專利名稱：利用循環伊波病毒dna對前癌、原位癌和癌病灶的篩查的制作方法
技術領域：
本發明涉及以下發現可在患者血液的不含細胞的液體中發現伊波(Epstein-barr)病毒(EBV)，且當發現該病毒時，該患者可能已患有前癌、原位癌或其它任意形式的、不限于與伊波病毒相關的癌癥。本發明依據的理論是，我們發現血漿中存在陽性EBV DNA的正常個體和癌癥患者的循環CD25+CD4+調節T(Treg)淋巴細胞上升。我們還發現在某些與伊波病毒關系未知的癌癥中，其患者的血清或血漿中的循環EBV DNA的滴定度呈陽性。將上述觀測結果結合得出的發現證明EBV再活化可導致對細胞毒T細胞的抑制，進而導致癌癥免疫監視的喪失。本發明提出一種新的通用的篩查方法，其使用血清或血漿中的循環EBV DNA對前癌、原位癌和癌病灶進行篩查。
背景技術：
公知地，多種腫瘤的癌細胞都可釋放出腫瘤衍生(tumor-derived)DNA(Anker et al.，Cancer Metastasis Rev.1865-73(1999))。其例子包括由胰腺癌產生的致癌基因突變(Anker et al.，Gastroenterology.1124-1120(1997))，由肺癌產生的微衛星改變(Chen etal.，Cancer Res.593(1999))和由肝癌產生的漸成(epigenetic)變化(Wong et al.，Cancer Res.593(1999)).此外，在許多公知與病毒感染有關的癌癥中，可在循環中發現病毒DNA。例子包括由鼻咽癌(Mutirangura et al.，Clin Cancer Res.4665-9(1998))；Lo et al.，Cancer Res.591188-91(1999))和某些淋巴瘤(Lei et al.，Br JHaematol.111239-46(2000)；Gallagher et al.，Int J Cancer.84442-8(1999)；Drouet et al.，J Med Virol.57383-9(1999))產生的伊波病毒(EBV)DNA和由頭部和頸部癌癥產生的人體乳頭癌病毒DNA(Capone et al.，ClinCancer Res.64171-5(2000))。
目前，研究者非常關注癌癥患者血漿和血清中腫瘤衍生DNA的存在(Chen，X.Q.et al.，Nat.Med.，21033-1035(1996)；Nawroz，H.et al.，Nat.Med.，21035-1037(1996))。在與病毒相關的癌癥中，其患者血漿和血清中檢測到無細胞的腫瘤相關病毒DNA(Mutirangura，A.et al.，Cancer Res.，4665-669(1998)；Lo，Y.M.D.et al.，Clin.Cancer Res.591188-1191(1999)；Capone，R.B.Clin.Cancer Res.，64171-4175(2000))。一種重要的與多種類型的惡性腫瘤相關的病毒是EBV(Cohen，J.I.N.Engl.J.Med.，343481-492(2000))。EBV是能夠感染大多數人群的人體皰疹病毒。EBV通常是通過唾液傳播的，并且在B淋巴細胞中形成潛伏感染，該感染可伴隨宿主終生。基于這種原因，在鼻咽癌(NPC)(Mutirangura，A.et al.，Cancer Res.，4665-669(1998)；Lo，Y.M.D.et al.，Clin.Cancer Res.，591188-1191(1999))患者和某些惡性淋巴腫瘤(Lei，K.I.et al.，Br.J.Haematol.，111239-246(2000)；Drouet，E.et al.，J.Med.Virol.，57383-389(1999)；Gallagher，A.et al.，Int.J.Cancer，84442-228(1999))患者的血漿和血清中已經檢測到循環EBV DNA。
還有報道稱部分胃癌也與EBV的感染有關(Shibata，D.et al.，Am.J.Pathol.，140769-774(1992))。在香港，有大約10％的胃癌病例發現與EBV感染有關(Yuen，S.T.et al.，Am.J.Surg.Pathol.，181158-1163(1994))。
目前，已發現具有CD3+CD4+CD25+表型的抑制T細胞在癌癥的發展中起作用。雖然，最初發現這些T細胞可保護宿主對抗自體免疫的發生，但它們也可同時防礙對宿主進行有效的腫瘤抗原的免疫監視。因此，具有這種表型的細胞上升可導致癌癥的形成及從前癌、原位癌發展成發育成熟的癌癥。
此外，我們也能發現某些與EBV無關的癌癥的患者其血漿中也含有EBV DNA，這進一步證明EBV確實在癌癥(除了由不同病原體引起的鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤之外)中起作用。
