專利名稱：棕囊藻的檢測探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組藻類檢測的寡核苷酸探針，具體是針對棕囊藻定性與定量檢測的特異性探針。屬于核酸檢測領域。
背景技術：
棕囊藻(Phaeocystis sp.)是一種有毒藻，能產生有溶血作用的毒素，屬于金藻門、定鞭藻類，在我國南部海域曾多次引發赤潮。該藻球形群體外圍具有一層柔軟的膠質被且藻體含多糖，當大量繁殖形成赤潮時，含膠質和糖的藻體便緊緊貼在魚鰓上，影響魚的呼吸和攝食，致使魚類窒息、缺氧而死亡；其次，該藻巨大的生物量(尤其是黎明和傍晚時)可造成水體缺氧導致災害。再加上藻體和藻細胞死亡腐爛后會產生溶血毒素等有毒物質，對水體環境的破壞將持續一定時間，嚴重時會導致魚類大面積死亡，尤其對網箱養殖和對蝦育苗危害更大。1997年11月中旬至12月底在北起福建泉州灣南至廣東汕尾的數千平方公里的近海與內灣水域發生了一起該藻引起的中國有史以來規模最大、持續時間最長、危害最嚴重的赤潮。因此，及時、準確、快速地檢測海洋環境中棕囊藻的種群動態，隨時了解其在海洋中的數量變化具有重要意義。傳統的利用光學顯微鏡直接觀察和計數的鑒別方法，過程煩瑣、費時、費力，并需要有經驗的分類專家參與其中。當樣品量多，生物多樣性豐富，監測范圍廣時工作量極大，因此主要用于藻的定性和分離，而不適用于藻的定量與大范圍監測研究。所以，發展用于快速、準確檢測棕囊藻的新方法和新技術極具現實意義。但是，目前國際國內關于這方面的研究進展不大，尚未形成非常有效的對該藻進行定性和定量檢測的成熟技術。由于rRNA被認為是與藻類的系統進化密切相關的序列，而且真核生物細胞中rRNA含量非常高，可以達到106～107個拷貝，rRNA是夾心雜交的很好的靶點。
經對現有技術文獻的檢索發現，Christopher A.Scholin等在《利用rRNA在全細胞和“三明治”雜交中識別南方菱形藻》(美國《藻類學雜志》，1996，35(3)，190～197)一文中將提取的RNA或者藻細胞裂解液在一定條件下與結合在96孔板上的寡核苷酸探針雜交后，再用一標記的信號探針與之雜交，最后進行酶標抗體顯色反應，取得了較滿意的結果。該技術現在海洋藻類的監測中已經有所應用。但到目前為止，應用該技術能夠檢測的微藻只限于有限的幾種(其中包括了棕囊藻)。其主要缺點是一，因捕獲探針的長度僅10～30bp，因此能夠有效區別親緣關系較近的微藻的捕獲探針數量極少；二，在整個檢測過程中都需要防止RNA降解，然而洗滌、抗體反應等各步驟極易造成RNA降解，因此操作難度大、檢測結果波動性大。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一組針對棕囊藻rRNA的特異性的棕囊藻的檢測探針，依據這組探針對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，實現對該藻的快速定性和定量。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明用于對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，具體包括三條相互關聯的寡核苷酸探針S1酶保護分析探針、抓捕探針、信號探針或者連接探針，所述的S1酶保護分析探針，是指與棕囊藻rRNA互補而且用于S1酶保護分析方法的寡核苷酸探針，所述的抓捕探針，是指與S1酶保護分析探針的一端結合，這一端通常為3’端，另外一端標記有生物素，從而將經過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護分析探針捕獲下來的探針，所述的信號探針或者連接探針能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護分析探針后，結合于S1酶保護分析探針的另一端的的探針為連接探針，同時該探針標記有可檢測信號，或者在一端具有信號探針結合區，能夠與通用信號探針互補。
所述的S1酶保護分析探針，在進行生物信息學比對分析時，僅與僅與棕囊藻核糖體小亞基210～280區域核苷酸互補，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為58bp，在一定的條件下可特異性結合于棕囊藻的rRNA上，序列為5’-CGATTCGAGCAGTTATTATGACTCAGCACACAACCGGGCGAACCCGAGAAGGTTTCTT。通過測定棕囊藻的rRNA序列，進行多序列比較，尋找棕囊藻的特征序列，作為該藻的rRNA特異區域，然后根據該rRNA特異區域序列(特征序列)設計S1酶保護分析探針。尋找生物特異性區域的方法以及根據特異區域設計探針都采用現有技術。已有的實驗表明，所述的棕囊藻rRNA之間若存在2～3個以上核苷酸的連續錯配或者缺失可作為特異探針設計的靶序列。
