專利名稱：一種高效酶解玉米蛋白制備生物活性短肽的技術的制作方法
一、背景介紹生物活性肽(Bioactive peptides)是蛋白質經過特征酶或生物降解后產生的具有顯著的生物學活性，且由數個至數十個氨基酸組成的肽類混合物，即蛋白水解產物(Protein Hydrolysates)。研究表明，酶切蛋白質釋放生物活性短肽，是由被降解的蛋白質的結構基礎決定的，其依據在于從生物進化的角度看，營養和貯存蛋白應該是從功能蛋白進化而來，因為開始的生物是不可能合成大量的此類蛋白的。當生物進化到需要為后代發育提供營養時，其不可能憑空制造出一種營養蛋白，最好的方法就是通過許多功能區(結構域)DNA組裝出營養或貯存蛋白的基因，所以在貯存和營養蛋白中可廣泛存在著不同的功能區，選擇適當的蛋白酶就可以將其釋放出來，還原其功能特性；從免疫的角度看，盡管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白質，但是由于非功能區已存在著較大的氨基酸差異，所以不能互相使用，因為生物正是通過免疫系統識別自身蛋白和外來蛋白的這些非功能區的差異來清除異己和保持自身的穩定性的。如果把注意力放在這些具有不同功能區的生物活性多肽上，則可能有效的避免生物免疫排斥反應的困擾。另外，20世紀50年代，人們研究發現蛋白質的多肽片段要比氨基酸更易為人體所吸收，它們可以直接通過小腸壁進入血液。這使得人們對蛋白質來源的多肽特別是其對生物體產生的生理功能產生了極大的興趣，并引發了世界范圍內的研究熱潮。截止到現在，人們已發現和分離出一百多種存在于人體的具有重要生理活性的多肽，使學術界和企業界對于肽的研究和利用產生了極大的關注，特別是關系人類健康的保健品其研發的前景將會產生不可估量的未來。
近年來，國外已經有大量的生物活性肽通過蛋白酶水解營養或貯藏蛋白釋放和辨別出來。我國水解蛋白制備生物活性多肽的研究相對滯后，直至90年代才有一些研究報道。據初步調查，國內雖然有多家單位進行了不同蛋白來源(如酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白等)的生物活性肽的研究，但成功生產的蛋白水解物或生物活性肽產品很少，而研究開發出具特征功能以及有良好功能配伍性的產品更是寥寥無幾，最顯著的問題是還沒有形成一套完整適合于產業化的生產活性肽的生產技術體系。總之，對動植物蛋白的有效利用，開發生物活性短肽具有巨大的產業化價值和市場潛力，必將會產生顯著的社會效益和經濟效益。
玉米蛋白(Corn Gluten Meal)水溶性差，組成復雜，口感粗糙，嚴重影響了其在食品中的應用。不僅如此，玉米蛋白就氨基酸組成而言，賴氨酸和色氨酸含量較低，為其限制性氨基酸，根據衡量氨基酸組成的木桶平衡理論，玉米蛋白是一種非全營養蛋白。因此作為人類的營養成分，玉米蛋白的利用受到限制；又加之玉米蛋白原料豐富，價格低廉，玉米淀粉的副產物很多未經利用即自然排放，這不僅是對可利用糧食資源的極大浪費，而且對環境造成一定程度的污染。據有關統計，我國每年隨廢液排走的玉米蛋白高達8萬噸以上，其余主要用作蛋白飼料，也就是說玉米蛋白質的利用率極低。但是隨著人類對蛋白資源的重視和對生物活性短肽的科學研究的不斷深入，掌握了酶解天然蛋白資源制備生物活性短肽的基本理論和技術方法，對玉米蛋白可實現有限的酶解過程，能生產出高營養且易于吸收的、高附加值的具生物學功能特性的生物制品。從酶解玉米蛋白制備生物活性多肽的研究結果統計可知，可釋放出具生物活性的多肽主要有(1)玉米降壓肽降血壓肽通過抑制人體中血管緊張素轉換酶(AgiotensinI-converting Enzyme，EC.3.4.15.1，縮寫為ACE)活性而達到降血壓的作用。ACE的抑制肽最早發現于蛇毒中。人們于90年代發現許多天然蛋白水解可以得到具有ACE抑制活性的多肽，這些寡肽的共同特征是C-末端為pro或芳香族氨基酸，而N-末端往往是疏水性氨基酸。