重組生產和純化蛋白激酶的改進方法

專利名稱：重組生產和純化蛋白激酶的改進方法
技術領域：
本發明涉及在原核生物中通過內含體重組生產和純化蛋白激酶的改進方法。
背景技術：
蛋白激酶通過向蛋白質添加磷酸基團來調控許多不同的細胞增殖、分化、和信號過程(Hunter，T.，Cell，50(1987)823-829)。蛋白激酶常常以它們的底物、它們的調控分子、或突變表型的一些方面命名。就底物而言，蛋白激酶可以分成兩組；將酪氨酸殘基磷酸化的稱為蛋白質酪氨酸激酶即PTK，和將絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化的稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶即STK。幾乎所有的激酶都包含類似250-300個氨基酸的催化結構域。N端結構域結合并定向ATP(或GTP)供體分子。較大的C端部分結合蛋白質底物，并執行將磷酸由ATP轉移至絲氨酸、蘇氨酸、或酪氨酸殘基的羥基。
可以根據位于激酶結構域的環的某一端或插入其環中的不同氨基酸序列(通常在5和100個殘基之間)將激酶分類成家族。這些外加氨基酸序列能夠調控各自激酶，因為它識別其靶蛋白并與其相互作用。激酶結構域的一級結構是保守的，而且可以進一步細分成11個亞結構域。這11個亞結構域的每一個都包含特定殘基和基序或氨基酸樣式，它們是亞結構域的特征，而且這些亞結構域是高度保守的(Hardie，G.和Hanks，S.，TheProtein Kinase Facts Books I，Academic Press，San Diego，Calif，1995，第7-20頁)。
第二信使依賴性蛋白激酶主要介導第二信使諸如環AMP(cAMP)、環GMP、肌醇三磷酸、磷脂酰肌醇、3，4，5-三磷酸、環ADP核糖、花生四烯酸和二酰甘油的作用。例如，環AMP依賴性蛋白激酶(PKA)和促分裂原活化蛋白激酶(MAP)是STK家族的成員。在已經研究過的所有原核和動物細胞中，環AMP是激素作用的胞內介導物。這些由激素誘導的細胞應答包括甲狀腺激素分泌、皮質醇分泌、孕酮分泌、糖原分解、骨吸收、以及心率和心肌收縮力度的調控。PKA發現于所有動物細胞中，而且認為它負責環AMP在大多數這些細胞中的作用。PKA表達的改變涉及多種疾病和病癥，包括癌癥、甲狀腺疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化、和心血管疾病。
MAP激酶像p38還調控胞內信號途徑。它們通過磷酸化級聯反應介導由細胞表面至細胞核的信號轉導。已經鑒定了幾個亞類，它們各自顯示不同的底物特異性并應答不同的胞外刺激(Egan，S.E.和Weinberg，R.A.，Nature，365(1993)781-783)。
蛋白激酶B(PKB/Akt)是具有基礎重要性的胞內信號途徑的成員，功能是發揮生長和存活因子的作用，并介導對胰島素和炎性信號的應答(Datta，S.R.等人，Genes Dev.，13(1999)2905-2927；Brazil，D.P.和Hemmings，B.A.，Trends Biochem.Sci.，11(2001)657-664)。WO2003/016516描述了使用苯基TSK疏水相互作用層析的PKB的重組生產和純化。將PKB吸附到柱上，并在清洗PKB后使用線性梯度洗脫。
SRC激酶涉及癌癥、免疫系統機能失調和骨重建疾病。一般綜述可參閱Thomas，S.M.和Brugge，J.S.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，13(1997)513-609。Src家族的成員有例如Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、和Blk。這些是非受體蛋白激酶，分子量范圍為52-62kD。它們的特征是共同結構組織，即包含六個不同功能結構域Src同源結構域4(SH4)、一個獨特結構域、SH3結構域、SH2結構域、一個催化結構域(SH1)、和C端15調控區。
在原核生物體中，蛋白質合成(也稱為翻譯)是在細胞質的核糖體上進行的。在原核宿主生物體諸如大腸桿菌中表達重組DNA時，由此生成的重組基因產物/蛋白質常常以不溶性內含體的形式在細胞質中沉淀。在完成發酵并裂解細胞后，分離并任選純化內含體，通過添加變性劑諸如尿素或鹽酸胍溶解其中包含的重組蛋白，并通過還原變性條件實現所述蛋白質的復性。這些方法是眾所周知的，并且已經長時間成功用于重組蛋白的工業生產(參閱如Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.，14(1996)98-105；Panda，A.K.等人，J.Biotechnol.，75(1999)161-172；Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.，27(2001)325-336；Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.，12(2001)202-207；Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51(1999)297-307；和Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.，9(1998)497-501)。
