專利名稱：一種擴增水稻t－dna插入位點側翼序列的方法
技術領域：
本發明涉及一種擴增水稻T-DNA插入位點側翼序列的方法。
背景技術：
水稻是世界上一半以上人口的主要食物，是有代表性的谷類作物。因其相對較小的基因組，成熟的轉化技術體系，構建的很好的物理圖譜，大量的cDNA序列以及indica和japonica兩個亞種接近完成的基因組測序計劃，水稻已成為單子葉植物基因組學研究的模式系統。
一般用來研究基因功能的途徑是創建DNA插入突變體群體，再利用對突變體篩選和表型鑒定來鑒別基因。T-DNA插入突變體庫是水稻功能基因組學研究的重要平臺之一，T-DNA插入位點側翼序列的分離有利于T-DNA插入方式和水稻重要農藝性狀基因的功能分析。水稻T-DNA插入位點側翼序列的擴增方法有質粒挽救法，cDNA末端快速擴增法(分為5-端RACE和3-端RACE法)，反向PCR法(iPCR)，熱不對稱PCR法(TAIL-PCR)等。傳統的方法如反向PCR法，其擴增效率受限于插入位點的序列和基因組DNA的酶切位點數目，而且其所擴增得到的序列片段大小不夠大，有時不能從基因數據庫獲得足夠的同源序列信息。質粒挽救法受菌種培養的限制而且時間漫長。TAIL-PCR必須在不同溫度下進行多步PCR。這些方法操作步驟繁瑣，側翼序列擴增效率底，費時費力，不適合于高通量序列擴增分析。
目前，模式植物擬南芥可用PCR-walking方法來分析T-DNA插入片段旁側的植物基因組DNA信息。如圖1所示，其主要步驟如下首先用平端限制性內切酶對植物基因組DNA進行酶切消化，然后將接頭退火復性到切割出來的平端片段上。一個步測的引物(WP)是根據T-DNA的左邊界序列(LB)的3’側設計的，另一個引物是根據接頭的序列設計(AP)的。用WP和AP就可以擴增出T-DNA插入片段側翼的植物DNA序列或有可能插入進去的載體骨架序列。一般設計2-3套嵌套的WP和AP引物，進行2-3輪的巢式PCR，就可以得到可以進行進一步研究所需量的PCR產物。但目前，沒有一套適合于水稻的PCR-walking技術體系。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速特異擴增水稻T-DNA插入位點側翼序列的方法。
本發明所提供的擴增水稻T-DNA插入位點側翼序列的方法，包括以下步驟
1)酶切連接在同一反應體系中，利用平端限制性內切酶酶切水稻基因組DNA并利用T4DNA連接酶將得到的酶切片段與不對稱接頭序列連接，得到酶切連接液；所述不對稱接頭序列為由一條長鏈和一條短鏈組成的雙鏈接頭，長鏈和短鏈互補，應有較高的GC含量，并且在水稻基因組中無同源序列，長鏈具有至少兩個嵌套引物的結合位點；2)以步驟1中的酶切連接片段為模板，以根據所述不對稱接頭序列和T-DNA的左邊界序列設計的嵌套引物進行兩輪嵌套引物PCR擴增，得到T-DNA插入位點側翼序列。
為了提高擴增的特異性，所述不對稱接頭序列的短鏈的3′端修飾有NH2基。
為了確保充分酶切，步驟1)中的酶切連接反應體系可為10μl，所述酶切連接反應體系的組成及反應條件為水稻基因組DNA 40-100ng，平端限制性內切酶3U，T4DNA連接酶70U，1×T4DNA連接酶緩沖液，不對稱接頭序列50μM，加雙蒸水到l0μl，25℃反應6-16個小時。其中，所用試劑均購自大連寶生物工程有限公司。
所述反應體系的組成及反應條件優選為水稻基因組DNA 82.5ng，平端限制性內切酶3U，T4DNA連接酶70U，T4DNA連接酶緩沖液1×，不對稱接頭序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反應6-16個小時。
所述平端限制性內切酶可為Dra I、EcoR V、Bal I、Pvu II、Sma I、Sna I或Stu I。
所述不對稱接頭序列具體可為由具有序列表中序列1的單鏈寡核苷酸序列(ADA1)和具有序列表中序列2的單鏈寡核苷酸序列(ADA2)加熱到80℃，然后在室溫下冷卻，退火而成的雙鏈接頭。
步驟2)中所述兩輪嵌套引物PCR擴增中，第一輪PCR擴增的引物對可為具有序列表中序列3的單鏈寡核苷酸序列和序列4的單鏈寡核苷酸序列；第二輪PCR擴增的引物對可為具有序列表中序列5和序列6的單鏈寡核苷酸序列。
為了便于DNA回收和序列測定，兩輪嵌套引物PCR擴增的反應體系均可為40μl。其中，所述第一輪PCR擴增的反應體系可為酶切連接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR緩沖液(可購自大連寶生物工程有限公司，TaKaRa)，加雙蒸水到40μl；所述第二輪PCR擴增的反應體系可為第一輪PCR產物50倍稀釋液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP 115μM，1×PCR緩沖液，加雙蒸水到40μl。
