專利名稱：啟動子與其應用的制作方法
技術領域：
本發明是有關于啟動子及其應用。
背景技術：
在亞洲國家，紅曲霉(Monascus)長期被用作為食品添加物。經紅曲霉發酵的谷物呈現鮮紅至紫色，且保有稻米原來形狀。此外，紅曲霉發酵產物也被認為具有促進健康的功效。將紅曲霉應用于米酒制造是由于其具有高量的α-淀粉酶，可促使淀粉轉化成葡萄糖。目前研究已確認紅曲霉發酵產物如Monacolin K等的醫療效果。且紅曲霉發酵產物所具有的保存效果也經實驗證明。
本領域的主要研究焦點為紅曲霉的基因產物或培養、生產的方法，然而，對于紅曲霉序列標簽(EST)基因庫的研究正方興未艾，紅曲霉的序列標簽可能提供重組DNA技術更多的信息。
發明內容
本發明人等對于由財團法人食品工業發展研究所所收集的紅曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因庫進行搜尋研究，發現兩個高表達量的基因，經比對為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡稱acuF基因)以及熱休克蛋白基因(heat shock protein gene，簡稱Hsp基因)，并檢測與確認此二基因上游區域的啟動子區域。由此而完成本發明。
(I)acuF啟動子因此，本發明的一型態為一種分離的DNA分子，其包括序列識別號1的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號1的核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動子活性。上述具有啟動子活性的DNA分子亦可包括序列識別號1中第117至1116個連續核苷酸序列，或序列識別號1中約第117至約1116個連續核苷酸序列，較佳地為序列識別號1中第367至1116個連續核苷酸序列，或序列識別號1中約第367至約1116個連續核苷酸序列，更佳地為序列識別號1中第517至1116個連續核苷酸序列，或序列識別號1中約第517至約1116個連續核苷酸序列；或于嚴苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。此外，上述DNA分子可由細菌或真菌取得，特別是由紅曲霉屬(Monascus sp.)，更特別是由紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可經基因工程方式， 由財團法人食品工業發展研究所所收集的BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡稱acuF)的起始子上游序列克隆而得。上述基因工程包含基因庫建構、菌落雜交(colony hybridization)、引物步行(primer walking)、或聚合酶鏈式反應(PCR)。此外，熟悉此技藝人士亦可依據本發明所揭示的DNA序列，經由已知的PCR、雜交反應、或人工合成等獲得本發明所述序列。上述嚴苛雜交條件可參考歐洲專利EP 1325959 A1 P7 節。
本發明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動子區域與一編碼區域。上述啟動子區域包括序列識別號1的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號1的核苷酸序列雜交的序列。特別是，上述啟動子區域可包括序列識別號1中第117至1116個連續核苷酸序列，或序列識別號1中約第117至約1116個連續核苷酸序列，較佳地為序列識別號1中第367至1116個連續核苷酸序列，或序列識別號1中約第367至約1116個連續核苷酸序列，更佳地為序列識別號1中第517至1116個連續核苷酸序列，序列識別號1中約第517至約1116個連續核苷酸序列；或于嚴苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。且上述啟動子區域可由紅曲霉屬(Monascus sp.)取得，特別是由紅曲霉屬Monascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可經基因工程方式，由財團法人食品工業發展研究所所收集的BCRC38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡稱acuF)的起始子上游序列克隆而得。而上述編碼區域包括編碼一所需蛋白質的核苷酸序列。所需蛋白質包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長因子。
本發明的另一型態是提供一種表達載體，其包括一啟動子，上述啟動子包括序列識別號1的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號1的核苷酸序列雜交的序列。上述啟動子是如以上重組DNA的啟動子區域所定義。用于建構本發明載體的工具是指在適當的宿主細胞中可自行復制或可整合入宿主細胞的染色體的分子序列，例如質粒，噬菌體，或病毒。上述表達載體可任擇地包括編碼所需蛋白質的核苷酸序列。上述所需蛋白質包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長因子。
本發明的另一型態是有關于一種表達系統，包括上述定義的表達載體，以及一適于表達所需蛋白質的宿主細胞。上述載體是經由一轉化方法被轉化入上述宿主細胞。上述宿主細胞意指任何可用于表達所需蛋白質的細胞。適當的宿主細胞包括細菌、酵母菌、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、或絲狀真菌。上述絲狀真菌可為紅曲霉屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉屬Monascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC38072。轉化方法可采用目前已知的宿主-載體系統，對于屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌施予一轉化步驟。可參考歐洲專利EP 1325959 A1 P5 節所述的方法。
本發明亦有關于一種轉化株，包括a)序列識別號1，或b)序列識別號1的第117至第1116個連續核苷酸，或序列識別號1的約第117至約第1116個連續核苷酸，或c)序列識別號1的第367至第1116個連續核苷酸，或序列識別號1的約第367至約第1116個連續核苷酸，或d)序列識別號1的第517至第1116個連續核苷酸的核苷酸序列，或序列識別號1的約第517至約第1116個連續核苷酸的核苷酸序列，或在嚴苛條件下可與上述任一序列雜交的核苷酸序列。上述轉化株更包括一編碼所需蛋白質的核苷酸序列。
本發明亦有關于一種表達一蛋白質的方法。上述方法包括于一培養基培養上述含有編碼所欲蛋白質的轉化株，由轉化株所在的培養基生產與累積所需蛋白質，以及由培養基收集所需蛋白質。
因此，本發明的一型態是提供一種分離的DNA分子，其包括序列識別號18的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號18的核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動子活性。
本發明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動子區域與一編碼區域。上述啟動子區域包括序列識別號18的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列，而上述編碼區域包括編碼一所需蛋白質的核苷酸序列。
本發明的另一型態是提供一種表達載體，其包括一啟動子。上述啟動子包括序列識別號18的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列。
本發明的又一型態提供一種分離的DNA分子，其包括序列識別號24的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動子活性。
(II)Hsp啟動子本發明的一型態提供一種分離的DNA分子，其包括序列識別號2的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號2的核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動子活性。上述具有啟動子活性的DNA分子亦可包括序列識別號2中第443至1478個連續核苷酸序列，或序列識別號2中約第443至約1478個連續核苷酸序列，較佳地為序列識別號2中第759至1478個連續核苷酸序列，或序列識別號2中約第759至約1478個連續核苷酸序列，更佳地為序列識別號2中第982至1478個連續核苷酸序列，或序列識別號2中約第982至約1478個連續核苷酸序列；或于嚴苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。此外，上述DNA分子可由細菌或真菌取得，特別是由紅曲霉屬(Monascus sp.)，更特別是由紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可經基因工程方式，由財團法人食品工業發展研究所所收集的BCRC 38072中熱休克蛋白(heat shock protein，簡稱Hsp)的起始子上游序列克隆而得。上述基因工程包含基因庫建構、菌落雜交(colony hybridization)、引物步行(primer walking)、或聚合酶鏈式反應(PCR)。此外，熟悉此技藝人士亦可依據本發明所揭示的DNA序列，經由已知的PCR、雜交反應、或人工合成等獲得本發明所請序列。上述嚴苛雜交條件可參考歐洲專利EP 1325959 A1 P7 節。