由于溶解性差、折疊不正確、缺乏穩定性和其它問題，哺乳動物蛋白質在微生物宿主細胞如大腸桿菌中的表達常常是具有挑戰性的任務。發明人在微生物宿主細胞中通過重組表達生產蛋白激酶的嘗試通常導致只有少量的有活性的可溶性激酶，但是產生大量的不需要的且無活性的二聚體和更高聚集體。

發明內容
發明概述現在，令人驚訝的發現，使用本發明的方法可以在微生物宿主細胞中的重組生成后大量回收正確折疊的激酶。
因此，本發明的目的是一種重組生產和純化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶選自酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成的組，該方法通過在微生物宿主細胞中表達編碼所述激酶的核酸，形成包含所述蛋白激酶的內含體，分離，溶解，復性(naturing)，和純化所述蛋白激酶而進行，其特征在于所述純化是通過在至少70％的所述正確折疊的蛋白激酶不結合于所述吸附劑的條件下與疏水吸附劑進行疏水相互作用而進行和回收不結合所述吸附劑的蛋白激酶。未折疊的蛋白質結合吸附劑。
優選的是，所述蛋白激酶是src、pkb、c-met、lck、aurora或p38。
依照本發明的吸附劑優選固體或凝膠材料，有經過疏水殘基如苯基、丁基、或辛基殘基修飾的纖維素、交聯葡聚糖、交聯瓊脂糖等組成(HIC吸附劑、疏水相互作用層析吸附劑)。
優選的是，用包含至少0.1M KCl或NaCl、更優選0.1-1M KCl或NaCl的水溶液中的疏水性吸附劑處理激酶。更高的KCl或NaCl濃度也是可能的，只要蛋白激酶不以超過蛋白激酶蛋白質物質總量70％的非期望大量發生結合。另外，高鹽濃度可能使蛋白激酶不穩定。
另外，所述疏水相互作用處理優選在存在至少1M精氨酸或具有通式I的化合物的條件下進行R2-CO-NRR1(I)，其中R和R1是氫或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C4烷基鏈，且R2是氫、NHR1或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C3烷基鏈。
發明詳述上文已經定義了可以依照本發明生產和純化的蛋白激酶。優選的是，依照本發明的方法可用于SRC激酶和環AMP依賴性蛋白激酶(PKA)的生產和純化。Src家族的成員有例如Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、和Blk。這些是非受體蛋白激酶，分子量范圍為52-62kD。它們的特征是共同結構組織，即包含六個不同功能結構域Src同源結構域4(SH4)、獨特結構域、SH3結構域、SH2結構域、催化結構域(SH1)、和C端15調控區。環AMP依賴性蛋白激酶(PKA)是STK家族的成員。在已經研究過的所有原核和動物細胞中，環AMP是激素作用的胞內介導物。這些由激素誘導的細胞應答包括甲狀腺激素分泌、皮質醇分泌、孕酮分泌、糖原分解、骨吸收、以及心率和心肌收縮力度的調控。PKA發現于所有動物細胞中，而且認為它負責環AMP在大多數這些細胞中的作用。
可以依照本發明生產的上文所述蛋白激酶都在生物化學過程中發揮重要作用。為了進一步說明代謝關聯，不僅關注天然的蛋白激酶，而且還關注這些天然存在蛋白激酶的突變體。
依照本發明有用的吸附劑(HIC吸附劑)優選由被疏水配基取代的凝膠基質組成。取代的程度通常在10-50μmol/ml凝膠的范圍內。優選的配基是例如C2-C8烷基殘基或簡單的芳基(像苯基)殘基。通常，疏水相互作用通過添加鹽而增強。如果使用HIC吸附劑進行層析，那么正確折疊形式的激酶的結合程度并不高，因此在流出液中進行回收。
尤其優選使用由苯基、丁基、或辛基取代的交聯瓊脂糖。這樣的吸附劑是例如苯基、丁基、或辛基瓊脂糖(如交聯瓊脂糖，4％是球形的，平均顆粒大小為90μm，顆粒大小范圍為45-165μm，取代程度約為50μmol丁基/ml凝膠)。
疏水吸附劑的處理可以以常見方式進行，如用吸附劑的懸浮液處理包含激酶的溶液或進行層析(HIC)。
