專利名稱：篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，是一種篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法。
背景技術：
目前國內外轉基因動物細胞陽性單克隆的篩選與培養，多選用抗新霉素基因為篩選標志，實驗過程中，由于被基因轉染的細胞數較少，能在培養過程中穩定遺傳的細胞數更少，因此轉基因動物細胞陽性單克隆的篩選十分重要。但是，用新霉素篩選轉基因動物細胞陽性單克隆時，一般先進行動物細胞的培養，然后在進行正常細胞新霉素濃度敏感性檢測，得到正常細胞致死新霉素濃度范圍后，將正常細胞進行基因轉染，將轉染后細胞用致死范圍內的新霉素濃度處理，存留下來細胞低濃度稀釋，進行96孔板單細胞克隆篩選；有關細胞計數、活細胞檢測、新霉素濃度敏感性檢測及轉染方法和步驟詳見薛慶善主編的2001年由科學出版社出版的“體外培養的原理與技術”一書；由于該實驗方法工作量大，消耗大量的培養基和培養耗材，同時由于單細胞篩選，細胞間失去接觸、聯系，在新霉素的作用下細胞極易老化、死亡，因此上述轉基因動物細胞陽性單克隆的篩選與培養方法效率較低、成本較高、費工費時。
發明內容
本發明提供了一種篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，克服了現有技術之不足，其效率較高、成本較低、省時省工。
本發明的技術方案是這樣來實現的一種篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其按下述步驟進行第一步，在培養液中對需要克隆的動物細胞進行培養，待其動物細胞聚合至40％至80％后，進行基因轉染；第二步，在基因轉染后進行1天至7天的動物細胞生長恢復，然后用能致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素進行5天至20天篩選；第三步，在第二步致死性篩選后，在陽性轉基因動物細胞維持生長的濃度的新霉素下，再加入離心收集的該動物細胞對數生長期含有生長因子培養液的條件下，在培養液中進行2天至14天的動物細胞培養擴增；第四步，當第三步中的陽性轉基因動物細胞生長形成克隆后，用細胞刮刀刮除正常細胞，保留轉基因陽性動物細胞克隆；第五步，挑選和標記選定的轉基因動物細胞陽性單克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定點消化該單克隆細胞并將消化后的陽性單克隆細胞迅速置入新的培養器皿中培養擴增，培養擴增至50％--80％的細胞聚合，用0.125％至0.25％濃度的胰酶或EDTA-胰酶消化和懸浮上述所培養擴增的陽性轉基因單克隆動物細胞，加入培養液和致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素，繼續培養細胞，在致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素和胰酶或EDTA-胰酶作用下，在培養液中致死殘留的非基因轉染動物細胞；第六步，將第五步所得到陽性單克隆動物細胞再植入新的培養器皿中培養，在陽性轉基因動物細胞維持生長的濃度的新霉素條件下，再加入離心收集的該細胞對數生長期含有生長因子培養液的條件下，即可得到大量的純化的轉基因陽性單克隆動物細胞。
本發明特別適用于牛、羊和豬等哺乳類轉基因動物細胞陽性單克隆的篩選與培養。依照此方法可獲得眾多不同轉基因陽性單克隆動物細胞。
下面是對本發明技術方案的進一步優化上述需要篩選的轉基因動物細胞可為成年荷斯坦奶牛成纖維細胞。
上述成年荷斯坦奶牛成纖維細胞被致死的新霉素濃度可為300μg/ml至1000μg/ml。
上述成年荷斯坦奶牛成纖維細胞能維持生長的新霉素濃度可為50μg/ml至250μg/ml。
上述需要篩選的轉基因動物細胞可為成年莎能奶山羊成纖維細胞。
上述成年莎能奶山羊成纖維細胞被致死的新霉素濃度可為250μg/ml至800μg/ml。
上述成年莎能奶山羊成纖維細胞能維持生長的新霉素濃度可為20μg/ml至200μg/ml。
上述需要篩選的轉基因動物細胞可為豬成纖維細胞。
上述豬成纖維細胞被致死的新霉素濃度可為400μg/ml至1000μg/ml。
上述豬成纖維細胞能維持生長的新霉素濃度可為100μg/ml至300μg/ml。
上述培養液可為含有10％至20％牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清和100u/ml雙抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液。
上述基因轉染可以脂質體包埋或電穿孔方法進行。
本發明的特點本發明的特點省時省工，效率高，并且大大降低了篩選轉基因動物細胞陽性單克隆的成本。同時該方法適用于商業上具有經濟價值的轉基因動物細胞陽性單克隆的篩選，是制作轉基因動物的必要手段之一。
附圖1為激發光照射下含有綠色熒光蛋白、新霉素抗性基因的牛耳成纖維細胞陽性單克隆。
附圖2為已將乳腺特異表達啟動子、綠色熒光蛋白及新霉素抗性三種基因同時導入的牛耳成纖維細胞陽性單克隆。
圖3、圖4激發光照射下正在生長的同時含有乳腺特異表達啟動子、綠色熒光白及新霉抗性三種基因的莎能奶山羊成纖維細胞陽性單克隆。
具體實施例方式
本發明不受下述實施例的限制，可根據上述本發明的技術方案和實際情況來確定具體的實施方式。
