重組表達的羧肽酶b及其純化的制作方法

專利名稱：重組表達的羧肽酶b及其純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。更特別地，本發明涉及一種具有羧肽酶B活性的蛋白的無酶活性前體的生產和進一步加工。本發明一方面涉及一種具有羧肽酶B活性的蛋白的活化以及伴隨的純化。
背景技術：
羧肽酶是一種水解C-末端肽鍵的酶。羧肽酶家族包括金屬、絲氨酸、和半胱氨酸羧肽酶。根據其底物特異性，這些酶被稱為羧肽酶A(裂解脂肪族殘基)或羧肽酶B(裂解堿性氨基酸殘基)。羧肽酶B(EC3.4.17.2)是一種催化從多肽的C-末端位置水解堿性氨基酸、賴氨酸、精氨酸、和鳥氨酸的酶
羧肽酶B的前體為一種存在于絕大多數脊椎動物胰腺中的酶原或前酶原(參見Folk J.綜述的Carboxypeptidase B，inThe Enzymes3，P.Boyer，Academic Press，NY，57，1971)。羧肽酶B可在胰蛋白酶消化產物的進一步降解中發揮功效，其對該底物的特異性作用非常相似于羧肽酶A對于胰凝乳蛋白酶產物的特異作用。羧肽酶B同樣具有酯酶活性，這與酶的金屬含量有關(Folk J.&Gladner，J.BiochimBiophys Acta(1961)48，139-47；Zisapel，N.&Sokolovsky，M，Eur J Biochem(1975)54，541-7)。
“酶原”是指酶的無活性前體。換句話說，酶原是一種具有酶活性的蛋白，比如一種具有羧肽酶B活性的蛋白的無活性前體。許多具有酶活性的蛋白是以這種無活性前體的方式合成，并隨后通過剪切掉一個或一些特定肽鍵來活化的。通過特定蛋白水解引發的酶和其他蛋白的活化常常發生在生物系統中。例如(a)存在于皮膚和骨骼中的纖維蛋白膠原衍生于可溶性前體 前膠原。(b)一些蛋白激素以無活性前體的形式合成。例如，胰島素是通過蛋白水解除去肽段的方式而衍生于前胰島素的。(c)水解蛋白的消化酶在胃和胰腺中是以酶原的形式合成和分泌的。(d)血液凝集是通過級聯的蛋白水解活化來介導的，這保證了對損傷的快速而放大的應答。
在體內，羧肽酶B的酶原，也就是“前羧肽酶B”，在胰腺細胞內以前體蛋白的形式被翻譯，該前體蛋白被命名為“前原羧肽酶B”。
前原羧肽酶B包括一種位于其N-末端的信號肽。前原羧肽酶B的氨基酸序列描述了初級翻譯產物。所述的信號肽引導前原羧肽酶B多肽進入胰腺細胞的分泌途徑。在分泌過程中，所述的引導肽通過蛋白水解的方式被切除，從而將前原羧肽酶B轉化成前羧肽酶B。
前羧肽酶B缺乏酶活性。通常在小腸內發生體內活化。胰蛋白酶剪切前羧肽酶B，從而產生無酶活性的前肽和具有蛋白水解活性的羧肽酶B酶。
作為前原羧肽酶的一個例子，如Clauser E.等，J.Biol.Chem.1988，Vol.263，17837-45中所公開的那樣，SEQ ID NO1描述了鼠前原羧肽酶B的氨基酸序列。相應地，前原羧肽酶B的前13個氨基酸表示信號肽，并且隨后的95個氨基酸構成了前肽。其活化產物，也就是活化的鼠羧肽酶B酶含有307個氨基酸，其計算分子量為35228Da。
也可采用胰蛋白酶在體外將前羧肽酶B活化形成羧肽酶B。通過分析方法，如SDS凝膠電泳和Ventura等在J.Biol.Chem.(1999)274(28)，19925-33中記載的反相HPLC，證實了前肽和酶部分的共形成。
在各種條件下的體外活化實驗表明，雖然具有蛋白酶活性的羧肽酶B酶易于產生，但在非變性條件下所述前肽仍然以非共價的方式結合至大量的羧肽酶B分子上。當對前肽和酶的復合體采用變性條件時可觀察到這種情況。因此，迄今為止，非變性純化方法，特別是陰離子交換色譜不能為從羧肽酶B酶的分子上分離非共價結合的前肽提供有效的途徑。
由于其對C-末端堿性氨基酸的高度特異性，已經發現羧肽酶B具有廣泛的用途，例如在末端基團分析中用于序列確定。不過，最主要的經濟重要性為涉及蛋白水解加工的工業應用。尤其是，羧肽酶B用于涉及蛋白水解酶切前胰島素以及產生用于醫藥用途的胰島素的生產過程。
考慮到胰島素作為一種藥物產品，由于以非共價方式結合至羧肽酶B酶的羧肽酶B前肽的特性從而引起了一特殊的問題。在所述胰島素的生產過程中，在蛋白水解酶切前胰島素之后，胰島素片段在變性條件下被純化。作為一種結果，很有可能羧肽酶B的前肽與胰島素一起被共同純化。在這種情況下，從胰島素分子中分離羧肽酶B的前肽可能成為一項繁重的工作從而同時有可能減少純化的胰島素的終產量。
從豬胰腺中純化的商業化的羧肽酶B有可能不完全地喪失其他蛋白水解酶的活性。此外，如同大多數動物來源的產物的情況那樣，豬羧肽酶B可能含有感染物質，如病毒、朊病毒、或其他具有損害人體健康潛能的生物活性組分。因此，理想的是從其他來源獲得羧肽酶B。此外，理想的是其他來源的羧肽酶B實質上不含前肽。
本領域已知，可以通過重組方式在轉化的宿主有機體中產生羧肽酶B并對其進行純化(例如，Ventura等J.Biol.Chem.(1999)274(28)，19925-33)。
WO0151624公開了在甲基營養酵母Pichia pastoris中豬前羧肽酶B的重組表達。隨后通過胰蛋白酶酶切的方式活化酶原，第一步純化步驟包括疏水層析。隨后添加大豆胰蛋白酶抑制劑，通過Q-瓊脂糖凝膠層析進一步純化活化的酶。WO0151624的純化方法涉及多個步驟并伴隨著羧肽酶B產物的損失。此外，還需從產物中分離大豆胰蛋白酶抑制劑和羧肽酶B前肽。
DE19915938公開了在甲基營養巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)中組氨酸標記的人前羧肽酶B的重組表達。利用親和層析憑借組氨酸標記的優點來純化該產物。隨后，利用胰蛋白酶活化前羧肽酶B并通過添加大豆胰蛋白酶抑制劑來終止該活化反應。通過能除去顆粒大小超過約30000Da的膜的過濾，將羧肽酶B與胰蛋白酶、前肽、抑制劑以及在純化過程中產生的其他片段分開。不過，由于羧肽酶B酶的分子量為約37000Da，可預見到依賴于所采用膜上的孔的大小分布，過濾步驟可造成一定的損耗。此外，由于活化步驟施用于溶解的酶原，因此需要進一步將前肽與羧肽酶B酶分開。
WO9623064中公開了在E.coli中的鼠前羧肽酶B的重組表達。產生了非溶解性的前羧肽酶B的包涵體。該酶原被復性并隨后被進一步純化。針對溶解的酶原進行活化步驟，因此需要進一步將前肽與羧肽酶B酶分開。由于變性/復性步驟，采用這種方法獲得的羧肽酶B酶的產量也相對較低。
根據本發明人所掌握的現有知識，目前沒有已知的區分活化的羧肽酶B和非活化形式的特定方法。

發明內容
本發明要解決的問題之一是提供一種從酶原中生產具有羧肽酶B活性的蛋白的替代方法，其中避免了前肽以非共價的方式結合于具有羧肽酶B活性的蛋白上。本發明要解決的另一問題是在活化步驟之后，提供一種在非變性條件下將具有羧肽酶B活性的蛋白與前肽和殘基酶原分離的替代方法。
根據本發明，提供了一種生產具有羧肽酶B活性的蛋白的方法，其包括如下步驟(a)提供一種含有編碼由N-末端與組氨酸標記融合的大鼠前羧肽酶B和一信號肽構成的前體蛋白的核苷酸序列的載體，由此任選地在組氨酸標記和信號肽之間或在組氨酸標記和大鼠羧肽酶B之間插入一間隔序列；(b)采用該載體轉化一種微生物宿主有機體；(c)在含有營養物和碳源的生長培養基中培養該微生物宿主有機體，由此微生物宿主有機體表達前體蛋白并將組氨酸標記的前羧肽酶B分泌至生長培養基中；(d)把在步驟(c)的生長培養基中的分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B固定在能結合組氨酸標記的顆粒狀的金屬螯合物親和基質上，并沖洗顆粒狀的金屬螯合物親和基質，從而組氨酸標記的前羧肽酶B被固定；(e)在一種含有胰蛋白酶的緩沖液中溫育步驟(d)中的帶有固定化的組氨酸標記的前羧肽酶B的顆粒狀的金屬螯合物親和基質，從而通過蛋白水解方式酶切前羧肽酶B部分并釋放具有羧肽酶B活性的蛋白至液相中，其中組氨酸標記的前肽部分被固定；(f)從顆粒狀的金屬螯合物基質中分離含有具有羧肽酶B活性的蛋白的液相，由此組氨酸標記的前肽部分被固定；和(g)從步驟(f)的液相中純化具有羧肽酶B活性的蛋白。
在本發明的說明書中，某些術語采用了其特定的含義，或首次被定義。為了本發明的目的，在存在這種定義的情況下，并且排除了當這些定義與如下定義相矛盾或部分矛盾的情況下，如下術語采用了其本領域通用的定義。在定義相矛盾的情況下，術語的含義首先采用如下的定義。
氨基酸的識別采用三字母縮寫和氨基酸的單字母表，例如，Asp D表示天門冬氨酸，Ile表示異亮氨酸，Thr T表示蘇氨酸，Leu L表示亮氨酸，Ser S表示蘇氨酸，Tyr Y表示酪氨酸，Glu E表示谷氨酸，Phe F表示苯丙氨酸，Pro P表示脯氨酸，His H表示組氨酸，Gly G表示苷氨酸，Lys K表示賴氨酸，Ala A表示丙氨酸，Arg R表示精氨酸，Cys C表示半胱氨酸，Trp W表示色氨酸，Val V表示纈氨酸，GlnQ表示谷氨酰氨，Met M表示蛋氨酸，Asn N表示天門冬酰胺。在一氨基酸序列中的特定位點的氨基酸由其三字母縮寫和編號來表示。例如，參考天然大鼠前原羧肽酶B的氨基酸序列SEQ ID NO1，“His 14”表示位于氨基酸位置14的組氨酸殘基。
本發明的說明書和權利要求書中所采用的術語“包括”表示“包括，但不必局限于”。
術語“前體蛋白”是指包括其位于N-末端的信號肽的初級翻譯產物。在本發明的上下文中，“前體蛋白”為酶原的前體，即前羧肽酶B。前體酶是由前體蛋白的翻譯后加工而產生的。
“信號肽”是一種存在于來源于可分泌蛋白的前體蛋白形式中的可切除的氨基酸信號序列。蛋白轉運穿過細胞膜，即“分泌”，一般具有一約15至30個氨基酸長度的富含疏水氨基酸的N-末端序列。有時，在穿過細胞膜的過程中，該信號序列被信號肽酶酶切(Alberts，B.，Johnson，A.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Walter，P.(eds)，Molecular Biology of the Cell，第四版，20002，GarlandScience Publishing)。
本領域熟練技術人員已知信號肽的許多來源，其可以包括，例如，來源于啤酒酵母或其類似物的α-因子信號肽的氨基酸序列。一般地基本上任何分泌蛋白的前體蛋白的N-末端都可以為適合于本發明所用的信號肽的潛在來源。一信號肽也可以是包括兩個信號肽的二分體，其引導前體蛋白到達第一個和第二個細胞區域。在分泌途徑中，二分的信號肽被逐步地剪切。為此，一優選的例子是來源于啤酒酵母的α-因子的前導肽(Waters等，J.Biol.Chem.263(1988)6209-14)。一更優選的例子為由SEQ ID NO3的1至255位核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