本發明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動子區域與一編碼區域。上述啟動子區域包括序列識別號2的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號2的核苷酸序列雜交的序列。特別是，上述啟動子區域可包括序列識別號2中第443至1478個連續核苷酸序列，或序列識別號2中約第443至約1478個連續核苷酸序列，較佳地為序列識別號2中第759至1478個連續核苷酸序列，或序列識別號2中約第759至約1478個連續核苷酸序列，更佳地為序列識別號2中第982至1478個連續核苷酸序列，或序列識別號2中約第982至約1478個連續核苷酸序列；或于嚴苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。且上述啟動子區域可由細菌或真菌取得，例如由紅曲霉屬(Monascus sp.)取得，特別是由紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可經基因工程方式，由財團法人食品工業發展研究所所收集的BCRC 38072中熱休克蛋白(heat shockprotein，簡稱Hsp)的起始子上游序列克隆而得。而上述編碼區域包括編碼一所需蛋白質的核苷酸序列。所需蛋白質包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長因子。
本發明的另一型態是提供一種表達載體，其包括一啟動子，上述啟動子包括序列識別號2的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號2的核苷酸序列雜交的序列。上述啟動子是如以上重組DNA的啟動子區域所定義。用于建構本發明載體的工具是指在適當的宿主細胞中可自行復制或可整合入宿主細胞的染色體的分子序列，例如質粒，噬菌體，或病毒。上述表達載體可任擇地包括編碼所需蛋白質的核苷酸序列。上述所需蛋白質包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長因子。
本發明的另一型態是有關于一種表達系統，包括上述定義的表達載體，以及一適于表達所需蛋白質的宿主細胞。上述載體是經由一轉化方法被轉化入上述宿主細胞。上述宿主細胞意指任何可用于表達所需蛋白質的細胞。適當的宿主細胞包括細菌、酵母菌、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、或絲狀真菌。上述絲狀真菌可為紅曲霉屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉屬Monascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC38072。轉化方法可采用目前已知的宿主-載體系統，對于屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌施予一轉化步驟。可參考歐洲專利EP 1325959 A1 P5 節所述的方法。
本發明亦有關于一種轉化株，包括a)序列識別號2，或b)序列識別號2的第443至第1478個連續核苷酸，或序列識別號2的約第443至約第1478個連續核苷酸，或c)序列識別號2的第759至第1478個連續核苷酸，或序列識別號2的約第759至約第1478個連續核苷酸，或d)序列識別號2的第982至第1478個連續核苷酸的核苷酸序列，或序列識別號2的約第982至約第1478個連續核苷酸的核苷酸序列，或在嚴苛條件下可與上述任一序列雜交的核苷酸序列。上述轉化株更包括一編碼所需蛋白質的核苷酸序列。
本發明亦有關于一種表達一蛋白質的方法。上述方法包括于一培養基培養上述含有編碼所欲蛋白質的轉化株，由轉化株所在的培養基生產與累積所需蛋白質，以及由培養基收集所需蛋白質。
本發明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動子區域與一編碼區域。上述啟動子區域包括序列識別號24的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該序列識別號24的核苷酸序列雜交的序列，而上述編碼區域包括編碼一所需蛋白質的核苷酸序列。
此外，本發明亦提供一種表達載體，其包括一啟動子。上述啟動子包括序列識別號24的核苷酸序列或在嚴苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列。
含有本發明啟動子序列的表達載體的實施例可經由PCR方式增殖本發明的啟動子序列，并于其下游接上具有標示功能的基因而得。所得表達載體可建構為篩選細胞轉化的標志(marker)，例如，用于評估基因克隆的效率。此外，本發明的載體亦可作為紅曲酶基因敲除(knockout)的工具，進行菌種改良，產生更安全及更具產業利用性的紅曲霉種。
本發明的啟動子序列尚可在其下游接上具有標示功能的基因及欲偵測的目標蛋白質基因，用于活體內(in vivo)或原位(in situ)偵測蛋白質間的交互作用及目標蛋白質的作用位置。
本發明的表達系統，轉化株及表達蛋白質方法的應用，可通過在啟動子序列下游接上要表達的酶基因，采用本發明的表達系統，可縮短酶生產時間，亦可大為增加產量。例如，增加紅曲霉蛋白酶的產量，可增進紅曲霉以大豆粉作為培養基質的效率，降低生產成本，另增加紅曲霉淀粉酶的產量，則可以增進紅曲在釀酒時的糖化力，藉以改變制酒的制程及產生新風味。
本發明的表達系統，轉化株及表達蛋白質的方法的應用，亦可以在啟動子的下游接上二次代謝產物基因，此表達系統可提前二次代謝產物的生產時間，增加產量，而大量減低生產成本。
此外，本發明的表達載體亦可以在啟動子下游接上轉錄活化子(transcriptional activator)基因，通過大量表達此活化子，同時也活化其所調控的基因，而大為增加產量。
圖1顯示本發明實施例中的acuF啟動子區域的克隆流程。
圖2顯示本發明實施例中的acuF啟動子區域的重組載體。本發明的acuF啟動子區域經轉化進入載體pHygEGFP后形成重組載體pMS-acuF。
圖3A與3B顯示pMS-acuF轉化后的綠色熒光蛋白表達情形。圖3A為明視野下；圖3B為熒光濾鏡下。
圖4顯示本發明實施例中的Hsp啟動子區域的克隆流程。
圖5顯示本發明實施例中的Hsp啟動子區域的重組載體。本發明的Hsp啟動子區域經轉化進入載體pHygEGFP后形成重組載體pMS-hsp。
圖6A與6B顯示pMS-hsp轉行后的綠色熒光蛋白表達情形。圖6A為明視野；圖6B為熒光濾鏡之下。
圖7顯示PCR產物的電泳圖。第1欄為1kb標記(Bio-1kbTM DNA ladder)；第2-5欄為編號1-4的轉化株；第6欄為BCRC 38072野生型，(-)對照組；以及第7欄為pHygEGFP，(+)對照組。
大腸桿菌EP1300pMPF 001、大腸桿菌EP1300pMPF 002、大腸桿菌DH5αpMS-acuF、大腸桿菌DH5αpMS-Hsp已于公元2003年12月5日被寄存于美國典型培養物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110-2209，USA)，寄存編號分別為PTA-5685、PTA-5686、PTA-5687、PTA-5688。
具體實施例方式
由財團法人食品工業發展研究所所收集的紅曲霉BCRC38072的EST基因庫中搜尋得到高表達量的基因，經比對為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinasegene，簡稱acuF基因)以及熱休克蛋白基因(heat shock proteingene，簡稱Hsp基因)，推測此二基因的上游應分別由一強大的啟動子所調控，其可用于大量表達蛋白質。
將紅曲霉BCRC 38072依照Hawksworth & Pitt(1983)的分類系統進行觀察及鑒定，其型態特征如下宏觀特征
CYA，25℃，7天。菌落直徑25-26mm，菌絲體開始為白色，漸漸變成淡紅橘色，復轉為深紅橘色。
MEA，25℃，7天。菌落直徑48mm，亮紅橘色，復轉為鮮紅橘色。
G25N，25℃，7天。菌落直徑28-29mm，深紅橘色，中央為深黃橘色。
微觀特征分生粉孢子(aleuriocondia)通常為單生或成短鏈，為倒梨狀(obpyriform)至球狀(globose)，大小為10-13×8-10μm。其有性世代閉囊殼(Cleistothecia)為球狀(globose)，直徑37-72μm。子囊孢子(ascospore)為透明，橢圓形，大小為4.6-6.3(-6.6)×3.3-4.2μm。
根據以上觀察，BCRC 38072的特征分析如下形態特征BCRC 38072介于M.pilosus與M.ruber之間。
1.依據菌落顏色與生長速度以及分生粉孢子的著生方式，BCRC 38072與M.pilosus較接近。
2.依據子囊孢子形態大小，BCRC 38072與M.ruber較接近。
序列分析BCRC 38072、M.pilosus與M.ruber的rDNAITS片段及β-微管蛋白(6-tubulin)基因部分序列100％相同。
綜合形態特征與序列分析B CRC 380 72的學名暫定為Monascus pilosus K.Sato ex D Hawksw.& Pitt。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡稱acuF)是在動物淀粉新生(gluconeogenesis)中重要的淀粉，此酶在細胞中能持續且強烈的表達。