術語“至少70％的所述蛋白激酶不結合”指在重組生產和復性(naturation)后回收的蛋白質中，它包含在含激酶的水溶液復性后存在的正確折疊形式、非正確折疊形式(如多聚體等)的所述蛋白激酶、以及來自宿主細胞的其它蛋白質雜質，至少70％的正確折疊形式不結合吸附劑且發現于用吸附劑處理激酶溶液后的上清液中或如果將吸附劑用于層析HIC純化中而發現于流出液中。
術語“正確折疊”指蛋白質在復性后采取天然的三維結構。這不依賴催化活性，而且還包括無催化活性的突變體。優選的是，活性蛋白激酶是依照本發明生產的。
可以通過在復性后用至少0.1M KCl或NaCl、更優選0.1-1M KCl或NaCl處理這種激酶的水溶液來實現激酶與吸附劑的結合率低于30％。更高的KCl或NaCl濃度也是可能的，只要蛋白激酶不以超過蛋白激酶蛋白質物質總量70％的非期望大量發生結合。另外，很高的鹽濃度可能使蛋白激酶不穩定。
對于具有通式I的化合物，優選采用甲酰胺、乙酰胺、尿素或尿素衍生物諸如乙脲或甲脲。可以使用精氨酸，例如堿性精氨酸的鹽酸化物或另一種滴定形式。然而，優選采用L-精氨酸，更優選采用L-精氨酸的鹽酸化物形式。
多肽在微生物宿主細胞的重組表達過程中形成不溶性內含體。內含體是在編碼基因過度表達的情況中發生的蛋白酶抗性錯誤折疊形式的期望蛋白質的折射性聚集物(Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51297-307，1999)。
適于重組基因表達的原核宿主細胞是例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，諸如大腸桿菌和枯草桿菌。合適的大腸桿菌菌株是諸如UT5600、AB101、XL1、K12、X1776、和W3110等大腸桿菌菌株。然而，其它腸桿菌科以及諸如克雷伯氏桿菌屬、沙門氏菌屬、或枯草桿菌屬等微生物、假單胞菌屬、或鏈霉菌屬也適于作為宿主細胞。同樣適于作為宿主細胞的還有酵母菌株，諸如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。
通常將編碼多肽的核酸插入表達載體。合適的載體對于本領域熟練技術人員而言是眾所周知的，例如質粒或噬菌體。
宿主細胞的發酵也是依照本領域熟練技術人員已知的方法進行的。在達到預定的細胞數目后(通過發酵液/細胞懸浮液的光密度來測量)，誘導重組多肽的表達，并進行培養直至達到穩定期(在分批培養的情況中)。在細胞培養完成后，收獲細胞，分離并處理內含體，即依照已知方法的溶解和復性。
提供下面的實施例、附圖、和參考文獻是為了幫助理解本發明，所附權利要求書列出了本發明的真正范圍。應當理解的是，可以對所列流程進行修改而不違背本發明的精神。


圖1如本文所述進行復性和疏水層析后的Src活性。活性發現于上清液(SN)中(EL＝洗脫液)。
圖2復性和丁基層析級分的SDS-PAGE，考馬斯藍染色。雖然在丁基上清液(SN)中保持了活性，但是切出了大量的失活src蛋白。1蛋白質分子量標準，2復性，3復性+KCl，4丁基SN，5超濾/濃縮。
圖3復性和添加KCl或硫酸銨后的src活性。添加在疏水層析中常用的硫酸銨造成上清液中活性src的喪失。高達1M的KCl使溶液中的src保持活性并能夠在丁基瓊脂糖上分離失活的src。
圖4SDS-PAGE，考馬斯藍染色。泳道1是標準蛋白質，泳道2是重新折疊和丁基瓊脂糖處理后的aurora激酶制劑。箭頭aurora激酶。
圖5重新折疊和丁基瓊脂糖處理后的aurora激酶的大小排阻層析。Superdex 75(Pharmacia)10/30。緩沖液50mM TRIS pH7.5，500mM NaCl，10％甘油，3mM Chaps。流速0.5ml/分鐘。
具體實施例方式
實施例1
src的重組生產a)克隆將Src激酶結構域克隆到pQE32(QIAGEN GmbH)的BamHI/HindIII位點中，并通過PCR在其N端引入凝血酶切割位點。
b)發酵為了制備接種物，將包含重組激酶蛋白生產所用表達質粒的適當大腸桿菌菌株甘油保存物1ml加到100ml LB培養基中，并在旋轉搖床上于37℃培養8-10小時。將此預培養物轉移到裝有更多LB培養基和葡萄糖的經滅菌發酵罐中。在期望蛋白激酶不溶性表達成內含體時，將主要培養物的溫度維持于37℃。通過提高攪拌速度將整個發酵過程中培養基的溶氧濃度保持在高于20％的飽和度。在pH值升高時添加葡萄糖并持續補充酵母-蛋白胨溶液(2ml/分鐘)進行額外的養分輸送。當檢測到光密度不再升高時，停止這種補料分批發酵。通過離心收獲培養肉湯。