具有分泌的N-末端信號肽的前體蛋白被引導進入“分泌途徑”。分泌途徑包括翻譯后的加工過程并最終導致前羧肽酶B的分泌。在本發明中應當理解由甲基營養酵母菌株分泌的蛋白已經通過了分泌途徑。
術語“翻譯后加工”表示為了在細胞內或細胞外區域獲得蛋白，使前體蛋白所經受的修飾步驟。在本發明的上下文中，前原羧肽酶B的翻譯后加工產生了分泌的前羧肽酶B。
前羧肽酶B的蛋白水解酶切，如被胰蛋白酶酶切，則被稱為“活化”。本領域熟練技術人員已知根據蛋白水解作用分子作用導致了活化。胰蛋白酶酶切前羧肽酶B，從而產生了無酶活性的“前肽”或“前肽部分”和蛋白水解酶活性的“酶部分”，也就是羧肽酶B。舉例說明，鼠前羧肽酶B的酶部分，也就是鼠前羧肽酶B多肽的“前羧肽酶B部分”為SEQ ID NO4的191至497位的氨基酸序列的多肽。
前羧肽酶B的前肽一般包括95個氨基酸。同時已知通過胰蛋白酶對前羧肽酶B的蛋白水解酶切不僅活化了羧肽酶B還形成了羧肽酶B的胰蛋白酶片段。
“甲基營養酵母”被定義為能利用甲醇作為其碳源的酵母。該術語還包括其實驗室菌株。在甲基營養酵母菌株為營養缺陷型，并且因此需要補充輔助的含碳物質，例如在該甲基營養酵母菌株無法合成足夠量的組氨酸而需要補充組氨酸的情況下，這種輔助物質被看作是營養物質而非碳源。
“載體”被定義為可可包括，例如攜帶和保持本發明的DNA片段的DNA，其包括如噬菌體和質粒。遺傳工程領域的熟練技術人員應當能理解這些術語的含義。術語“表達盒”是指編碼前體蛋白的核苷酸序列，它與一啟動子和一終止子可操縱地相連接。對于含有表達盒載體來說，術語“載體”和“表達載體”是同義詞。
“轉化”是指將DNA導入有機體使得該DNA作為染色體外的元件是可復制的或通過染色體整合的方式是可復制的。
術語“游離體”是指由一系列的基因組成的一種遺傳物質單位，其有時獨立地存在于宿主細胞之中，有時被整合至細胞染色體，與染色體一起進行自我復制。一種游離體的例子為

圖1的載體。
術語“表達”和其動詞“表達”表示DNA序列的轉錄和/或轉錄的mRNA在宿主有機體中的翻譯從而產生前體蛋白，即不包括翻譯后的步驟。
當至少一部分核苷酸序列，或其互補序列可被直接翻譯來提供肽或蛋白的氨基酸序列時，或當分離的核苷酸序列可以單獨使用或作為表達載體的一部分使用，在原核宿主細胞或真核宿主細胞中用于體外表達肽或蛋白時，一種核苷酸序列“編碼”了一種肽或蛋白。
所有的核苷酸序列均以從5’端(表示起始處)到3’端的方向書寫，也稱為從5’至3’的方向。
“啟動子”為刺激轉錄的調節核苷酸序列。遺傳工程領域的熟練技術人員應當可以理解這些術語的含義。如同啟動子一樣，一“啟動子元件”調控轉錄不過組成了一個較大的啟動子序列的亞片段。
術語“可操縱地連接的”是指在一個單一的載體上的兩個或多個核酸片段的聯系從而一個片段的功能受到另一個片段的影響。例如，一個啟動子可操縱地與一編碼序列連接，也就是一種編碼一種蛋白或一種前體蛋白的核苷酸序列，當它能影響編碼序列的表達時，即該編碼序列在該啟動子的轉錄調控之下。
“肽鍵”是介于兩個氨基酸之間的共價鍵，其中一個氨基酸的α-氨基基團與另一個氨基酸的α-羧基基團鍵合。
發明詳述本發明的第一個實施方案為一種生產具有羧肽酶B活性的蛋白的方法，包括如下步驟a)提供一種含有編碼由N-末端與組氨酸標記融合的大鼠前羧肽酶B和一信號肽構成的前體蛋白的核苷酸序列的載體，由此任選地在組氨酸標記和信號肽之間或在組氨酸標記和大鼠羧肽酶B之間插入一間隔序列；(b)采用該載體轉化一種微生物宿主有機體；(c)在含有營養物和碳源的生長培養基中培養該微生物宿主有機體，其中微生物宿主有機體表達前體蛋白并將組氨酸標記的前羧肽酶B分泌至生長培養基中；(d)把步驟(c)的生長培養基中的分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B固定在能結合組氨酸標記的顆粒狀的金屬螯合物親和基質上，并沖洗顆粒狀的金屬螯合物親和基質，從而將組氨酸標記的前羧肽酶B固定；(e)在一種含有胰蛋白酶的緩沖液中溫育步驟(d)中的帶有固定化的組氨酸標記的前羧肽酶B的顆粒狀的金屬螯合物親和基質，從而通過蛋白水解方式酶切前羧肽酶B部分并釋放具有羧肽酶B活性的蛋白至液相中，由此組氨酸標記的前肽部分被固定；(f)從顆粒狀的金屬螯合物基質中分離含有具有羧肽酶B活性的蛋白的液相，由此組氨酸標記的前肽部分被固定；和(g)從步驟(f)的液相中純化具有羧肽酶B活性的蛋白。
當構建用于轉化微生物宿主菌株，如甲基營養酵母菌株的載體時，一些分子克隆技術將需要把連接或間隔序列添加至編碼前體蛋白功能元件的核苷酸序列中。例如當包括前體蛋白的功能元件的編碼序列的DNA片段被限制性內切酶從克隆載體上切下，產生一長于編碼序列的片段時，也可以產生間隔序列。為什么連接或間隔核苷酸序列會出現的其他原因也是可能的。基于這種考慮，編碼前體蛋白的功能元件的核苷酸序列編碼(a)信號肽，(b)組氨酸標記和(c)前羧肽酶B部分。因此，由于這種連接核苷酸序列的存在，另外的氨基酸，即“間隔序列”，可以被插入前體蛋白的任意兩個功能元件的連接點處。一為此的實施例是在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的86和87氨基酸位置處由絲氨酸殘基和丙氨酸殘基組成的間隔序列。在本發明的前體蛋白中優選的是由不超過4個氨基酸殘基組成的間隔序列，更優選為由兩個氨基酸殘基組成的間隔序列。編碼間隔序列的連接核苷酸序列的插入在某種意義上是“任選的”，這基于所述的插入將有助于分離的編碼兩個功能元件的核苷酸序列的連接，形成編碼前體蛋白或其前體的核苷酸序列。
組氨酸標記是一種優選含有6個連續的組氨酸的氨基酸序列。由于組氨酸代表了基本的部分，還有極少的另外的氨基酸包含在組氨酸標記部分中。重要的是，本發明中采用的組氨酸標記不給分泌蛋白增加另外的相關的胰蛋白酶酶切位點。因此，在固定化的組氨酸標記的前羧肽酶B的柱上活化期間的條件下，酶原的胰蛋白酶酶切位點仍然是優選的酶切位點。在固定化的組氨酸標記的前羧肽酶B的柱上活化后，該前肽仍然通過組氨酸標記結合于顆粒狀的金屬螯合物基質上。
利用固定化的金屬親和層析有助于分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B的純化。該方法是用于純化含有由組氨酸殘基構成的短親和標記(組氨酸標記)的重組蛋白的一種廣泛采用的方法。固定化的金屬親和層析(記載于Porath，J.等，Nature 258(1975)598-599)基于固定在顆粒狀的金屬螯合物親和基質上的過渡金屬離子(Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+)與特定氨基酸側鏈的相互反應。組氨酸是一種顯示出與固定化的金屬離子基質之間有最強相互反應的氨基酸，因為組氨酸咪唑環上的電子供體基團很容易與固定化的過渡金屬形成配位鍵。含有連續的組氨酸殘基序列的肽能有效地保留于螯合顆粒狀金屬的親和柱上。在沖洗基質材料后，含組氨酸序列如組氨酸標記的肽可很容易地通過調整柱緩沖液的低pH(酸性)或通過加入游離的咪唑來洗脫。
純化帶有組氨酸殘基的蛋白的方法首次在Hochuli，E.等，J.Chromatogr.411(1987)177-184中記載。該文獻記載了一種用于金屬螯合物親和層析的次氮基三乙酸吸附劑(NTA)。NTA樹脂形成了四配位體螯合物，并且特別適用于具有6個配位鍵數目的金屬離子，因為其中兩價保留用于對生物高分子的可逆結合。具有組氨酸標記的二氫葉酸還原酶可以采用如Houchuli，E.等，Bio/Technology 6(1988)1321-1325中所述的Ni2+-NTA基質成功地進行純化。該系統的純化效率取決于組氨酸標記的長度和溶劑系統。當該系統在變性條件下能有效地對His6-標記的蛋白進行工作時，在生理條件下His3-標記的蛋白可被有效地純化。不過，His6-標記的蛋白可在低或高鹽緩沖液中在非變性條件下與Ni2+-NTA基質結合。在結合后，可以通過梯度為0.8至250mM的咪唑來洗脫靶蛋白。采用低濃度的咪唑(如0.8mM)洗脫可用于降低宿主蛋白與組氨酸的非特異性結合。
在本發明中，固定化步驟優選地在存在咪唑的條件下進行。在這些條件下，發現其他含組氨酸的蛋白的非特異性結合減少了。基于這種考慮，優選的咪唑的濃度在0.01mM至1mM范圍內。
用于純化組氨酸標記的蛋白的另一種開發的材料是TALON。其含有與固相載體樹脂偶聯的羧甲基天冬氨酸鹽(Co2+-CMA)。據報道，TALON比Ni2+-NTA樹脂顯示出更少的非特異性的蛋白結合，從而導致了更高的洗脫產物純度(Chaga，G.等，Biotechnol.Appl.Biochem.29(1999)19-24；Chaga，G.Et al.，J.Chromatogr.A 864(1999)257-256)。
組氨酸標記通常位于重組蛋白的N-或C-末端。標記的最理想的位置是蛋白特異性的。采用組氨酸標記的純化已在許多表達系統中被成功地實施了，這些系統包括細菌(Chen，B.P.&Hai，T.，Gene 139(1994)73-75；Rank，K.B.等，Protein Expr.Purif.22(2001)258-266)、酵母(Borsing，L.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.240(1997)586-590；Kaslow，D.C.&Shiloach，J.，Bio/Technology 12(1994)494-499)，哺乳動物細胞(Janknecht，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)8972-8976；Janknecht，R.&Nordheim，A.，Gene 121(1992)321-324)，和病毒感染的昆蟲細胞(Kuusinen，A.等，Eur.J.Biochem.233(1995)720-726；Schmidt，M.等ProteinExpr.Purif.12(1998)323-330)。有超過100個組氨酸標記的蛋白結構被保藏于蛋白質數據庫中。將其鑲嵌現象和衍射與天然蛋白的相比較，攜帶有組氨酸標記的蛋白僅稍有不同(Hakansson，K.等ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.56(2000)924-926)。原則上，不排出組氨酸標記干涉蛋白活性的可能(Wu，J.&Filutowicz，M.，Acta Biochim.Pol.46(1999)591-599)，但是組氨酸標記的相對小的尺寸和電荷保證了蛋白活性幾乎不受影響。將組氨酸標記移至相對的末端(Halliwell，C.M.等，Anal Biochem.295(2001)257-261)或在變性條件下進行純化常常可以解決這種問題。