在動物淀粉新生的過程中，丙酮酸(pyruvate)經由丙酮酸羧基酶(pyruvate carboxylase)生成草酰乙酸(oxaloacetate)，再通過磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)生成磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)。其反應如下所示。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶熱休克蛋白(heat shock protein，簡稱Hsp)是一類高度保守的蛋白質，屬于一蛋白質家族(protein family)，廣泛存在于原核生物與真核生物中，依其分子量分為四大類Hsp 90(83-90KDa)，Hsp 70(66-78 KDa)，Hsp 60，以及小Hsp家族。在生物體受到環境刺激時，此類蛋白質會大量表達。
將acuF與Hsp的啟動子以BLAST方式比對目前公開數據庫，發現并無與本發明紅曲霉的acuF與Hsp啟動子序列相似的序列。于是將acuF與Hsp啟動子序列重組到一pHygEGFP載體上，其具有HPH(潮霉素B磷酸轉移酶(hygromycin Bphosphotransferase))與增強綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，簡稱EGFP)的融合蛋白。通過觀察熒光蛋白的表達，證實上述兩個啟動子的確具有開啟下游基因的活性。
以下將以實施例說明本發明。
實施例1acuF啟動子1.材料(1)宿主紅曲霉Monascus BCRC 38072、Monascus pilosus，BCRC 31527、Neurospora crassa BCRC 32685(財團法人食品工業發展研究所)。
(2)感受態細胞ECOSTME.coli competent cells DH5α(益生生技公司)。
(3)質粒pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T EasyVector(PROMEGA)。
(4)培養基a.大腸桿菌的培養基LB肉汁(USB)，瓊脂(USB)。
b.紅曲霉及粉紅面包霉(Neurospora crassa)的培養基PDA(DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培養基(參見*)，以及topagar。
(5)抗生素青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B)(SIGMA)。
*Vogel氏培養基1.微量元素溶液將5g檸檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1gFe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mgMnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml的滅菌去離子水。最終總量100ml。
2.生物素溶液5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。
3.50X Vogel氏鹽濃縮液150g檸檬酸鈉·5H2O、250gKH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事先緩緩溶于20ml的水中)于750ml的滅菌去離子水，加入5ml微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最終總量1升。過濾、滅菌后，將溶液保存于室溫。
4.修飾過的Vogel氏培養基將1％葡萄糖溶于1X的Vogel氏鹽液。
2.流程acuF啟動子的制備流程是如圖1所示。由財團法人食品工業發展研究所所收集的紅曲霉Monascus B CRC 38072的EST基因庫尋找到cDNA表達量最高的基因Contig IDMPTC00008457，經比對為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡稱acuF)，推測該基因由一強大啟動子所調控。于是利用acuF基因5’端基因序列設計一段465bp的探針，以PCR方式由紅曲霉染色體放大該段探針。之后，將PCR產物接到pGEM-T Easy Vector上，再以DIG(Digoxigenin)標示制成探針。利用此探針對紅曲BCRC 38072的原生質體數據庫(fosmid library)進行菌落雜交，找到含有acuF基因的原生質體，編號為mpf01014A4。利用引物步行方式對編號為mpf01014A4的原生質體進行定序，找出acuF基因前端的啟動子序列。成功定序出1116bp的預定啟動子序列，并將之以BLAST進行比對，并無比對相似序列。將此1116bp的acuF啟動子序列以限制酶BglII與KpnI切位接到載體pHygEGFP上，并命名為pMS-acuF(又標記為pMS-a1)，如圖2所示(右方的圖譜)。將pMA-acuF轉化至紅曲霉中，成功觀察到熒光蛋白的表達，如圖3A與3B所示。圖3A為明視野下，圖3B為熒光濾鏡下。此結果證明所推測的acuF啟動子序列具有啟動子活性。詳細步驟說明如下。
A.acuF的探針基因片段的取得利用PCR克隆出BCRC 38072的acuF探針序列。
由紅曲霉EST基因庫設計引子如下正向引物5`-TGTTAATAGGACCGCCCTGC-3`(序列識別號3)反向引物5`-AGTATGCGGTCAGAGCACC-3`(序列識別號4)反應條件如下100μl的PCR反應中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，53℃30秒，72℃30秒，30次循環，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應結束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續以70％酒精洗滌，經離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
B.重組質粒TA-acuF將PCR產物acuF探針片段純化回收，將回收的DNA與pGEM-T Easy Vector以濃度3∶1的比例混勻，加入1μl的T4DNA接合與10×接合緩沖液，以滅菌去離子水調制總體積10μl，于室溫進行接合1小時。待接合完成后，取出5μl接合反應產物加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，進行轉化作用，所得轉化株已于93年12月7日寄存于財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 940474。篩選出3483bp的質粒，并以PCR確認，得到重組質粒TA-acuF。
C.acuF啟動子片段的取得利用PCR克隆出原生質體mpf01014A4的acuF啟動子序列。
所采用的引子與反應條件如下正向引物5`-GAAGATCTCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3`(序列識別號6)反向引物5`-ATGGTAC CTGTTTCTGAGTGAGGTC GAGTG-3`(序列識別號7)100μl的PCR反應中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，59℃30秒，72℃1分鐘，30次循環，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應結束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續以70％酒精洗滌，經離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
D.重組質粒pMS-acuF的制備以限制酶BglII與KpnI分別和PCR產物acuF啟動子片段與克隆載體pHygEGFP進行剪切作用4小時，再以DNA電泳鑒定分離，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。將回收的載體與acuF啟動子片段以1∶3比列混勻，并以滅菌去離子水調制總體積10μl。于16℃進行接合反應4小時。待接合反應完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受態細胞DH5α，進行轉化作用。經大腸桿菌質粒篩選出6.1kb的質粒，并以PCR確認，即得到重組質粒pMS-acuF。
E.Monascus原生質體(protoplast)的制備將Monascus孢子液接在PDA斜面培養基上，30℃靜置培養5-7天。用無菌水刮下孢子，以兩層滅菌的miracloth濾膜過濾孢子液，除去菌絲及瓊脂塊。于光學顯微鏡下，以血球計數盤計算濾液中的孢子數。接種孢子107個/ml至50ml的修飾過的Vogel氏培養基中，于30℃，200rpm震蕩培養16-18小時。以兩層滅菌的miracloth濾膜過濾萌芽的紅曲孢子，以無菌水清洗后，接著以酶消化緩沖液潤濕菌絲。
以10ml酶消化緩沖液洗下miracloth濾膜上的菌絲，加入5ml酶混合液，置于震蕩器上，于室溫快速搖晃反應半小時，每隔十分鐘，于光學顯微鏡下觀察細胞壁分解情形，直到約90％菌絲均釋出原生質體。用兩層miracloth濾膜過濾，濾液于4℃，1500rpm離心15分鐘，收集原生質體。倒去上清液，以酶消化緩沖液清洗沉淀物兩次，再以STC清洗兩次。加入1.5ml的STC、20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于顯微鏡下計算原生質體數目，分裝107個/管，并置于-80℃保存。
