專利名稱：一株葡糖酸醋酸桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株葡糖酸醋酸桿菌及其應用，特別是涉及一株葡糖酸醋酸桿菌及利用該菌株生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法。
背景技術：
紅茶菌(kombucha)，又名紅茶菇、茶霉菌、海寶，是以含糖的茶葉浸出液通過微生物發酵制成的一種民間傳統酸性飲料。紅茶菌是多菌種的發酵產品，菌種主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌。經研究，紅茶菌具有防病治病、延年益壽的保健作用，如它具有增強機體免疫力、長壽、減少皺紋、防癌、抗癌、減肥、潤滑腸道、增強心腦肝腎的功能、降血壓、安眠、幫助消化、化結石、軟化血管等功效；所涉及的能夠預防和治療的疾病至少有二三十種，如它可以治療和預防癌癥、由病毒和細菌引起的各種疾病(如感冒)、便秘、痔瘡、風濕性關節炎、胃炎、因胃酸分泌不足引起的消化功能障礙、食欲減退、頭痛、神經失調、失眠、慢性疲勞綜合癥、結石(包括腎結石、膽結石、尿道結石)、高血壓及其并發癥、糖尿病等。
在胃的酸性pH(2-4.7)下，部分D-葡萄糖二酸及其相關衍生物可慢慢轉變成D-葡萄糖二酸1，4內酯。D-葡萄糖二酸1，4內酯是紅茶菌中一種很重要的功能因子(Michael R.Roussin，Analyses of KombuchaFermentsReport on Growers，http//persweb.direct.ca/chaugen/kombucha-research-mroussin2toc.htmL)。經研究，D-葡萄糖二酸1，4內酯可大大減少有害物質對肝素、透明質酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破壞能力，利于機體更有效地排出毒素，從而起到防癌抗癌、緩解因關節炎、痛風、氣喘及相關組織功能下降引起的不適等作用。
D-葡萄糖二酸1，4內酯對葡萄糖苷酸酶具有抑制作用。Kim等人在對結腸癌患者的研究中發現，癌癥是由一些酶(如β-葡萄糖苷酸酶)進入腸道而誘發的。腸道中的β-葡萄糖苷酸酶可將致癌物前體轉化為致癌物，因它可水解葡萄糖醛酸以及內源和外源毒素、膽紅素、苯并芘等的結合體—葡萄糖苷酸。
此外，在Gupta和Singh的研究實驗中發現，D-葡萄糖二酸1，4內酯的作用濃度和作用底物不同，結果也不同。如0.0017mM的D-葡萄糖二酸1，4內酯就能顯著抑制人的精液和血漿中β-葡萄糖苷酸酶(Gupta-GS，Singh-GP.Isolation andcharacterization of the major form of beta-glucuronidase from human seminaland plasma.Biochem-Biophys-Acta，1983，748(3)398-404)。Kim等人研究發現，0.03-0.15mg/mL的D-葡萄糖二酸1，4內酯就能顯著抑制正常人和結腸癌患者腸道中以及糞便中葡萄糖苷酸酶的活性，從而解釋出紅茶菌具有解毒、抗癌作用的原因(Kim-DH，Jin-YH，Jung-EA et al.Purification and characterization ofbeta-glucuronidase from Escherichia coli HGU-3，a human intestinal bacterium.Biol-Pharm-bull，1995，18(9)1184-1188)。Zenser-TV等人在對人體中的和大腸桿菌中的β-葡萄糖苷酸酶對聯苯胺和4-氨基雙苯的葡萄糖苷酸的水解作用的研究中發現，0.5mM的D-葡萄糖二酸1，4內酯就可完全抑制水解作用(Zenser-TV，Lakshmi-VM，Davis-BB. Human and Escherichia coli beta-glucuronidasehydrolysis of glucuronide conjugates of benzidine and 4-aminobiphenyl，andtheir hydroxy metabolites.Drug-Metab-Dispos，1999，27(9)1064-1067)。上述研究結果表明，D-葡萄糖二酸1，4內酯在較低濃度時就可起到很好的解毒、抗癌作用。
紅茶菌含有D-葡萄糖二酸1，4內酯，但是，由于紅茶菌中含有膜醋菌，發酵生產時在液體表面會生成一層細菌纖維素膜，因此目前紅茶菌的生產以家庭小規模液體靜止培養為主，還未形成大規模工業化生產，而且其中生成D-葡萄糖二酸1，4內酯的具體菌株還不清楚。
