專利名稱：長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法
技術領域：
本發明為生物技術領域，尤其涉及一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法。
背景技術：
自1992年Adams提出表達序列標簽(expressed sequence tag)和隨后的大規模表達序列標簽技術的建立，以及生物技術的發展和生命科學發展的需要，基因芯片技術應運而生。基因芯片(Biochips)的實質就是在面積不大的基片上有序地點陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識別分子(R.J.Lipshutz et al.，Bio Techniques 19(1995)，442-447；S.P.Fodor et al.，Nature364(1993)，555-556；S.P.Fodor et al.，Science 251(1991)，767-773；A.C.Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的基因芯片主要是用于DNA序列測定，基因表達譜鑒定(D.J.Lockhart et al.，Nature Biotechnol.14(1996)，1675-1680)和基因突變體的檢測和分析(Feriotto G，et al.，Hum Mutat1999；13390-400；Hacia J.G.et al.，Nat Genet 1999；21(suppl 1)42-7；Hacia JG，etal.，Nat Genet 1999；22164-7；Nilsson P，et al.，Biotechniques 1999；26308-16)，所以又稱為DNA芯片或基因芯片。目前，這一技術以擴展至免疫反應、受體結合等非核酸領域。如今基因芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動電微陣列和蛋白質芯片等。運用基因芯片技術，將獲得的芯片運用雜交技術和掃描技術對基因芯片進行芯片處理、有效數據提取、分析和報告，可獲得相應的基因表達譜(Gene expression profiling)。基因芯片因具有強有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點而被應用在許多領域，如DNA序列測定、基因多態性檢測、新基因的發現、疫苗和藥物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS2000；9711655-11660)。
基因芯片技術的發展勢必帶動一大批相應技術的發展，如基因芯片的信號檢測方法。目前基因芯片信號檢測方法主要包括以Cy5/Cy3標記的熒光信號檢測方法和以同位素標記的信號檢測方法，而且這些方法目前大都應用于高通量的基因芯片的信號檢測中，但無論應用那種信號檢測方法，都需要對探針進行標記，而且應用Cy5/Cy3熒光標記需要對Cy5和Cy3分別進行兩次，用同位素標記不僅能夠對操作者的人身受到傷害，還會對環境造成核輻射污染。
鑒于此，本發明提供了一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法。方法的步驟是運用特異引物對目的基因進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增并用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；聚合酶鏈式反應擴增陽性產物約5μg 100℃煮沸5min變性后，直接放入冰上冷卻3-5min，以備探針雜交用；將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液(pH7.2)進行潤濕后，加入預雜交液(0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃進行預雜交1-2小時；接著加入制備好的5μg變性探針DNA(該探針無需進行任何標記，如同位素、生物素等)，60℃進行雜交10-12小時；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％SDS)洗滌2次，每次20min，用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗滌15min；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE緩沖液漂洗5-10min，重復2次；在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進行信號檢測。該方法省卻了對探針進行標記的繁雜程序，特別是避免了同位素標記對人體所造成的傷害和對環境造成的放射污染；應用該方法可以克服單純運用聚合酶鏈式反應擴增可能造成的假陽性結果，使所得結果更靈敏、穩定、可靠。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法。方法的步驟為1)運用特異引物對待測目的基因進行聚合酶鏈式反應擴增并用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，陽性PCR產物備用；2)聚合酶鏈式反應擴增產物5μg 90-100℃煮沸5-10min進行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min；3)將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液，pH7.2，進行潤濕后，加入預雜交液，55-65℃進行預雜交1-2小時；預雜交液為0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，重量體積比為7％十二烷基磺酸鈉，重量體積比為1％牛血清白蛋白；4)接著加入步驟2)的5μg變性DNA，55-65℃進行雜交10-12小時；5)用洗膜液I洗滌1-3次，每次15-20min；洗膜液I為2×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；2×SSC為0.3mol/L氯化鈉，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0；
6)用洗膜液II洗滌15-20min；洗膜液II為0.1×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；7)將基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液中染色5-10min；1×TE緩沖液為10mmo/LTris堿，pH8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；8)用TE緩沖液漂洗5-10min，重復2-3次；9)在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進行信號檢測。