抓捕探針特異性結合于S1酶保護分析探針一端，長度為22bp，序列特征為5’-AAGAAACCTTCTCGGGTTCGCC，在5’端標記有生物素、磷酸基團，或者氨基基團以及其他任何可用來標記的用于固定于固體基質的標記。
信號探針或者連接探針在另一端具有通用信號探針互補區，與通用信號探針互補結合，序列為5’-GCTGAGTCATAATAACTGCTCGAATCG；該序列上標記各種檢測的信號，具體包括熒光素、地高辛、生物素用于信號檢測的序列，或者與通用的信號探針互補的一段序列。
通用信號探針與連接探針的一端(不同于與S1酶保護分析探針互補結合的一端)互補。常用的標記物包括(但并不限于)地高辛、熒光素、生物素或者辣根過氧化物酶等。
簡而言之，本發明是針對棕囊藻的rRNA特定區域合成以S1酶保護分析探針為核心的一組探針，聯合S1酶保護分析和夾心雜交技術實現對棕囊藻rRNA的定性定量檢測。
本發明的這組探針可用于以S1酶保護分析和夾心雜交技術檢測樣品中是否存在棕囊藻及其數量，所述的檢測過程包括下列步驟(a)待檢測樣品和S1酶保護分析探針的混合在該步驟中，可以將經裂解處理已釋放出rRNA的待檢測的微藻樣品與S1酶保護分析探針混合。也可以將待檢測的微藻樣品與S1酶保護分析探針直接混合，然后再進行裂解處理，從而釋放rRNA。一旦釋放出的rRNA包含對應于S1酶保護分析探針的靶序列，經過雜交，則會與S1酶保護分析探針形成雙鏈。
(b)S1酶處理當S1酶保護分析探針與待檢測生物的rRNA雜交后，用適當濃度(通常為0.5U～2U/μl，較佳地為1U/μl)的S1酶消化過量游離的探針；當該探針與其他非目標rRNA反應時，由于雜交體存在切口或小缺口，S1酶亦能將該探針切斷；最終保留下與完全匹配的S1酶保護分析探針和棕囊藻的rRNA形成的DNA/RNA雙鏈，而且該雙鏈的量代表了樣本中相應的rRNA的量。
(c)DNA-RNA雜合體的變性將DNA/RNA雙鏈雜合體變性為DNA單鏈(即S1酶保護分析探針)和RNA單鏈。合適的變性方法沒有特別限制，可以用本領域常用的各種變性方法，例如熱變性等。例如，加入中和溶液后加熱，使S1酶保護分析探針和目標生物的rRNA形成的雜合體變性，從而釋放出保留下來的S1酶保護分析探針。由于RNA不穩定，解鏈形成的RNA單鏈易被內源或外源的RNA酶降解。
(d)捕獲S1酶保護分析探針將保留有S1酶保護分析探針的溶液與預先固定于固相載體上的抓捕探針雜交，將S1酶保護分析探針特異地抓捕在固相載體上，并洗滌除去非特異的結合。
(e)結合帶可檢測信號的探針用連接探針與被捕獲的S1酶保護分析探針雜交，并洗滌除去非特異的結合，再用信號探針與連接探針結合，并洗滌除去非特異的結合。
(f)信號檢測可用本領域常規方法對可檢測信號進行信號檢測。例如信號探針上可以標記上熒光信號，這樣通過激發熒光來讀取數據；也可以在信號探針上標記上地高辛、熒光素或者生物素等，然后通過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗體或者親和素與之反應；最后加入發光底物或者顯色底物(TMB或者NPP等)，通過探測發光強弱或者吸光度來判讀信號。
本發明的主要優點在于(1)探針適用性好夾心雜交特異識別的關鍵是抓捕探針的特異性，一般情況抓捕探針約長20～30核苷酸，該探針要具有特異性，必須與其他非目標生物的rRNA分子要有較大的差異，盡管不同生物的rRNA在進化上會有差異，但在找到并成功驗證親緣關系較近的生物之間的特異性探針并不是一件容易的事，這可能也是夾心雜交技術發展到現在只有找到很少量抓捕探針的原因之一。本發明中涉及的S1酶保護分析探針，盡管長度在60個核苷酸左右，但并不要求探針全長都要有特異性，而只要求探針的中間區域有幾個核苷酸的差異即可，這大大方便了特異探針的尋找和實現。
(2)穩定性高夾心雜交技術成功執行的關鍵之一在于保證RNA分子在整個過程不被降解，特別要保證抓捕探針與信號探針之間的那段目標RNA分子(可能在幾十到幾百個核苷酸之間)在整個實驗過程的完好無損。但由于實驗過程涉及抗原抗體反應和多次洗滌步驟，這為RNA酶對RNA分子降解提供了較多機會，因此要保證目標RNA分子不被降解有非常大的難度。即使最終能夠實現定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本發明中直接與rRNA分子相關的過程只有S1酶保護分析探針與rRNA分子雜交這一步，只要雜交裂解液加入適當的RNA酶抑制劑就能保證雜交時rRNA分子不被降解或很少被降解，實驗操作的其他步驟都是針對穩定的DNA分子進行的，相對比較容易執行。因此本發明的穩定性遠遠高于夾心雜交技術。
圖1本發明各種不同的藻示意2顯示對不同細胞數的棕囊藻的檢測曲線示意圖具體實施方式