1996年，YAMADA基于16SrRNA部分序列的不同將葡糖酸醋酸桿菌亞屬(Gluconacetobacter)提升到葡糖酸醋酸桿菌屬(Yamada，Y.，Hoshino，K.andIshikawa，T.The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partialsequences of 16S ribosomal RNAthe elevation of the subgenusGluconoacetobacter to the generic level.Biosci.Biotechnol.Biochem，1997，611244-1251)。
發明內容
本發明的目的是提供一株新的葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)。
本發明所提供的葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)名稱為Jlab A4，已于2004年05月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC № 1157。
該菌株具有產生D-葡萄糖二酸1，4內酯的能力；該菌株的細胞呈桿狀，革蘭氏陰性；運動；好氧；最適生長溫度30℃；不能產生氧化酶；不能氧化乙酸或乳酸生成CO2和H2O；可以α-D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、甘油、D-果糖、甲酸、山梨糖醇、阿糖醇、甘露醇、丙酮酸甲酯、D，L-乳酸或赤蘚糖醇為唯一碳源；DNA中G+C mol％含量為59.5％；其16SrDNA具有序列表中序列1的多核苷酸序列，以其16SrDNA全序列為基礎的系統發育樹如圖1所示(標尺為1％的堿基差異)。
本發明的另一個目的是提供一種生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法。
本發明所提供的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，是在糖茶水培養基中培養葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157得到D-葡萄糖二酸1，4內酯。
所述糖茶水培養基包括碳源，茶葉浸出液和水，pH 4-7；所述碳源選自下述化合物中的至少一種葡萄糖，果糖，葡萄糖酸，果葡糖漿，山梨糖醇，阿糖醇和甘露醇；所述碳源的終濃度為5-25g/100ml，所述茶葉浸出液中的固形物的終濃度為0.5-2.0波美度(°Bx)。
所述碳源的終濃度優選為5g/100ml。所述碳源優選為葡萄糖。
所述茶葉浸出液可按如下方法制備將茶葉經90-100℃的水連續浸泡2-3次，每次10-15min，除去茶渣，得到浸出液。
所述茶葉可為不發酵茶，半發酵茶，全發酵茶和后發酵茶中的一種或任意組合，也可為由上述茶加工而來的后加工茶，固形物濃度為0.5-2.0波美度。所述水可為蒸餾水、自來水或井水等一般可飲用的水。
所述葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的接種量無特別限制，一般為105-107個細胞/mL培養基。
所述葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的培養條件為20-35℃培養5-12天。其中，所述培養溫度優選為25-30℃。
所述葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157可以120-200rpm的轉速振蕩培養5-8天，也可靜止培養8-12天。
由葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157發酵上述糖茶水培養基得到的發酵制品也屬于本發明的保護范圍。
所述發酵制品可為發酵產品本身、經稀釋過的發酵產品或經純化的發酵產品；所述發酵制品可采用顆粒、膠囊、片劑等固體外形或是糊狀、膠狀、液體等流體外形。
本發明的葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157具有較高的D-葡萄糖二酸1，4內酯的生產能力，且其發酵工藝簡單、穩定、成本低廉，產量高(3-5mg/mL)；在D-葡萄糖二酸1，4內酯、D-葡萄糖二酸1，4內酯保健食品的生產中具有廣闊的工業應用和市場前景。
圖1為以16SrDNA全序列為基礎的CGMCC № 1157的系統發育樹狀2為D-葡萄糖二酸1，4內酯標準品的氣相色譜3為D-葡萄糖二酸1，4內酯標準品氣相色譜圖中2#峰的質譜4為Gluconacetobacter sp.Jlab A4菌株發酵樣品的氣相色譜5為Gluconacetobacter sp.Jlab A4菌株發酵樣品氣相色譜圖中3#峰的質譜圖具體實施方式
實施例1、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)CGMCC № 1157的篩選醋酸桿菌固體培養基葡萄糖100g，酵母浸出物10g，碳酸鈣20g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH6.8，121℃滅菌15min。