本發明的優點是1)該方法省卻了對探針進行標記的繁雜程序，特別是避免了同位素標記對人體所造成的傷害和對環境造成的放射污染；2)應用該方法可以克服單純運用聚合酶鏈式反應擴增可能造成的假陽性結果，使所得結果更可靠。3)該方法與常規的檢測方法相比具有高靈敏度和較高的檢出率。
圖1是Nos終止子基因為探針雜交后進行染色的結果，圖中1為Nos終止子，2為NPTII基因，3為CP4-EPSPS基因，4為Bar基因；圖2是用于長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法基因芯片的結構示意圖；圖3是用于長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法基因芯片圖2的方陣結構放大示意圖。
具體實施例方式
實施例(一)長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的制備如圖2所示，基因芯片是在平面型支撐載體5的平面上被覆有帶正電荷材料的膜6，在該膜層的表面設有點陣7，在點陣7上排布有如下供轉基因植物判斷用的外源基因探針1)35S啟動子，2)FMV35S啟動子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
點陣7為排布的凹窩狀結構8，點陣7之間保持有空間間隔，所說的各供轉基因植物判斷用的外源基因探針分別被覆于各凹窩狀結構8內。帶正電荷材料的膜層6為聚賴氨酸材料或氨基硅烷材料膜層。平面型支撐載體5為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
將預先合成好的上述的19個基因的單鏈寡核苷酸片段(長度大于50bp)稀釋成濃度為0.2μg/μl，按照實驗要求將各種濃度、各種不同基因的單鏈寡核苷酸片段排列于96孔PCR板中，用于基因芯片的點制；基因芯片由arrayer(GenomicSolution，USA)機器手，使用直徑為0.4mm的96針點制，基因芯片載體為尼龍膜(Millipore Nylon N+)，所有的點點制為36×24的一級方陣，每種基因的三種不同濃度在3×3的二級陣中平行三次重復以驗證試驗的重復性。
(二)CTAB法抽提轉基因大豆DNA用液氮將0.1g轉基因大豆磨成粉末，將粉末狀的干物質加入400μl預冷的CTAB提取緩沖液I(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃預熱的CTAB提取緩沖液II(2％CTAB，50mmol/LTris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巰基乙醇，混勻，65℃保溫30-90min，其間不時輕緩顛倒混勻。待冷至室溫后加入450μl氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至溶液呈乳濁狀。12000rpm離心2min至分相。將上清液轉移至干凈的離心管中，加入5μl Rnase A儲液，室溫下保溫30min。依次加入600μl異丙醇及60μl乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻。12,000rpm離心10min，沉淀DNA。棄上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm離心10min，棄上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min，沉淀DNA，除去殘留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE緩沖液中，4℃保存備用。
(三)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增總反應體系為50μl，10μl上述模板DNA，5μl 10×PCR反應緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP(每種2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混勻后離心5秒。將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心。95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35次擴增反應循環，進行PCR。最后一輪循環結束后，于72℃下保溫10min，使反應產物擴增充分。PCR擴增的引物分別為Nos終止子基因Pnos-F15’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’Pnos-R15’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’(四)瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的瓊脂糖凝膠液；加入10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應的凝膠板；取10μl PCR產物與2μl 6×載樣緩沖液(0.25％溴酚藍，40％(w/v)蔗糖水溶液)混勻，用微量移液槍小心加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，立即接通電源進行電泳；當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
(五)分子雜交及信號檢測聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產物約5μg 100℃煮沸5min進行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min，以備探針雜交用；將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液(pH7.2)進行潤濕后，加入預雜交液(0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃進行預雜交1-2小時；接著加入制備好的5μg變性探針DNA(該探針未進行任何標記，如同位素、生物素等)，60℃進行雜交10-12小時；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％SDS)洗滌2次，每次20min；用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗滌15min；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE緩沖液漂洗5-10min，重復2次；在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進行信號檢測。
權利要求