實施例1，用含有10％或15％或20％的牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清和100u/ml雙抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液，純化培養成年荷斯坦奶牛成纖維細胞，待細胞聚合至40％或50％或60％或70％或80％，以脂質體包埋或電穿孔方法進行基因轉染，24小時或36小時或48小時的細胞生長恢復，然后用300μg/ml或500μg/ml或750μg/ml或1000μg/ml濃度新霉素篩選培養5天或10天或14天，再用含20％的牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清、100u/ml雙抗和50μg/ml或100μg/ml或150μg/ml或200μg/ml或250μg/ml新霉素的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液并加入離心收集的該細胞對數生長期含有生長因子培養液，使陽性轉基因細胞生長、擴增2天或6天或10天。待陽性轉基因動物細胞生長形成克隆后并長到接觸抑制，用細胞刮刀盡可能刮除正常細胞，保留陽性克隆。挑選和標記選定的轉基因動物細胞陽性單克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定點消化該單克隆細胞并將消化后的陽性單克隆細胞迅速置入新的培養器皿中培養擴增，培養擴增至50％--80％的細胞聚合，用胰酶或EDTA-胰酶消化和懸浮上述培養放大的陽性轉基因單克隆動物細胞，并在培養液中保留原消化胰酶和加入300μg/ml或500μg/ml或750μg/ml或1000μg/ml篩選濃度的新霉素，殘留下來的正常細胞由于受胰酶或EDTA-胰酶和新霉素雙重負作用因子影響，將很難再貼壁并很快死亡。將上述細胞植入各種培養器皿，再次聯合使用離心收集到的該細胞對數生長期含有生長因子培養液，保持50μg/ml或100μg/ml、150μg/ml或200μg/ml或250μg/ml陽性轉基因動物細胞維持生長的濃度的新霉素，即可得到大量的轉基因陽性單克隆動物細胞。
實施例2，用含有10％或15％或20％牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清和100u/ml雙抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液，純化培養成年莎能奶山羊成纖維細胞，待細胞聚合至40％或50％或60％或70％或80％，以脂質體包埋或電穿孔方法進行基因轉染，24小時或36小時或48小時的細胞生長恢復，然后用250μg/ml或600μg/ml或800μg/ml濃度新霉素篩選培養5天或10天或14天，再用含有20％牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清、100u/ml雙抗和20μg/ml或60μg/ml或100μg/ml或140μg/ml或180μg/ml或200μg/ml新霉素的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液并加入離心收集的該細胞對數生長期含有生長因子培養液，使陽性轉基因細胞生長、擴增2天或6天或10天。待陽性轉基因動物細胞生長形成克隆后并長到接觸抑制，用細胞刮刀盡可能刮除正常細胞，保留陽性克隆。挑選和標記選定的轉基因動物細胞陽性單克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定點消化該單克隆細胞并將消化后的陽性單克隆細胞迅速置入新的培養器皿中培養擴增，培養擴增至50％--80％的細胞聚合，用胰酶或EDTA-胰酶消化和懸浮上述培養放大的陽性轉基因單克隆動物細胞，并在培養液中保留原消化胰酶和加入250μg/ml或600μg/ml或800μg/ml篩選濃度的新霉素，殘留下來的正常細胞由于受胰酶或EDTA-胰酶和新霉素雙重負作用因子影響，將很難再貼壁并很快死亡。將上述細胞植入各種培養器皿，再次聯合使用離心收集到的該細胞對數生長期含有生長因子培養液，保持50μg/ml或100μg/ml或150μg/ml或200μg/ml陽性轉基因動物細胞維持生長的濃度的新霉素，即可得到大量的轉基因動物陽性單克隆細胞。
實施例3，用含有10％或15％或20％牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清和100u/ml雙抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液，純化培養豬成纖維細胞，待細胞聚合至40％或50％或60％或70％或80％，以脂質體包埋或電穿孔方法進行基因轉染，24小時或36小時或48小時的細胞生長恢復，然后用400μg/ml或600μg/ml或800μg/ml或1000μg/ml濃度新霉素篩選培養5天或10天或14天，再用20％牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清、100u/ml雙抗和100μg/ml或200μg/ml或300μg/ml新霉素的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液并加入離心收集的該細胞對數生長期含有生長因子培養基，使陽性轉基因細胞生長、擴增2天或6天或10天。待陽性轉基因動物細胞生長形成克隆后并長到接觸抑制，用細胞刮刀盡可能刮除正常細胞，保留陽性克隆。挑選和標記選定的轉基因動物細胞陽性單克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定點消化該單克隆細胞并將消化后的陽性單克隆細胞迅速置入新的培養器皿中培養擴增，培養擴增至50％--80％的細胞聚合，用胰酶或EDTA-胰酶消化和懸浮上述培養放大的陽性轉基因單克隆動物細胞，并在培養液中保留原消化胰酶和加入400μg/ml或600μg/ml或800μg/ml或1000μg/ml篩選濃度的新霉素，殘留下來的正常細胞由于受胰酶或EDTA-胰酶和新霉素雙重負作用因子影響，將很難再貼壁并很快死亡。將上述細胞植入各種培養器皿，再次聯合使用離心收集到的該細胞對數生長期含有生長因子培養基，保持100μg/ml或200μg/ml或300μg/ml陽性轉基因動物細胞維持生長的濃度的新霉素，即可得到大量的轉基因動物陽性單克隆細胞。