糖茶水培養基5g/100ml葡萄糖，固形物終濃度為0.5波美度茶葉浸出液，pH4.9。
葡糖酸醋酸桿菌Jlab A4(Gluconacetobacter sp.)的篩選步驟如下一、初步篩選1、將已活化的紅茶菌混合菌種(在北京民間采樣)振蕩混勻后，取10mL菌液及一小塊菌膜放入帶玻璃珠的90mL無菌水中，充分振蕩混勻；吸取5mL至45mL無菌水中，混勻后依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，分別吸取10-4、10-5和10-6三個稀釋度的菌液各0.1mL涂布于醋酸桿菌固體培養基中，每個稀釋度平行涂三個板，在30℃培養，觀察生長情況，鏡檢選取不同菌株的單菌落，分別接種于糖茶水培養基中進行發酵培養，然后按下述步驟2進行D-葡萄糖二酸1，4內酯的檢測。
2、樣品中D-葡萄糖二酸1，4內酯的檢測1)儀器設備(1)Shimadzu GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀(2)色譜柱DB-WAX 50m×0.32mm×0.25um極性柱(3)TDL-5-A型臺式離心機上海安亭科學儀器廠2)氣相色譜-質譜分析條件(1)氣相色譜條件進樣口溫度(250℃)；載氣(高純度氦氣)，線速度(40cm/s)；柱溫(初始50℃，以后每分鐘升12℃，至220℃后保持8分鐘)(2)質譜條件EI離子源，離子源溫度為200℃；接口溫度與進樣口溫度相同；電子能量70eV；質量范圍(45-500amu)
3)待測樣品處理及標樣配制(1)待測樣品處理將經菌株發酵得到的紅茶菌樣品3000rpm離心15min后，準確吸取1mL上清液至50mL小三角瓶中，置于真空干燥器中90℃真空干燥至恒重，取出后向三角瓶中加入4mL甲醇將瓶內物質完全溶解后，再次3000rpm離心15min，取上清液用于測定。
(2)標樣配制準確稱取D-葡萄糖二酸1，4內酯100.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，使濃度為10000mg/L，分別從中吸取5.0mL、2.0mL、0.5mL、0.1mL，分別定容至10mL，配制成濃度分別為5000mg/L、2000mg/L、500mg/L和100mg/L的D-葡萄糖二酸1，4內酯標準溶液。
4)檢測結果先比較樣品與D-葡萄糖二酸1，4內酯標準品的氣相色譜圖，其中標準品的保留時間為11.033min(圖2)，若樣品的保留時間約為11.033min時也出峰，則進一步比較標準品色譜圖中保留時間為11.033min的峰的質譜圖(圖3)與樣品色譜圖中保留時間約為11.033min的峰的質譜圖，若兩者相同，則可以確定該樣品中存在D-葡萄糖二酸1，4內酯。通過對發酵液中D-葡萄糖二酸1，4內酯的檢測，表明分離得到的酵母菌和乳酸菌都不具有產生D-葡萄糖二酸1，4內酯的能力，只有分離得到的醋酸菌能產生D-葡萄糖二酸1，4內酯。但是由于醋酸菌仍然是菌株的復合體，因此確定其中產生D-葡萄糖二酸1，4內酯的菌株是非常必要的。
二、二次篩選將經初篩的醋酸菌的多個菌株分別用糖茶水培養基發酵，然后按步驟一的方法測定不同菌株產生D-葡萄糖二酸1，4內酯的能力，選出其中產量最高的菌株。檢測結果表明D-葡萄糖二酸1，4內酯產量較高的菌株是Jlab A1、Jlab A2、Jlab A3、Jlab A4、Jlab A5、Jlab A6、Jlab A7、Jlab A8、Jlab A9和Jlab A10，且Jlab A4菌株D-葡萄糖二酸1，4內酯的產量最高，該菌株的檢測結果如圖4和圖5所示。
對篩選出的功能因子-D-葡萄糖二酸1，4內酯產量最高的菌株Jlab A4的表型特征和核酸特征(G+C mol％和16SrDNA全序列分析)進行系統地鑒定，結果表明該菌株的基因組DNA中G+C mol％含量為59.5％，其中16SrDNA具有序列表中序列1的多核苷酸序列；采用MicroStation自動微生物鑒定儀(Biolog公司)及GN2微孔鑒定板對其進行唯一碳源的測定，所用95種碳源如表1所示，結果表明該菌株可以α-D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、甘油、D-果糖、甲酸、山梨糖醇、阿糖醇、甘露醇、丙酮酸甲酯、D，L-乳酸或赤蘚糖醇為唯一碳源；該葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp.)Jlab A4已于2004年05月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC № 1157。
表1.GN2微孔鑒定板
實施例2、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的發酵生產包括以下步驟1、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157種子液的培養醋酸桿菌液體培養基葡萄糖100g，酵母浸出物10g，碳酸鈣20g，蒸餾水1000ml，pH6.8，121℃滅菌15min。