F.轉化作用采用STC清洗原生質體兩次，于4℃、1500rpm離心15分鐘。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生質體沉淀。加入1-10μg的質粒DNA，于200Ohms，25μF，0.7KV的條件下進行電轉。加入1ml的再生緩沖液(regeneration buffer)，于30℃下靜置隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B)的top agar培養基，鋪于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培養基上，于30℃靜置培養，約3-5天可觀察到轉化株。
G.轉化株的篩選與確認(1)用尖頭鑷子挑取少許轉化株上的菌絲與孢子置于載玻片上，滴一滴無菌水后蓋上蓋玻片，于光學顯微鏡下觀察。在觀察綠色熒光蛋白所使用的濾鏡下(Ex.430-510nm；Em.475-575nm)可觀察到綠色熒光蛋白的表達。
(2)將轉化株接到PDB(potato dextrose broth)培養基中，于30℃，200rpm震蕩培養5-10天。之后將菌體磨碎，抽取染色體DNA，以HPH-EGFP專一性引子進行PCR，可得到1740bp的產物。
H.確認具有啟動子活性的最小片段為更進一步確認acuF啟動子片段(1116bp)中具有功能活性的最小片段，利用PCR方式分別得到包含活性序列片段的1000bp，750bp，600bp，及500bp的PCR產物。所采用的模板為pMS-a1。獲得上述PCR產物所使用的引子列示如下。
1000bp正向引物acuF-B2 gaagatctTGTCGATGCAATCGGGCAATCC(序列識別號13)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識別號14)750bp正向引物acuF-B3 gaagatctTGATGATTGGGATCGGACTCGG(序列識別號15)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識別號14)600bp正向引物acuF-B4 gaagatctTGCGGATCCGAGGATAAAAC(序列識別號16)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識別號14)500bp正向引物acuF-B5 gaagatctCCCGGTATTGTCCGAGGCTC(序列識別號17)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識別號14)將1000bp，750bp，600bp，及500bp的acuF啟動子序列接到pMS載體，并命名為pMS-a2，pMS-a3，pMS-a4，及pMS-a5。將載體轉化至Monascus BCRC 38072，并以含有Hygr30ug/ml的PDA培養基做篩選。結果如下所示。
1R抗性；N.R.無抗性。
2+陽性；-陰性。
N.D.未偵測。
具有功能活性的最小片段為600bp。且含有600bp片段的轉化株亦可偵測到熒光反應。
將這些質粒亦轉化到Monascus pilosus BCRC 31527，以含有Hygr 50ug/ml的PDA培養基進行篩選。結果如下表。
1R抗性；N.R.無抗性。
2+陽性；-陰性。
N.D.未偵測。
具有功能活性的最小片段亦為600bp。且含有600bp片段的轉化株亦可偵測到熒光反應。
將這些質粒亦轉化到Neurospora crassa BCRC 32685，并以含Hygr 50ug/ml的PDA培養基篩選之。結果如下表。
1R抗性；N.R.無抗性。
N.D.未偵測。
具有功能活性的最小片段亦為600bp。
由上述結果證明，acuF啟動子序列中具有功能活性的最小片段為600bp(序列識別號18)，且其可表達于Monascus BCRC38072，Monascus pilosus BCRC 31527，以及Neurosporacrassa BCRC 32685。
實施例2Hsp啟動子1.材料(1)宿主紅曲霉Monascus BCRC 38072，Monascus pilosusBCRC 31527，以及Neurospora crassa BCRC 32685(財團法人食品工業發展研究所)。
(2)感受態細胞ECOSTME.coli competent cells DH5α(益生生技公司)。
(3)質粒pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T EasyVector(PROMEGA)。
(4)培養基a.大腸桿菌的培養基LB肉汁(USB)，瓊脂(USB)。
b.紅曲霉及粉紅面包霉(Neurospora crassa)的培養基PDA(DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培養基(參見*)，以及topagar。
(5)抗生素青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B)(SIGMA)。
*Vogel氏培養基①.微量元素溶液將5g檸檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mgMnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml的滅菌去離子水。最終總量100ml。
②.生物素溶液5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。
③.50X Vogel氏鹽濃縮液150g檸檬酸鈉·5H2O、250gKH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事先緩緩溶于20ml的水中)于750ml的滅菌去離子水，加入5ml微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最終總量1升。過濾、滅菌后，將溶液保存于室溫。
④.修飾過的Vogel氏培養基將1％葡萄糖溶于1X的Vogel氏鹽液。
2.流程Hsp啟動子的制備流程是如圖4所示。由財團法人食品工業發展研究所所收集的紅曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因庫尋找到25℃ 培養三天時表達量最高的基因，經比對為熱休克蛋白(Heat shock protein，簡稱Hsp)，推測該基因由一強大啟動子所調控。于是利用其5’端基因序列設計一段探針，以PCR方式由紅曲霉染色體放大該段探針。之后，將PCR產物接到pGEM-TEasy Vector上，命名為TA-Hsp，再以DIG(Digoxigenin)標示制成探針。利用此探針對紅曲BCRC 38072的fosmid基因庫進行菌落雜交，找到含有Hsp基因的原生質體。利用基因槍(shotgun)的方式對此克隆株進行定序，找出Hsp基因序列及其5’端的啟動子區域。針對Hsp基因5’啟動子區域設計引子，利用PCR方法，自紅曲染色體放大一段1478bp長的啟動子區域。將此1478bp的Hsp啟動子序列以限制酶BglII與XhoI切位接到載體pHygEGFP上，并命名為pMS-Hsp，如圖5所示(右方的圖譜)。將pMS-Hsp轉化至紅曲霉中，以潮霉素進行篩選，得到的轉化株在熒光顯微鏡下可成功觀察到綠色熒光蛋白的表達，如圖6A與6B所示。圖6A為明視野下，圖6B為熒光濾鏡下。此結果證明此段啟動子區域具有活性。再以QIAGEN DNasePlant kit抽取紅曲霉BCRC38072熒光轉化株的染色體DNA，以HPH-EGFP專一性引子進行PCR反應，轉化株得到1740的產物，如圖7所示。第1欄代表1kb標記(Bio-1KbTM DNA Ladder)，第2-5欄為標號1-4的轉化株，第6欄為BCRC 38072野生型，(-)對照組，以及第7欄為pMS-Hsp，(+)對照組。詳細步驟說明如下。
A.Hsp的探針基因片段的取得利用PCR克隆出BCRC 38072的Hsp探針序列。
由紅曲霉EST基因庫設計引子如下正向引物mptc3161-A5`-GCTTATCTCCAATGCCTCCG-3`(序列識別號8)反向引物mptc3161-B5`-CAAGGTCTCGCTCGTTAC-3`(序列識別號9)反應條件如下所示。
100μl的PCR反應中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，55℃30秒，72℃30秒，30次循環，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應結束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續以70％酒精洗滌，經離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
B.重組質粒TA-Hsp將PCR產物Hsp探針片段純化回收，將回收的DNA與pGEM-T Easy Vector以濃度3∶1的比例混勻，加入1μl的T4DNA接合 與10×接合緩沖液，以滅菌去離子水調制總體積10μl，于室溫進行接合1小時。待接合完成后，取出5μl接合反應產物加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，進行轉化作用。篩選出3482bp的質粒，并以PCR確認，得到重組質粒TA-Hsp。
C.Hsp啟動子片段的取得由Monascus EST基因庫設計出Hsp啟動子的引子，利用PCR克隆出Hsp啟動子序列。