在生長培養基中分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B被固定于能結合組氨酸標記的顆粒狀的金屬螯合物親和基質上。例如，組氨酸標記的前羧肽酶B可被吸附至固定于螯合金屬的樹脂上的金屬顆粒上。如上文所述，這種樹脂是本領域技術人員所公知的。一種優選的顆粒狀的金屬螯合物親和基質為覆蓋有鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)的層析材料。基于這種考慮，本領域的熟練技術人員知道EP0253303、EP0282042、EP1069131。Qiagen使QIA表達純化系統商業化，其可用于固定化步驟。該家公司還提供了一種可用于生產組氨酸標記的融合多肽的表達載體(pQE)。基于這種考慮，本領域的熟練技術人員同樣也知道US5284933和US5310663。
具有金屬中心的蛋白的純化可能需要特別適應的純化方法，因為該金屬可以被NTA吸附。在厭氧條件下的純化也需要特別適應的純化方法，因為Ni2+-NTA被還原了。雖然如此，具有組氨酸標記的前體蛋白的純化是目前最常采用的方法之一。
羧肽酶B含有Zn2+作為輔因子。由于這種原因，除了采用Ni2+-NTA作為層析純化的基質之外，優選采用負載了Zn2+的螯合金屬的親和基質。從而可以避免任何偶然的和不希望的Ni2+替代Zn2+輔因子現象的發生。
因此更優選的顆粒狀的金屬螯合物親和基質是負載了Zn2+的(即固定了Zn2+離子的)StreamlineTM螯合吸附劑(AmershamBioscences)。StreamlineTM螯合吸附劑是以瓊脂糖為基礎的。高度交聯的瓊脂糖基質的大孔結構對大分子物質，如蛋白質有非常好的結合能力，并具有很高的化學和機械穩定性。高的機械穩定性是基質的一種非常重要的特性，其可用于膨脹床層析柱中以減少當顆粒在膨脹床中自由移動時的摩擦效應。僅由有機材料制成的顆粒只有有限的密度，因此為了達到所需的高沉降速度顆粒必須具有很大的直徑。這種大的顆粒直徑導致了長擴散的路徑長度，這導致了相當大的質量遷移阻力，從而降低了生產率。因此，StreamlineTM吸附劑以含有比有機材料密度更大的內核物質的復合顆粒為基材。可以設計這種顆粒從而在合理的顆粒大小時其沉降速度仍然很高。
膨脹床吸附是一種簡單的通過操作，其中理想的蛋白從粗的含顆粒的原料中被純化得到，并且無須對原料進行澄清、濃縮和初步純化。吸附床的膨脹在吸附劑顆粒間產生了一定距離，也就是增加了床中的空隙率(空隙體積部分)，其允許細胞、細胞碎片和其他顆粒在原料加樣過程中無障礙地通過。
通過向柱中施加向上的液體流來膨脹和平衡顆粒狀的金屬螯合物親和基質(如StreamlineTM)吸附劑。由于在顆粒的沉積速度和向上的液體流動速度之間達到平衡，當吸附劑顆粒懸浮于平衡液中時，一種穩定的流化床就形成了。在這期間柱銜接頭位于柱的上部分。粗的、未澄清的原料，即含有分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B和微生物宿主有機體的培養基被加樣于具有如膨脹和平衡期間所采用的相同的向上液流的膨脹床中。通過組氨酸標記與吸附劑的結合使組氨酸標記的前羧肽酶B被固定，而細胞碎片、細胞、顆粒和污染物則無障礙地通過。利用向上的液流將弱結合的物質，如殘留的細胞、細胞碎片和其他類型的顆粒物質從膨脹床中沖洗出來。當弱結合的物質被從床中沖洗出來后，通過利用胰蛋白酶對組氨酸標記的前羧肽酶B進行柱上酶切而活化，從而保持了向上的液流模式。羧肽酶B被釋放并從柱中洗脫下來。流通物中含有濃度增加、澄清、部分純化的靶蛋白，并備用于填充床以進行進一步的純化。
如何使用優選的顆粒狀的金屬螯合物親和基質，如StreamlineTM螯合吸附劑(Amersham Biosciences)和如何設定、優化和操作膨脹床層析在Pharmacia Biotech手冊“ Expanded bed adsorption，principles and methods”中(ISBN 91-630-5519-8)進行了進一步的詳細描述。其中也記載了如何進行柱再生的常規方法。
大量的微生物宿主有機體可用于本發明。主要的要求是所述的微生物宿主有機體經工程改造和培養使得它可以分泌組氨酸標記的前羧肽酶B至生長培養基中。在一優選的實施方式中，所述的微生物宿主有機體為原核生物。基于這種考慮，本領域的熟練技術人員熟知各種用于基于細菌如大腸桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌的重組表達和分泌的商業上可購得的細菌系統。在一更優選的實施方式中，微生物宿主有機體是一種微生物真核生物。非常優選的是酵母物質。在一更加優選的實施例中，所述的微生物有機體為甲基營養酵母菌株。
因此，在本發明的另一實施方式中，組氨酸標記的大鼠前羧肽酶B是通過采用甲基營養酵母作為非動物宿主有機體的重組方式來生產的。甲基營養酵母具有甲醇利用所必需的生物化學途徑，并根據細胞形態核生長特性將其分為4個屬Hansenula，Pichia，Candida，和Torulopsis。最高度發展的甲基營養酵母系統利用巴氏畢赤酵母Pichia pastoris(Komagataella pastoris)和多形漢遜酵母Hansenulapolymorpha(Pichia angusta)。
酵母中異源蛋白的表達記載于US5618676、US5854018、US5856123和US5919651中。
酵母有機體產生了許多在細胞內合成但在細胞外表現功能的蛋白。這種胞外蛋白被稱為分泌蛋白。最初這種分泌蛋白在細胞內以前體和含N-末端信號肽的前體蛋白形式在細胞內表達，所述的信號肽保證有效地引導表達的產物進入細胞分泌途徑，穿過內質網膜。所述的信號肽通常在易位過程中從目的產物中切下。通過信號肽酶以蛋白水解方式有效地進行酶切。信號肽酶識別和酶切信號肽的一種特定的氨基酸亞序列。這種亞序列被稱為信號肽酶切位點。一旦進入分泌途徑，所述的蛋白被轉運至高爾基體上。所述蛋白從高爾基體上被分配至質膜、溶酶體和分泌泡中。
與胞內蛋白相比，分泌的蛋白面對了各種不同的環境條件。分泌途徑的部分步驟是穩定變性的胞外蛋白。因此，通過了酵母的分泌途徑的前體蛋白經歷了特定的翻譯后加工步驟。例如，所述的加工可以包括二硫鍵的產生從而形成分子內交聯。此外，蛋白的特定氨基酸可以被糖基化。
許多的方法已經被建議用于在酵母中表達和分泌酵母的異源蛋白。EP0116201記載了一種方法，通過該方法酵母的異源蛋白經裝載有編碼目的蛋白的DNA、一種信號肽和一表現為信號肽酶切位點的肽的表達載體來轉化。制備轉化的有機體培養物并進行培養，并從培養基中回收蛋白。為了在酵母細胞中應用，一種合適的信號肽被發現為來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子信號肽(US4870008)。
在分泌過程中，酵母酶KEX-2是識別賴氨酸-精氨酸序列作為其前體蛋白的酶切位點的信號肽酶。KEX-2在目的蛋白序列的連接處進行酶切。結果是，目的基因產物被釋放并不含引導部分，即前體蛋白的信號肽。KEX-2內切蛋白酶原始來源于釀酒酵母，在其中它特異性地作用于配對型α-因子的前體和一種殺傷因子(Julius，D.等，Cell37(1984)1075-1089)。甲基營養酵母菌株如巴氏畢赤酵母具有與釀酒酵母相同的KEX-2型蛋白酶(類似的作用和功能)(Werten，M.W.等，Yeast 15(1999)1087-1096)。
一作為高水平重組蛋白表達的宿主、以實施例方式記載的良好構建的甲基營養酵母菌株為巴氏畢赤酵母(US4683293、US4808537、US4812405、US4818700、US4837148、US4855231、US4857467、US4879231、US4882279、US4885242、US4895800、US4929555、US5002876、US5004688、US5032516、US5122465、US5135868、US5166329、WO0056903)。在缺乏葡萄糖的條件下，巴氏畢赤酵母采用甲醇作為碳源，這同時也是甲基營養有機體的一種證明。以SEQ IDNO5表示的乙醇氧化酶(AOX1)啟動子調控了乙醇氧化酶的表達，這催化了甲醇代謝的第一步。典型的，在甲醇誘導的細胞中，可溶性蛋白總數的30％為乙醇氧化酶。好幾種畢赤酵母表達載體攜帶了AOX1啟動子并采用甲醇來誘導目的異源蛋白的高水平表達。表達構建體同樣被整合至巴氏畢赤酵母的基因組中，從而產生了轉化的遺傳穩定的宿主。
采用編碼包括信號肽或具有信號肽酶切位點的信號肽和目的蛋白的異源前體蛋白的表達載體，甲基營養酵母菌株，如巴氏畢赤酵母菌株可以被操作從而可以分泌目的蛋白產品至生長培養基中，從培養基中可以純化該分泌蛋白。其可有助于生產編碼擁有實質上不同的密碼子應用的前體蛋白的核苷酸序列。
就編碼的前羧肽酶B多肽來說，包括于SEQ ID NO3中的核苷酸序列不同于以前公開的核苷酸序列如SEQ ID NO1，這是由于遺傳密碼子的簡并性造成的。SEQ ID NO3的286至1497位核苷酸序列編碼了與SEQ ID NO1的40至1248位核酸所編碼的相同的多肽。不過，SEQ ID NO3摻入了兩個氨基酸的交換，即Lys201Asn和Arg329Asp。這些氨基酸的交換同樣也記載于WO9623064中。術語“簡并密碼”表示在遺傳密碼中一種特定的氨基酸可采用兩種或更多的不同密碼子來編碼。簡并性的發生是由于有64種可能的堿基三聯體，其中3種用于編碼終止信號，而剩下的61種用于編碼僅有的20種不同的氨基酸的這樣一個事實。
從而，可以根據宿主所采用的特定密碼子的頻率選擇密碼子來增加其中發生在特定酵母表達宿主的前體蛋白的表達比率。作為實質上改變編碼前體蛋白的核苷酸序列，而不改變編碼的氨基酸序列的核苷酸序列的其它原因，包括RNA轉錄子的產生，其中所述的轉錄子比天然存在的序列產生的轉錄子具有更理想的特性如更長的半衰期。SEQ IDNO3的核苷酸序列是一種采用這種方式優化的編碼序列的例子。