用接種環從斜面挑取1環該菌種接于10mL醋酸桿菌液體培養基中，在30℃振蕩培養24h，然后按20％(體積比)的比例將其接種于糖茶水培養基中連續進行兩次擴大培養，在30℃振蕩培養24h。
2、發酵糖茶水培養基固形物濃度為0.5波美度的云南滇紅茶葉浸出液，5g/100ml葡萄糖，pH4.9。
將步驟1的種子液按10％(體積比)的比例接種于糖茶水培養基(pH4.9)(250mL三角瓶裝150mL培養基)中，在25℃靜止培養8天，發酵結束后測定發酵液中D-葡萄糖二酸1，4內酯的含量為3.00mg/mL。
實施例3、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的發酵生產包括以下步驟1、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157種子液的培養同實施例2。
2、發酵將步驟1的種子液按10％(體積比)的比例接種于糖茶水培養基(除pH4.0外，其它同實施例2)(250mL三角瓶裝150mL培養基)中，在25℃、160rpm振蕩培養6天，發酵結束后測定發酵液中D-葡萄糖二酸1，4內酯的含量為3.46mg/mL。
實施例4、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的發酵生產包括以下步驟1、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157種子液的培養同實施例2。
2、發酵將步驟1的種子液按10％(體積比)的比例接種于糖茶水培養基(除pH 4.0外，其它同實施例2)(250mL三角瓶裝50mL培養基)中，在25℃、160rpm振蕩培養6天，發酵結束后測定發酵液中D-葡萄糖二酸1，4內酯的含量為4.29mg/mL。
實施例5、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的發酵生產包括以下步驟1、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157種子液的培養同實施例2。
2、發酵將步驟1的種子液按10％(體積比)的比例接種于糖茶水培養基(除pH4.9外，其它同實施例2)(250mL三角瓶裝150mL培養基)中，在25℃、160rpm振蕩培養6天，發酵結束后測定發酵液中D-葡萄糖二酸1，4內酯的含量為3.20mg/mL。
序列表<160>1<210>1<211>1383<212>DNA<213>葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter)<400>1tgcttaacac atgcaagtcg cacgaacctt tcggggttag tggcggacgg gtgagtaacg 60cgtagggatc tgtccatggg tgggggataa ctttgggaaa ctgaagctaa taccgcatga 120cacctgaggg tcaaaggcgc aagtcgcctg tggaggaacc tgcgttcgat tagctagttg 180gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgatgatc gatagctggt ctgagaggat gatcagccac 240actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 300tgggcgcaag cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga aggttttcgg attgtaaagc 360actttcagcg gggacgatga tgacggtacc cgcagaagaa gccccggcta acttcgtgcc 420agcagccgcg gtaatacgaa gggggcaagc gttgctcgga atgactgggc gtaaagggcg 480cgtaggcggt tttaacagtc agatgtgaaa ttcctgggct taacctgggg gctgcatttg 540atacgttgag actagagtgt gagagagggt tgtggaattc ccagtgtaga ggtgaaattc 600gtagatattg ggaagaacac cggtggcgaa ggcggcaacc tggctcatta ctgacgctga 660ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 720tgtgtgctgg atgttgggtg actttgtcat tcagtgtcgt agttaacgcg ataagcacac 780cgcctgggga gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaggg cttgacatgc 900ggaggccgtg tccagagatg ggcatttctc gcaagagacc tccagcacag gtgctgcatg 960gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg1020cctttagttg ccatcacgtt tgggtgggca ctctagagga actgccggtg acaagccgga1080ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgt cctgggctac acacgtgcta1140caatggcggt gacagtggga agccaggtag cgataccgag ccgatctcta aaagccgtct1200cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaaggtg gaatcgctag taatcgcgga1260tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg1320agttggtttg accttaagcc ggtgagcgaa ccgcaaggac gcagccgacc acggtcgggt1380cag 138權利要求
1.葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157。
2.一種生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，是在糖茶水培養基中培養葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157得到D-葡萄糖二酸1，4內酯。
3.根據權利要求2所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述糖茶水培養基包括碳源，茶葉浸出液和水，pH 4-7；所述碳源選自下述化合物中的至少一種葡萄糖，果糖，葡萄糖酸，果葡糖漿，山梨糖醇，阿糖醇和甘露醇；所述碳源的終濃度為5-25g/100ml，所述茶葉浸出液中的固形物的終濃度為0.5-2.0波美度。
4.根據權利要求3所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述碳源的終濃度為5g/100ml；所述碳源為葡萄糖。
5.根據權利要求3或4所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述茶葉為不發酵茶，半發酵茶，全發酵茶和后發酵茶中的一種或任意組合或為由上述茶加工而來的再加工茶。
6.根據權利要求3或4所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的接種量為105-107個細胞/mL培養基。
7.根據權利要求3或4所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的培養條件為20-35℃培養5-12天。
8.根據權利要求7所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述培養溫度為25-30℃。
9.根據權利要求7所述的生產D-葡萄糖二酸1，4內酯的方法，其特征在于所述葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157以120-200rpm的轉速振蕩培養5-8天或靜止培養8-12天。
10.由權利要求2-9中任一所述方法得到的發酵制品。
全文摘要
本發明公開了一株葡糖酸醋酸桿菌及其應用。其目的是提供一株新的葡糖酸醋酸桿菌及利用該菌株生產D－葡萄糖二酸1，4內酯的方法。該菌株為葡糖酸醋酸桿菌(Gluco nacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157。用該菌株生產D－葡萄糖二酸1，4內酯的方法，是在糖茶水培養基中培養葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157得到D－葡萄糖二酸1，4內酯。本發明的葡糖酸醋酸桿菌(Gluco nacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157具有較高的D－葡萄糖二酸1，4內酯的生產能力，且其發酵工藝簡單、穩定、成本低廉，產量高(3－5mg/mL)。
文檔編號C12N1/20GK1614007SQ200410091488
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者籍保平, 田文禮, 李博, 吳薇, 楊志偉, 蓋寶川, 張泓, 周峰 申請人:中國農業大學