所采用的引子與反應條件如下正向引物Mps17-9259-F5`-AGTGGCAGCCAACCCTCACC-3`(序列識別號11)反向引物Mps17-7782-R5`-CGGGCTGATAGAGCAGATAGATAGATG-3`(序列識別號12)100μl的PCR反應中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，60℃30秒，72℃1分鐘，30次循環，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應結束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續以70％酒精洗滌，經離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
D.重組pMS-hsp的制備以限制酶BglII與XhoI分別和PCR產物Hsp啟動子片段與克隆載體pHygEGFP進行剪切作用16小時，再以DNA電泳鑒定分離，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。將回收的載體與Hsp啟動子片段以1∶3比列混勻，并以滅菌去離子水調制總體積10μl。于16℃進行接合反應16小時。待接合反應完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受態細胞DH5α，進行轉化作用，所得轉化株已于93年12月7日寄存于財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 940473。經大腸桿菌質粒篩選出6215bp的質粒，并以PCR確認，即得到重組質粒pMS-hsp。
E.Monascus原生質體(protoplast)的制備將Monascus孢子液接在PDA斜面培養基上，30℃靜置培養5-7天。用無菌水刮下孢子，以兩層滅菌的miracloth濾膜過濾孢子液，除去菌絲及瓊脂塊。于光學顯微鏡下，以血球計數盤計算濾液中的孢子數。接種孢子107個/ml至50ml的修飾過的Vogel氏培養基中，于30℃，200rpm震蕩培養16-18小時。以兩層滅菌的miracloth濾膜過濾萌芽的紅曲孢子，以無菌水清洗后，接著以酶消化緩沖液潤濕菌絲。
以10ml酶消化緩沖液洗下miracloth濾膜上的菌絲，加入5ml酶混合液，置于震蕩器上，于室溫快速搖晃反應半小時，每隔十分鐘，于光學顯微鏡下觀察細胞壁分解情形，直到約90％菌絲均釋出原生質體。用兩層miracloth濾膜過濾，濾液于4℃，1500rpm離心15分鐘，收集原生質體。倒去上清液，以酶消化緩沖液清洗沉淀物兩次，再以STC清洗兩次。加入1.5ml的STC、20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于顯微鏡下計算原生質體數目，分裝107個/管，并置于-80℃保存。
F.轉化作用采用STC清洗原生質體兩次，于4℃、1500rpm離心15分鐘。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生質體沉淀。加入1-10μg的質粒DNA，于200 Ohms，25μF，0.7KV的條件下進行電轉。加入1ml的再生緩沖液(regeneration buffer)，于30℃下靜置隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B)的top agar培養基，鋪于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培養基上，于30℃靜置培養，約3-5天可觀察到轉化株。
G.轉化株的篩選與確認(1)用尖頭鑷子挑取少許轉化株上的菌絲與孢子置于載玻片上，滴一滴無菌水后蓋上蓋玻片，于光學顯微鏡下觀察。在觀察綠色熒光蛋白所使用的濾鏡下(Ex.430-510nm；Em.475-575nm)可觀察到綠色熒光蛋白的表達。
(2)將轉化株接到PDB(potato dextrose broth)培養基中，于30℃，200rpm震蕩培養5-10天。之后將菌體磨碎，抽取染色體DNA，以HPH-EGFP專一性引子進行PCR，可得到1740bp的產物。
H.確認具有啟動子活性的最小片段為更進一步確認Hsp啟動子片段(1478bp)中具有功能活性的最小片段，利用PCR方式分別得到包含活性序列片段的1036bp，720bp，及497bp的PCR產物。所采用的模板為pMS-hsp。獲得上述PCR產物所使用的引子列示如下。
497bp
正向引物CCGAGAGCGCGTATATGTAACG(序列識別號19)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識別號20)720bp正向引物TGAATTGTGTGGGTGCGTGG(序列識別號21)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識別號20)1036bp正向引物CAGTGCATCTTAGCGGTTGG(序列識別號22)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識別號20)1478bp正向引物AGTGGCAGCCAACCCTCACC(序列識別號23)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識別號20)將1478bp，1036bp，720bp，及497bp的Hsp啟動子序列接到表達載體，并將載體轉化至Monascus BCRC 38072，以含有Hygr 30ug/ml的PDA培養基做篩選。結果如下所示。
1R抗性；N.R.無抗性。
2+陽性；-陰性。
具有功能活性的最小片段為497bp。且含有497bp片段的轉化株亦可偵測到熒光反應。
將這些質粒亦轉化到Monascus pilosus BCRC 31527與Neurospora crassa BCRC 32685，以含有Hygr 50ug/ml或200ug/ml的PDA培養基進行篩選。結果如下表。
1R抗性；N.R.無抗性。
2+陽性；-陰性。
具有功能活性的最小片段為497bp(序列識別號24)。且證實可于Monascus BCRC 38072，Monascus pilosus BCRC 31527與Neurospora crassa BCRC 32685表達。
其它實施型態含有本發明啟動子序列的表達載體的實施例可經由P CR方式增殖本發明的啟動子序列，并于其下游接上具有標示功能的基因而得。具有標示功能的基因為，例如，潮霉素抗性基因或Hyg-GFP基因。所得表達載體可建構為篩選細胞轉化的標志(marker)，例如，用于評估基因克隆的效率。此外，本發明的載體亦可作為紅曲基因敲除(knockout)的工具，進行菌種改良，如破壞橘霉素(citrinin)的生合成基因、抑制子(repressor)基因等有害基因，產生更安全及更具產業利用性的紅曲霉種。
本發明的啟動子序列尚可在其下游接上具有標示功能的基因及欲偵測的目標蛋白質基因，用于活體內(in vivo)或原位(in situ)偵測蛋白質間的交互作用及目標蛋白質的作用位置。
本發明的表達系統，轉化株及表達蛋白質方法的應用，可通過在啟動子序列下游接上要表達的酶基因，例如蛋白酶，淀粉酶(amylase)，幾丁質酶(chitinase)，植酸酶(phytase)，葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)。采用本發明的表達系統，可縮短酶生產時間，亦可大為增加產量。例如，增加紅曲霉蛋白酶的產量，可增進紅曲霉以大豆粉作為培養基質的效率，降低生產成本，另增加紅曲霉淀粉酶的產量，則可以增進紅曲在釀酒時的糖化力，藉以改變制酒的制程及產生新風味。
本發明的表達系統，轉化株及表達蛋白質的方法的應用，亦可以在啟動子的下游接上二次代謝產物基因，例如，聚縮酮類合成酶(polyketide synthase)，或非核糖體羧氨酸合成酶(nonribosomal peptide synthase)基因。此表達系統可提前二次代謝產物的生產時間，增加產量，而大量減低生產成本。
此外，本發明的表達載體亦可以在啟動子下游接上轉錄活化子(transcriptional activator)基因，通過大量表達此活化子，同時也活化其所調控的基因，而大為增加產量。
雖然本發明已以一較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作各種的更動與潤飾，故本發明的保護范圍當視后附的權利要求書所界定的范圍為準。
序列表<110>財團法人食品工業發展研究所<120>啟動子與其應用<140>
<141>
<160>24<210>1<211>1116<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動子<222>
