如樹突狀細胞(DC細胞)、惡性腫瘤細胞，及CD34+的人外周血細胞和造血干細胞等靶細胞，均能夠被本發明中所述的重組腺病毒包裝系統所包裝出的Ad5F35型重組腺病毒感染，從而實現外源基因的轉入。
本發明所述之骨架質粒，是以pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒為材料，通過下述方法得到用AdEasy5/35為模板擴增得到fiber5/35序列，即編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結的基因序列，序列如序列表中SEQ ID No 2所示；用fiber5/35序列替換pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒上編碼Ad5纖突柄及纖突結的基因序列，如序列表中SEQ ID No 1所示序列，得到pBHG-fiber5/35。因此，在pBHG-fiber5/35質粒上，含有SV40AN位點和pIX基因，SV40AN位點和pIX基因之間含有Cre位點、HCMV IE立早啟動字、氨芐青霉素抗性基因和loxP位點。pBHG-fiber5/35與pBHGlox(delta)E1，3Cre相比，編碼腺病毒纖突柄及纖突結的基因發生了改變，而重組腺病毒包裝所需的其他元件并沒有發生變化。通過這種改造，使得pBHG-fiber5/35骨架質粒可以與帶有loxP位點的穿梭質粒配合起來進行重組腺病毒的包裝，而且包裝出的帶有外源基因的重組腺病毒不僅保留了AdMax系統出毒快、穩定性好、產率高等優點，而且感染細胞的范圍更廣、感染效率更高、外源基因表達量更多。
本發明所述之骨架質粒可以與具有loxP位點的穿梭質粒一起共轉染細胞，在細胞內發生病毒基因組同源重組，產生能夠表達外源基因的Ad5F35型重組腺病毒。
本發明所述之骨架質粒可以與具有loxP位點的穿梭質粒共轉染細胞，在細胞內發生病毒基因組同源重組，產生攜帶組織或腫瘤特異啟動元件的Ad5F35型重組腺病毒。
圖1.本發明公開的骨架質粒構建流程(1)將AdMax系統中的骨架質粒pBHGlox(delta)E1，3Cre用SpeI和XbaI進行雙酶切，保留酶切后得到的大片段；(2)將雙酶切得到的小片段即圖1中的片段I克隆入pBluescript II KS，得到中間質粒I；(3)用PacI和AflII雙酶切中間質粒I，保留酶切得到的大片段；(4)以AdEasy5/35為模板擴增得到兩端帶有PacI和AflII酶切位點的fiber5/35序列，即為圖1中所示的片段II；(5)將步驟(4)得到的fiber5/35序列即片段II連接入步驟(3)得到的大片段中，得到中間質粒II；(6)將步驟(5)得到的中間質粒II用SpeI和XbaI進行雙酶切，將得到的小片段與步驟(1)中保留的大片段連接，得到本發明中所述之骨架質粒pBHG-fiber5/35。與改造前的pBHGlox(delta)E1，3Cre質粒相比，在SpeI與XbaI兩個酶切位點間，編碼Ad5纖突柄及Ad5纖突結的基因序列(圖3B所示)被編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結的基因序列替換(圖3A所示)，其他序列沒有改變。
圖2.Microbix公司AdMax系統pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒結構示意圖此質粒上含有SV40AN位點和pIX基因，SV40AN位點和pIX基因之間含有Cre位點、HCMVIE立早啟動字、氨芐青霉素抗性基因和loxP位點，還具有如圖2所示的多個限制性內切酶的位點。
圖3.本發明公開的骨架質粒與pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒相比，SpeI與XbaI兩個酶切位點間序列的示意A顯示的是本發明公開的骨架質粒中SpeI與XbaI兩個酶切位點間序列的示意圖，在兩個酶切位點間包含Ad5尾部序列、Ad35纖突柄序列、Ad35纖突結序列、polyA序列、E4基因序列；
圖B顯示的是AdMax系統中未經改造的pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒，SpeI與XbaI兩個酶切位點間序列的示意圖，在兩個酶切位點間，包含Ad5尾部序列、Ad5纖突柄序列、Ad5纖突結序列、polyA序列、E4基因序列圖4.本發明公開的骨架質粒與帶有外源基因及loxP位點的穿梭質粒一起共轉染細胞，在細胞內發生病毒基因組同源重組，產生能夠表達外源基因的Ad5F35型重組腺病毒過程的示意圖通過Cre-loxP重組酶，轉染進HEK-293細胞的穿梭質粒和骨架質粒發生定點重組，7～10天后，產生帶有外源基因序列的重組腺病毒圖5.帶有編碼GFP的外源基因序列及loxP位點的穿梭質粒與本發明所述的骨架質粒共轉染HEK-293細胞后，產生能夠表達外源基因GFP的Ad5F35重組腺病毒圖A是在相差顯微鏡下觀察的結果，在圖的中心部分可以看到一個明顯的毒斑；圖B是同一視野在熒光顯微鏡下觀察的結果，可以看到毒斑及其周圍細胞中有能夠發出綠色熒光的GFP表達。
結果說明用帶有編碼外源基因序列及loxP位點的穿梭質粒與本發明所述的骨架質粒，以及能夠提供腺病毒E1區的細胞(本實施例中采用HEK-293細胞)所組成的新型重組腺病毒包裝系統能夠包裝出表達外源基因的Ad5F35重組腺病毒。