c)IB制備將生物物質懸浮于含Tris和MgSO4的緩沖液中。如果需要，添加溶菌酶和DNA酶(如來自Merck的Benzonase)。通過勻漿裂解細菌細胞以釋放其中的內含體。補充的DNA酶使懸浮液保持液態，這對于進一步的處理是至關重要的。于室溫培育期后，向懸浮液中添加含NaCl、EDTA、和Brij液的第二種緩沖液。于室溫培育期后，通過離心由上清液分離隱蔽的內含體。然后將沉淀懸浮于含Tris和EDTA的第三種緩沖液以清洗IB(內毒素釋放)，并于室溫攪動下溫育和離心。
d)src的復性將1.3g內含體于室溫懸浮于100ml 0.1M TRIS pH8.0、8M鹽酸胍、10mM EDTA、10mM DTT。將此src溶解物邊攪動邊滴加到含1M TRIS pH7.0、0.5M精氨酸、10mM DTT、10片Complete的10升重新折疊緩沖液中。重新折疊過程于8℃持續3-5天，無需攪動。
由于失活的未折疊src的高度聚集和然后活性級分免疫共沉淀，因此在此階段用不同的緩沖液(含多種添加劑的醋酸鹽、磷酸鹽、MES、TRIS pH5-9)進行透析是不成功的。必需在透析前通過疏水層析除去復性緩沖液中的失活的未折疊src。
e)分批疏水層析將重新折疊的蛋白質溶液設為1M KCl。隨后加入40g丁基瓊脂糖4Fast Flow(Amersham)，并于8℃結合1小時。過濾除去丁基瓊脂糖后，上清液包含正確折疊的活性src蛋白。在這些條件下，未折疊的無活性蛋白質結合丁基瓊脂糖。此方法使得有活性的和無活性的src得以分離(圖1和2)。如果需要，可以通過額外的層析步驟即Ni-鰲合層析和大小排阻層析實現進一步的純化。
正如在圖3中能夠看到的，添加KCl(0.2M、0.5M、和1.0M)證實優于硫酸銨。相同濃度的硫酸銨早就引起活性src的沉淀。因為在柱子上損失了大量的活性，所以使用導致活性src結合疏水材料的條件是不合適的。洗脫液只顯示低水平的src蛋白和活性回收。
f)src檢測使用Eu標記(PT66 Lance Eu-W1024(Wallac))的磷酸酪氨酸抗體，并檢測時間分辯熒光信號，由此測量src激酶對src底物肽YA133的磷酸化。
實施例2aurora的重組生產a)克隆依照以下流程設計并克隆用于在細菌中表達人全長野生型Aurora A激酶和衍生物的載體構建體，所述激酶和衍生物用于激酶測定法(如Elisa、HTRF、FP)和生物結構目的。
使用基因特異性寡核苷酸引物和Pwo DNA聚合酶(Roche DiagnosticsGmbH)通過標準PCR由人HeLa cDNA文庫(Clontech)擴增編碼人全長Aurora A激酶(第1-403位殘基)的ORF，隨后亞克隆到細菌表達載體中。以這些載體為模板，使用基因特異性寡核苷酸引物通過PCR生成截短形式的Aurora A，并通過定點誘變生成Aurora A突變型蛋白。對于最終的表達構建體，使用基因特異性引物和Pwo DNA聚合酶通過PCR由相應的Aurora A基礎載體擴增野生型和突變型Aurora A激酶結構域(第114-403位殘基)。通過NdeI和XhoI限制性位點將PCR產物亞克隆到含有或不含N端RGS-(His)6標簽在T5啟動子控制下的經修飾的pQE40表達載體。通過測序證實了所有載體插入片段的序列。隨后將載體轉化到大腸桿菌BL21和UT5600菌株中，用于通過大規模發酵以內含體形式表達蛋白質。在用1mM異丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)于37℃過夜誘導前，將大腸桿菌菌株BL21和UT5600于37℃在補充氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB培養基中培養至光吸收值達到0.5-0.8，在該菌株中表達蛋白質。誘導后，通過離心收獲細胞，重懸，并依照給定流程制備內含體。
b)發酵為了制備接種物，將包含重組激酶蛋白生產所用表達質粒的適當大腸桿菌菌株甘油保存物1ml加到100ml LB培養基中，并在旋轉搖床上于37℃培養8-10小時。將此預培養物轉移到裝有更多LB培養基和葡萄糖的經滅菌發酵罐中。將主要培養物的溫度維持于37℃。在pH值升高時添加葡萄糖并持續補充酵母—蛋白胨溶液(2ml/分鐘)進行額外的養分輸送。當檢測到光密度不再升高時，停止這種補料分批發酵。通過離心收獲培養肉湯。
c)IB制備將生物物質懸浮于含Tris和MgSO4的緩沖液中。如果需要，添加溶菌酶和DNA酶(如來自Merck的Benzonase)。通過勻漿裂解細菌細胞以釋放其中的內含體。于室溫培育期后，向懸浮液中添加含NaCl、EDTA、和Brij液的第二種緩沖液。于室溫另外的培育期后，通過離心由上清液分離隱蔽的內含體。然后將沉淀懸浮于含Tris和EDTA的第三種緩沖液以清洗IB，并于室溫攪動溫育和離心。
d)aurora的復性將160mg內含體于室溫懸浮于10ml 0.1M TRIS pH8.0、8M鹽酸胍、10mM EDTA、10mM DTT。將此aurora溶解物邊攪動邊滴加到含1M TRISpH7.0、0.5M精氨酸、10mM DTT的1升重新折疊緩沖液中。重新折疊過程于8℃持續1天，無需攪動。