<223>acuF啟動子<400>1ACTATTAGCG AAAGACCGGC AAGTAGATGG AAGAGCCGGA ATTATTCTTG50TTCTTCGATA GTATTCCGTC CATGCCTAGG CACAGATAGT AAGATACACA100TCGTAATAGG ACCGCCTGTC GATGCAATCG GGCAATCCAG GAACCCACGC150AGCCCAAACA CGAGGCTAGA CTCGCGTCTG CTGCACATGG AAGCTGATGG200ATACATATAC CCCCAGCAGC ATGCGGTTCC CCCTGCAGAG ACCAGAGGCT250AGAAGTCTCT GGGCGCATGT ATGTATCTAT TATTACCTAT CAATCGGTTT300CGGGTACTCC TTGCCGGAGT CGCTGAAGCG CAGACGTGCC GACCCGGAAC350ATTTAGGAAG AAACCGTGAT GATTGGGATC GGACTCGGGC ACACATGGCA400CCGAATTGCC AAAAAATGGC GCATTCTGGG GAATCAAGCA TGCAGCACAT450CTTACTAGAT TCAATAGATT AAGGCACAGG CCATGTAGAG GGCAGTGGCA500ATACAATATG GGGCCGTGCG GATCCGAGGA TAAAACTTGC CCGTTAGTCC550GGCTGGGGGT TACGGCAGTC ATAACCATCT ACAGCCACGG CCGGGCCAGG600TGGTGCACAC GGCCGTCCCG GTATTGTCCG AGGCTCAGCC GAGAAGCCCT650AACCCCTAGC CGACCAGGGC TCCGCGTCTC CCCGCAAACT CGTTTTAAAC700TTGCAGCTTC CCGTGCTCCG TCGTGCCCTA GCCCGCGCTG ATTCGCCGCT750CGGGCGAATT CGGGCGTGTT TATGCCTCGT CCTGCTCTGA CTTCATCGTC800CGGAGCCCAA TTCCTGGCCG TCAATCGCTC TCCTTCGCTG CCCTGACGCA850AACCGCGCTG TCCACAGCGC TCCCCATCTC GCAACGACCC CGACATCTCC900CGTTATACGG TGGAGACGGA CGAGAAATCT TCTGCGGATG GGAGGCATAT950TCGACACTTT ACGACTTATC GTCGCCCTCA TGGTTTCCCC CGCTGCAAAC1000ATTCCATATA CCCCCCCTTC GGCCCTGCTT CTCCTGCTCC TGCAAACTCG1050
GATTTTGTTC GACAGCAAGT CGCGAGACAG CAGAAGAACG ACTACCACTC1100GACCTCACTC AGAAAC 1116<210>2<211>1478<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動子<222>
<223>Hsp啟動子<400>2AGTGGCAGCC AACCCTCACC AAATCGGAAC TGAACAGATT TACGTTGAAG50AACGCCGTAC TCGTACCAAT ACCTACGGTG GAAATGCCAA CTTTGGAGCT100GGCAGGGGTG GCGCTGGCCG TGGTCGTGCT GGACAAGGCC GGGGCGGCTT150CCAACGAGAT GGCGGCCGTG GAGGGTTTGC TCCCCGTGGC CGTGGCGGAA200ACGTCACGCC CAAGGGCCGC AACCAGCCTC AAACTGCATA AAGTAAGGAT250GCCAATGAGA ATTCGAATGC GTGATGCTTT CTTTGTTTCT CCGGCTGACG300ATACCTCTTT TTCTTTTTTT CTACCAATCC CGCTGGTTGG TGCAGCGCTG350ATCTTTGTTA TATTGCTTAC GGAATTTCCA GGTTATGTAT TACTTTCCCA400TTTACCCATA ATGATATGTG TTATGTGGCT CTCATTTTGT CACAGTGCAT450CTTAGCGGTT GGAAAAAAGT TTTCATTTTT CCCAGCTCAG CACTTTTATT500TTCCATGGCC TCTTTGGTTT GTGTTTTATG AGCTCGTTTC TTTTGTTACT550TTCTGCCTTT GTATTGTCCG CATCCGTGTG ATCCTAGCAT AGCGCGCAGA600AAGCCTATAT TCTTCTCCCC TATTATTCCA CATATCCTTT TCTTTCTCCT650TGATGCTGTG TTTCAGATCT CAACCTAACA ACACTTAGTG TTCTCTTCTT700TCTATTTCTT ATTTTTATTT TTATTTATTT ATATTTTTTC ACATTGGTAT750TGGCACCCTG AATTGTGTGG GTGCGTGGAA TACTGTACAA TCAATCCACT800CAGGCGCAGT GAATTGGTTT GCAGGAAGGG AACAGTATAT GGATATCTGC850AAATATGCTA GAATACACTT TTAGCTAATG TAAAACAATC AGTGAATTCT900GAAGCTTCTC AGGGTTGCTG CGCCAACAGG GCTGGCGGAG AGCAAGGGCG950GAGGGCGGAC AGGCTTGTAC GATGACTGGC CCCGAGAGCG CGTATATGTA1000ACGGTACTGT AATGTAGTCA CCCGCGGCAG CGATATTGCA GTTAAGATAC1050TGTAATGCTC TGTAACGGCA GCCGGCCGAA CAATGGAATG GGTGGAGCGG1100AACGTTCTAG ATTGTTCAAG ACCTCAGGTA GCAATTGCCT CACCCCTCCA1150GTTTCCTCGA AGGCAGACTA GAAAAATGCA GAAGGAAAGA GAGGCTTCCA1200ACGGATTCGA TGGCTATATC CTGTGATTGG AAAAACACGA ATTTCCAGTG1250
TGTCCGGATC CACGGAAAGC ACTGGAACCA AGTGAAAGTG CAGAGTTCAA1300AGCTGGTTGA GCCCCCAAAG TGGTTTAGGG CACGGCGGAG CGCGTGGAAG1350TTGCTGGACG GCCGTAGAAT CGCAGATTCC TGCTCTCTTC CCTCGCAACT1400ATTTTATCCT CGCTTCCTCC GCTTCTCTCT CTCTCTTTCT TCCGCTTCAT1450CTATTCATCT ATCTATCTGC TCTATCAG1478<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-F<400>3TGTTAATAGG ACCGCCCTGC 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-R<400>4AGTATGCGGT CAGAGCACC 19<210>5<211>465<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>
<223>acuF probe<400>5
TGTTAATAGG ACCGCCCTGC ACCCTGGTGG TGTTCNTTAC GTCTTCCTTT50CCTGCCTTGT TGCTGCTGCT TCCGTTGCAT ACTACATCTA TCGCACCAAG100GACAACAACA GGTCTTGCTG TTCTCTTTTC TTATTGCTTT TTCTCTTTTT150TCTCCGTTCT ACTCTCCATC GTTCCTTCCC CATGACTCAA CCTCGCTAAC200ATCTGCTTTC TTTTCTGCTC TTTCTAGGCC GGGCAAAGGA CACACGGAGC250TTGAGGAGGA GCTCCATGAG ACAGCGCACA TTGACTATGA CCGAGTGGCA300ATCGTAAGAT CCCAGTCATC CTCTTGATGT TTTCCTCCTT GACAAGGACA350TGGCTAACGA ACGACTCTAG ATTGCGAATC CTTCCGTTGC TGCCCTCTAC400GAAGATGCCC TTGTCTATGA AACGGGAACC GCCATCACAT CCAGCGGTGC450TCTGACCGCA TACTC 465<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>6GAAGATCTCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGC 34<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>7ATGGTACCTG TTTCTGAGTG AGGTCGAGTG 30<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-結合<222>
<223>mptc3161-A<400>8GCTTATCTCC AATGCCTCCG 20<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>mptc3161-B<400>9CAAGGTCTCG CTCGTTAC 18<210>10<211>269<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>