所述兩輪嵌套引物PCR擴增的反應條件均可為94℃下預變性3min；然后94℃下變性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循環35次；72℃下充分延伸5min。
本發明的擴增水稻T-DNA插入位點側翼序列的方法，具有如下特點1)酶切與連接在同一反應體系中常溫下進行，簡潔快速，大大節省了反應試劑和反應時間；2)不對稱性接頭和嵌套的PCR保證了擴增的特異性；不對稱性接頭由于短鏈3’端具有NH2基團，防止了接頭引物的結合位點產生，接頭引物的結合位點只有在T-DNA引物下擴增出來；即使擴增出兩端具有接頭序列的片段，也會由于末端反向重復序列在退火時形成手性結構而抑制擴增；3)平端限制性內切酶(如Dra I或EcoR V)在T4連接酶緩沖液的10μl體系中能夠充分酶切；4)在單酶切條件下，僅用左邊界引物和接頭引物就能達到擴增效率85％，遠高于一般方法的擴增效率；5)第二次PCR反應體系達到40μl大大提高了產率，利于DNA回收和序列測定。該方法適用于高通量水稻基因組分析。
圖1為PCR-walking技術擴增T-DNA側翼序列原理示意2為增強子捕捉質粒pFX-E24.2-15R的物理圖譜具體實施方式
以下實施例中的實驗方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、水稻T1代T-DNA插入突變體的側翼序列擴增1、水稻T1代T-DNA插入突變體的獲得水稻遺傳轉化所用的T-DNA雙元載體為含有GAL4-VP16-GUS增強子捕獲元件的增強子捕獲載體pFX-E24.2-15R(購自澳大利亞CAMBIA研究中心)。載體的物理圖譜如圖2所示，T-DNA右邊界內有由基礎35S啟動子驅動的GAL4-VP16元件。GAL4的結合位點在長度上是UAS的六倍。UAS的下游是GUS基因。T-DNA區攜帶有質粒挽救所需的pUC-ori和氨芐青霉素抗性基因。植物轉化體的選擇標記基因——潮霉素-3’NOS——連在T-DNA左邊界鄰接的地方，由35S啟動子驅動。細菌中的選擇抗性基因——氯霉素抗性基因在T-DNA左邊界(LB)外邊。圖2中，T BORDER(L)T-DNA區左邊界；T BORDER(R)T-DNA區右邊界；CAM RESISTANCE氯霉素抗性基因；CAMV35S35S啟動子；HYG(R)潮霉素抗性基因；POLY A SITEPoly A位點；Amp氨芐青霉素抗性基因；BoGUS葡糖醛酸酶基因；GFP綠色熒光蛋白基因；EGFP增強的綠色熒光蛋白基因；6xUAS6段重復的上游激活序列；GAL4/VP16酵母轉錄激活蛋白GAL4DNA結合域和單純皰疹病毒激活域的融合基因。
根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105超毒力菌株。EHA105是EHA101的衍生菌，刪除了EAH101中的pTiB0542的T-DNA及kan抗性基因。以A136為染色體背景，琥珀堿型(Suc)。這種菌株具有侵染能力比較強，生長快，不結球等優良特性。
用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介導的基因轉化方法將pFX-E24.2-15R導入粳稻品種日本晴(O.sativa spp.Japonica)的愈傷組織，經篩選培養得到水稻粳稻品種日本晴(O.sativa spp.Japonica)T1代轉化體325株。
2、擴增水稻T1代T-DNA插入突變體的側翼序列取水稻粳稻品種日本晴(O.sativa spp.Japonica)T1代轉化體325株抽穗期前的葉片，用CTAB法提取水稻基因組DNA，酶切連接后，用作PCR反應模板。
接頭雙鏈序列分別為ADA15′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT-3′(序列1)ADA25′P-ACCTCCCC-NH23′(序列2)ADA1和ADA2加熱到80℃，然后在室溫下冷卻，退火成雙鏈接頭。
WP15′-CGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGC-3′(序列3)AP15′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(序列4)WP25′-GTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTG-3′(序列5)AP25′-CTATAGGGCTCGAGCGGC-3′(序列6)。
WP1和WP2是根據T-DNA左邊界設計的嵌套引物。AP1和AP2是根據接頭設計的嵌套引物。接頭和引物均由上海生工公司合成。
PCR試劑rTaq酶和dNTP混合物，均為大連寶生物工程有限公司產品。
限制性內切酶DraI為大連寶生物工程有限公司產品。