e)分批疏水層析將重新折疊的蛋白質溶液設成1M KCl。30分鐘后加入5g丁基瓊脂糖4 Fast Flow(Amersham)，并于8℃結合1小時。過濾除去丁基瓊脂糖后，上清液主要包含正確折疊的活性aurora蛋白。在這些條件下，未折疊的蛋白質結合丁基瓊脂糖。如果需要，可以通過額外的層析步驟即離子交換和大小排阻層析實現進一步的純化。
f)重新折疊蛋白質的分析正如在SDS-PAGE和大小排阻層析中看到的，重新折疊后丁基瓊脂糖批次的上清液含有90％以上的單體aurora激酶。
參考文獻Brazil，D.P.和Hemmings，B.A.，Trends Biochem.Sci.，11657-664，2001Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.，12202-207，2001Datta，S.R.等人，Genes Dev.，132905-2927，1999Egan，S.E.和Weinberg，R.A.，Nature，365781-783，1993Hardie，G.和Hanks，S.，The Protein Kinase Facts Books I，AcademicPress，San Diego，Calif.，1995，第7-20頁Hunter，T.，Cell，50823-829，1987Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.，1498-105，1996Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.，9497-501，1998Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.，27325-336，2001Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51297-307，1999Panda，A.K.等人，J.Biotechnol.，75161-172，1999Thomas，S.M.和Brugge，J.S.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，13513-609，1997WO 2003/01651權利要求
1.一種重組生產和純化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶選自由酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成的組，所述方法通過在微生物宿主細胞中表達編碼所述激酶的核酸，形成包含所述激酶的內含體，分離，溶解，復性，和純化所述激酶來進行，其特征在于所述純化是通過在至少70％所述正確折疊的蛋白激酶不結合所述吸附劑的條件下與疏水吸附劑進行疏水相互作用而進行和回收不結合所述吸附劑的蛋白激酶。
2.依照權利要求1的方法，其特征在于所述激酶是src、pkb、c-met、lck或p38。
3.依照權利要求1或2的方法，其特征在于所述吸附劑是苯基-、辛基-或丁基-瓊脂糖。
4.依照權利要求1至3的方法，其特征在于將所述激酶施加到包含至少0.1M KCl或NaCl的水溶液中的層析物質上。
5.依照權利要求4的方法，其特征在于所述水溶液額外包含至少1M精氨酸或具有通式I的化合物R2-CO-NRR1(I)，其中R和R1是氫或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C4烷基鏈，和R2是氫、NHR1或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C3烷基鏈。
全文摘要
一種重組生產和純化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶選自由酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成的組，所述方法通過在微生物宿主細胞中表達編碼所述激酶的核酸，形成包含所述激酶的內含體，分離，溶解，復性，和純化所述激酶來進行，其特征在于所述純化是通過在至少70％所述蛋白激酶不結合所述吸附劑的條件下與疏水吸附劑進行疏水相互作用而進行和回收不結合所述吸附劑的蛋白激酶。
文檔編號C12N9/12GK1624123SQ20041009804
公開日2005年6月8日 申請日期2004年12月2日 優先權日2003年12月2日
發明者胡貝特·赫騰貝格爾, 康拉德·霍諾爾德, 克里斯蒂安·克萊因, 彼得拉·呂格爾 申請人:霍夫曼—拉羅奇有限公司