從實施例1、實施例2和實施例3來看，本發明不僅適用于牛、羊和豬的轉基因成纖維細胞陽性克隆的篩選，還適用于其它哺乳類轉基因動物細胞陽性克隆的篩選與培養。
權利要求
1.一種篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于按下述步驟進行第一步，在培養液中對需要轉基因的動物細胞進行培養，待其動物細胞聚合至40％至80％后，進行基因轉染；第二步，在基因轉染后進行1天至7天的動物細胞生長恢復，然后用能致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素進行5天至20天篩選；第三步，在第二步致死性篩選后，使用轉基因動物細胞維持生長濃度的新霉素，再加入離心收集的該動物細胞對數生長期含有生長因子培養液，在此條件下，在培養液中進行2天至14天的動物細胞培養擴增；第四步，當第三步中的陽性轉基因動物細胞生長形成克隆后，用細胞刮刀刮除正常細胞，保留轉基因陽性動物細胞克隆；第五步，挑選和標記選定的轉基因動物細胞陽性單克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定點消化該單克隆細胞并將消化后的陽性單克隆細胞迅速置入新的培養器皿中培養擴增，培養擴增至50％--80％的細胞聚合，用0.125％至0.25％濃度的胰酶或EDTA-胰酶消化和懸浮上述所培養擴增的陽性轉基因單克隆動物細胞，加入培養液和致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素，繼續培養細胞，在致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素和胰酶或EDTA-胰酶作用下，在培養液中致死殘留的非基因轉染動物細胞；第六步，將第五步所得到陽性單克隆動物細胞再植入新的培養器皿中培養，在陽性轉基因動物細胞維持生長的濃度的新霉素條件下，再加入離心收集的該細胞對數生長期含有生長因子培養液的條件下，即可得到大量的純化的轉基因陽性單克隆動物細胞。
2.根據權利要求1所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于需要篩選的轉基因動物細胞為成年荷斯坦奶牛成纖維細胞。
3.根據權利要求2所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于成年荷斯坦奶牛成纖維細胞被致死的新霉素濃度為300μg/ml至1000μg/ml；或/和，成年荷斯坦奶牛成纖維細胞能維持生長的新霉素濃度為50μg/ml至250μg/ml。
4.根據權利要求1所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于需要篩選的轉基因動物細胞為成年莎能奶山羊成纖維細胞。
5.根據權利要求2所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于成年莎能奶山羊成纖維細胞被致死的新霉素濃度為250μg/ml至800μg/ml；或/和，成年莎能奶山羊成纖維細胞能維持生長的新霉素濃度為20μg/ml至200μg/ml。
6.根據權利要求1所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于需要篩選的轉基因動物細胞為豬成纖維細胞。
7.根據權利要求2所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于豬成纖維細胞被致死的新霉素濃度為400μg/ml至1000μg/ml；或/和，豬成纖維細胞能維持生長的新霉素濃度為100μg/ml至300μg/ml。
8.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于培養液為含有10％至20％牛血清或小牛血清或類胎牛血清或胎牛血清和100u/ml雙抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培養基的培養液。
9.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于基因轉染以脂質體包埋或電穿孔方法進行。
10.根據權利要求8所述的篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其特征在于基因轉染以脂質體包埋或電穿孔方法進行。
全文摘要
一種篩選轉基因動物細胞陽性單克隆方法，其按下述步驟進行第一步，對需要轉基因的動物細胞進行培養，并進行基因轉染；第二步，用能致死非基因轉染動物細胞的濃度的新霉素進行篩選；第三步，轉基因動物細胞陽性克隆的培養擴增；第四步，刮除非基因轉染動物細胞，保留轉基因動物細胞陽性克隆；第五步，挑選轉基因動物細胞陽性單克隆并培養擴增，致死殘留的非基因轉染動物細胞；第六步，進一步培養擴增得到大量的轉基因動物陽性單克隆細胞。本發明的特點省時省工，效率高，并且大大降低了篩選轉基因動物細胞陽性單克隆的成本。同時該方法適用于商業上具有經濟價值的轉基因動物細胞陽性單克隆的篩選，是制作轉基因動物的必要手段之一。
文檔編號C12N5/10GK1616653SQ20041009283
公開日2005年5月18日 申請日期2004年11月12日 優先權日2004年9月20日
發明者王亮, 朱海, 呂自力, 劉婷婷, 帥志強, 彭濤 申請人:新疆金牛生物股份有限公司