采用一種編碼前體蛋白的有能力表達的載體，即可操縱地與一啟動子或啟動子元件和終止子或終止子元件相連的，以及和有效翻譯所需的序列相連的，采用該載體轉化所述的宿主有機體并挑選轉化體。隨后根據分泌至培養基中的重組蛋白的產量來分析轉化體。挑選分泌最多量的重組蛋白的轉化體。因此篩選得到分泌最多量的組氨酸標記的前羧肽酶B的轉化體。
另一方面，表達的產量還依賴于目的產物的正確靶向，也就是說通過信號肽將前體蛋白靶向酵母的分泌途徑。一信號肽的例子為在SEQID NO3中的1至255位編碼的來源于釀酒酵母的α-因子信號肽。另外，可通過增加編碼目的蛋白的基因的量來增加表達產量，如擴大宿主有機體中的表達構建體的拷貝數目。實現這個目標的一種方法是多倍轉化編碼目的產物的表達載體。向宿主有機體中導入編碼目的蛋白的基因的方式是采用第一和第二表達載體，其中第二表達載體是基于與第一表達載體所采用的選擇性標記不同的選擇性標記。當宿主有機體已攜帶了第一表達載體的多個拷貝時，編碼相同目的產物的第二表達載體仍可導入宿主中(US5324639；Thill，G.P.，等，Positive andNegative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichiapastoris，International Symposium on the Genentics ofMicroorganisms 2(1990)，pp.477-490；Vedvick，T.，等，J.Ind.Microbiol.7(1991)197-201；Werten，M.W.，等，Yeast15(1999)1087-1096)。
前羧肽酶B的分泌引導融合蛋白至細胞質外區域，從那里它擴散到培養基中。因此，在本發明一種優選實施方式中，甲基營養酵母在液體培養基中生長并分泌前羧肽酶B至液體生長培養基中，也就是液體培養基中。這允許通過，如膨脹床色譜技術非常有效地將酵母的生物質與重組蛋白分開。其結果是，從酵母來源的有機體中純化得到的前羧肽酶B可以有效地排除其他不理想的酶活性。
就在優選實施例中甲基營養酵母菌株轉化的載體來說，本領域熟練技術人員熟知各種能允許攜帶含有一種被稱作“組氨酸標記”、“(多聚)組氨酸標記”、或“組氨酸-標記”的融合多肽構建體的表達載體。在本發明的優選蛋白中，一種氨酸標記融合至前羧肽酶B多肽的N-末端。該組氨酸標記總共包括六個連續的組氨酸殘基。基于此，本領域的熟練技術人員將注意到前羧肽酶B多肽的N-末端氨基酸也是組氨酸。因此，在標注的編碼前體蛋白的核苷酸序列中，存在著融合的編碼序列中的重疊，其中組氨酸標記的最后一個組氨酸的密碼子也代表前羧肽酶B部分的第一個組氨酸。
在活化后，即胰蛋白酶對固定化的組氨酸標記的前羧肽酶B的酶切，組氨酸標記的多肽部分保持與顆粒狀的金屬螯合物親和基質的結合。活化的羧肽酶B被釋放并在步驟(f)中被從顆粒狀的金屬螯合物親和基質上分離下來。因此，從液相中分離的顆粒狀的金屬螯合物親和基質同時也使前肽與羧肽酶B酶分離。通過這種方法，也避免了前肽與羧肽酶B的非共價結合。
優選地，載體包括一種編碼由大鼠前羧肽酶B和信號肽構成的前體蛋白的核苷酸序列，其中所述的前羧肽酶B的N-末端與組氨酸標記融合，由此任選地將一間隔序列插入組氨酸標記和信號肽之間。更優選的大鼠前羧肽酶B的氨基酸序列為SEQ ID NO3的第14至415位的氨基酸序列。同時還優選，所述的信號肽含有一信號肽酶的酶切位點，其位于組氨酸標記附近或間隔序列附近。非常優選所述的表達前體蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO4的氨基酸序列。更優選編碼大鼠前羧肽酶B的核苷酸序列為SEQ ID NO3的第286至1497位的核苷酸序列。進一步優選編碼前體蛋白的核苷酸序列是在SEQ ID NO3中的核苷酸序列。更加優選編碼前體蛋白的核苷酸序列與啟動子或啟動子元件可操縱地連接。
為了能夠使編碼前體蛋白的核苷酸序列轉錄，優選編碼前體蛋白的核苷酸序列與啟動子或啟動子元件可操縱地連接。非常優選來源于巴氏畢赤酵母的啟動子或啟動子元件，更優選如SEQ ID NO5所示的巴氏畢赤酵母的AOX1啟動子。此外還優選，在甲基營養酵母中，編碼前體蛋白的核苷酸序列與指導轉錄終止的終止序列可操縱地連接。非常優選的是來源于巴氏畢赤酵母的終止子，更優選巴氏畢赤酵母的AOX1終止子。
進一步優選所述載體為能在甲基營養酵母菌株中以游離體形式復制的質粒。因此，優選的質粒為包括指導游離體在甲基營養酵母菌株中復制的復制起點的環狀核酸分子。此外，所述的質粒包括能在甲基營養酵母菌株中表達的選擇性標記，由此所述的選擇性標記能選擇質粒是否在甲基營養酵母菌株中存在。一種非常優選的選擇性標記為ZeocinTM抗性基因，這是來源于來自Streptoalloteichushindustanus的天然的Sh ble基因或其經遺傳工程改造的變體(Drocourt，D.，等，Nucleic Acids Res.18(1990)4009；Carmels，T.，等，Curr.Genet.20(1991)309-314)。另一中非常優選的選擇性標記具有抗氨基糖苷類抗生素如潮霉素和G418的抗性(Southern，P.J.，&Berg，P.，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)327-341)。
一種這種選擇性標記的例子為氨基糖苷類磷酸轉移酶基因。
進一步優選能在甲基營養酵母菌株中復制的人工染色體含有所述的載體。因此，優選的人工染色體為線狀的核酸分子，其包括至少一個轉錄起點、一個著絲粒和末端端粒，從而調控人工染色體在甲基營養酵母菌株中的復制、整合和有絲分裂/減數分裂分布。此外，包括在人工染色體中的載體包含一種在甲基營養酵母菌株中表達的選擇性標記并用于篩選在甲基營養酵母菌株中復制的人工染色體的載體的存在與否。一種非常優選的選擇性標記為ZeocinTM抗性基因，這是來源于印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的天然的Sh ble基因或其經遺傳工程改造的變體。另一非常優選的選擇性標記具有抗氨基糖苷類抗生素如潮霉素和G418的抗性。一種這種選擇性標記的例子為氨基糖苷類磷酸轉移酶基因。
甚至更優選甲基營養酵母菌株的染色體含有所述的載體。非常優選所述的載體具有與染色體序列相同的核苷酸序列，從而所述的載體能通過位點特異性重組的方式整合至宿主染色體上。為此目的，巴氏畢赤酵母的AOX1的位置甚至更優選的作為通過點特異性重組整合至宿主染色體中的位置。同時非常優選的是，所述的載體包括一種能在甲基營養酵母中表達的選擇性標記并允許選擇所述載體在甲基營養酵母菌株中的存在與否。一種非常優選的選擇性標記為ZeocinTM抗性基因，這是來源于印度斯坦鏈異壁菌的天然的Sh ble基因或其經遺傳工程改造的變體。另一非常優選的選擇性標記具有抗氨基糖苷類抗生素如潮霉素和G418的抗性。一種這種選擇性標記的例子為氨基糖苷類磷酸轉移酶基因。
本領域熟練技術人員知曉如下事實當編碼前體蛋白的核苷酸序列的拷貝數目增加時，來源于生長培養基，如液體生長培養基的分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B的產量會增加。因此，當甲基營養酵母菌株基因組中的載體拷貝數目增加時，來源于生長培養基中的分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B分子的產量也增加。例如，可以通過重復轉化所述載體至甲基營養酵母菌株和通過增加包括在載體中的抗性的選擇性標記所抗的選擇性試劑的濃度來重復篩選從而增加載體的拷貝數目(US5324639，Thill，G.P.，等，Positive and Negative Effects ofMulti-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris，International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2(1990)，pp.477-490；Vedvick，T.，等，J.Ind.Microbiol.7(1991)197-201)。
本領域熟練技術人員還知曉如下事實采用一個以上的載體可進行重復的轉化。例如，采用第一或第二載體可實現重復轉化，其中第一和第二載體編碼相同的前體蛋白，其中在第一和第二載體中編碼前體蛋白的核苷酸序列可操縱地與啟動子或啟動子元件相連，其中相同的前體蛋白被表達并且組氨酸標記的前羧肽酶B被分泌，其中第一和第二載體具有對第一和第二選擇性標記的抗性。
第一選擇性標記的一個例子為Sh ble基因，即ZeocinTM抗性基因(Drocourt，D.，等，Nucleic Acids Res.18(1990)4009；Carmels，T.，等，Curr.Genet.20(1991)309-314)。由Sh ble基因編碼的蛋白與ZeocinTM化學定量的結合并具有較強的親和力。ZeocinTM的結合抑制了其毒性活性從而選擇了含有Sh ble基因的轉化體。本領域熟練技術人員已知增加培養基中作為篩選試劑的ZeocinTM濃度，可以篩選表達Sh ble基因的載體的拷貝數目的增加。因此，通過采用攜帶Sh ble基因作為選擇性標記的載體非常有利于重復轉化含有多個載體拷貝的釀酒酵母菌株的多重轉化體。更有利的是，不斷重復地轉化并且也不斷重復地篩選更具抗性的轉化體直到對于轉化的甲基營養酵母菌株來說，沒有獲得ZeocinTM抗性水平的進一步的增加，或在選擇培養基中沒有進一步增加ZeocinTM濃度的可能性。
在采用第一和第二載體的情況下，第二選擇性標記的一個例子是抗氨基糖苷類抗生素的抗性(Southern，P.J.，&Berg，P.，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)327-341)，如G418。因此第二載體的一個實例表達了一具有抗G418的抗性基因。例如，本領域已知許多氨基糖苷類磷酸轉移酶具有抗氨基糖苷類抗生素的抗性(van Treeck，U.，等，Antimicrob Agents Chemother.19(1981)371-380；Beck，E.，等，Gene 19(1982)327-336)。氨基糖苷類磷酸轉移酶I(APH-I)酶具有失活抗體G418的能力并且是酵母中一種已經建立的選擇性標記(Chen，X.J.，&Fukuhara，H.，Gene，Vol.69(1988)181-192)。