玉米蛋白含有高比例的Val、Ile、Leu、Pro和Gln等，很少含有Lys等堿性氨基酸，這種獨特的氨基酸組成使玉米醇溶蛋白的水溶性差，營養價值不高，而這種不平衡的氨基酸組成使玉米蛋白成為多種生理活性肽，特別是降血壓肽的來源。α-玉米醇溶蛋白，γ-玉米醇溶蛋白的酶解產物就具有較為顯著的抗高血壓的作用。降解α-玉米醇溶蛋白時所得到的血管緊張素抑制劑大多數為三肽，其C-末端一般具有四種不同的氨基酸Pro、Tyr、Ala、Glu。(2)高F值寡肽早在1970年，Fisher等人發現肝病病人血液中的氨基酸組成失常對于正常人而言，血液中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸之比約為3-3.5，而肝病病人只有1.0或更低。他們將支鏈氨基酸對芳香族氨基酸的摩爾比稱之為F值(Fisher ratio)。就氨基酸而言，賴氨酸和色氨酸較低，為其限制性氨基酸，但支鏈氨基酸和中性氨基酸的含量相當高，是植物中頗為少見的特色組成，早期特別是營養學家以此使玉米蛋白的利用受限制，但近年來卻是玉米蛋白深層次加工的依據。谷文英等人對酶解玉米蛋白制備高F值肝性腦病防治肽進行了較為深入的研究，確立了制得F值＞20的高F值功能性低聚肽混合物的技術路線。而且，經動物實驗證實了其效果相當于市售的氨基酸配置品，如肝醒靈、六合氨基酸靜脈輸液等。(3)谷氨酰胺活性肽長期以來Gln被認為是非必需氨基酸，而且Gln單位不穩定，這是傳統氨基酸營養液或輸液中不含Gln的主要原因。自從認識到應激狀態下Gln的必需作用后，才開始重視Gln代用品的研究開發。玉米蛋白中Gln含量豐富，為開發Gln活性肽提供了物質條件。任國普等人采用復合酶、胃蛋白酶對酶解玉米蛋白制備Gln活性肽的技術路線進行了探索，確定了Gln活性肽的制備工藝和最佳工藝條件，最終產品中Gln組成百分比大約為18.16％。(4)抗氧化肽抗氧化肽是指生物體內源性的或由生物體內蛋白質降解后的寡肽。李相魯以玉米蛋白粉為原料，制備了具有較高純度的抗氧化肽(Leu-Asp-Tyr-Gln)。發現該抗氧化肽對自由基造成的各種線粒體損傷、流動性下降、ATPase酶活性降低、線粒體膨脹等均有不同程度的抑制作用。(5)醒酒肽武漢天天好生物工程公司從玉米蛋白中成功的提取了醒酒肽，實驗證明可縮短醉酒時間。利用玉米蛋白粉制備含有豐富支鏈氨基酸(Leu、Ile、Val)的短肽，口服后通過提高血液中的丙氨酸和亮氨酸濃度產生穩定的脫氫輔酶NAD+，增強乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性，促進體內乙醇的分解和代謝，從而降低血液中乙醇的濃度，達到醒酒的作用。從目前玉米蛋白的利用現狀可知將酶解玉米蛋白粉所得的生物活性肽混合物制成功能性食品，目前已顯現出可觀的市場前景。
本發明是采用多酶體系對玉米蛋白水解制造具生物活性短肽的技術。該技術系統地篩選了二組生物法制造生物活性短肽的多酶體系；建立了一套有效地以玉米蛋白為原料的處理方法，經適度變性的玉米蛋白提高了酶解效率；同時設計建立了酶解玉米蛋白的生物反應器，實現了玉米蛋白的高效二次酶解；最終研究建立了一套完整的利用多酶體系生產和分離制備玉米活性短肽的技術工藝路線，玉米蛋白生物活性短肽混合物的得率達到36％以上。本發明的技術特點是建立了一條優化的技術路線，提高了生物法生產玉米生物活性短肽的水解度和得率。
二、生產玉米短肽的技術路線本發明生產玉米生物活性短肽的工藝路線見附圖
。[注附圖為“生產玉米短肽的技術路線圖”]。
三具體實施例方式
1、將玉米蛋白粉與水按1∶5～1∶15配制成粗分散系統。
2、20℃～80℃恒溫條件下，添加促進使底物適度變性的復合添加劑(變性劑A)，調制pH＝7.0～10.0，處理過程維持10～20min左右。