1.一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法，其特征在于，方法的步驟為1)運用特異引物對待測目的基因進行聚合酶鏈式反應擴增并用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，陽性PCR產物備用；2)聚合酶鏈式反應擴增產物5μg 90-100℃煮沸5-10min進行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min；3)將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液，pH7.2，進行潤濕后，加入預雜交液，55-65℃進行預雜交1-2小時；預雜交液為0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，重量體積比為7％十二烷基磺酸鈉，重量體積比為1％牛血清白蛋白；4)接著加入步驟2)的5μg變性DNA，55-65℃進行雜交10-12小時；5)用洗膜液I洗滌1-3次，每次15-20min；洗膜液I為2×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；2×SSC為0.3mol/L氯化鈉，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0；6)用洗膜液II洗滌15-20min；洗膜液II為0.1×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；7)將基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液中染色5-10min；1×TE緩沖液為10mmo/L Tris堿，pH8.0；1mmol/L 乙二胺四乙酸，pH8.0；8)用TE緩沖液漂洗5-10min，重復2-3次；9)在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進行信號檢測。
2.根據權利要求1所述的一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法，其特征在于，所說的聚合酶鏈式反應為總反應體系為50μl，10μl模板DNA，5μl 10×聚合酶鏈式反應緩沖液，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP，0.5μl 100ng/μl上游引物，0.5μl 100ng/μl下游引物，1μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，重蒸水25μl，混勻后離心5秒；10×聚合酶鏈式反應緩沖液為500mmol/L氯化鉀，100mmol/L Tris堿，pH9.0，重量體積比為1.0％ Triton X-100；4種dNTP為包含各為2.5mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP；將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數秒，使管壁上液滴沉至管底，加入2.5U Taq DNA聚合酶，混勻后稍離心；95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35次擴增反應循環，進行PCR，最后一輪循環結束后，于72℃下保溫10min。
3.根據權利要求1所述的一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法。其特征在于，所說的瓊脂糖凝膠電泳方法為用0.5×TBE電泳緩沖液配制重量體積比為1％的瓊脂糖凝膠液；0.5×TBE電泳緩沖液為45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；加入10mg/ml溴化乙錠溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應的凝膠板；取10μl PCR產物與2μl 6×載樣緩沖液混勻；6×載樣緩沖液為重量體積比為0.25％溴酚藍，重量體積比為40％蔗糖水溶液；用微量移液槍加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40-100mA，接通電源進行電泳；溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿2-3cm時，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
4.根據權利要求1所述的一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法，其特征在于，所述的基因芯片是在平面型支撐載體(5)的平面上被覆有帶正電荷材料的膜(6)，在該膜層的表面設有點陣(7)，在點陣(7)上排布有如下供轉基因植物判斷用的外源基因探針1)35S啟動子，2)FMV35S啟動子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
5.根據權利要求4所述的一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法，其特征在于所述的點陣(7)為排布的凹窩狀結構(8)，點陣(7)之間保持有空間間隔，所說的各供轉基因植物判斷用的外源基因探針分別被覆于各凹窩狀結構(8)內。
6.根據權利要求4所述的一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法，其特征在于，所述的帶正電荷材料的膜層(6)為聚賴氨酸材料或氨基硅烷材料膜層。
7.根據權利要求4所述的一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法，其特征在于所述的平面型支撐載體(5)為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
全文摘要
本發明公開了一種長度大于五十個堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號檢測方法。方法的步驟是目的基因進行聚合酶鏈式反應擴增并檢測；陽性產物約5μg100℃煮沸變性，冰上冷卻；將檢測用基因芯片用磷酸緩沖液潤濕后，加入預雜交液進行預雜交；接著加入制備好的5μg變性DNA，60℃進行雜交；用洗膜液I洗滌2次，用洗膜液II洗滌；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液染色；用TE緩沖液漂洗，重復2次；紫外光下或熒光顯微鏡下進行信號檢測。該方法省卻了對探針進行標記的繁雜程序，特別是避免了同位素標記對人體所造成的傷害和對環境造成的放射污染；應用該方法可以克服單純運用聚合酶鏈式反應擴增可能造成的假陽性結果，使所得結果更靈敏、穩定、可靠。
文檔編號C12Q1/68GK1661104SQ20041009315
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月17日 優先權日2004年12月17日
發明者李德葆, 駱紅梅, 戴承恩, 姜玉新, 董海濤 申請人:浙江大學