<223>Hsp probe<400>10GCTTATCTCC AATGCCTCCG ATGCCCTCGA CAAGATCCGC TATGAGTCCT50TGTCGGACCC TTCCAAGCTC GATTCGTGCA AGGACCTCCG TATCGACATC100ATCCCGGATA AGGAGTCTAA GACTCTCACC ATCCGCGATA CCGGTATTGG150TATGACCAAG GCTGATCTAA TCAACAACCT TGGTACCATT GCTCGCTCTG200GAACATAACC ATACTGGTTC CGACTAGATT AGTTGTTGGA ACCATGGTAA250CGAGCGAGAC CTTG 269<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>Mps 17-9259-F<400>11AGTGGCAGCC AACCCTCACC 20<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>Mps17-7782-R<400>12CGGGCTGATA GAGCAGATAG ATAGATG 27<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-B2<400>13GAAGATCTTG TCGATGCAAT CGGGCAATCC 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-KpnI<400>14ATGGTACCTG TTTCTGAGTG AGGTCGAGTG30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-B3<400>15GAAGATCTTG ATGATTGGGA TCGGACTCGG 30<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-B4<400>16GAAGATCTTG CGGATCCGAG GATAAAAC 28<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>acuF-B5<400>17GAAGATCTCC CGGTATTGTC CGAGGCTC 28
<210>18<211>600<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動子<222>
<223>
<400>18TGCGGATCCG AGGATAAAAC TTGCCCGTTA GTCCGGCTGG GGGTTACGGC50AGTCATAACC ATCTACAGCC ACGGCCGGGC CAGGTGGTGC ACACGGCCGT100CCCGGTATTG TCCGAGGCTC AGCCGAGAAG CCCTAACCCC TAGCCGACCA150GGGCTCCGCG TCTCCCCGCA AACTCGTTTT AAACTTGCAG CTTCCCGTGC200TCCGTCGTGC CCTAGCCCGC GCTGATTCGC CGCTCGGGCG AATTCGGGCG250TGTTTATGCC TCGTCCTGCT CTGACTTCAT CGTCCGGAGC CCAATTCCTG300GCCGTCAATC GCTCTCCTTC GCTGCCCTGA CGCAAACCGC GCTGTCCACA350GCGCTCCCCA TCTCGCAACG ACCCCGACAT CTCCCGTTAT ACGGTGGAGA400CGGACGAGAA ATCTTCTGCG GATGGGAGGC ATATTCGACA CTTTACGACT450TATCGTCGCC CTCATGGTTT CCCCCGCTGC AAACATTCCA TATACCCCCC500CTTCGGCCCT GCTTCTCCTG CTCCTGCAAA CTCGGATTTT GTTCGACAGC550AAGTCGCGAG ACAGCAGAAG AACGACTACC ACTCGACCTC ACTCAGAAAC600<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>19CCGAGAGCGC GTATATGTAA CG 22<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>20CTGATAGAGC AGATAGATAG ATG 23<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>21TGAATTGTGT GGGTGCGTGG 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>22CAGTGCATCT TAGCGGTTGG 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結合<222>
<223>
<400>23AGTGGCAGCC AACCCTCACC20<210>24<211>497<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動子<222>
<223>
<400>24CCGAGAGCGC GTATATGTAA CGGTACTGTA ATGTAGTCAC CCGCGGCAGC50GATATTGCAG TTAAGATACT GTAATGCTCT GTAACGGCAG CCGGCCGAAC100AATGGAATGG GTGGAGCGGA ACGTTCTAGA TTGTTCAAGA CCTCAGGTAG150CAATTGCCTC ACCCCTCCAG TTTCCTCGAA GGCAGACTAG AAAAATGCAG200AAGGAAAGAG AGGCTTCCAA CGGATTCGAT GGCTATATCC TGTGATTGGA250AAAACACGAA TTTCCAGTGT GTCCGGATCC ACGGAAAGCA CTGGAACCAA300GTGAAAGTGC AGAGTTCAAA GCTGGTTGAG CCCCCAAAGT GGTTTAGGGC350ACGGCGGAGC GCGTGGAAGT TGCTGGACGG CCGTAGAATC GCAGATTCCT400GCTCTCTTCC CTCGCAACTA TTTTATCCTC GCTTCCTCCG CTTCTCTCTC450TCTCTTTCTT CCGCTTCATC TATTCATCTA TCTATCTGCT CTATCAG 49權利要求
1.一種DNA分子，其包括序列識別號1中約517至約1116個連續核苷酸序列(即序列識別號18)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列，其中該DNA序列具有啟動子活性。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，其包括序列識別號1中約367至約1116個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的DNA分子，其包括序列識別號1中約117至約1116個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的DNA分子，其包括序列識別號1的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與序列識別號1的序列雜交的核苷酸序列。
5.根據權利要求1～4任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自細菌或真菌。
6.根據權利要求1～4任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬Monascus sp。
7.根據權利要求1～4任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
8.根據權利要求1～4任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自寄存于財團法人食品工業發展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
9.根據權利要求8所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡稱acuF基因)的上游序列。
10.一種重組DNA，其包括一啟動子區域，包括序列識別號1中約517至約1116個連續核苷酸序列(即序列識別號18)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列；以及一編碼區域，包括一編碼所需蛋白質的核苷酸序列。
11.根據權利要求10所述的重組DNA，其啟動子區域包括序列識別號1中約367至約1116個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
12.根據權利要求10所述的重組DNA，其啟動子區域包括序列識別號1中約117至約1116個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
13.根據權利要求10所述的重組DNA，其啟動子區域包括序列識別號1的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與序列識別號1的序列雜交的核苷酸序列。
14.根據權利要求10～13任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自細菌或真菌。
15.根據權利要求10～13任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自紅曲霉屬Monascus sp。
16.根據權利要求10～13任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
17.根據權利要求10～13任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自寄存于財團法人食品工業發展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