因此，為了進一步增加編碼前體蛋白的核苷酸序列的量，第二載體非常有利地用于進一步輪次的轉化和篩選，其中在這種情況下一種優選的選擇性試劑為G418并且因此采用了被第一載體轉化的甲基營養酵母菌株。
進一步優選的甲基營養酵母菌株為漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母、光滑球擬酵母菌株。在本發明的一非常優選的實施方式中，甲基營養酵母菌株選自巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、波氏假絲酵母(Candida boidinii)、光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)。
更優選的巴氏畢赤酵母菌株被保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，其入藏號為201178、201949、204162、204163、204164、204165、204414、204415、204416、204417、20864、28485、34614、60372、66390、66391、66392、66393、66394、66395、76273、76274、和90925。
不過，更優選的甲基營養酵母菌株為美國典型培養物保藏中心編號為76273的巴氏畢赤酵母菌株或其衍生物。
更優選的多形漢遜酵母菌株被保藏在美國典型培養物保藏中心，入藏號為14754、200499、200500、200501、200502、200503、200504、200505、200506、200507、200508、200509、200510、200511、200512、200513、200838、200839、201322、204205、22023、26012、34438、36669、38626、44954、44955、46059、48180、58401、62809、64209、66057、76722、76723、76760、90438、96694、96695、MYA-335、MYA-336、MYA-337、MYA-338、MYA-339、和MYA-340。
更優選的波氏假絲酵母菌株被保藏在美國典型培養物保藏中心，入藏號為18810、201209、20432、26175、32195、32929、36351、38256、38257、44637、46498、48180、56294、56507、56897、60364、62807、90439、90441、96315、和96926。
更優選的光滑球擬酵母菌株被保藏在美國典型培養物保藏中心，入藏號為15126、15545、2001、22019、26512、28226、28290、32312、32554、32936、34147、34449、36909、38326、4135、46433、48435、58561、66032、750、和90030。
本發明的另一實施例為采用含有載體的染色體轉化的氏畢赤酵母菌株，其中所述載體包括一種編碼前體蛋白的核苷酸序列，所述的前體蛋白由N-末端與組氨酸標記融合的前羧肽酶B和信號肽組成，所述的核苷酸序列與如SEQ ID NO5所示的氏畢赤酵母菌株AOX1啟動子或其啟動子元件可操縱地連接，其中編碼前體蛋白的核苷酸序列為SEQID NO3的核苷酸序列。還優選包括編碼前體蛋白的核苷酸序列的載體，所述的前體蛋白由N-末端與組氨酸標記融合的前羧肽酶B和信號肽組成，由此任選地在組氨酸標記和信號肽之間插入一間隔序列。
本發明的另一實施例為來源于如本發明所述的方法的具有羧肽酶B活性的蛋白，其基本上不含有羧肽酶B的前肽。術語“基本上不含”表示采用質譜檢測方式測得的所述前肽的量在檢測水平以下。實施例8記載了一示例性的分析。
如實施例8所示，具有羧肽酶B活性的純化蛋白絕大多數缺乏C-末端酪氨酸(SEQ ID NO4中的Tyr497)。只有非常少的一小部分純化蛋白仍含有該氨基酸。因此，根據本發明，基本上不含羧肽酶B的前肽的具有羧肽酶B活性的蛋白具有SEQ ID NO4的191至496位的氨基酸序列。
實施例9顯示，在經過如實施例7所示的第一次純化步驟后，收集的庫中含有幾乎等量的具有C-末端酪氨酸的產物和不具有C-末端酪氨酸的產物的產物。在加工過程中末端酪氨酸殘基被逐步除去。在第二次層析純化步驟后，絕大多數蛋白類物質幾乎全部缺失了C-末端酪氨酸。因此一種可能的但未經證實的解釋是用于表達和分泌產物的宿主有機體產生了具有羧肽酶Y活性的蛋白。羧肽酶Y是已知的來源于啤酒酵母的具有廣泛特異性的切除C-末端氨基酸的能力。雖然羧肽酶Y已知是一種空泡酶(Kato，M.等，Eur.J.Biochem 270(2003)4587-4593)，但是裂解的酵母細胞可顯著提高發酵培養基中的羧肽酶Y的活性。不過，既然除去C-末端酪氨酸并未改變具有羧肽酶B活性的蛋白的總體上的酶學特性，并且既然在C-末端沒有進一步的氨基酸被除去，假定的羧肽酶Y活性的失活或另外的分離不被認為是一定必需的。
不過本發明的另一實施方式涉及應用如本發明所述的基本上不含羧肽酶B前肽的具有羧肽酶B活性的蛋白用于蛋白水解酶切肽鍵。優選的是肽鍵的酶切受來源于多肽中C-末端處的堿性氨基酸、賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸的催化水解的影響。更優選的是所述的具有羧肽酶B活性的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO4第191至第496位的氨基酸序列。
非常優選的是如本發明所述的基本上不含羧肽酶B前肽的具有羧肽酶B活性的蛋白的應用的特點在于胰島素前肽鍵被切除。因此操作過程記載于，如EP0264250和EP0195691。因此，胰島素前體通過胰蛋白酶和具有羧肽酶B活性的蛋白來進行蛋白水解酶切。更優選，具有羧肽酶B活性的蛋白催化了來源于胰島素前體胰蛋白酶蛋白水解產物的C-末端處的堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸的水解酶切。
不過，本發明的另一實施例為一種含有如本發明所述的基本上不含羧肽酶B前肽的具有羧肽酶B活性的蛋白的試劑溶液。優選的試劑溶液中的具有羧肽酶B活性的蛋白能催化來源于肽或前肽C-末端處的堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸的水解酶切。更優選的是試劑溶液中具有羧肽酶B活性的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO4的191位至496位的氨基酸序列。一種含有具有羧肽酶B活性的蛋白的試劑溶液通常為另外還含有緩沖鹽的水溶液。不過，其他成分也是可以的并且為本領域熟練技術人員所公知。其他成分的一個例子為胰蛋白酶。
提供如下的實施例、參考文獻、序列表和圖有助于進一步理解本發明，本發明實際要保護的范圍由所附的權利要求書所限定。應當理解在不背離本發明的主旨的情況下可以對其中所述的方法進行各種改進。
附圖簡述圖1載體Pcpb-1的圖解表示。該載體含有一種編碼前體蛋白的核苷酸序列，該前體蛋白是一種包括來源于啤酒酵母的α-因子信號肽(命名為“α-Faktor-SS”)和組氨酸標記的前羧肽酶B的融合蛋白。編碼前體蛋白的核苷酸序列受到AOX1啟動子(命名為“AOX1-啟動子”)和AOX1終止子(命名為“AOX1-TT”)的轉錄調控。所述載體具有抗Zeocin的抗性。
圖2a表示對按照實施例8的羧肽酶B制劑進行的示例性的質譜分析結果的圖表。其中X-軸表示m/z值(m＝離子質譜；z＝離子電荷)。星號標明相應于個別的羧肽酶B二聚物的峰。
圖2b表示對按照實施例8的羧肽酶B制劑進行的示例性的質譜分析結果的圖表。其中X-軸表示以[Da]表示的離子分子量。
圖3(a)部分顯示了假設的m/z值和相應于羧肽酶B前肽，也被稱作12132Da肽的峰。被命名為(b)的部分顯示了如圖1a的光譜的相應的削波。其中部分(a)和(b)的X-軸對齊，并具有相同的標度。
圖4(a)部分顯示了假設的m/z值和相應于羧肽酶B前肽，也被稱作10746Da肽的峰值。被命名為(b)的部分顯示了如圖1a的光譜的相應的削波。其中部分(a)和(b)的X-軸對齊，并具有相同的標度。
圖5用按照實施例8的酶制劑所獲得的光譜削波。
圖6表示對產物羧肽酶B制劑所作的質譜分析結果的圖表。分析針對如實施例9所述的膨脹床層析后取樣的樣品進行。其中(a)部分的X-軸表示m/z值(m＝離子質譜；z＝離子電荷)。(b)部分的X-軸表示以[Da]表示的離子分子量。
圖7表示對羧肽酶B制劑所作的質譜分析結果的圖表。分析針對如實施例9所述的Q-Sepharose ffTM層析后取樣的樣品進行。其中(a)部分的X-軸表示m/z值(m＝離子質譜；z＝離子電荷)。(b)部分的X-軸表示以[Da]表示的離子分子量。
圖8表示對羧肽酶B制劑所作的質譜分析結果的圖表。所述的分析針對如實施例9所述的純化步驟的終產物進行。其中(a)部分的X-軸表示m/z值(m＝離子質譜；z＝離子電荷)。(b)部分的X-軸表示以[Da]表示的離子分子量。
實施例1編碼前體蛋白的基因的合成根據標準的操作方案來進行DNA操作技術(Sambrook，Fritsh&Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rdEdition，CSHL Press，2001)。分子生物學實驗中采用的試劑按制造商的建議來使用。
重新合成一種如SEQ ID NO3所示的編碼人工前原羧肽酶B基因的核苷酸序列。將核苷酸序列的幾個部分合成為24個長度介于54至90個核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸。該單鏈寡核苷酸表示SEQ ID NO3的先導鏈和滯后鏈的一種以交替方式重疊的部分。設計每一寡核苷酸使得其5’和3’端與鄰近的寡核苷酸重疊。作為例外，表示SEQ ID NO3的5’和3’末端的寡核苷酸僅分別與其鄰近的寡核苷酸的5’和3’端相重疊。選擇重疊的序列，使得在退火反應中避免了非特異性的退火。表示SEQ ID NO3的5’和3’末端的寡核苷酸另外還含有識別限制性酶切位點的連接序列，從而有助于進一步的分子克隆，如向表達載體中插入人工編碼的序列。表示SEQ ID NO3的5’末端的寡核苷酸的優選的限制性酶切位點為XhoI。表示SEQ ID NO3的3’末端的寡核苷酸的優選的限制性酶切位點為NotI。