發明內容
本發明的第一方面提供了通過測定患者血清或血漿中存在的伊波病毒DNA(EBV DNA)的含量來對癌癥進行常規篩查的方法。因此，本發明在臨床醫學中，尤其在潛伏EBV感染(某些人群中超過90％的人都存在)中具有廣泛的應用。
本發明的方法通常包括如下步驟從患者獲取血液樣本；從該血液樣本中提取DNA；分析提取的DNA中存在的循環EBV DNA的含量；重復上述步驟；以及將所述血液樣本中存在的循環EBV DNA的含量與對照進行對比，其中所述EBV DNA的含量恒定或上升的趨勢表明所述患者患有癌癥或前癌。
本發明所述的癌癥優選選自鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤；或者選自肺癌、結腸癌、腮腺癌、乳腺癌和肝癌。除上述癌癥以外的其它癌癥亦可用于本發明。
優選地，本發明血液樣本是非細胞液體樣本。所述非細胞液體部分指該樣本是提取細胞后的血清或血漿，其中血清的提取是通過凝聚并將細胞與剩余液體分離而獲得的，或者通過抑制凝聚并進行離心來實現液體部分(血漿)的提取。在該液體部分中分析EBV DNA。
優選地，本發明方法中的重復步驟在第一次測定后的4-12周內進行。也可在4-12周以外的時間進行。
在本發明的某實施方案中，分析EBV DNA的含量的方法是通過雜交、擴增、定量的方法進行，并選擇EBV基因組的任意序列或序列片段作為任意引物和探針或其組合的結合位點。
本發明的第二方面提供了包含適當的檢測患者血清或血漿中EBVDNA的試劑的診斷試劑盒。本發明的試劑盒還可包含一種或多種從患者獲取血液樣本的裝置、從該血液樣本中分離EBV DNA的裝置以及定量該血液樣本中存在的EBV DNA的含量的裝置。該試劑盒可用于癌癥的常規篩查，所述篩查是通過測定患者血清或血液中存在的伊波病毒DNA(EBVDNA)的含量來實現的。
附圖的簡要說明
圖1顯示了以下結果對一組血漿EBV DNA滴定度呈陽性的癌癥患者，對其滴定度進行的一系列分析的結果顯示所有未接受治療的患者在第二次及后續的分析中表現出水平升高。
圖2顯示了以下結果對一組血漿EBV DNA滴定度呈陽性的正常個體，分別在第一次和第二次測定之后間隔4-12周進行一系列的第二次或第三次分析，結果顯示除一例個體外所有個體的EBV DNA滴定度讀數都為零。
圖3顯示了以下結果在一批懷疑患有不同類型癌癥的不同患者中，與EBV非直接相關的癌癥患者的EBV DNA滴定度也呈陽性。對一例有完全反應的結腸癌患者的治療也同時伴隨著其EBV DNA滴定度的消失。
發明的詳細描述本發明涉及通過測定患者血清或血漿中存在的伊波病毒DNA(EBVDNA)的含量來對癌癥進行常規篩查的方法。該方法涉及檢測和測定這些患者血漿液中存在的EBV DNA的含量。本發明的方法在臨床醫學中有廣泛的應用。
臨床上，循環EBV DNA早已應用在診斷和控制鼻咽癌上(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，606878-6881)。
類似地，循環EBV DNA也可應用在一部分有資料支持的且已確定與伊波病毒有關的胃癌和淋巴瘤的診斷中。然而，上述檢測還從未應用于在普通人群中篩查與EBV相關的癌癥。
任何常規的DNA擴增或信號放大方法都可應用于檢測EBV DNA。在大多數情況下，需要使用任意本領域公知的核酸擴增步驟使目標序列擴增。特別地，核酸擴增是指核酸擴增子(拷貝)的酶合成，其中該核酸擴增子包含被擴增的核酸序列的互補序列。本領域采用的核酸擴增步驟的例子包括聚合酶鏈反應(PCR)、鏈替代擴增(SDA)、連接酶鏈反應(LCR)和轉錄相關擴增(TAA)。當樣本中存在的目標序列的含量非常少時，核酸擴增的效果尤其顯著。為了更好地檢測樣本中目標生物體或病毒的核酸，在分析開始時需要的目標序列較少，因此通過將目標序列擴增并檢測合成的擴增子，可大幅度提高分析的靈敏度。
在文獻中對核酸擴增的方法進行了詳盡的描述。例如，Mullis等人在美國專利第4,683,195、4,683,202和4,800,159號中，以及在Methods inEnzymology，155335-350(1987)中描述了PCR擴增方法。SDA的例子可以在Walker的PCR Methods and Applications，325-30(1993)、Walker等人的Nucleic Acids Res.，201691-1996(1992)和Proc.Natl.Acad.Sci.，89392-396(1991)中找到。在美國專利第5,427,930和5,686,272中描述了LCR方法。而且，在各種出版物中提供了TAA的不同形式，如Burg等人在美國專利第5,437,990號；Kacian等人在美國專利第5,339,491和5,554,516號中；以及Gingeras等人在
發明者楊華顯 申請人:楊華顯