連接酶T4DNA連接酶及其緩沖液購自大連寶生物工程有限公司。
分子量標準SD300購自鼎國生物技術有限責任公司。
水稻T-DNA插入位點側翼序列PCR擴增法操作步驟1)酶切連接水稻DNA的酶切及其與接頭的連接在同一體系中進行。反應體系的組成及反應條件為水稻基因組DNA 82.5ng，平端限制性內切酶3U，T4DNA連接酶70U，T4DNA連接酶緩沖液1×(購自大連寶生物工程有限公司)，不對稱接頭序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反應6-16個小時。
2)第一輪PCR反應體系為步驟1)獲得的酶切連接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR緩沖液(購自大連寶生物工程有限公司)，加雙蒸水到40μl；3)第二輪PCR反應體系為第一輪PCR產物50倍稀釋液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP 115μM，1×PCR緩沖液，加雙蒸水到40μl。反應條件為94℃下預變性3min；然后94℃下變性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循環35次；72℃下充分延伸5min。
4)PCR產物檢測將第二輪PCR產物2μl與加樣緩沖液混勻，加入含25ng/ml溴化乙錠的1.2％瓊脂糖凝膠樣孔中，在100V電壓下電泳20min。結果表明有276個樣品擴增出1個或多個產物，擴增效率為85％，各樣品條帶數不同，條帶位置不同。將每條帶切膠，參照上海生工玻璃珠(silver beads)膠回收試劑盒操作步驟回收，詳細步驟按照試劑盒使用說明書。
5)PCR回收產物的DNA測序按照常規方法使用ABI3730基因分析儀對所回收產物中的部分產物(80個)進行測序。結果如表1所示，有7個樣品未測出結果，有8個樣品測出的結果與載體序列和水稻基因組序列用BLASTN比對后沒有任何同源性，這兩項占測序樣品總數的18.7％。有81.3％的PCR-walking產物的測序結果表明含有T-DNA區的序列，其中46.2％的序列包含有水稻序列，即可以初步確定轉化元件的插入位點。
表1.部分PCR-walking產物測序結果
測序的結果表明T-DNA插入位點處有多種多樣的情況。有的T-DNA序列與水稻序列之間沒有其它的填充序列；有的填充有長度不一的不明來源的序列；還有的通讀了T-DNA左邊界序列，有大量的T-DNA區外的載體骨架序列(27.7％)；3個產物中只有水稻序列，找不到載體序列。
利用BLASTN比對工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對確定了插入位點的30個序列在水稻基因組中的分布進行初步分析，結果顯示，所測序列的同源序列除了在第7條染色體外，別的染色體中都有分布(表2)。如D2174有兩個插入片段，分別插入到第二和第十一條染色體中。
表2.所測插入位點在水稻各條染色體上的分布
實施例2、水稻GUS基因胚乳特異表達突變體基因組的T-DNA側翼序列擴增1、水稻GUS基因胚乳特異表達突變體的獲得參照實施例1的方法構建水稻GUS基因胚乳特異表達突變體庫，在水稻灌漿期取突變株的未成熟種子，葉和根進行GUS組織化學染色，根據染色結果篩選出水稻GUS基因胚乳特異表達突變體。
2、擴增水稻GUS基因胚乳特異表達突變體基因組的T-DNA側翼序列接頭、引物、PCR試劑、限制性內切酶、連接酶和操作步驟均同實施例1。按照常規方法使用ABI3730基因分析儀對所回收產物中的部分產物(260個)進行測序。結果如表3所示，有29個樣品未測出結果，有2個樣品測出的結果與載體序列和水稻基因組序列用BLASTN比對后沒有任何同源性，這兩項占測序樣品總數的11.9％。有88.1％的PCR-walking產物的測序結果表明含有T-DNA區的序列，其中52.8％的序列包含有水稻序列，即可以初步確定轉化元件的插入位點。
表3.部分PCR-walking產物測序結果
利用BLASTN比對工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對確定了插入位點的121個序列在水稻基因組中的分布進行初步分析，結果顯示，所測序列的同源序列在各條染色體中都有分布(表4)。
表4.所測插入位點在水稻各條染色體上的分布