圖6.利用發明所述的系統包裝出的Ad5F35-GFP與Ad5-GFP感染CD34+造血干細胞的效率比較結果白色柱狀圖顯示的是在MOI分別為20、100、500時用Ad5-GFP感染CD34+造血干細胞后能夠表達GFP的細胞占總細胞量的百分比；黑色柱狀圖顯示的是在MOI分別為20、100、500時用Ad5F35-GFP感染CD34+造血干細胞后能夠表達GFP的細胞占總細胞量的百分比。***表示在t檢測中，p＜0.001。結果說明與Ad5相比，Ad5F35能夠攜帶外源基因高效感染CD34+造血干細胞，并實現外源基因在其中的表達。
圖7.帶有編碼人血管內皮細胞生長因子VEGF的外源基因序列及loxP位點的穿梭質粒與本發明所述的骨架質粒共轉染HEK-293細胞后，產生能夠表達外源基因VEGF的Ad5F35重組腺病毒結果可以看到，被病毒感染的細胞脹大、脫落、崩解，細胞間出現明顯的毒斑。
圖8.帶有編碼人血管內皮細胞生長因子VEGF的外源基因序列及loxP位點的穿梭質粒與本發明所述的骨架質粒共轉染HEK-293細胞后，產生能夠表達外源基因VEGF的Ad5F35重組腺病毒Ad5F35-VEGF，用此病毒感染CHO細胞，Western blot檢測被病毒感染的實驗組細胞及未被病毒感染的對照組細胞抽提液中VEGF表達情況結果可以看出，被Ad5F35-VEGF感染的A59細胞與未被感染的細胞相比，VEGF的表達量明顯增加。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步的描述，但本發明的內容并不只限于下列實施例所述的范圍。能夠與含有loxP位點的穿梭質粒及本發明所述的pBHG-fiber5/35質粒構成重組腺病毒包裝系統的細胞是能夠提供腺病毒E1區的細胞，下述實施例以HEK-293細胞為例進行說明，其它允許細胞也可以使用。
實施例1pBHG-fiber5/35質粒的構建過程以圖2所示的pBHGlox(delta)E1，3Cre質粒為材料，按照圖1所示的過程，構建本發明所公開的骨架質粒，步驟如下(1)將AdMax系統中的骨架質粒pBHGlox(delta)E1，3Cre用SpeI和XbaI進行雙酶切，保留酶切后得到的大片段；(2)將雙酶切得到的小片段即圖1中的片段I克隆入pBluescript II KS，得到中間質粒I；(3)用PacI和AflII雙酶切中間質粒I，保留酶切得到的大片段；(4)以AdEasy5/35為模板擴增得到兩端帶有PacI和AflII酶切位點的fiber5/35序列，即為圖1中所示的片段II；(5)將步驟(4)得到的fiber5/35序列即片段II連接入步驟(3)得到的大片段中，得到中間質粒II；(6)將步驟(5)得到的中間質粒II用SpeI和XbaI進行雙酶切，將得到的小片段與步驟(1)中保留的大片段連接，得到本發明中所述之骨架質粒pBHG-fiber5/35。與改造前的pBHGlox(delta)E1，3Cre質粒相比，在SpeI與XbaI兩個酶切位點間，編碼Ad5纖突柄及Ad5纖突結的基因序列(圖3B所示)被編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結的基因序列替換(圖3A所示)，其他序列沒有改變。
實施例2利用本發明所述的重組腺病毒載體骨架質粒pBHG-fiber5/35包裝出帶有外源基因的重組腺病毒下列操作均在無菌條件下進行，包裝出毒的原理如圖4所示1.將HEK-293細胞復蘇1.1取凍存于液氮中的HEK-293細胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細胞；1.4將重懸的細胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養過夜；2.HEK-293細胞的轉染2.1細胞培養至匯合度達到80％時，在轉染前2～6小時，給細胞換液，換上新鮮的含有10％FBS的DMEM；2.2用攜帶有外源基因序列且含有loxP位點的穿梭質粒和本發明所述的骨架質粒共轉染細胞；2.34～11天后，細胞全部被感染、脫落并崩解，培養細胞的培養液中即含有攜帶有外源基因序列的Ad5F35型重組腺病毒。
實施例3帶有編碼GFP的外源基因序列及loxP位點的穿梭質粒與本發明所述的骨架質粒共轉染細胞后，包裝出表達外源基因GFP的Ad5F35型重組腺病毒1.將HEK-293細胞復蘇1.1取凍存于液氮中的HEK-293細胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細胞；1.4將重懸的細胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養過夜；2.HEK-293細胞的轉染2.1細胞培養至匯合度達到80％時，在轉染前2～6小時，給細胞換液，換上新鮮的含有10％FBS的DMEM；2.2用攜帶有編碼GFP基因序列且含有loxP位點的穿梭質粒和本發明所述的骨架質粒共轉染細胞；3.3～7天后，開始有重組腺病毒Ad5F35-GFP包裝成功，在相差顯微鏡下觀察可看到部分細胞發生聚集、細胞間出現毒斑(圖5A)，在熒光顯微鏡下可觀察到有Ad5F35-GFP包裝的細胞產生綠色熒光(圖5B)。