18.根據權利要求17所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自紅曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡稱acuF基因)的上游序列。
19.一種表達載體，其包括一啟動子，該啟動子包括序列識別號1中約517至約1116個連續核苷酸序列(即序列識別號18)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
20.根據權利要求19所述的表達載體，其啟動子包括序列識別號1中約367至約1116個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
21.根據權利要求19所述的表達載體，其啟動子包括序列識別號1中約117至約1116個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
22.根據權利要求19所述的表達載體，其啟動子包括序列識別號1的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與序列識別號1的序列雜交的核苷酸序列。
23.根據權利要求19～22任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自細菌或真菌。
24.根據權利要求19～22任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自紅曲霉屬Monascus sp。
25.根據權利要求19～22任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
26.根據權利要求19～22任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自寄存于財團法人食品工業發展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
27.根據權利要求26所述的表達載體，其中該啟動子區域是源自紅曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡稱acuF基因)的上游序列。
28.一種DNA分子，其包括序列識別號2中約982至約1478個連續核苷酸序列(即序列識別號24)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列，其中該DNA序列具有啟動子活性。
29.根據權利要求28所述的DNA分子，其包括序列識別號2中約759至約1478個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
30.根據權利要求28所述的DNA分子，其包括序列識別號2中約443至約1478個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
31.根據權利要求28所述的DNA分子，其包括序列識別號2的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與序列識別號2的序列雜交的核苷酸序列。
32.根據權利要求28～31任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自細菌或真菌。
33.根據權利要求28～31任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬Monascus sp。
34.根據權利要求28～31任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
35.根據權利要求28～31任一項所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自寄存于財團法人食品工業發展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
36.根據權利要求35所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉BCRC 38072中熱休克蛋白基因(heat shockprotein gene，簡稱hsp基因)的上游序列。
37.一種重組DNA，其包括一啟動子區域，包括序列識別號2中約982至約1478個連續核苷酸序列(即序列識別號24)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列；以及一編碼區域，包括一編碼所需蛋白質的核苷酸序列。
38.根據權利要求37所述的重組DNA，其啟動子區域包括序列識別號2中約759至約1478個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
39.根據權利要求37所述的重組DNA，其啟動子區域包括序列識別號2中約443至約1478個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
40.根據權利要求37所述的重組DNA，其啟動子區域包括序列識別號2的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與序列識別號2的序列雜交的核苷酸序列。
41.根據權利要求37～40任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自細菌或真菌。
42.根據權利要求37～40任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自紅曲霉屬Monascus sp。
43.根據權利要求37～40任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
44.根據權利要求37～40任一項所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自寄存于財團法人食品工業發展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
45.根據權利要求44所述的重組DNA，其中該啟動子區域是源自紅曲霉BCRC 38072中熱休克蛋白基因(heat shockprotein gene，簡稱hsp基因)的上游序列。
46.一種表達載體，其包括一啟動子，該啟動子包括序列識別號2中約982至約1478個連續核苷酸序列(即序列識別號24)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
47.根據權利要求46所述的表達載體，其啟動子包括序列識別號2中約759至約1478個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
48.根據權利要求46所述的表達載體，其啟動子包括序列識別號2中約443至約1478個連續核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。
49.根據權利要求46所述的表達載體，其啟動子包括序列識別號2的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與序列識別號2的序列雜交的核苷酸序列。
50.根據權利要求46～49任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自細菌或真菌。
51.根據權利要求46～49任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自紅曲霉屬Monascus sp。
52.根據權利要求46～49任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自紅曲霉屬Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
53.根據權利要求46～49任一項所述的表達載體，其中該啟動子是源自寄存于財團法人食品工業發展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
54.根據權利要求53所述的表達載體，其中該啟動子區域是源自紅曲霉BCRC 38072中熱休克蛋白基因(heat shockprotein gene，簡稱hsp基因)的上游序列。
全文摘要
本發明涉及啟動子及其應用。acuF啟動子包括序列識別號1中約517至約1116個連續核苷酸序列(即序列識別號18)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。Hsp啟動子，包括序列識別號2中約982至約1478個連續核苷酸序列(即序列識別號24)的核苷酸序列，或于嚴苛條件下可與上述連續序列雜交的核苷酸序列。含有上述兩個啟動子的相應的DNA分子、重組DNA、表達載體。含有本發明啟動子序列的應用如表達載體可建構為篩選細胞轉化的標志，用于評估基因克隆的效率。作為紅曲酶基因敲除的工具，進行菌種改良，產生更安全及更具產業利用性的紅曲霉種。
文檔編號C12N15/74GK1644689SQ200410097179
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月13日 優先權日2003年12月12日
發明者陳怡靜, 郭恩惠, 劉意如, 黃英娥, 吳文蓉, 李鐘財, 陳智偉, 彭筱琦, 廖麗玲, 袁國芳 申請人:食品工業發展研究所