一種包含如SEQ ID NO3所述的核苷酸序列的核酸分子是通過PCR方式(聚合酶鏈反應)逐步地合成的。在原理上，首先向PCR反應混合物中加入兩段表示先導鏈和滯后鏈的鄰近的和部分重疊的部分的寡核苷酸。隨后進行幾輪PCR循環，獲得了一種表示先導鏈和滯后鏈的相鄰的雙鏈片段。任選地純化雙鏈片段，并與連續的相鄰和部分重疊的單鏈寡核苷酸重疊并進行進一步輪次的PCR循環。
采用如上文所述的步驟，獨立地合成了如SEQ ID NO3所示的3段較大的核苷酸序列片段。每一片段均可在副產物的混合物中存在。因此，將片段在瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳并根據其大小來鑒定。切下含有目的片段的凝膠塊，并通過QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)來分離DNA片段。其他的提取方法也是可行的。
在3個片段中，第二個片段的5’端有一個序列與第一個片段的3’端重疊，并且第二個片段的3’端有一個序列與第三個片段的5’端重疊。再一次通過逐級的方式合成了如SEQ ID NO3所示的全長序列。在PCR反應混合物中連接了該三個片段。考慮具有最低熔點的重疊序列來選擇退火溫度。進行了5輪PCR循環，隨后加入了與目的全長產物的5’端和3’端互補的另外的引物對。采用一針對新加入的具有較低熔點的引物的退火溫度而選擇的退火溫度，進一步進行25個循環的PCR反應，獲得了包括SEQ ID NO3的核苷酸序列的全長片段。將全長片段(即包括帶有限制性內切酶酶切位點的連接序列的全長前體蛋白的編碼DNA)插入載體中并在轉化的宿主有機體中增殖。用于增殖目的的一種優選的宿主有機體為E.coli。
通過測序來驗證包括SEQ ID NO4所示的編碼前體蛋白的序列的全長DNA序列的核苷酸序列。最終的全長產物通過PCR來進行擴增。
實施例2載體的構建、轉化、表達針對表達載體的構建、轉化、前體蛋白的表達和組氨酸標記的前羧肽酶B在生長培養基中的分泌，采用了記載于Invitrogen手冊的“Pichia酵母表達試劑盒”型號M 011102 25-0043，“pPICZ A，B，和C”型號D 110801 25-0148，“pPECZα A，B，和C”型號E 01030225-0150，和“pPIC9K”型號E030402 25-0106中的方法來進行實驗。同時也參考了在此提到的其他載體、酵母菌株和培養基。同時也采用如Sambrook，Fritsh&Maniatis，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，3rdEdition，CSHL Press，2001所述的基本的分子生物學方法。
結果是，獲得了許多載體，其中在甲基營養酵母菌株中的每一株均包括一個含有能表達如SEQ ID NO4所示的前體蛋白的表達盒。一種優選的酵母菌株為巴氏畢赤酵母菌株。此外，每一載體還包括，在其他的遺傳元件中，一種能使載體在甲基營養酵母細胞中自主復制的復制起點。此外，設計所述的載體從而使其能整合至宿主細胞的基因組中。在每一載體上均含有的另一遺傳元件為表達選擇性標記的其它表達盒。
重復進行巴氏畢赤酵母菌株的轉化從而增加分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B的產量。
實施例3蛋白定量分析通過利用寬度為1cm的比色杯在280nm處測量吸收值的方法來進行純化的大鼠羧肽酶B的定量分析。根據如下公式來確定其濃度 實施例4蛋白活性在25℃下采用溶于100mM的Tris pH7.8中的的1.5M馬尿酰-L-精氨酸(Bachem G-2265)和寬度為0.5cm的比色杯來測定羧肽酶B的活性。
實施例5HPLC分析通過HPLC(高壓液相色譜)和凝膠過濾分離(Superdex 75 HR10/30，Amersham Biosciences)的方法來檢測來源于組氨酸標記的前羧肽酶B的羧肽酶B的活性。層析緩沖液為0.1M Tris pH7.5，0.3M NaCl。流速為0.5ml/min。
羧肽酶B和組氨酸標記的前羧肽酶B的保留時間明顯不同(1.2ml)，從而有助于其在洗脫圖譜上的識別。
實施例6發酵根據文獻的記載采用常用方法(Methods in Molecular BiologyVol.103中的Higgins，D.R.，Cregg，J.M.(1998)的Pichia Protocols.，全文不過尤其是第107-120頁；Pichia fermentation Guidelines，Invitrogen中的Stratton，J.，Chiruvolu，V.，Meagher，M.(1998))。
轉化的能表達SEQ ID NO4所示的前體蛋白巴氏畢赤酵母菌株的預培養在不含有氨基酸的酵母氮源基礎培養基(DIFCO)中在30℃下進行。將預培養物接種至發酵培養基中。該發酵培養基含有礦物質，即H3PO4、CaSO4×2H2O、K2SO4、MgSO4×7H2O、KOH、NaOH，微量元素CuSO4×5H2O、KI、MnSO4×H2O、Na2MoO4×2H2O、H3BO4、ZnCl2、CoCl2×6H2O和FeSO4×7H2O。發酵培養基還含有生物素和甘油。將pH值調節至pH5.0，并通過NH3來保持pH值，同時NH3還作為氮源使用。
當作為第一碳源的甘油消耗盡時，加入甲醇，從而誘導受AOX1啟動子調控的前體蛋白的表達。
實施例7純化通過加入含20mM Tris pH7.5、1M NaCl和1mM咪唑的緩沖液，將發酵培養基的液體物質部分調節到5-13％。使稀釋的發酵液通過裝有顆粒狀的金屬螯合物親和基質的純化柱。優選的顆粒狀的金屬螯合物親和基質為加Zn2+的StreamlineTM螯合柱(AmershamBiosciences)。通過膨脹床層析技術采用組氨酸標記的前羧肽酶B裝載顆粒狀的金屬螯合物親和基質。在上文所述的條件下，稀釋的發酵培養基中的組氨酸標記的前羧肽酶B結合，即吸附于顆粒狀的金屬螯合物親和基質上。
在結合步驟后，采用含20mM Tris pH7.5、1M NaCl和1mM咪唑的洗滌緩沖液來沖洗柱中的顆粒狀的金屬螯合物親和基質(仍在膨脹)。在允許組氨酸標記的前羧肽酶B保持與顆粒狀的金屬螯合物親和基質結合的條件下，進行數步(至少兩步)的洗滌步驟。采用額外加入含有11％甘油[體積/體積]的洗滌緩沖液來進行首次洗滌步驟。
采用不含有甘油的洗滌緩沖液來進行另外的洗滌步驟。
羧肽酶B活性的影響受到采用胰蛋白酶進行的柱上酶切的影響。在洗滌步驟后，一種含胰蛋白酶(13-20U/ml)的緩沖液(20mM TrispH7.5，1M NaCl和1mM咪唑)被泵送通過純化柱，其中從柱中流出的緩沖液被重新循環加入柱中。經150-300分鐘后，另外含有活化的羧肽酶B的緩沖液被除去。采用洗滌緩沖液以向上流動的方式來洗滌純化柱(2到3步的洗滌步驟)，從而收集流通的液體。現在將另外含有活化的羧肽酶B的緩沖液和通過洗滌步驟得到的流通的液體混合。通過加入苯甲脒鹽酸鹽至終濃度為1mM來終止胰蛋白酶活性。
過濾含有活化的羧肽酶B和胰蛋白酶的緩沖液從而除去殘留生物量的最后痕量。通過切向液流過濾對過濾的緩沖液進行滲濾。使用含有濃度為60-100mM的Tris pH8.3和進一步含有1mM苯甲脒鹽酸鹽、0.1mM的ZnCl2的滲析緩沖液。滲濾導致了緩沖液的交換，在緩沖液中存在活化的羧肽酶。
隨后的步驟為Q-Sepharose ffTM層析。將其中存在活化的羧肽酶的緩沖液加樣至含Q-Sepharose ffTM的純化柱中。采用60-100mM的Tris pH8.3和1mM苯甲脒鹽酸鹽、0.1mM的ZnCl2進行洗滌步驟。在洗滌步驟后，采用一種擴展至125mM NaCl的梯度來洗脫柱。收集餾分。匯合含羧肽酶B的餾分。
實施例8純化的羧肽酶B的質譜按照實施例7的方法純化羧肽酶B。在進行質譜分析前，采用配有自動加樣器(Gilson 234)的微量HPLC裝置(ABI-120A)使酶制劑脫鹽。采用的柱子是配有適當安全夾的Vydac Protein C4桶(Vydac目錄號.214GD51)。將含有50μg-100μg蛋白的等量酶制劑加樣于柱中，并采用洗脫緩沖液A(3.5％的溶于HPLC級水[Baker]中的“蛋白分析”級的HCOOH[甲酸])和緩沖液B(80％HPLC級的乙腈，5％溶于HPLC級水[Baker]中的HPLC級的甲酸)的梯度來進行洗脫。通過在第一個5分鐘采用5％的緩沖液B，95％緩沖液A洗脫，隨后再采用3分鐘的100％的緩沖液B洗脫來形成梯度。在HPLC過程中，柱溫度保持在35℃。在280nm下檢測酶純度。發現在t5min至t8min之間酶被洗脫下來。收集蛋白峰(從30mAU-40mAU；最大峰值＞800mAU)。
在配有納噴灑接口的Q-Tof2TM上(Waters Micromass，Manchester，UK)進行質譜分析。該裝置能選擇具有200-2000m/z的肽或蛋白離子以及具有800-2000m/z的蛋白離子。噴霧毛細管來源于Proxeon(“中號”，目錄號ES 387)。采用涉及毛細管電壓、錐電壓、和MS輪廓等變量參數進行測量。考慮到測量范圍，調整每一待檢測樣品的參數。為了進行分析，采用軟件MassLynx 4.0TM和MaxEnt 1TM工具包(Waters)。采用適用于質譜數據MaxEnt 1TM的最大熵處理有助于通過允許對蛋白質混合物分析產生的重疊多倍負荷的光譜的去疊合來增強復合光譜。小于10000Da的指示物為單同位素標記，等于或高于10000Da的指示物質為平均質量。
通過質譜分析顯示，酶制劑也就是純化的羧肽酶B基本上產生了3個不同的峰(1)相應于35015Da質量(平均值)的主峰[在圖2b中命名為A]，表示缺失C-末端酪氨酸的羧肽酶B；(2)同時還發現了一個相應于約70026Da質量的小峰(未標明)，其表示缺乏C-末端酪氨酸的羧肽酶B的二聚體；(3)一個相應于約35176Da質量的小峰，表示包括C-末端酪氨酸的羧肽酶B。
理論上，相應于組氨酸標記的前肽的峰應當反映一個由105個氨基酸組成的大小為12132Da的肽，其通過SEQ ID NO4的氨基酸序列經(a)KEX-2信號肽酶在Arg85和Ser86位間的酶切(b)在Arg190和Ala191間的胰蛋白酶酶切來產生。同樣地可以假設推定的組氨酸標記的前肽片段。這些片段包括由從Ser86至Arg178位的氨基酸組成的10746Da的肽和由從Asn179至Arg190位的氨基酸組成的1404Da的肽。圖3和4的“a”部分表示理論峰，如果12132Da和10746Da的肽存在于酶制劑中則預計可出現該峰。“b”部表示如圖2a中所示的光譜的擴大的削波。可以觀察到，在理論峰的位置并沒有檢測到酶制劑的光譜，圖5顯示了一個來自于酶制劑的光譜削波。可預計理論上的1404Da的肽將在m/z＝702.8([M+2H]2+)和m/z＝468.9([M+3H]3+)處產生峰。不過，沒有能指示前肽存在的顯著的峰出現。