實施例4利用實施例3所述的方法包裝出的Ad5F35-GFP重組腺病毒感染CD34+造血干細胞1.CD34+造血干細胞的分離和培養1.1采集臍帶血；1.2用德國Miltenyi Biotech公司生產的CD34+起源細胞分離試劑盒分離CD34+造血干細胞；1.3用流式細胞儀檢測，分離得到的CD34+造血干細胞純度達到95％以上；1.4將分離得到的CD34+造血干細胞以2×105/孔的數量置于細胞培養用24孔板中，用美國BioWhittaker公司生產的X-vivo 15無血清培養基培養，培養基用量為每孔600微升；1.5培養CD34+造血干細胞的培養基中還含有1％的加拿大StemCellTechnologies公司產牛血清白蛋白、2mM的L-谷氨酰胺、100uM的β-巰基乙醇、100單位/mL的青霉素、100ug/mL的鏈霉素。
1.6在CD34+造血干細胞培養的生存期，上述培養基中加入人巨核細胞生長發育因子至50ng/mL、干細胞生長因子至100ng/mL、Flt3配基至50ng/mL；1.7在CD34+造血干細胞培養的增殖期，上述培養基中加入人干細胞生長因子至100ng/mL。
2.Ad5F35-GFP重組腺病毒感染CD34+造血干細胞2.1CD34+造血干細胞培養過夜后，用實施例3中所述的方法包裝出的Ad5F35-GFP分別以MOI為20、100、500感染細胞，混合均勻，同時以同樣的條件用Ad5-GFP感染細胞作為對照；2.2三小時后，洗去未感染細胞的殘留病毒，細胞換新鮮的培養基。
3.外源基因表達的檢測及作圖3.1病毒感染細胞48小時后，用流式細胞儀檢測實驗細胞和對照細胞中GFP的表達量；3.2以能夠表達GFP的CD34+造血干細胞占細胞總量的百分比為縱坐標，對不同MOI條件下Ad5-GFP感染細胞與Ad5F35-GFP感染細胞的情況做柱狀圖，計算方差。結果如圖6所示，與Ad5-GFP相比，Ad5F35-GFP能夠更高效感染CD34+造血干細胞，并實現GFP在其中更大量的表達。
實施例5帶有編碼人血管內皮細胞生長因子VEGF的外源基因序列及loxP位點的穿梭質粒與本發明所述的骨架質粒共轉染細胞后，包裝出表達外源基因VEGF的Ad5F35型重組腺病毒1.將HEK-293細胞復蘇
1.1取凍存于液氮中的HEK-293細胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細胞；1.4將重懸的細胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養過夜；2.HEK-293細胞的轉染2.1細胞培養至匯合度達到80％時，在轉染前2～6小時，給細胞換液，換上新鮮的含有10％FBS的DMEM；2.2用攜帶有編碼人VEGF基因序列且含有loxP位點的穿梭質粒和本發明所述的骨架質粒共轉染細胞；3.3～7天后，開始有重組腺病毒Ad5F35-VEGF包裝成功，在相差顯微鏡下觀察可看到部分細胞發生聚集、細胞間出現毒斑(圖7)。
實施例6帶有編碼人血管內皮細胞生長因子VEGF的外源基因序列的重組腺病毒Ad5F35-VEGF感染CHO細胞后，在細胞中表達VEGF1.將CHO細胞復蘇1.1取凍存于液氮中的CHO細胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細胞；1.4將重懸的細胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養過夜；2.CHO細胞的感染細胞培養擴增至2×108個細胞時，以MOI＝10的劑量加入Ad5F35-VEGF，感染12～16小時。
3.CHO細胞中表達VEGF的檢測3.1CHO細胞被感染24小時后，收集細胞，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，進行SDS-PAGE，同時以未被感染的細胞為對照組；3.2對照組和實驗組的樣品同時以抗VEGF抗體進行Western blot檢測；3.3Western blot檢測結果用ECL化學發光法顯色。由圖8結果可看出，Ad5F35-VEGF感染的細胞中VEGF的表達量大大多于對照組細胞。
序列表<110>本元正陽基因技術股份有限公司<120>新型重組腺病毒載體骨架質粒及其用途<130>200412171<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2280<212>DNA<213>Human adenovirus type 5<220>
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<400>1gtctggtaaa gcaggccaaa gtcacctacg acagtaatac caccggacac cgccttagct 60acaagttgcc aaccaagcgt cagaaattgg tggtcatggt gggagaaaag cccattacca120taactcagca ctcggtagaa accgaaggct gcattcactc accttgtcaa ggacctgagg180atctctgcac ccttattaag accctgtgcg gtctcaaaga tcttattccc tttaactaat240
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<221>插入到骨架質粒中的Ad35序列<222>(129)..(972)<223>