3、添加0.1％～2％(V/V)的Alcalase AF 2.4L或堿性蛋白酶(酶活力為10萬以上)對處理的玉米蛋白進行專一性酶解，酶解反應過程采用pH-stat自動系統監控，酶解1h～1.5h。注酶活力單位定義每毫升酶制劑在37℃，pH＝7.5條件下每分鐘水解酪蛋白產生1ug酪氨酸的所需酶量為酶的一個活力單位。
4、利用10,000～50,000Da的超濾膜對上述酶解液進行超濾，收集的濾液，對未反應的蛋白和酶循環泵入生物反應器1，使酶解蛋白的水解度達到一定的水解度，獲得第一次酶解濾液。
注在該酶解過程中注意監測酶活，目的是控制保持酶解反應的酶量及酶活水平。
5、將第一次酶解的超濾液泵入生物反應器，調節超濾液溫度維持在20℃～55℃，pH＝7～10。
6、添加0.1％～3.0％(W/V)的復合風味蛋白酶(包括風味酶，氨肽酶、中性蛋白酶等)(酶活力為5萬)。反應采用pH-stat自動滴定系統控制酶解反應條件，酶解1h左右終止反應，獲得第二次酶解液。
7、濾液選用300Da～5,000Da的超濾膜進行超濾處理。收集分子量在6000Da左右的水解產物的濾液；大于6000Da的產物和酶循環泵入酶解生物反應器2。合并收集全部符合產品質量要求的酶解液，適度濃縮(蛋白含量維持在30％～35％以上)，進行真空噴霧干燥，獲得最終產品-玉米生物活性短肽。其得率達到36％以上。
注在該酶解過程中注意監測酶活，目的是控制保持酶解反應的酶量及酶活水平。
權利要求
1.一種高效酶解玉米蛋白制備生物活性短肽的技術，其特征在于篩選了二組生物法制造生物活性短肽的多酶體系；建立了一套有效地玉米蛋白原料的處理方法；設計建立了以玉米蛋白二次酶解為特點的生物反應器的加工系統；形成了一套完整的利用多酶體系生產和分離制備玉米活性短肽的技術工藝路線。
2.根據權利要求1所述，本發明制造生物活性短肽所選用的多酶體系，包括酶制劑有Alcalase AF 2.4L，2709堿性蛋白酶，胰蛋白酶，中性蛋白酶、Flavourzyme、胃蛋白酶。
3.根據權利要求1所述，有效地玉米蛋白原料的處理方法，主要包括物理的方法和化學方法相結合，使用的物理學方法是熱處理和超聲波處理；化學法是堿、亞硫酸氫鈉等，添加量為0.1％～5％。
4.根據權力1所述，高效二次酶解玉米蛋白的生產工藝路線的特征在于采用pH-stat反應控制體系與優化的超濾系統組合方式。
5.根據權力1和4所述，本工藝優化的超濾系統為二次超濾。一次超濾截留的分子量為10,000Da～50,000Da。二次超濾截留的分子量為300Da～5,000Da。
6.根據權力1和4所述，本工藝優化的超濾系統，其酶解產物大于6000Da的物質，采用再循環酶解的方式，達到理想的酶解效率。
7.根據權利1、2和4所述，玉米蛋白二次酶解的條件分別是一次酶解體系溫度為20℃～55℃，pH為7.0～9.0，攪拌速度為100r/min～500r/min。二次酶解體系溫度為10℃～60℃，pH為6.5～9.0，攪拌速度為100r/min～500r/min。
全文摘要
玉米淀粉加工的副產物－玉米蛋白，因其水溶性差，組成復雜，口感粗糙，賴氨酸和色氨酸含量較低，則玉米蛋白是一種非全營養蛋白，從而嚴重影響了該蛋白資源的應用。本發明是采用多酶體系對玉米蛋白水解制造具生物活性短肽的技術。篩選了二組生物法制造生物活性短肽的多酶體系；建立了一套有效地玉米蛋白原料的處理方法；設計建立了以玉米蛋白二次酶解為特點的生物反應器的加工系統；形成了一套完整的利用多酶體系生產和分離制備玉米活性短肽的技術工藝路線，生產生物活性短肽混合物的得率達到36％以上。本發明的技術特點是建立了一條優化的技術路線，有效地提高了生物法生產玉米生物活性短肽的水解度和得率；同時又具有簡易有效的分離制備的工藝、操作簡單、無污染、成本低廉等特點。
文檔編號C12P21/02GK1786183SQ20041009689
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優先權日2004年12月10日
發明者陳慶森, 陳新, 張曉峰, 龐廣昌 申請人:天津商學院