此外，測定了相應于主峰的多肽的N-末端氨基酸序列。該15個N-末端氨基酸的序列為“A S G H S Y T K Y N N W E T I”。這與SEQID NO4的191至205位的氨基酸序列相一致，也就是其代表了活化的羧肽酶B酶的N-末端序列。
實施例9C-末端酪氨酸的除去按照如實施例7的方式純化了羧肽酶B。從匯合的含羧肽酶B的餾分和洗滌溶液中取樣。按照如實施例8所述的方法進行質譜分析。結果示于圖6中所示。圖7顯示了經Q-sepharose ffTM層析后的樣品的結果，而圖8顯示了終產物的結果。很明顯，開始時有約50％或更多的羧肽酶B含有C-末端胰蛋白酶。在第二次色譜后，絕大多數的蛋白種類均已經缺乏了C-末端的酪蛋白。不過，C-末端降解僅限于C-末端酪蛋白。
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<221>混雜的特征<223>大鼠羧肽酶B1(Cpb1)，如“Clauser，E.等(1988)J.Biol.Chem.263(33)，17837-17845”所述的編碼前原酶的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1248)<223>包括終止密碼子的編碼序列<220>
<221>信號肽<222>(1)..(39)<223>編碼信號肽部分<220>
<221>混雜的特征<222>(40)..(1248)
<223>編碼前羧肽酶B(酶原)部分<220>
<221>混雜的特征<222>(325)..(1248)<223>編碼活化的羧肽酶B片段<400>1atg ttg ctg cta ctg gcc ctg gtg agt gtg gcc ttg gct cat gct tcc48Met Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Ser Val Ala Leu Ala His Ala Ser1 5 10 15gag gag cac ttt gat ggc aac cgg gtg tac cgt gtc agt gta cat ggt96Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser Val His Gly20 25 30gaa gat cac gtc aac tta att cag gag cta gcc aac acc aaa gag att 144Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr Lys Glu Ile35 40 45gat ttc tgg aaa cca gat tct gct aca caa gtg aag cct ctc act aca 192Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro Leu Thr Thr50 55 60gtt gac ttt cat gtt aaa gca gaa gat gtt gct gat gtg gag aac ttt 240Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val Glu Asn Phe65 70 75 80ctg gag gag aat gaa gtt cac tat gag gta ctg ata agc aac gtg aga 288Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser Asn Val Arg85 90 95aat gct ctg gaa tcc cag ttt gat agc cac acc cgt gca agt gga cac 336Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg Ala Ser Gly His100 105 110agc tac acc aag tac aac aag tgg gaa acg att gag gcg tgg att caa 384Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Ile Gln115 120 125caa gtt gcc act gat aat cca gac ctt gtc act cag agc gtc att gga 432Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln Ser Val Ile Gly130 135 140acc aca ttt gaa gga cgt aac atg tat gtc ctc aag att ggc aaa act 480
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325 330 335gcc act ctg cat ggc acc aag tac aca tat ggc cca gga gct aca aca 1056Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr340 345 350atc tat cct gct gct ggg gga tct gac gac tgg tct tat gat cag gga 1104Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser Tyr Asp Gln Gly355 360 365atc aaa tat tca ttt acc ttt gaa ctc cgg gat aca ggc ttc ttt ggc 1152Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Phe Phe Gly370 375 380ttt ctc ctt cct gag tct cag atc cgc cag acc tgt gag gag aca atg 1200Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Cys Glu Glu Thr Met385 390 395 400ctt gca gtc aag tac att gcc aat tat gtc cga gaa cat cta tat tag 1248Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu His Leu Tyr405 410 415<210>2<211>415<212>PRT<213>大鼠<400>2Met Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Ser Val Ala Leu Ala His Ala Ser1 5 10 15Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser Val His Gly20 25 30Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr Lys Glu Ile35 40 45Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro Leu Thr Thr50 55 60
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Ser Ser Cys Leu Gly Val Arg Pro Asn Arg Asn Phe Asn Ala Gly Trp245 250 255Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu Thr Tyr Cys Gly260 265 270Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile275 280 285Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr290 295 300Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr Lys Leu Pro Glu305 310 315 320Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala Ala Lys Glu Leu325 330 335Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr340 345 350Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser Tyr Asp Gln Gly355 360 365Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Phe Phe Gly370 375 380Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Cys Glu Glu Thr Met385 390 395 400Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu His Leu Tyr405 410 415<210>3
<211>1497<212>DNA<213>人工的<220>
<223>優化的用于在甲基營養酵母中表達的編碼前原羧肽酶B多肽的人工序列。
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1497)<223>包括終止密碼子的編碼序列<220>
<221>信號肽<222>(1)..(255)<223>編碼含有信號肽酶切位點的啤酒酵母α-因子信號肽序列的序列。
<220>
<221>混雜的特征<222>(256)..(261)<223>編碼間隔子的序列<220>
<221>混雜的特征<222>(262)..(288)<223>編碼組氨酸標記的序列，RGSHHHHHH.