<400>2atgaccaaga gagtccggct cagtgactcc ttcaaccctg tctaccccta tgaagatgaa 60agcacctccc aacacccctt tataaaccca gggtttattt ccccaaatgg cttcacacaa120agcccagacg gagttcttac tttaaaatgt ttaaccccac taacaaccac aggcggatct180ctacagctaa aagtgggagg gggacttaca gtggatgaca ctgatggtac cttacaagaa240aacatacgtg ctacagcacc cattactaaa aataatcact ctgtagaact atccattgga300aatggattag aaactcaaaa caataaacta tgtgccaaat tgggaaatgg gttaaaattt360aacaacggtg acatttgtat aaaggatagt attaacacct tatggactgg aataaaccct420ccacctaact gtcaaattgt ggaaaacact aatacaaatg atggcaaact tactttagta480ttagtaaaaa atggagggct tgttaatggc tacgtgtctc tagttggtgt atcagacact540gtgaaccaaa tgttcacaca aaagacagca aacatccaat taagattata ttttgactct600tctggaaatc tattaactga ggaatcagac ttaaaaattc cacttaaaaa taaatcttct660acagcgacca gtgaaactgt agccagcagc aaagccttta tgccaagtac tacagcttat720cccttcaaca ccactactag ggatagtgaa aactacattc atggaatatg ttactacatg780actagttatg atagaagtct atttcccttg aacatttcta taatgctaaa cagccgtatg840
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1.新型重組腺病毒載體骨架質粒pBHG-fiber5/35。
2.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒是以pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒為材料改造而成的。
3.根據權利要求2所述之改造，其特征在于，所述改造是通過用編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結的基因序列替換了pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒上編碼Ad5纖突柄及Ad5纖突結的基因序列所完成的。
4.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒上的PacI酶切位點是外源基因插入的位點。
5.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒上含有SV40 AN位點和pIX基因，SV40 AN位點和pIX基因之間含有Cre位點、HCMV IE立早啟動子、氨芐青霉素抗性基因和loxP位點。
6.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒可以與有loxP位點的穿梭質粒、能夠提供腺病毒E1區的細胞組成新型重組腺病毒包裝系統。
7.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒可以與有loxP位點的穿梭質粒一起共轉染細胞，在細胞內發生病毒基因組同源重組，產生能夠表達外源基因的Ad5F35型重組腺病毒。
8.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒與有loxP位點的穿梭質粒、能夠提供腺病毒E1區的細胞組成的新型重組腺病毒包裝系統，包裝出的重組腺病毒是E1缺失的復制缺陷型腺病毒。
9.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒與有loxP位點的穿梭質粒、能夠提供腺病毒E1區的細胞組成的新型重組腺病毒包裝系統，包裝出的重組腺病毒上能夠帶有外源基因序列。
10.根據權利要求1所述之骨架質粒，其特征在于，所述骨架質粒的用途是用于新型重組腺病毒的包裝。
全文摘要
本發明公開了新型重組腺病毒載體骨架質粒及其用途，利用此載體構建用骨架質粒能夠快速、高效率、簡便地獲得攜帶有外源基因的Ad5F35型重組腺病毒，并且明顯提高病毒的產率。本發明通過下述技術方案實現用編碼Ad35纖突的基因序列替換pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質粒上編碼Ad5纖突的基因序列。本發明的主要用途是快速、穩定、高產的包裝出攜帶外源基因的Ad5F35型重組腺病毒載體，感染很難用傳統病毒載體感染的惡性腫瘤細胞、人外周血細胞和造血干細胞等靶細胞，進而應用于基因治療、基因功能性研究、反義治療、疫苗開發領域。
文檔編號C12N15/861GK1796566SQ20041010150
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月22日 優先權日2004年12月22日
發明者吳小兵, 袁振華, 劉寧, 趙革新, 高金華, 董小巖 申請人:本元正陽基因技術股份有限公司