序列表<160>6<210>1<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1acctcccc 8<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2cgatggctgt gtagaagtac tcgc 24<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3ggatcctaat acgactcact atagggc 27<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>4ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgccgggga ggt43<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>5gttcctatag ggtttcgctc atgtgttg 28
<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>6ctatagggct cgagcggc18
權利要求
1.一種擴增水稻T-DNA插入位點側翼序列的方法，包括以下步驟1)酶切連接在同一反應體系中，利用平端限制性內切酶酶切水稻基因組DNA并利用T4DNA連接酶將得到的酶切片段與不對稱接頭序列連接，得到酶切連接液；所述不對稱接頭序列為由一條長鏈和一條短鏈組成的雙鏈接頭，長鏈和短鏈互補，并且在水稻基因組中無同源序列，長鏈具有至少兩個嵌套引物的結合位點；2)以步驟1中的酶切連接片段為模板，以根據所述不對稱接頭序列和T-DNA的左邊界序列設計的嵌套引物進行兩輪嵌套引物PCR擴增，得到T-DNA插入位點側翼序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述不對稱接頭序列的短鏈的3′端修飾有NH2基。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述酶切連接反應體系的組成及反應條件為水稻基因組DNA 40-100ng，平端限制性內切酶3U，T4DNA連接酶70U，T4DNA連接酶緩沖液，不對稱接頭序列50μM，加雙蒸水到10μl，25℃反應6-16個小時。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述反應體系的組成及反應條件為水稻基因組DNA 82.5ng，平端限制性內切酶3U，T4DNA連接酶70U，T4DNA連接酶緩沖液1×，不對稱接頭序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反應6-16個小時。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述平端限制性內切酶為Dra I、EcoRV、Bal I、Pvu II、Sma I、Sna I或Stu I。
6.根據權利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述不對稱接頭序列是由具有序列表中序列1的單鏈寡核苷酸序列和具有序列表中序列2的單鏈寡核苷酸序列加熱到80℃，然后在室溫下冷卻，退火而成的雙鏈接頭。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述兩輪嵌套引物PCR擴增中，第一輪PCR擴增的引物對為具有序列表中序列3和序列4的單鏈寡核苷酸序列；第二輪PCR擴增的引物對為具有序列表中序列5和序列6的單鏈寡核苷酸序列。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述第一輪PCR擴增的反應體系為酶切連接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR緩沖液，加雙蒸水到40μl；所述第二輪PCR擴增的反應體系為第一輪PCR產物50倍稀釋液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP115μM，1×PCR緩沖液，加雙蒸水到40μl。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述兩輪嵌套引物PCR擴增的反應條件均為94℃下預變性3min；然后94℃下變性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循環35次；72℃下充分延伸5min。
全文摘要
本發明公開了一種擴增水稻T－DNA插入位點側翼序列的方法。本發明所提供的擴增水稻T－DNA插入位點側翼序列的方法，包括以下步驟1)酶切連接在同一反應體系中，利用平端限制性內切酶酶切水稻基因組DNA并利用T
文檔編號C12N15/63GK1782074SQ20041009645
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月1日 優先權日2004年12月1日
發明者路鐵剛, 彭昊, 楊永智, 吳金霞, 黃紅梅, 宛淑艷 申請人:中國農業科學院生物技術研究所