下面結合附圖，在具體實施例進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例應用針對rRNA的S1酶保護分析和夾心雜交技術對棕囊藻定性定量檢測在本實施例中，將S1酶保護分析技術和夾心雜交技術聯合用來實現對海洋赤潮生物棕囊藻(Phaeocystis sp.)的定性和定量檢測，步驟如下1.1 棕囊藻rRNA特異區域的尋找和S1酶保護分析探針的設計與合成通過測定棕囊藻核糖體小亞基18S rRNA序列并與其它藻類的rRNA序列進行多序列比較，找到其在小亞基rRNA的210～280區域與其它藻類不同，確定該區域序列為特征序列；根據特征序列設計和合成S1酶保護分析探針ZN_S15’-CGATTCGAGCAGTTATTATGACTCAGCACACAACCGGGCGAACCCGAGAAGGTTTCTT(SEQ IDNO.1)。
根據S1酶保護分析探針設計和合成夾心雜交所需的其他探針抓捕探針ZN_CAPT5’-Biotin-AAGAAACCTTCTCGGGTTCGCC(SEQ ID NO.2)，與S1酶保護分析探針的3’端互補，在5’端有生物素(Biotin)標記；連接探針SCR_LINK5’-GCTGAGTCATAATAACTGCTCGAATCGTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG(SEQID NO.3)，在5’端的25個核苷酸與S1酶保護分析探針的5’端互補，在3’端的32個核苷酸與通用信號探針的5’端互補。
1.2 抓捕探針固定于酶標板抓捕探針的固定方法在預先包被有親和素的酶標板(Pierce公司)的每一孔中加入100μl溶解于CBS(pH7.2)的40nM抓捕探針，37℃靜置2小時。用PBS洗三次備用。
1.3 S1酶保護分析將用f2培養基培養的海藻樣品計數后，離心收集于1.5ml塑料管中，棄去上清，加入濃度為50nM S1酶保護分析探針的1000μl裂解液(0.8％SDS，1.2M Urea，20％Formamide，0.3M NaCl，50mM Tris，pH7.0)。
進行棕囊藻的特異性驗證時，將塔瑪亞歷山大藻、角毛藻、中肋骨條藻、赤潮異彎藻、共生藻、錐狀斯氏藻、紅色共生藻、海洋原甲藻、微型原甲藻、尖刺菱形藻等各約106個細胞分別進行上述處理。
進行棕囊藻的檢測曲線分析時，將過濾收集到的棕囊藻樣品用含有S1酶保護分析探針的裂解液10倍逐級稀釋6次共獲得7個樣品。
對于海藻樣品和S1酶保護分析探針的混合物，超聲波處理兩分鐘，將混合溶液在95℃放置10分鐘，然后70℃雜交2小時。自然冷卻后加入500μl含有800US1酶(Promega公司)的S1酶解緩沖液(50mM ZnSO4，500mM NaAc，50mM NaClpH4.5)，在50℃酶切處理30分鐘。
1.4 DNA-RNA雜合體的變性加入250μl變性緩沖液(1.5M NaOH，300mM EDTA)，95℃處理10分鐘，自然冷卻后用于夾心雜交。此時DNA-RNA雜合體變性形成單鏈DNA(即曾結合于靶序列的S1酶保護分析探針)和單鏈RNA。與此同時，單鏈RNA被降解，因此溶液中僅含曾結合于靶序列的S1酶保護分析探針。
1.5 夾心雜交抓捕將100μl上述變性后的反應混合液分別移入到預固定有抓捕探針的酶標板微孔中，50℃雜交1小時，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
夾心雜交每孔加入含有100μl 5nM連接探針的雜交緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)，于50℃雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次；每孔加入含有100ul 5nM信號探針的雜交緩沖液(2×SSC，0.5％SDS)于50℃雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
1.6 信號檢測酶標板用磷酸緩沖液(PBS)洗6次；每孔加入含有標記了辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體(購自Roche公司)，37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB(購自Pierce公司)顯色液100μl，37℃處理15分鐘后，每孔加入50μl2M硫酸終止反應。將酶標板置于讀板機上于450nm測定光吸收值。
1.7 結果檢測結果如圖1和圖2所示。
圖1顯示了用針對棕囊藻的探針探測各種不同的藻的檢測結果，證明了本發明方法具有極高的可行性和特異性。
對數據用常規統計方法進行擬合，獲得如下關系y＝6E-05x+0.0923；R2＝0.997；x為樣品中棕囊藻的細胞數，y為實際測定的OD.450，R2為相關系數。