<220>
<221>混雜的特征<222>(286)..(570)<223>編碼大鼠羧肽酶B前肽的序列；第一個密碼子同時也是組氨酸標記的一部分。該序列中整合了WO 96/23064中的氨基酸互換Lys14Asn和Arg142Asp。
<220>
<221>混雜的特征<222>(571)..(1497)<223>編碼大鼠羧肽酶B的酶部分的序列<400>3atg aga ttt cct tca att ttt act gct gtt tta ttc gca gca tcc tcc48
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15gca tta gct gct cca gtc aac act aca aca gaa gat gaa acg gca caa96Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30att ccg gct gaa gct gtc atc ggt tac tca gat tta gaa ggg gat ttc 144Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45gat gtt gct gtt ttg cca ttt tcc aac agc aca aat aac ggg tta ttg 192Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60ttt ata aat act act att gcc agc att gct gct aaa gaa gaa ggg gta 240Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80tct ctc gag aag aga tcc gct aga ggt tct cac cac cat cac cat cac 288Ser Leu Glu Lys Arg Ser Ala Arg Gly Ser His His His His His His85 90 95gct tct gag gag cac ttc gac ggt aac aga gtt tac aga gtt tct gtt 336Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser Val100 105 110cac ggt gag gac cac gtt aac ttg att caa gag ttg gct aac act aag 384His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr Lys115 120 125gag att gac ttc tgg aag cca gac tct gct act caa gtt aag cca ttg 432Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro Leu130 135 140act act gtt gac ttc cac gtt aag gct gag gac gtt gcc gat gtt gaa 480Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val Glu145 150 155 160aac ttc ttg gag gag aac gag gtt cac tac gaa gtt ttg atc tct aac 528Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser Asn165 170 175gtt cgt aac gct ttg gaa tcc caa ttc gac tct cac act aga gct tct 576Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg Ala Ser
180 185 190ggt cac tct tac act aag tac aac aac tgg gag act att gag gct tgg 624Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp195 200 205att caa caa gtt gct act gac aac cca gac ttg gtt act caa tct gtt 672Ile Gln Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln Ser Val210 215 220att ggt act act ttc gag ggt aga aac atg tac gtt ttg aag att ggt 720Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys Ile Gly225 230 235 240aag act aga cca aac aag cca gct att ttc att gac tgt ggt ttc cac 768Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly Phe His245 250 255gct aga gaa tgg att tcc cca gct ttc tgt caa tgg ttc gtt aga gag 816Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu260 265 270gct gtt aga act tac aac caa gag att cac atg aag caa ttg ttg gac 864Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gln Glu Ile His Met Lys Gln Leu Leu Asp275 280 285gag ttg gac ttc tac gtt ttg cca gtt gtt aac att gac ggt tac gtt 912Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly Tyr Val290 295 300tac act tgg act aag gac aga atg tgg aga aag act cgt tcc act atg 960Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr Met305 310 315 320gct ggt tct tct tgc ctt ggt gtc gat cca aat aga aac ttt aac gct 1008Ala Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asn Ala325 330 335ggt tgg tgt gag gtc ggt gct tct aga tcc cca tgc tct gaa act tac 1056Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu Thr Tyr340 345 350tgt ggt cct gct cct gaa tct gaa aag gag act aag gct ttg gct gac 1104Cys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp355 360 365
ttc att aga aac aac ttg tct act att aag gct tac ttg act att cac 1152Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His370 375 380tct tac tct caa atg atg ttg tac cca tac tct tac gac tac aag ttg 1200Ser Tyr Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr Lys Leu385 390 395 400cca gaa aac tac gag gag ttg aac gct ttg gtt aag ggt gct gct aaa 1248Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala Ala Lys405 410415gaa ttg gct act ttg cac ggt act aaa tac act tac ggt cca ggt gct 1296Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala420 425 430act act att tac cca gct gct ggt ggt tct gac gac tgg tct tac gac 1344Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser Tyr Asp435 440 445caa ggt att aag tac tct ttc act ttc gag ttg aga gat act ggt ttc 1392Gln Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Phe450 455 460ttc ggt ttc ttg ttg cct gag tcc caa att aga caa act tgt gag gaa 1440Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Cys Glu Glu465 470 475 480acc atg ttg gct gtt aag tac att gct aac tac gtt aga gag cac ttg 1488Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu His Leu485 490 495tac taa taa 1497Tyr<210>4<211>497<212>PRT<213>人工的<220>
<223>優化的用于在甲基營養酵母中表達的編碼前原羧肽酶B多肽的人工序列。
<400>4Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Ser Ala Arg Gly Ser His His His His His His85 90 95Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg ValTyr Arg Val Ser Val100 105110His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr Lys115 120 125Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro Leu130 135 140Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val Glu145 150 155 160Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser Asn
165 170 175Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg Ala Ser180 185 190Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp195 200 205Ile Gln Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln Ser Val210 215 220Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys Ile Gly225 230 235 240Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly Phe His245 250 255Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu260 265 270Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gln Glu Ile His Met Lys Gln Leu Leu Asp275 280 285Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly Tyr Val290 295 300Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr Met305 310 315 320Ala Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asn Ala325 330 335Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu Thr Tyr340 345 350
Cys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp355 360 365Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His370 375 380Ser Tyr Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr Lys Leu385 390 395 400Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala Ala Lys405 410 415Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala420 425 430Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser Tyr Asp435 440 445Gln Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Phe450 455 460Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Cys Glu Glu465 470 475 480Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu His Leu485 490 495Tyr<210>5<211>938<212>DNA
<213>巴氏畢赤酵母<220>
<221>啟動子<222>(1)..(938)<223>巴氏畢赤酵母的AOX啟動子<400>5agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt120tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc180agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta240acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta300tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg360agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct420gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcayccaa gatgaactaa gtttggttcg480ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt540cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct600ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct660ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact720gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat780atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt840actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga900caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaa938
權利要求
1.一種生產具有羧肽酶B活性的蛋白的方法，包括如下步驟a)提供一種含有編碼由N-末端與組氨酸標記融合的大鼠前羧肽酶B和信號肽構成的前體蛋白的核苷酸序列的載體，由此任選地在組氨酸標記和信號肽之間或在組氨酸標記和大鼠羧肽酶B之間插入一種間隔序列；(b)采用該載體轉化一種微生物宿主有機體；(c)在含有營養物和碳源的生長培養基中培養該微生物宿主有機體，其中微生物宿主有機體表達前體蛋白并將組氨酸標記的前羧肽酶B分泌至生長培養基中；(d)把步驟(c)的生長培養基中的分泌的組氨酸標記的前羧肽酶B固定在能結合組氨酸標記的顆粒狀的金屬螯合物親和基質上，并沖洗顆粒狀的金屬螯合物親和基質，從而將組氨酸標記的前羧肽酶B固定；(e)在一種含有胰蛋白酶的緩沖液中溫育步驟(d)中的帶有固定化的組氨酸標記的前羧肽酶B的顆粒狀的金屬螯合物親和基質，由此通過蛋白水解方式酶切前羧肽酶B部分并將具有羧肽酶B活性的蛋白釋放到液相中，由此組氨酸標記的前肽部分被固定；(f)從顆粒狀的金屬螯合物基質中分離含有具有羧肽酶B活性的蛋白的液相，由此組氨酸標記的前肽部分被固定；和(g)從步驟(f)的液相中純化具有羧肽酶B活性的蛋白。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于所述的微生物宿主菌株是甲基營養酵母菌株。
3.根據權利要求1或2中任意一項的方法，其特征在于大鼠前羧肽酶B的氨基酸序列為SEQ ID NO3中的14至415位的氨基酸序列。
4.根據權利要求1至3中任意一項的方法，其特征在于所述的信號肽含有鄰近組氨酸標記或鄰近間隔序列的信號肽酶切位點。
5.根據權利要求1至4中任意一項的方法，其特征在于所述的表達前體蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6.根據權利要求1至5中任意一項的方法，其特征在于編碼大鼠前羧肽酶B的核苷酸序列為SEQ ID NO3中的286至1497位的氨基酸序列。
7.根據權利要求1至6中任意一項的方法，其特征在于編碼所述的前體蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO3中的核苷酸序列。
8.一種通過權利要求1至7中任意一項所述的方法制備的基本上不含有羧肽酶B的前肽并具有羧肽酶B活性的蛋白。
9.如權利要求8所述的基本上不含有羧肽酶B的前肽并具有羧肽酶B活性的蛋白在蛋白水解酶切肽鍵中的應用。
10.一種含有如權利要求8所述的基本上不含有羧肽酶B的前肽并具有羧肽酶B活性的蛋白的試劑溶液。
全文摘要
本發明提供了一種生產來源于非動物宿主有機體的，具有來自前羧肽酶B酶原的羧肽酶B活性的蛋白的制備方法。在非變性條件下，由酶原活化得到羧肽酶B。尤其是，該活化是在避免前肽與活化的羧肽酶B酶的不必要的非共價結合的條件下進行的。
文檔編號C12N9/48GK1624122SQ20041009802
公開日2005年6月8日 申請日期2004年12月3日 優先權日2003年12月5日
發明者S·格拉瑟, F·蓋佩爾, T·柯施鮑姆, B·雷克塞爾, J·-P·塔爾霍菲, R·米勒, C·吉塞爾, H·埃克施泰因, E·沃爾夫 申請人:霍夫曼—拉羅奇有限公司