下表列出了用本實施例方法測定的棕囊藻樣品數量與顯微計數結果的比較
本發明涉及的序列及記號分別如下(1)SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大學<120>棕囊藻S1酶保護分析探針<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>58
<212>DNA<213>人工序列<400>1CGATTCGAGCAGTTATTATGACTCAGCACACAACCGGGCGAACCCGAGAAGGTTTCTT(2)SEQ ID NO.2的信息<110>上海交通大學<120>棕囊藻抓捕探針<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1AAGAAACCTTCTCGGGTTCGCC(3)SEQ ID NO.3的信息<110>上海交通大學<120>棕囊藻信號探針(連接探針)<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1GCTGAGTCATAATAACTGCTCGAATCG
權利要求
1.一種棕囊藻的檢測探針，其特征在于，用于對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，具體包括三條相互關聯的寡核苷酸探針S1酶保護分析探針、抓捕探針、信號探針或者連接探針，所述的S1酶保護分析探針，是指與棕囊藻rRNA互補而且用于S1酶保護分析方法的寡核苷酸探針，所述的抓捕探針，是指與S1酶保護分析探針的一端結合，這一端通常為3’端，另外一端標記有生物素，從而將經過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護分析探針捕獲下來的探針，所述的信號探針或者連接探針能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護分析探針后，結合于S1酶保護分析探針的另一端的的探針為連接探針，同時該探針標記有可檢測信號，或者在一端具有信號探針結合區，能夠與通用信號探針互補。
2.根據權利要求1所述的棕囊藻的檢測探針，其特征是，所述的棕囊藻rRNA之間若存在2～3個以上核苷酸的連續錯配或者缺失可作為特異探針設計的靶序列。
3.根據權利要求1所述的棕囊藻的檢測探針，其特征是，所述的S1酶保護分析探針，在進行生物信息學比對分析時，僅與僅與棕囊藻核糖體小亞基210～280區域核苷酸互補，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為58bp，在一定的條件下可特異性結合于棕囊藻的rRNA上，序列為5’-CGATTCGAGCAGTTATTATGACTCAGCACACAACCGGGCGAACCCGAGAAGGTTTCTT。
4.根據權利要求1所述的棕囊藻的檢測探針，其特征是，所述的抓捕探針特異性結合于S1酶保護分析探針一端，長度為22bp，序列特征為5’-AAGAAACCTTCTCGGGTTCGCC，在5’端標記有生物素、磷酸基團，或者氨基基團以及其他任何可用來標記的用于固定于固體基質的標記。
5.根據權利要求1所述的棕囊藻的檢測探針，其特征是，所述的信號探針或者連接探針在另一端具有通用信號探針互補區，與通用信號探針互補結合，序列為5’-GCTGAGTCATAATAACTGCTCGAATCG該序列上標記各種檢測的信號，具體包括熒光素、地高辛、生物素用于信號檢測的序列，或者與通用的信號探針互補的一段序列。
全文摘要
一種棕囊藻的檢測探針，屬于核酸檢測領域。用于對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，具體包括三條相互關聯的寡核苷酸探針S1酶保護分析探針，在進行生物信息學比對分析時，僅與棕囊藻核糖體小亞基210～280區域核苷酸互補，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為58bp，在一定的條件下可特異性結合于棕囊藻的rRNA上，序列為5’－CGATTCGAGCAGTTATTATGACTCAGCACACAACCGGGCGAACCCGAGAAGGTTTCTT。本發明探針適用性好，大大方便了特異探針的尋找和實現。本發明的穩定性遠遠高于夾心雜交技術。
文檔編號C12Q1/68GK1661100SQ20041009309
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月16日 優先權日2004年12月16日
發明者李榮秀, 于志剛, 蔡青松, 米鐵柱, 甄毓 申請人:上海交通大學